Гідролізат казеїну, спосіб його одержання та застосування

1. Гідролізат казеїну, що містить вільні амінокислоти й пептиди, одержаний гідролізом тваринного молочного казеїну до середньої довжини ланцюга не більше 2,1, вираженої кількістю амінокислотних залишків, в якому вказані пептиди містять неперетравлювані in vivo пептиди, що складаються із дипептидів, які мають послідовність Хаа-Pro, і трипептидів, що мають послідовність Хаа-Pro-Pro, і в якому вміст дипептидів, що мають послідовність Хаа-Рrо, становить не менше 5 % мас. від загальної кількості вільних амінокислот і пептидів у гідролізаті, і вміст трипептидів, що мають послідовність Хаа-Pro-Pro, становить не менше 1 % мас. від загальної кількості вільних амінокислот і пептидів у гідролізаті. 2. Застосування гідролізату казеїну за п. 1 для одержання харчової добавки. 3. Гідролізат казеїну за п. 1, в якому дипептиди, які мають послідовність Хаа-Pro, містять Ile-Pro, GluPro, Arg-Pro, Gln-Pro, Met-Pro і Tyr-Pro, і трипептиди, що мають послідовність Хаа-Pro-Pro, містять Ser-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro і Val-Pro-Pro. C2 2 (19) 1 3 89616 4 лікарських засобів, а також способу отримання утворенням не більше 5% вільних амінокислот. такого гідролізату казеїну і його застосування. Патентна публікація 2 розкриває функціональну Передумови винаходу їжу, що використовує продукти перетравлювання Повідомлялося про множину пептидів, що масоєвого білка, і способи її отримання. Продукти ють різноманітні функції, такі як гіпотензивний перетравлювання містять як активні інгредієнти ефект, антибактеріальна активність, кальційдипептид і трипептиди, які включають Ala-Туr, Glyрозчиняючий ефект та імуномодулюючий ефект, і Tyr-Tyr, Ala-Asp-Phe і Ser-Asp-Phe, отримані переці пептиди використовуються у харчових продуктравлюванням термоденатурованого соєвого білка тах і лікарських препаратах. із застосуванням таких ферментів як протеази, Наприклад, пропонуються гіпотензивні пептипохідні Aspergillus oryzae. Продукти перетравлюди, багато з яких мають активність по інгібуванню вання переважно мають середню довжину ланцюангіотензин-конвертуючого ферменту (тут нижче га пептиду від 2 до 4 і містять від 20 до 30% мас. позначений АСЕ). АСЕ конвертує попередник, анвільних амінокислот. гіотензин І, в ангіотензин II, що має судинозвужуюОднак дані ферментативні продукти перетрачу активність у живому організмі, підвищуючи при влювання соєвого білка мають компоненти, які цьому кров'яний тиск. Таким чином, передбачаповністю відрізняються від компонентів продуктів ється, що пептиди, які мають АСЕ-інгібуючу активферментативного перетравлювання тваринного ність, демонструють гіпотензивний ефект, пригнімолочного казеїну. Таким чином, вказані вище чуючи виробництво ангіотензину II за допомогою патентні публікації нічого не пропонують з приводу інгібування АСЕ у живому організмі. При розробці способів отримання з тваринного молочного казеїгіпотензивних пептидів, дослідження зазвичай нану як вихідного матеріалу продуктів перетравлюправлені, у першу чергу, на пептиди, які мають вання казеїну та гідролізату казеїну, які мають виАСЕ-інгібуючу активність, так що ознакою гіпотенсоку концентрацію активних інгредієнтів і чудову зивної дії пептидів, що пропонуються, є, головним абсорбційну здатність у живому організмі і можуть чином, АСЕ-інгібуючий ефект як показник. До давикористовуватися без необхідної складної обробного часу запропоновано і застосовується для ки, такої як концентрування, очищення і виділення. профілактики та лікування гіпертонії велика кільЗ іншого боку, патентні публікації 3 і 4 пропокість агентів, що надають гіпотензивну дію та оцінують способи отримання пептидів, що мають різні нених за їх АСЕ-інгібуючою активністю як