Застосування [d-meala]3-[etval]4-циклоспорину для лікування інфекції гепатиту с та фармацевтична композиція, що включає [d-meala]3-[etval]4-циклоспорин

1. Застосування [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA для виготовлення лікарського засобу, призначеного для лікування інфекції вірусу гепатиту С (HCV) у пацієнта. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA вводять спільно або роздільно з щонайменше другим компонентом, що є C2 2 (19) 1 3 високою антивірусною активністю та кращим профілем безпеки. Щоб установити безпечний профіль, для клінічного лікування інфекції HCV особливо важливі такі критерії, як низька цитотоксичність, а також цитостатичний ефект і високий індекс селективності. Новий підхід до лікування інфекції HCV з використанням циклоспоринів був недавно описаний клінічними спостереженнями [див. Teraoka et al., Transplant Proa, 1988, 20 (3 suppl. 3), 868-876, та Inoue et al. J. Gastroenterol., 2003, 38, 567-572]. Недавно було показано, що Циклоспорин A (CsA) інгібував in vitro внутрішньоклітинну реплікацію HCV субгеномного реплікону при клінічно досяжних концентраціях препарату [див. Watashi et al., Hepatology 38, 2003, 1282-1288, і Nakagawa et al., BBRC 313, 2004, 42-47]. Обидві групи припустили, що анти-HCV дія CsA не пов'язана з імуносупресивною активністю, основаною на спостереженнях, зроблених з використанням відповідно імуносупресивного макроліду, тобто, сполуки, відомої під назвою FK 506, і неімуносупресивного похідного Циклоспорину А, тобто, сполуки, відомої під назвою NIM 811 або [МеІІе]4-CsA. Nakagawa та ін. вважають, що розширення застосувань CsA може викликати істотні проблеми через його широко відомі імуносупресивні властивості і гадають, що один з методів вирішення цієї проблеми полягає в тому, щоб взяти до уваги використання неімуносупресивних аналогів циклоспорину. Протягом останніх 15 років проводилася безліч досліджень в області хімії ліків з метою ідентифікації таких неімуносупресивних аналогів циклоспорину, і NIM 811 є однією з найбільш представницьких сполук, що володіють такою якістю. Kо та ін. у заявці на патент ЕР 0484281, що стосується їхніх неімуносупресивних властивостей, повідомляли про NIM 811, поряд з дев'ятьма іншими похідними Циклоспорину А, і розглядали його як такий, що є потенційно корисним у лікуванні інфекції ВІЛ і профілактиці СНІД. Синтез цих похідних включав модифікацію амінокислот у положеннях 4 та/або 5 Циклоспорину А. Змінюючи амінокислоти в положеннях 2 та/або 6 Циклоспорину A, Sigal та ін. синтезували в сумі 61 аналог циклоспорину і помітили, що такі хімічні модифікації викликають зменшення імуносупресивної активності [див. Sigal et al., J. Exp. Med., 173, 1991, 619-628]. Наступні спроби модифікування амінокислоти в положенні 3 Циклоспорину А з метою одержання неімуносупресивних сполук були описані, зокрема, Ваrrіеrе та ін. у WO 98/28328, WO 98/28329 та WO 98/28330. Wenger та ін. синтезували ряд сполук, які відрізняються від Циклоспорину А в положенні 3, де вони містять N-метильовану, невелику гідрофобну або нейтральну амінокислоту, іншу ніж гліцин, і в положенні 4, де вони містять N-метильовану або N-етиловану гідрофобну чи нейтральну амінокислоту, іншу ніж лейцин. Зазначені автори повідомляють, що ці сполук мають високу ефективність інгібування реплікації HIV-1 і, по суті, не володіють імуносупресивною активністю [див. публікацію 88484 4 міжнародної заявки WO 00/01715 та Tetrahedron Lett., 41, (2000), 7193-6]. Задача даного винаходу полягає в тому, щоб забезпечити клініциста новою терапією при лікуванні інфекції HCV, особливо, наприклад, у випадку запобігання рецидиву HCV. Ця терапія повинна пропонувати більш високу антивірусну активність і кращий профіль безпеки у порівнянні з вже перевіреним або недавно запропонованим лікуванням. Автори даного винаходу несподівано виявили, що введення HCV-інфікованому пацієнту особливої сполуки, а саме, [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, відповідає вищезгаданим вимогам. Вони помітили, що, на додаток до своїх неімуносупресивних властивостей, [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA має значно більш високу спорідненість до циклофілінів, чия підвищена спорідненість співвідноситься з підвищеною ефективністю у відношенні інгібування реплікації HCV. Відповідно, один з об'єктів даного винаходу стосується застосування [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA для виготовлення лікарського продукту, призначеного для лікування інфекції HCV у пацієнта. Про [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA повідомляли Wenger та ін. у WO 00/01715, і йому був приписаний реєстраційний номер CAS 254435-95-5. Він є циклічним ундекапептидом, описуваним такою формулою: де MeBmt позначає N-метил-(4R)-4-бут-2Е-ен-1іл-4-метил-(L)треонін, aAbu позначає L-a-аміномасляну кислоту, D-МеАІа позначає N-метил-D-аланін, EtVa позначає N-етил-L-валін, Va позначає L-валін, MeLeu позначає N-метил-L-лейцин, Ala позначає L-аланін, (D)Ala позначає D-аланін, і MeVa позначає N-метил-L-валін. Загальноприйнята нумерація положень амінокислот, у загальному випадку використовуваних для Циклоспорину А, показана під формулою. Це досягається шляхом використання складних назв, що включають першу частину, яка вказує на ідентичність залишків, що відрізняються від тих же залишків у Циклоспорині А із вказівкою їхнього положення, і другу частину, позначену як "CsA", яка вказує на те, що всі інші залишки є ідентичними тим же залишкам у Циклоспорині А. Наприклад, [Melle]4-CsA є циклоспорином, який є ідентичним Циклоспорину А, за винятком того, що MeLeu у положенні 4 замінений на МеІІе (N-метил-Liзолейцин). Даний винахід буде пояснюватися далі за допомогою наступних прикладів i графічних матеріалів, у яких: Фіг.1 представляє гістограму "доза-відповідь", одержану шляхом аналізу люциферази в інфікованих клітинах Huh-7-Lunet; 5 Фіг.2 представляє гістограму "доза-відповідь", одержану шляхом аналізу люциферази в інфікованих клітинах Huh-7,5-Lunet; Фіг.3 представляє криві "кліренс-відповідь" в інфікованих клітинах Huh-9-13; Фіг.4 представляє тривимірне зображення "доза-відповідь" в комбінації з IFN/[D-MeAla]3-[EtVal]4CsA. Усталені медичні застосування Циклоспорину А зв'язані зі здатністю цієї сполуки пригнічувати клітинну імунну відповідь шляхом запобігання продукуванню та вивільненню декількох аутокринних факторів росту Т-клітини, включаючи інтерлейкін 2 (IL-2), від активованих Т-клітин [див. ВогеІ (1989) Transplant. Proceed. 21, 810-815; Kronke et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5214-5218; Faulds et al. (1993) Drugs 45, 953-1040]. При потраплянні в клітини Циклоспорин А зв'язується із циклофілінами з високою спорідненістю [див. Handschumacher et al. (1984) Science 226, 544547]. Оскільки серед різних біологічних функцій вони мають активність пептидил-проліл цис-транс ізомерази (PPIase), вона може бути виміряна in vitro [див. Fischer et al. (1989) Nature 337, 476-478; Takahashi та ін. (1989) Nature 337, 473-475]. Критичним для імуносупресивної дії Циклоспорину А є взаємодія між комплексом "циклофілін - Циклоспорин А" та кальцій- і кальмодулін-залежною серин/треонін фосфатазою 2В (кальцинейрин) [див. Hauske (1993) DN&P 6, 705-711, Friedman et al. (1991) Cell 66, 799-806; Liu et al. (1991) Cell 66, 807-815]. Утворення цього потрійного комплексу приводить до інгібування активності фосфатази кальцинейрину [див. Jain et al. (1993) Nature 365, 352-355; Rao et al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 707-747; Crabtree (1999) Cell 96, 611-614]. Кальцинейрин сприяє селективному дефосфорилюванню нуклеарного фактора активованих Т-лімфоцитів (NF-AT), який потім переміщається до ядра, де він зв'язується з білком активатора 1 і трансактивує цільові гени, включаючи IL-2 ген. Вважають, що через амінокислоти в положеннях 3 та 4, [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA має істотно знижену здатність взаємодіяти з кальцинейрином, як показано транскрипційним та імунологічним аналізом, а також значно більшу спорідненість до циклофілінів, як показано аналізом інгібування активності пептидил-проліл цис-транс ізомерази. Активність пептидил-проліл цис-транс ізомерази (PPIase) циклофілінів визначали, використовуючи адаптовану методику Kofron та ін. [див. Biochemistry 30, 6127-6134 (1991); J. Am. Chem. Soc. 114, 2670-2675 (1992)]. N-Сукцинільований Ala-Ala-Pro-Phe-пара-нітроанілін (Suc-AAPF-pNA, Bachem, Bubendorf, Швейцарія) використовували як субстрат. Аналіз ґрунтувався на переважному розщепленні хімотрипсином транс-ізоформи зв'язку Phe-pNA у тетрапептиді Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. Це розщеплення вивільняє фрагмент паранітроаніліну, який може бути виявлений і визначений кількісно при 390нм (e=11814Μ-1см-1) [Schutkowski et al. (1995) Biochemistry 34, 1301613026]. Цис-транс ізомеризація каталізується цик 88484 6 лофіліном (PPIase, EC 5.2.1.8). Після змішування CsA або іншого циклоспорину (кінцеві концентрації 10-9-2´10-5Μ одержані з концентрованих в 1000 разів наявних у продажі розчинів в етанолі) з 0,1мкг циклофіліну (Sigma) у загальному об'ємі 1,5мл 40мМ розчину HEPES, рН 7,9, та інкубації протягом 50 хвилин на льоді, реакційну суміш переносили в кювету, яку витримували при 10°С у спектрофотометрі Varian. Після додавання 3,75мг хімотрипсину (70мкл розчину хімотрипсину в 10мМ НСІ), реакцію ініціювали додаванням 10мкл 3,2мМ розчину Suc-AAPF-pNA в 0,5М LiCI/трифторетанолі. Реакцію контролювали протягом 3 хвилин, і з одержаних даних визначали початкову константу швидкості. Для контролю початкову константу швидкості визначали також для паралельної реакції, у якій був відсутній циклофілін. Криві "концентрація-відповідь" будували для Циклоспорину А та інших циклоспоринів, і значення ІС50 (IK50, 50% інгібуюча концентрація) різних циклоспоринів виражали відносно інгібуючої концентрації Циклоспорину А (1,0). Значення менше 1 означає, що сполука має більш високу спорідненість до циклофіліну, ніж CsA. Спочатку для оцінки імуносупресивної активності циклоспоринів використовували NF-ATзалежний аналіз репортера [Baumann et al. (1992) Transplant. Proc. 24, 43-48]. Т-клітини Jurkat, стійко трансфековані репортерною структурою, що містить бактеріальний ген b-галактозидази під контролем промотору IL-2 гена, були одержані від G. Zenke, Novartis Pharma AG, Basel, Швейцарія. Клітини вирощували в середовищі RPM11640 з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки, інактивованої при високій температурі, 100Од./мл пеніциліну, 100мкг/мл стрептоміцину, 2мМ глутаміну, 50мкМ 2-меркаптоетанолу та 100Од./мл гігроміцину В. Клітини стимулювали додаванням 2,4мкМ форбол-12-міристат-13-ацетату та 75мкг/мл фітогемаглютиніну в присутності або за відсутності Циклоспорину А чи іншого циклоспорину (кінцеві концентрації 10-9-2´10-5Μ одержані з концентрованих в 1000 разів наявних у продажі розчинів в етанолі). Після інкубації протягом 20год. при 37°С, клітини збирали та лізували в 50мМ Na2HPO4 (рН 9,0), 10мМ KСІ, 1мМ MgSO4, 1%-ому розчині Triton Х-100, 0,5мМ 4-етилумбеліферил-bD-галактозиду (Sigma, Buchs, Швейцарія). Реакція з b-галактозидазою проходила протягом 1год. у темряві при кімнатній температурі. Флуоресцентний 4-метилумбеліферон аналізували флуорометрично в надосадній рідині (довжина хвилі збудження 355нм; довжина хвилі випромінювання 460нм). Криві "концентрація-відповідь" будували для Циклоспорину А та інших циклоспоринів, і значення ІС50 різних циклоспоринів виражали відносно відповідного значення для Циклоспорину А (1,0). Значення більше 1 означає, що сполука є менш імуносупресивною, ніж CsA. Результати, одержані в результаті експерименту, показані в Таблиці 1 нижче. 7 88484 Таблиця 1 Циклофілін-зв'язувальна (PPIase) та імуносупресивна (IL-2) активності CsA та інших циклоспоринів Сполука CsA [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA [Melle]4-CsA PPIase 1,0 0,3 0,5 IL-2 1,0 7161 2250 Дані, наведені в Таблиці 1, показали, що певні заміни в положенні 4 (тобто, Va, lle) значно зменшують імуносупресивну активність (вимірювану як інгібування IL-2 експресії), а також відчутно збільшують циклофілін-зв'язувальну активність (вимірювану як інгібування PPIase активності циклофіліну). Заміщення в положенні 3 приводило до подальшого істотного збільшення циклофілінзв'язувальної активності (в 2 рази або більше; порівн. [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA). Сполука мала більш високу циклофілін-зв'язувальну активність, і більш низьку залишкову імуносупресивну активність, ніж [Melle]4-CsA, що є кращою еталонною сполукою, відомою з літератури. Сполука [Melle]4-CsA також відома як NIM811. Неімуносупресивна активність [D-MeAla]3[EtVal]4-CsA 8 У підтверджувальному аналізі імуносупресивну активність CsA, [Melle]4-CsA та [D-MeAla]3[EtVal]4-CsA оцінювали з використанням змішаної лімфоцитної реакції. У