показнифункції, перетравлюванням тваринного молочного ком. казеїну з використанням ферментів, таких як проПри отриманні функціональних пептидів, таких теази та пептидази, і конкретних функціональних як пептиди, які надають гіпотензивну дію, що оціпептидів, які отримуються даними способами. нюється за АСЕ-інгібуючим ефектом, зокрема, при Однак розкриті у даних публікаціях продукти отриманні функціональних пептидів за допомогою ферментативного перетравлювання призначені перетравлювання харчового білка ферментами, для отримання конкретних пептидів як активних після ферментативного перетравлювання зазвиінгредієнтів. Відповідно, у даних публікаціях відсучай потрібні складні стадії, наприклад, концентрутні вказівки відносно гідролізу тваринного молочвання, очищення і виділення перетравлених проного казеїну до середньої довжини ланцюга не дуктів для кращого прояву функціональних більше 2,1, конкретного способу гідролізу та ефекефектів. тивності гідролізату казеїну, який має конкретну Очікується, що як пептиди, які абсорбуються у середню довжину ланцюга. кров у травному тракті, проявляючи свої функції у Патентна публікація 1: JP-5-252979-A живому організмі, корисні in vivo пептиди, які не Патентна публікація 2: JP-2003-210138-A перетравлюються, що мають високу абсорбційну Патентна публікація 3: JP-6-128287-A здатність і стійкість до перетравлювання відносно Патентна публікація 4: JP-2001-136995-A різних травних ферментів у живому організмі. ОдКороткий опис винаходу нак точно відомо, які пептиди сприяють підвищенМетою даного винаходу є забезпечення гідроню in vivo стійкості до перетравлювання. Таким лізату казеїну, що містить in vivo пептиди, які не чином, потрібна розробка продуктів ферментативперетравлюються, і вільні амінокислоти, що має ного перетравлювання для харчових або лікарсьмінімальну in vivo ферментну перетравлюваність і, ких препаратів і способів отримання таких продукяк очікується, виявляє функції, наприклад, гіпотентів, які мають високу in vivo стійкість до зивний ефект у живому організмі. перетравлювання і можуть ефективно виявляти Іншою метою даного винаходу є забезпечення свої бажані функції, не зазнаючи складних спососпособу отримання вказаного вище гідролізату бів обробки, таких як концентрування, очищення казеїну, який дозволяє легко і ефективно отримуабо виділення після ферментативного перетраввати вказаний вище гідролізат казеїну без необлювання. хідності включення складних процесів. Наприклад, патентна публікація 1 розкриває Ще однією метою даного винаходу є забезпеспосіб отримання суміші низькомолекулярних пепчення агента, що має АСЕ-інгібуючу активність або тидів, що складається, головним чином, з дипепгіпотензивний ефект, який містить in vivo пептиди, тидів і трипептидів, які мають середню довжину що не перетравлюються, і вільні амінокислоти, ланцюга не більше 3 і чудову кишкову абсорбційну надає, як очікується, чудову гіпотензивну дію в здатність. Суміш пептидів готують з соєвого білка живому організмі і застосовний для різних функціпри одночасній або послідовній дії двох або більональних харчових продуктів або лікарських преше ферментів, які мають ендопротеазну активність паратів. і по суті не маючих екзопротеазну активність, з 5 89616 6 Заявники даного винаходу провели інтенсивні ктів або лікарських препаратів, що має АСЕдослідження для досягнення вказаних вище цілей, інгібуючу активність або гіпотензивний ефект. виявивши, що при гідролізі тваринного молочного Гідролізат казеїну за даним винаходом містить казеїну до середньої довжини ланцюга не більше вільні амінокислоти і низькомолекулярні пептиди, 2,1, вираженої кількістю амінокислотних залишків, такі як in vivo пептиди, що не перетравлюються, які можна отримати гідролізат казеїну, що містить отримуються