цьому аналізі циклоспорини розчиняли в етанолі (10мг/мл). Змішували свіжовиділені клітини CD4+ PBMCs від двох здорових донорів з наступною інактивацією шляхом опромінення однієї з популяцій (клітини стимулятора; S). Через п'ять днів спільного культивування в присутності або за відсутності циклоспорину (1мкг/мл) визначали проліферативну відповідь неінактивованої популяції клітин (клітини респондера; R) шляхом введення [3Н]-тимідину. Аналіз проводили перехресно з двома популяціями клітин, причому кожну інактивували та стимулювали по черзі. Стимуляцію (%) клітин респондера розраховували за формулою: відсоток порушення=100´(зразок із циклоспорином-фон)/(зразок без циклоспорину-фон) «Зразок» є сумішшю клітин респондера та стимулятора. «Фон» є контролем, у якому змішані тільки клітини стимулятора. Результати наведені в Таблиці 2. Вони показують, що і [Melle]4-CsA, і [DMeAla]3-[EtVal]4-CsA в значній мірі позбавлені імуносупресивної активності. Таблиця 2 Проліферативна відповідь клітин CD4+ PBMCs у присутності/за відсутності циклоспоринів Спів-культура R1´S2 R1´S2 R1´S2 R1´S2 R2´S1 R2´S1 R2´S1 R2´S1 S1´S2 Сполука немає CsA [Mellef-CsA [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA немає CsA [Melle]4-CsA [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA немає N 8 4 4 4 4 4 4 4 4 % Стимуляції (відносний) 100 29 84 75 100 9 75 65 0 Стандартне відхилення 30 3 13 11 9 2 9 7 0,6 R1´S2 стосується спів-культури клітин респондера від донора 1 і клітин стимулятора від донора 2. N позначає кількість вимірів. Висока анти-HCV активність і низький цитотоксичний/цитостатичний ефект [D-MeAla]3-[EtVal]4CsA Як згадувалося раніше, інфекція вірусного гепатиту С (HCV) є серйозною проблемою для здоров'я, тому що постійно інфіковані пацієнти піддані високому ризику розвитку хронічних захворювань печінки, включаючи цироз печінки та гепатоцелюлярну карциному. Відома з попереднього рівня техніки терапія (способи лікування) є не придатною для великої частини останньої популяції, а також зв'язана з істотними побічними ефектами. Донедавна розвитку більш ефективних терапій (способів лікування) перешкоджала відсутність відповідної моделі реплікації HCV in vitro, що дозволяє здійснювати скринінг потенційно активних сполук до оцінки в клінічних випробуваннях на людині. Ця перешкода була подолана розвитком генетично змінених мінігеномів HCV (репліконів), які самоампліфікуються в культивованих клітинах гепатоми до високих рівнів [Lohmann et al. Science 285, (1999), 110-113]. Ця система реплікону HCV швидко стала стандартним інструментом для вивчення реплікації HCV, патогенезу та живучості [Bartenschlager et al. Antiviral Res. 60, (2003), 91102]. Геном HCV складається з однониткової РНК, яка містить єдину відкриту рамку зчитування для поліпротеїнів з приблизно 3000 амінокислот. Трансляція цього поліпротеїну ініціюється на внутрішньому сайті входу в рибосому (IRES), розташованому на 5' кінці РНК. Поліпротеїн HCV розщеплюється, щонайменше, на десять білків. Вони включають капсидний білок С, оболонкові білки Е1 та Е2, можливий віропориновий білок р7, неструк 9 турні білки NS2 та NS3, що мають активність серинпротеїнази, а також активність АТФази/хелікази, NS4A, індукуючий мембранну сітку білок NS4B, NS5A і РНК-залежну РНК-полімеразу NS5B. Першим успішним репліконом була біцистронна РНК, що містить у напрямку від 5' до 3' IRES HCV кодуючу послідовність для неоміцинфосфотрансферази, IRES від вірусу енцефалокардиту та кодуючі послідовності для білків HCV від NS3 до NS5. Можна показати, що після введення в клітини Huh-7 і селекції з використанням G418 (генетицин), цей реплікон може автономно реплікуватися до високих рівнів (1000-5000 копій на клітину) [Lohmann et al., 1999]. Характеристика системи показала, що ефективність реплікації залежить від дозволу (пермісивності) клітини хазяїна і, що важливо, від вибору адаптивних мутацій культури клітини в кодуючих послідовностях білка HCV. Було виявлено, що реплікація є чутливою до інтерферону-альфа, що забезпечує свідчення придатності системи для скринінгу ліків, які є ефективними in vivo. Також були сконструйовані різні реплікони, у яких кодуюча послідовність "неоміцинфосфотрансфераза" була замінена, наприклад, кодуючою послідовністю люциферази або послідовностями, що кодують злитий білок "люцифераза-убіхітин-неоміцин фосфотрансфераза". Реплікація останніх різних репліконів може бути проаналізована за допомогою придатного аналізу люциферази, тоді як реплікація колишнього реплікону вимагає визначення числа копій РНК. Watashi та ін. (2003) продемонстрували за допомогою нозерн-блотингу та кількісної RT-PCR (полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою), що накопичення РНК HCV у клітинах МН-14, які містять реплікон HCV, інгібується CsA, а не імуносупресивним макролідом FK506 і неімуносупресивним похідним CsA PSC 833. Їхні аналізи, які включали 7-денний вплив активних агентів на клітини, показали, що титр РНК HCV зменшується приблизно в 200 разів у присутності 1мкг/мл Циклоспорину А. Вони далі виявили, що неімуносупресивний циклоспорин [Melle]4-CsA також інгібує реплікацію HCV. Результати вказували на те, що [Melle]4-CsA є приблизно таким саме ефективним в зниженні титру РНК HCV, як і CsA. Для того, щоб визначити, чи має циклоспорин згідно із даним винаходом анти-HCV активність і, якщо він має таку активність, то якою є ця активність у порівнянні з активністю CsA та [Melle]4-CsA, були проведені експерименти, щоб порівняти інгібуючі ефекти CsA, [Melle]4-CsA та [D-MeAla]3[EtVal]4-CsA у системах реплікону HCV. В аналізах використовували клітини Huh 5-2, які містили біцистронну РНК, що кодуює злитий білок люцифераза-убіхітин-неоміцин фосфотрансфераза світлячка, і білки HCV NS3-5. Вірусні послідовності були одержані з вірусу HCV генотипу 1b. Клітини вирощували в середовищі RPMI 1640 (виробник - Gibco) з додаванням 10%-ої ембріональної телячої сироватки, 2мМ глутаміну (виробник - Life Technologies), 1´ замінної амінокислоти (виробник - Life Technologies), 100Од./мл пеніциліну, 100мкг/мл стрептоміцину та 250мкг/мл G418 (генетицин, Geneticin, виробник - Life Technologies) при 88484 10 37°С та 5% СО2. Для антивірусного аналізу (реплікації), клітини висівали при щільності 7000 клітин на лунку в 96-лунковий планшет View PlatesÔ (виробник - Packard) у тому самому середовищі, за винятком G418. Після 24-годинної інкубації середовище видаляли, додавали послідовні