гідролізом тваринного молочного вільні амінокислоти і низькомолекулярні пептиди, казеїну до середньої довжини ланцюга не більше наприклад, трипептиди і дипептиди, в якому ефек2,1, вираженої кількістю амінокислотних залишків. тивно утворюються вільні амінокислоти та молеТаким чином, очікується, що даний гідролізат казекули in vivo пептидів, що не перетравлюються, які їну при пероральному прийомі виявляє чудову in мають залишок Pro. vivo абсорбційну здатність і різні функції у живому Заявники даного винаходу також виявили, що організмі і застосовний для різних функціональних in vivo пептиди, що не перетравлюються, які мають харчових продуктів, лікарських препаратів і харчозалишок Pro на карбоксильному кінці, мають, як вих домішок. Наприклад, даний гідролізат казеїну очікувалося, високу стійкість до перетравлювання передбачається для використання в агенті, що має відносно in vivo пептидаз, так що цілком ймовірно АСЕ-інгібуючу активність або гіпотензивний ефект, для таких пептидів, що не перетравлюються, повякий містить даний гідролізат як активний інгредіністю виявляти свої функції в живому організмі, і єнт. що гідролізат казеїну має високий вміст пептидів з Даний спосіб включає стадію (А) гідролізу твахорошою in vivo абсорбційною здатністю, таких як ринного молочного казеїну до середньої довжини дипептиди і трипептиди, так що гідролізат казеїну ланцюга не більше 2,1 із застосуванням групи фездатний повністю проявляти різні функції, наприрментів, здатних перетравлювати тваринний моклад, гіпотензивний ефект, у живому організмі, лочний казеїн у гідролізат казеїну із середньою здійснюючи, таким чином, даний винахід. довжиною ланцюга не більше 2,1, вираженою кільКрім того, заявники даного винаходу виконали кістю амінокислотних залишків. Отже, спосіб допудослідження по пошуку ферментів, які ефективно скає легке і ефективне отримання гідролізату казепродукують гідролізат казеїну за даним винахоїну за даним винаходом. Таким чином, даний дом, серед різних відомих ферментів, виявивши, спосіб корисний у промисловому виробництві гідщо конкретний клас ферментів здатний з високою ролізату казеїну за даним винаходом. мірою ефективності продукувати гідролізат казеїну Короткий опис креслень за даним винаходом. На фіг. 1 представлений графік, що показує Згідно з даним винаходом запропонований гірезультати оцінки in vivo абсорбційної здатності і дролізат казеїну, що містить вільні амінокислоти і стійкості до перетравлювання Хаа-Рrо і Хаа-Рrопептиди, отриманий гідролізом тваринного молочРrо, виконаної у прикладі 1. ного казеїну і такий, що має середню довжину лаНа фіг.2 представлений графік, що показує ренцюга не більше 2,1, виражену кількістю амінокисзультати експерименту по визначенню гіпотензивлотних залишків. Більш конкретно, даний винахід ного ефекту порошків гідролізату казеїну, який стосується вказаного вище гідролізату казеїну, в залежить від дози, отриманих у прикладі 1. якому пептиди містять in vivo пептиди, що не переНа фіг.3 представлений графік, що показує травлюються, які складаються з дипептидів, що співвідношення між схемою елюювання зв'язаного мають послідовність Хаа-Рrо, і трипептидів, які білка з лінійним градієнтом від 0 до 0,6 Μ NaCl та мають послідовність Хаа-Pro-Pro, і в якому вміст протеолітичною активністю в прикладі аналізу 1. дипептидів, що мають послідовність Хаа-Рrо, не На фіг.4 представлений графік, що показує нижче 5% мас. від загальної кількості пептидів і співвідношення між часом перетравлювання казевільних амінокислот у гідролізаті і вміст трипептиїну з використанням групи ферментів і АСЕдів, що мають послідовність Хаа-Рrо-Рrо, не нижче інгібуючою активністю гідролізату казеїну, отрима1% мас. від загальної кількості пептидів і вільних ного у прикладі 