розведення випробуваних сполук у середовищі, і клітини інкубували протягом ще 72год. Антивірусну дію оцінювали за допомогою аналізу люциферази або кількісної RT-PCR. Для виконання аналізів люциферази середовище видаляли, а клітини промивали з використанням фосфатного буфера PBS. Після лізису в 50мкл буфера Glo-lysis (виробник - Promega) протягом 15 хвилин, до клітинних лізатів додавали 50мкл реагенту для аналізу люциферази Stead-Glo Lusiferase Assay Reagent (виробник - Promega). Активність люциферази вимірювали з використанням люмінометра, і сигнал від кожної тестової комірки виражали як процент від сигналу, вимірюваного в осередках культур, які не піддають дії тестової сполуки. Розподіл клітин і цитостатичні ефекти оцінювали в паралельних культурах у стандартному 96лунковому планшеті (Beckton-Dickinson) з використанням МТТ аналізу (CellTiter 96R AQueous NonRadioactive Cell Proliferation Assay, Promega). У цьому аналізі, 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-5-(3карбоксиметокси-феніл)-2-(4-сульфофеніл)-2Нтетразолій (MTS) відновлювався біологічно до формазану, який кількісно визначався при 498нм у планшет-рідері. Продукування формазану безпосередньо зв'язане із числом живих клітин. В аналізі RT-PCR кількісно визначали область репліконів неоміцину, з використанням датчиків послідовності АВІ PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Прямими та зворотними використовуваними праймерами були 5'CCGGCTACCTGCCCATTC-3' та 5'CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3', відповідно. Флуорогенною пробою була сполука 5'ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3'. Як внутрішня контрольна проба використовувалася плазміда, що містить частину генної послідовності неоміцин фосфотрансферази. Результати цих експериментів дозволили обчислити для різних циклоспоринів ЕС50, що є ефективною концентрацією, необхідною для інгібування реплікації реплікону HCV на 50%, а також СС50, що є концентрацією, необхідною для інгібування проліферації клітин, що експоненціально ростуть, на 50%, і індекс селективності SI, який є відношенням CC50 до ЕС50. У Таблиці 3 показані значення, одержані від клітин Huh 5-2, з використанням аналізів активності люциферази, для оцінки ефективності реплікації та МТТ аналізів для калібрування аналізів люциферази та для оцінки цитостатичних ефектів сполук. Відповідно до спостережень Watashi та ін. (2003), обговорюваних вище, CsA та [Melle]4-CsA мали подібну анти-HCV активність (реплікацію). Несподівано, [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA виявився значно більш сильнодіючим, ніж CsA та [Melle]4CsA. Також було відзначено, що 50% цитостатична концентрація (СС50) для [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 11 була значно вище, ніж значення, визначені для CsA та [Melle]4-CsA. Відповідно, було виявлено, що [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA має значно більш високий індекс селективності в порівнянні з двома іншими циклоспоринами. Аналогічні експерименти, у яких значення ЕС50 були одержані з визначень 88484 12 титрів РНК, з використанням кількісної RT-PCR, привели до подібних висновків. Значення SI, рівні 45*, 73 та 625* були одержані для CsA, [Melle]4CsA та [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, відповідно. Зірочки вказують, що представлене більш низьке із двох незалежно визначених значень. Таблиця 3 ЕС50, СС50 і значення SI, визначені з аналізів люциферази реплікації РНК HCV та МТТ аналізів цитотоксичності в клітинах Huh 5-2, що включають люцифераза-вмісний мініреплікон HCV ЕС50 (мкг/мл) ± середньоквадра- СС50 (мкг/мл) ± середньоквадра- Індекс селектичне відхилення тичне відхилення тивності CsA 0,28±0,13 11,6±5,6 41 [Melle]4-CsA 0,03±0,04 >27 >900 [D-MeAla]3-[BVal]4-CsA 0,22 14 64 Сполука Антивірусна активність [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. виміряна в інфікованих клітинах-мішенях з рекомбінантним HCV Анти-HCV активність [D-MeAIa]3-[EtVal]4-CsA у порівнянні з CsA далі визначали в системах культури, що наближаються до умов in vivo. У методі використовували клітини гепатоми (гепатоаденоми), які були інфіковані інфекційною повнорозмірною хімерною структурою HCV або таким саме вірусом, який модифікували, щоб він ніс ген рецептора люциферази. Після обробки інфікованих клітин за допомогою циклоспорину відповідно до винаходу або CsA, вимірювали активність люциферази, безпосередньо пов'язану з інгібуванням вірусної реплікації. Для інокуляції клітин гепатоаденоми в цих аналізах використовували інфекційні віруси повнорозмірного HCV хімерного геному між штамами HCV J6 та JFH1 (Jc1). Структуру Jc1 вірусу також змінювали, щоб одержати біцистронний геном, що несе ген репортера люциферази (Jc1-Luc). Через двадцять чотири та дев'яносто шість годин після трансфекції транскриптів РНК геномів шляхом електропорації клітин Huh-7,5 збирали надосадову рідину клітинних культур. Надосадову рідину відфільтровували (0,45мкм) та визначали ССID50 (інфекційна доза клітинної культури 50) на мл з використанням аналізу обмеженого розведення згідно Lindenbach та ін. [Science, 309, (2005), 623-626]. Значення ССID50 становили 1,3´105 для Jc1 та 4,2´103 для Jc1-Luc. В аналізах використовували клітини Huh-7Lunet або Huh-7,5 [Lohmann et al., Science 285(5424), (1999), 110-113]. Клітини вирощували в середовищі Ігла, модифікованому за Дальбекко (Dulbecco's modified Eagle's Medium, DMEM; виробник - Gibco), з додаванням 10% ембріональної бичачої сироватки, інактивованої при високій температурі (FCS) (Integra), 1´ замінної амінокислоти (Gibco), 100Од./мл пеніциліну (Gibco), 100мкг/мл стрептоміцину (Gibco) або 25мкг/мл гігроміцину (Gibco) для Huh - моноклітин при 37°С та 5% СО2. Для антивірусних аналізів (реплікації) клітини Huh7-Lunet та Huh-7,5 висівали при щільності 2´104 або 4´104 клітин на лунку 12-лункового планшета. Через двадцять чотири години середовище замі няли на 0,5мл вірусного матеріалу Jc1-Luc (12лунковий планшет) або 0,25мл Jc1 вірусного матеріалу (12-лунковий планшет). Через чотири години вірусний інокулят заміняли середовищем, що містить різні концентрації CsA або [D-MeAla]3[EtVal]4-CsA і потім інкубували протягом ще 72 годин. Інгібування вірусної реплікації оцінювали за допомогою аналізу люциферази. Для виконання аналізу люциферази клітини збирали, промивали фосфатним буфером (PBS) та лізували в буфері для лізису люциферази (1%-ий Тритон Х-100, 25мМ гліцилгліцин, 15мМ MgSO4, 4мМ EGTA і 1мМ DTT). Активність люциферази світлячка вимірювали згідно Krieger та ін. [J. Virol., 75(10), (2001), 4614-4624]. Стисло, після одного циклу заморожування/відтаювання, клітини повторно суспендували, і 100мкл лізату клітин змішували з 360мкл аналітичного буфера (25мМ гліцилгліцину, 15мМ MgSO4, 1мМ DTT, 2мМ АТР, 15мМ буфера фосфату калію, рН 7,8) і 200мкл розчину субстрату (200мМ люциферину, 25мМ гліцилгліцину). Наприкінці вимірювали люмінесценцію з використанням люмінометра Lumat LB9507 (Berthold) на 20 зразків. У цих прикладах (Фіг.1 та 2) і [D-MeAla]3[EtVal]4-CsA (білі стовпці), і CsA (чорні стовпці) приводили до антивірусної активності, залежної від дози, у силу чого було виявлено, що [DMeAla]3-[EtVal]4-CsA знову перевершує CsA, таким чином, підтверджуючи дані, одержані із субгеномними репліконами. Була потрібна в 10 разів більша концентрація CsA, щоб одержати такий самий інгібуючий ефект реплікації, що й для циклоспорину відповідно до винаходу. Висока спорідненість циклоспорину відповідно до винаходу щодо циклофіліну У вищезгаданих спостереженнях Watashi та ін. (2003) і Nagakawa та ін. (2003), анти-HCV ефект був зв'язаний зі зв'зувальною здатністю циклоспоринів по відношенню до циклофілінів. Щоб визначити більш потужний інгібітор PPIase активності циклофіліну, наприклад, циклофіліну А, і, отже, реплікації HCV, для циклофілінів вимірювали вплив CsA, [Melle]4-CsA та [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA на активність PPIase. 13 88484 В аналізах використовувався комерційно доступний рекомбінантний циклофілін людини (Sigma). Активність PPIase циклофілінів визначали з використанням спектрофотометричного аналізу, що включає хімотрипсин, згідно Garcia-Echverria та ін. [BBRC, 191, (1993), 70-75]. Цей спосіб ґрунтується на високій транс-селективності хімотрипсину для пептидів типу N-сукциніл-аІа-аІа-рrо-phe-пнітроанілід. Розщеплення пептидів вивільняло фрагмент пара-нітроаніліну, який може бути виявлений і кількісно визначений при 390нм. Гідроліз цис-форми обмежувався швидкістю цис-транс ізомеризації, здійснюваної за допомогою циклофіліну А. Пептид витримували в 25нМ розчині LiCI в 2,2,2-трифторетанолі при 470мМ, щоб збільшити популяцію цис-конформера пептидів. Аналіз виконували на спектрофотометрі з розщепленим пучком, і температуру водяної бані встановлювали на 5°С. Циклофілін (загальна концентрація ферменту 7500пмоль/мг; Sigma) розчиняли до концентрації 20нМ у буфері (35мМ HEPES та 0,26мг/мл хімотрипсину (питома активність 50одиниць/мг), рН 7,8 за допомогою KОН) i інкубували протягом 6 хвилин при кімнатній температурі, а потім протягом 54 хвилин на водяній бані. CsA, [Melle]4-CsA або [DMeAla]3-[EtVal]4-CsA додавали відповідно до цих інкубацій, використовуючи діапазон концентрацій 2-50нМ. Потім до кювети зі зразком додавали 3,5мл інкубованого циклофіліну. Кювета порівняння містила пробу суміші, у якій реакція вже завершилася, для компенсації променя порівняння. Пептид додавали при концентрації 25мкм для ініціювання реакції, і зміну поглинання контролювали в 10 точках даних за секунду. Для контролю, 14 швидкості визначали також для паралельної реакції, у якій був відсутній циклофілін. Ці холості швидкості гідролізу пептиду (тобто, у відсутності циклофіліну) віднімали зі швидкостей у присутності циклофіліну А. Початкові швидкості реакції, одержані з аналізів PPIase слідових кількостей речовин на протязі часу, аналізували за допомогою регресійного аналізу першого порядку, використовуючи перетворення першого порядку, по зміні поглинання при 390нм. Загальну концентрацію ферменту (Et), константу дисоціації інгібітора (Ki) і константу швидкість-визначальної реакції розраховували за допомогою програмного забезпечення FigSyS (2003, Biosoft) шляхом апроксимації даних, одержаних з регресійного аналізу у рівнянні щільного зв'язування мультипротеїну інгібітора. Рівняння щільного зв'язування мультипротеїну інгібітора мало таку формулу: v=k*Et*P-k*(-b-sqrt(b*b-4*с))/2 де b визначають як b=-(Et*Ρ+І+Kf) і с визначається як с=Et*Ρ*I. Et, Ki та k розраховували на комп'ютері один раз для даного набору даних, потім будували графічне зображення даних, і лінія відповідала точкам, що припускають щільне зв'язування інгібітору з єдиним білком, визначуване такими рівняннями: v=k*Et*P-K*(-B-sqrt(В*В-4*С))/2 де В=Et*Ρ+І+К,таС=Et*Ρ*І. Таблиця 4 Ε, Ki і значення k циклофіліну А для CsA, [Melle]4-CsA та [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, визначені з аналізів активності PPIase Сполук CsA [Melle]4-CsA [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA Et (пмоль/мг) 7500 7500 7500 Найнижче значення Ki циклофіліну А, спостережуване для циклоспорину відповідно до винаходу, підтверджувало більшу потенційну можливість антивірусної активності, специфічності та індексу селективності (як згадано вище) у порівнянні з CsA та [Melle]4-CsA. Як не дивно, неімуносупресивний [D-MeAla]3- [EtVal]4-CsA показав майже в б разів більш високу спорідненість по відношенню до циклофіліну за цим прикладом у порівнянні з іншим неімуносупресивним циклоспорином [Melle]4-CsA. Вищеописаний експеримент показав, що [DMeAla]3-[EtVal]4-CsA є більш ефективним інгібітором реплікації HCV, ніж будь-який інший випробуваний циклоспорин. Ця підвищена анти-HCV активність співвідноситься з підвищеною циклофілінзв'язувальною активністю, [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. Кліренс реплікону HCV та "ребаунд" ефект (ефект скасування) Рецидив інфекції HCV є головною проблемою хвороби, особливо, при проведенні потенційно Ki (нМ) 9,79±1,37 2,11±0,32 0,34±0,12 K (с-1) 0,17±0,0069 0,17±0,0068 0,16±0,0074 ефективного лікування, наприклад, при застосуванні циклоспорину та/або інтерферону. Для того, щоб вивчити, чи відображена більш висока антиHCV активність циклоспорину відповідно до винаходу в порівнянні з CsA стосовно здатності сполук більш ефективно лікувати клітини, що продукують реплікон HCV від них, проводили аналіз клітин in vitro, оснований на присутності селективного препарату G418, для рекомбінантного продукованого реплікону. В аналізах використовували клітини Huh-9-13, клітини гепатоаденоми людини (Huh-7) [Lohmann et al., Science 285(5424), (1999), 110-113]. Клітини вирощували в стандартному повному середовищі DMEM без впливу G418. Клітини культивували в присутності CsA або [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA (обидва при концентрації 0,5 або 1мкг/мл) або залишали