3. амінокислот у гідролізаті. Позначення Хаа, що виНа фіг. 5 представлений графік, що показує користовується тут, може являти собою будь-яку співвідношення між середньою довжиною ланцюга амінокислоту. і АСЕ-інгібуючою активністю гідролізату казеїну, Згідно з даним винаходом запропонований таотриманого гідролізом казеїну з використанням кож вказаний вище спосіб отримання гідролізату групи ферментів у прикладі 3. казеїну, що включає стадію (А) гідролізу тваринноПереважні варіанти винаходу го молочного казеїну до середньої довжини ланТепер даний винахід буде пояснений детальцюга не більше 2,1 за допомогою групи ферментів, но. Гідролізат казеїну за даним винаходом містить здатних перетравлювати тваринний молочний вільні амінокислоти і пептиди, отримані гідролізом казеїн у гідролізат казеїну, що має середню довтваринного молочного казеїну до певного діапазожину ланцюга не більше 2,1, виражену кількістю ну величин середньої довжини ланцюга, виражеамінокислотних залишків. ної кількістю амінокислотних залишків. Кількість Згідно з даним винаходом, запропонований вільних амінокислот і пептидів переважно складає також агент, що має АСЕ-інгібуючу активність або не менше 80% мас, більш переважно від 80 до гіпотензивний ефект, який містить вказаний вище 90% мас. від загальної кількості гідролізату казеїгідролізат казеїну як активний інгредієнт. ну. Згідно з даним винаходом запропоновано таОсобливо переважно, щоб гідролізат мав точкож застосування вказаного вище гідролізату казений вміст in vivo пептидів, що не перетравлюютьїну у виробництві функціональних харчових продуся, наприклад, пептидів, які складаються з дипеп 7 89616 8 тидів, що мають послідовність Хаа-Рrо, і трипепність і гіпотензивну дію, якщо містить такі дипептитидів, що мають послідовність Хаа-Рrо-Рrо. Пепди і трипептиди. тиди можуть являти собою солі пептидів. Гідролізат казеїну за даним винаходом, крім Для цілей даного винаходу середню довжину пептидів, містить вільні амінокислоти. Вміст вільланцюга можна виразити як співвідношення заганих амінокислот зазвичай складає від 35 до 50% льної кількості молей пептидів і вільних амінокисмас, переважно від 40 до 45% мас. від загальної лот, що генерується гідролізом тваринного молочкількості пептидів і вільних амінокислот у гідроліного казеїну, по відношенню до кількості молей заті. усіх амінокислот у кислотному гідролізаті казеїну Гідролізат казеїну за даним винаходом крім тієї самої маси. Тут кислотний гідролізат казеїну пептидів і вільних амінокислот може необов'язково отримують перетравлюванням казеїнового білка містити, наприклад, ліпід, золу, вуглевод, харчові до окремих амінокислот. волокна і воду, які зазвичай містяться у тваринноСередню довжину ланцюга можна визначити, му молочному казеїні, що є у продажу в кількості наприклад, оцінюючи молярні концентрації аміногприблизно від 10 до 20% мас. Деякі або всі дані руп у гідролізатах методом ΟΡΑ, використовуючи інгредієнти можна видалити, якщо потрібно. реагент ΟΡΑ (орто-фталальдегід), який забарвлюГідролізат казеїну за даним винаходом можна, ється при взаємодії з аміногрупами, і виразити наприклад, отримати способом за даним винахонаступним чином: дом, що включає стадію (А) гідролізу тваринного середня довжина ланцюга = (кількість молей молочного казеїну до середньої довжини ланцюга аміногруп у кислотному гідролізаті казеїне більше 2,1 з використанням групи ферментів, ну)/(кількість молей аміногруп у ферментативному здатних перетравлювати тваринний молочний гідролізаті казеїну). казеїн у гідролізат, що має середню довжину ланВираз «in vivo пептиди, що не перетравлюютьцюга не більше 2,1, виражену кількістю амінокисся», який використовується тут, означає дипептилотних залишків. ди Хаа-Рrо і трипептиди Хаа-Рrо-Рrо, які мають Pro