необробленими протягом 7 послідовних проходів. Виконували контрольний аналіз для того, щоб гарантувати, що відсутність селективної дії G418 не 15 впливає на вміст реплікону HCV протягом декількох проходів. Щоб підтвердити, що клітини Huh-913, які вже обробляли протягом 7 днів за допомогою [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, дійсно очистилися від їхнього реплікону, селекцію проб G418 (1000мкг/мл) повторно починали протягом ще 2 проходів. Тільки ті клітини, які усе ще несли реплікон HCV, були здатні розмножуватися в цих умовах, а клітини без реплікону гинули в присутності G418 протягом фази скасування. Реакцію RT-PCR виконували на екстрактах вірусного РНК зразків, відібраних у різних точках проходу. Прямими та зворотними використовуваними праймерами були 5'CCGGCTACCTGCCCATTC-3' та 5'CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3', відповідно. Флуорогенною пробою була сполука 5'ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3'. Як внутрішня контрольна проба використовувалася плазміда, що містить частину генної послідовності неоміцин фосфотрансферази. Результати аналізували та виражали як кількість реплікону РНК (нанограм) в 1000 клітин та використовували для побудови графіка. Результати цих експериментів (Фіг.3) показали кращий антивірусний ефект [D-MeAla]3-[EtVal]4CsA у порівнянні з CsA в цьому стандартному клітинному аналізі in vitro. Циклоспорин відповідно до винаходу несподівано показав віруцидний ефект, а не тільки вірустатичний ефект, як інший імуносупресивний CsA. Дійсно, коли оброблені за допомогою [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA клітини Huh-9-13 (кружки і квадратики на Фіг.3) знову культивували в присутності G418 (фаза скасування), культури гинули, на відміну від клітин, оброблених за допомогою CsA, (ромбики та трикутники). Обидві культури, оброблені за допомогою CsA для 7 послідовних проходів, були здатні розмножуватися в присутності G418. Це підтвердило, що [DMeAla]3-[EtVal]4-CsA є здатним виліковувати клітини Huh-9-13 від їхнього реплікону HCV. Комбінація ліків Інтерферон (IFN) є частиною загальновживаної терапії інфекції HCV. Ефект комбінації [DMeAla]3-[EtVal]4-CsA/IFN-a 2а оцінювали, використовуючи метод Prichard and Shipman [Antiviral Res, 1990, 14, 181-205]. Стисло, теоретичний адитивний ефект розраховується, виходячи з кривих "доза-відповідь" індивідуальних сполук за рівнянням формули: Z=X+Y(1-X) де X позначає інгібування, викликане одним лише [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, a Y представляє один IFN-a 2а. Ζ позначає ефект, викликаний комбінацією [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA з IFN-a 2а. Теоретичну сукупну поверхню віднімають із фактичної експериментальної поверхні, приводячи до горизонтальної поверхні, що відповідає нульовій площині; коли комбінація адитивна, поверхня, що находиться вище нульової площини, вказує на синергічний ефект комбінації, а поверхня нижче нульової площини вказує на антагонізм. Антивірусний аналіз виконували по суті як описано вище 88484 16 для клітин Huh 5-2, за винятком того, що сполуки додавали в шаховому порядку. Для кожної сполуки використовували три реплікаційні планшети, щоб виміряти криву "доза-відповідь" для кожної індивідуальної сполуки. Дані, одержані від всіх трьох планшетів, використовували для розрахунку теоретичної сукупної поверхні. Дослідження комбінації для кожної пари сполук також робили тричі. Дані аналізували на дисперсність за допомогою тесту ANOVA. Незначна синергічна активність була відзначена при найвищих використовуваних концентраціях IFN-a 2а, але в цілому об'єднану анти-HCV активність [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA з IFN-a 2а можна розглядати як адитивну (Фіг.4). Результати з [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA можуть бути підсумовані у такий спосіб: - [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA має більш високу анти-HCV активність та є менш цитотоксичним, ніж CsA, як показано в субгеномній системі реплікону HCV. - Це було підтверджено в клітинній культурі гепатоаденоми, інфікованій повнорозмірним інфекційним хімерним геном зі штамів HCV J6 та JFH1. - [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA здатний лікувати клітини від їхнього HCV реплікону більш ефективно, ніж CsA. - Ці ефекти пов'язані з більш вираженою спорідненістю до зв'язування циклофіліну. - Анти-HCV активність комбінації [D-MeAla]3[EtVal]4-CsA/IFN-a 2а є адитивною. [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA може застосовуватися для лікування пацієнтів, інфікованих HCV. Активна сполука може вводитися будь-яким звичайно використовуваним способом. Вона може вводитися парентерально, наприклад, у формі розчинів або суспензій для ін'єкції, або у формі осаджуваних сумішей для ін'єкції. Краще, вона буде застосовуватися перорально у формі розчинів або суспензій для пиття, таблеток або капсул. Фармацевтичні композиції для перорального введення, що включають циклоспорин відповідно до винаходу, описані в Прикладах. Приклади показують, що такі фармацевтичні композиції в характерному випадку включають циклоспорин відповідно до винаходу та одну чи більше фармацевтично прийнятних речовин-носіїв. Як правило, ці композиції є концентрованими і перед введенням повинні бути об'єднані з відповідним розріджувачем, наприклад, водою. Фармацевтичні композиції для парентерального введення в характерному випадку також включають один чи більше наповнювачів. Необов'язкові наповнювачі включають ізотонічний агент, буфер або інший рН-регулюючий агент, і консервант. Ці наповнювачі можуть бути додані для збереження композиції та для досягнення кращих діапазонів рН (приблизно 6,5-7,5) і осмотичних властивостей (приблизно 300мосм/л). Додаткові приклади композицій циклоспорину для орального застосування можуть бути знайдені в патентах США №5525590 та №5639724 і заявці на патент США №2003/0104992. Потрібне дозування циклоспорину відповідно до винаходу для перорального застосування від щоденного до трьох разів на тиждень може становити приблизно 17 від 1мг/кг до приблизно 100мг/кг, краще, приблизно від 1мг/кг до приблизно 20мг/кг. Для внутрішньовенного введення відповідне дозування може бути приблизно від 1мг/кг до приблизно 50мг/кг, краще, приблизно від 1мг/кг до приблизно 25мг/кг. Під ефективною кількістю циклоспорину відповідно до винаходу розуміють таку кількість, що при неодноразовому введенні пацієнту, який потребує лікування інфекції HCV, в ході терапевтичного режиму приводить до об'єктивної клінічної відповіді, такої як статистично суттєве зменшення титру HCV сироватки або суттєве зменшення активності ALT сироватки у пацієнта. Була проведена початкова фаза 1 клінічних випробувань, щоб визначити безпеку оральних доз [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA при прийомі усередину і визначити фармакокінетичний профіль та безпечний профіль лікарської речовини. Випробування показали, що дози від 50 до 1600мг в мікроемульсії у воді добре переносяться. Спостерігалися помірні та нетривалі побічні ефекти, включаючи нудоту, блювоту, біль у животі, помірні головні болі. Ці побічні ефекти не були пов'язані з дозою. Клініцистом мають бути враховані численні фактори при визначенні пробних доз для перевірки ефективності фармацевтичної композиції, що включає циклоспорин за даним винаходом, по відношенню до інфекції HCV. Первинними серед них є токсичність і період напіввиведення вибраного циклоспорину відповідно до винаходу. Додаткові фактори включають вагу пацієнта, вік пацієнта, загальний стан пацієнта (включаючи істотні системні або серйозні захворювання, включаючи декомпенсоване захворювання печінки, тяжке захворювання кісткового мозку, що існувало раніше, та інші вірусні інфекції), стадію інфекції HCV (гостру проти хронічної), на що вказують, наприклад, рівні аланінової амінотрансферази (ALT) сироватки, специфічний генотип HCV, попередню терапію інфекції HCV, прийом пацієнтом інших ліків тощо. Курс лікування звичайно вимагає повторного введення фармацевтичної композиції за винаходом. Як правило; адекватна доза препарату звичайно вводится 3-7 разів на тиждень, і тривалість лікування може складати приблизно від 4 тижнів до 6 місяців, краще, приблизно від 4 тижнів до приблизно 12 місяців. Лікування може супроводжуватися визначеннями HCV у сироватці та вимірюванням рівнів ALT сироватки. Кінцевою точкою лікування є вірологична відповідь, тобто, відсутність HCV наприкінці курсу лікування, через кілька місяців після початку лікування, або через кілька місяців після завершення лікування. HCV у сироватці може бути виміряний на рівні РНК такими способами, як кількісна RT-PCR чи нозерн-блотинг, або на рівні білка - імунологічним ферментним аналізом чи вдосконаленим хемілюмінесцентним імуноаналізом вірусних білків. Кінцева точка може також включати визначення рівня ALT сироватки в нормальному діапазоні. Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом може включати один чи більше інших компонентів, активних по відношенню до інфекції HCV, на додаток до циклоспорину за даним винаходом, таких як, наприклад, інша антивірусна лі 88484 18 карська речовина, наприклад, рибавірин, або інтерферон-альфа Циклоспорин за винаходом і такий інший активний компонент можуть вводитися разом як частина однієї й тієї ж фармацевтичної композиції, або можуть вводитися окремо як частина відповідної схеми прийому, розробленої для одержання переваг комбінованого лікування. Відповідна схема прийому, кількість кожної дози, що вводиться, і конкретні інтервали між прийомами кожного активного агента будуть залежати від конкретної комбінації використовуваних активних агентів, стану пацієнта, якого лікують, та інших факторів, обговорюваних у попередньому розділі. Такі додаткові активні компоненти в загальному випадку будуть вводитися в кількостях, менших або рівних тим, у яких вони є ефективними як окремі терапевтичні засоби. Схвалені Управлінням з контролю за продуктами та ліками США (FDA) дозування для таких активних засобів, що вже одержали схвалення FDA для застосування на людях, опубліковані та доступні фахівцям в даній області. Всі патенти, заявки на патенти та публікації, що цитуються в даній роботі, розглядаються як включені в даний опис шляхом посилання у всій їхній повноті. Винахід далі детально описаний за допомогою наступних прикладів. Приклади представлені в цілях ілюстрації фахівцю в даній області техніки, i не призначені для обмеження обсягу винаходу, як він описаний у формулі винаходу Таким чином, винахід не повинен розглядатися як обмежений представленими прикладами, але повинен розглядатися як такий, що охоплює будь-які та всі зміни, що є очевидними на основі представленого тут опису. Приклад 1 Синтез [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA [Переведено з докторської дисертації Jean Francois Guichou, озаглавленої "De nouveaux analogues de Cyclosporin A comme agent anti-HIV-1" («Нові аналоги циклоспорину як агенти проти ВІЛ1»), Faculte des Sciences, University of Lausanne, CH-1015 Lausanne, Швейцарія (2001)]. Синтез H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeuMeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe 4-Диметиламінопіридин (DMAP) (41,5ммоль; 5,8г) додавали до розчину циклоспорину (CsA) (8,3ммоль; 10г) в 100мл оцтового ангідриду. Розчин перемішували протягом 18год. при кімнатній температурі. Реакційну суміш потім розбавляли 600мл етилацетату і промивали двічі водою та чотири рази насиченим водним розчином бікарбонату натрію. Органічну фазу сушили над безводним Na2SO4, фільтрували і розчинник випаровували при зниженому тиску Одержаний жовтий залишок хроматографували на силікагелі (елюент дихлорметан/метанол 98:2) і перекристалізували з ефіру. Виділяли 9,5г MeBmt(OAc)-CsA у вигляді білого порошку з виходом 92%. Тетрафторборат триметилоксонію (22,5ммоль; 3,3г) додавали до розчину MeBmt(OAc)-CsA (7,5ммоль; 9,4г) в 60мл дихлорметану. Після 16год. витримування при кімнатній температурі додавали 35мл 0,26М розчину метилату натрію в метанолі. Через 1год. додавали 35мл метанолу та 19 35мл 2Н розчину сірчаної кислоти, і реакційну суміш перемішували протягом ще 15 хвилин, нейтралізували до рН 6,0 за допомогою насиченого розчину KНСО3 (28мл) i екстрагували двічі етилацетатом. Органічну фазу промивали 2 рази насиченим розчином NaCI, сушили над безводним Na2SO4 і фільтрували. Потім розчинник випаровували під зменшеним тиском. Залишок хроматографували на силікагелі (елюент: етилацетат/метанол 5:1). Одержували 7,3г H-MeLeu-ValMeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeValMeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (вихід: 76%). HPLC tr (час утримання)=268,23хв. (98%) ES/MS: m/z: 1277,5 [M+H+], 639,2 [M+2H+]. Синтез H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeuMeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe 4-Диметиламінопіридин (DMAP) (2,3ммоль; 334мг) і фенілізотіоціанат (6,9ммоль; 0,75мл) додавали до розчину H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-AlaMeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (4,6ммоль; 7г) в 4 мл тетрагідрофурану. Через 2год. розчинник випаровували, і неочищений продукт хроматографували на силікагелі (елюенти: метил-трет-бутиловий ефір (МТВЕ)/етилацетат 9:1 (1); МТВЕ/метанол 9:1 (2)). Одержували 5,8г PhNH-C(S)-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeuMeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (вихід 90%). 13,8мл трифтороцтової кислоти додавали до розчину останньої сполуки (4ммоль; 5,6г) в 290мл дихлорметану. Після 1год. реакції, суміш нейтралізовували, використовуючи KНСО3 і розбавляли 500мл дихлорметану. Органічну фазу промивали 2 рази насиченим розчином NaCI, сушили над безводним Na2SO4 і фільтрували. Потім випаровували розчинник при зниженому тиску. Залишок хроматографували на силікагелі (елюенти: МТВЕ/етилацетат 9Ί (1); МТВЕ/метанол 3:1 (2)). Одержували 2,8г H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeuMeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (вихід 61%). HPLC tr=25,80хв. (99%) ES/MS: m/z: 1050,5 [M+H+], 547,7 [M+2H+] Синтез Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-DAla-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMeCH2-CH2-OH Фторо-Ν,Ν,Ν'-тетраметилформамідиній гексафторофосфат (TFFH) (0,96ммоль; 0,25г) додавали в інертній атмосфері до розчину H-Val-MeLeu-AlaD-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-SarOMe (0,87ммоль; 1,00г), діізопропілетиламіну (2,78ммоль; 0,48мл) і Boc-D-MeAla-EtVal-OH (0,96ммоль; 0,32г) в 15мл дихлорметану. Через 15 хвилин дихлорметан випаровували, i залишок витягали етилацетатом. Органічну фазу промивали послідовно насиченим розчином NаНСО3, 10%-им розчином лимонної кислоти та насиченим розчином NaCI, а потім сушили над безводним Na2SO4 і концентрували. Хроматографія на силікагелі (у суміші етилацет/метанол 98:2) давала 1,14г (90%) Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeuMeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-ОМе. Останній продукт (0,64ммоль; 0,93г) розчиняли в 45мл безводного метанолу, і невеликими порціями з інтервалом в 15 хвилин протягом 3год. 30хв 88484 20 додавали боргідрид натрію (25,5ммоль; 0,96г). Через 4год. реакційну суміш охолоджували до 0°С, гідролізували додаванням 10%-ой лимонної кислоти та концентрували. Залишок витягали етилацетатом. Органічну фазу промивали 10%-им розчином лимонної кислоти та насиченим розчином NaCI, а потім сушили над безводним Na2SO4 і концентрували. Після хроматографії на силікагелі (у суміші етилацетат/метанол 95:5) одержували 0,63г (81%) Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-AlaMeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2CH2-OH. ES/MS: m/z: 1434,9 [M+H+], 717,9 [M+2H+]. Синтез H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-AlaMeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH Метансульфокислоту (3,18ммоль; 2,060мл) додавали до розчину Boc-D-MeAla-EtVal-ValMeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeValMeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-СН2-ОН (0,425ммоль; 610мг) в 42,5мл метанолу, і суміш нагрівали до 50°С та витримували при цій температурі. Хід реакції контролювали за допомогою HPLC і масспектрометрії. Через 80год. суміш охолоджували до 0°С і гідролізували додаванням 1М розчину NаНСО3. Метанол видаляли, і залишок витягали етилацетатом. Органічну фазу промивали 1М розчином NаНСО3 i потім насиченим розчином NaCI, сушили над безводним Na2SO4 і концентрували. Продукт (557мг), H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-AlaD-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-OCH2-CH2-NHMe, використовували на наступній стадії без очищення. Продукт (0,42ммоль; 557мг) розчиняли в 20мл метанолу та поєднували в інертній атмосфері з розчином метилату натрію (1,26ммоль) в 1,26мл метанолу Через 18год. при кімнатній температурі, реакційну суміш охолоджували до 0°С i додавали по краплях гідроксид натрію (4,2ммоль; 168мг) в 5мл води. Через 21год при кімнатній температурі реакційну суміш знову охолоджували до 0°С i нейтралізували 1М розчином KHSO4. Метанол видаляли, а залишок розчиняли в етилацетаті. Органічну фазу промивали напівнасиченим розчином NaCI, сушили над безводним Na2SO4 і концентрували. Продукт (335мг; 64%), H-D-MeAla-EtVal-ValMeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-AbuOH, використовували на наступній стадії без очищення. HPLC tr=26,27хв. (86%) ES/MS: m/z: 1235,5 [M+H+], 618,2 [M+2H+]. Синтез [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA В інертній атмосфері розчин H-D-MeAla-EtValVal-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmtAbu-OH (0,162ммоль, 200мг) і сим.-колідину (1,78ммоль, 0,24мл) в 50мл дихлорметану додавали по краплях до розчину (7-азабензотриазол-1ілокси)трипіролідинофосфоній гексафторфосфату (РуАОР, 0,486ммоль; 254мг) в 3,2л дихлорметану. Через 72год. реакційну суміш гідролізували додаванням 10% розчину Na2CO3. Дихлорметан випаровували, i залишок витягали етилацетатом. Органічну фазу промивали послідовно 0,1Н розчином НСІ i насиченим розчином NaCI, сушили над безводним Na2SO4 i концентрували. Неочищений 21 продукт очищали на силікагелі з утворенням 110мг (59%) [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. HPLC tr=30,54хв. (100%) ES/MS: m/z: 1217,6 [М+Н+], 609,3 [М+2Н+] Приклад 2 Композиції циклоспорину відповідно до винаходу для перорального застосування Кількості виражені в масових процентах. Приклад А: Циклоспорин за винаходом 10 Glycofurol 75 35,95 Miglycol 812 18 Cremophor RH40 35,95 Альфа-токоферол 0,1 Приклад Б: Циклоспорин за винаходом 10 Тетрагліколь 2 Captex 800 2 Nikkol HCO-40 85,9 Бутилгідрокситолуол (ВНТ) 0,1 88484 22 Приклад В: Циклоспорин за винаходом 10 Glycofurol 75 39,95 Miglycol 812 14 Cremophor RH40 36 Бутилгідроксіанізол (ВНА) 0,05-0,1 Приклад Г: Циклоспорин за винаходом 10 Тетрагліколь 10 Myritol 5 Cremophor RH40 74,9 Альфа-токоферол 0,1 Приклад Д: Циклоспорин за винаходом 10 Етанол 9 Пропіленгликоль 8 Cremophor RH40 41 Гліцерин монолінолеат 32 Індивідуальні компоненти композицій А-Г та способи одержання цих композицій описані в заявці на патент Великобританії №2222770. 23 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 88484 Підписне 24 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601