Тваринний молочний казеїн є білком з високим на карбоксильному кінці, що мають високу стійвмістом Pro і встановленою безпекою для застокість до перетравлювання відносно in vivo пептисування в харчових і подібних продуктах і може даз при абсорбції у кишечнику в живому організмі. являти собою, наприклад, казеїн з коров'ячого Згідно з даним винаходом середня довжина молока, кінського молока, козячого молока і овечоланцюга гідролізату, отриманого гідролізом тваго молока, причому переважний коров'ячий молоринного молочного казеїну, складає не більше 2,1, чний казеїн. переважно від 1,1 до 2,1, більш переважно від 1,3 Концентрація казеїну в тваринному молочному до 2,1, виражена кількістю амінокислотних залишказеїні, який гідролізується, не має особливих обків. При середній довжині ланцюга більше 2,1 межень і для ефективного отримання гідролізату вміст бажаних дипептидів і трипептидів, а також за даним винаходом переважно може складати від вільних амінокислот є низьким, і, отже, низьким є 3 до 19% мас. вміст бажаних in vivo пептидів, що не перетравГрупа ферментів, що використовуються в сполюються, які абсорбуються і in vivo. собі за даним винаходом, може бути будь-якою Вміст дипептидів, що мають послідовність групою ферментів, в якій ферменти здатні перетХаа-Рrо, у гідролізаті казеїну за даним винаходом равлювати тваринний молочний казеїн у гідролізазвичай складає не менше 5% мас, переважно зат, що має середню довжину ланцюга не більше від 5 до 25% мас. від загальної кількості пептидів і 2,1, виражену кількістю амінокислотних залишків, вільних амінокислот у гідролізаті. При вмісті менш вибрані і комбіновані придатним чином. Напринеобхідних 5% in vivo абсорбційна здатність зниклад, можна переважно використовувати групу жується, і прояв функцій є недостатнім. ферментів (X), що включає пептидази, здатні розВміст трипептидів, що мають послідовність щеплювати пептидний зв'язок Pro-Хаа на карбокХаа-Рrо-Рrо, у гідролізаті казеїну за даним винахосильному кінці Xaa-Pro-Хаа або Хаа-Рrо-Рrо-Хаа. дом зазвичай складає не менше 1% мас, переваГрупа ферментів (X) може переважно містити жно від 1 до 5% мас. від загальної кількості пептисеринпротеїнази, що мають серин в активному дів і вільних амінокислот у гідролізаті. При вмісті центрі, або металопротеїнази, які мають метал в менш необхідного 1% мас. in vivo абсорбційна активному центрі. Металопротеїнази можуть являздатність знижується, і прояв функцій є недостатти собою нейтральну протеазу І, нейтральну пронім. теазу II або леицинамінопептидазу. ВикористовуУ казеїновому гідролізаті за даним винаходом ючи, щонайменше, одну з даних металопротеїназ, Хаа у дипептидах, що мають послідовність Хааможна ефективно отримати цільовий гідролізат за Рrо, і в трипептидах, що мають послідовність Хаакороткий час і навіть при одностадійній взаємодії, Рrо - Рrо, може бути будь-якою амінокислотою. що переважно. Пептидази, здатні розщеплювати Гідролізат казеїну за даним винаходом може пептидний зв'язок Pro-Хаа, можуть переважно явпереважно містити He-Pro, Glu- Рrо, Arg-Pro, Ginляти собою ферменти, які мають ізоелектричні Pro, Met-Pro і Tyr-Pro як дипептидів, що мають поточки в кислій ділянці. слідовність Хаа- Рrо, і Ser-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro і ValГрупа ферментів або група ферментів (X) моPro-Pro як трипептидів, які мають послідовність же являти собою, наприклад, групу позаклітинних Хаа- Рrо - Рrо. ферментів, похідних koji, наприклад, Aspergillus Гідролізат казеїну за даним винаходом особoryzae. Така група позаклітинних ферментів може ливо ефективно демонструє АСЕ-інгібуючу активявляти собою групу, отриману культивуванням клітинного тіла у придатному середовищі та екст 9 89616 10 ракцією водою ферментів, що продукуються позащення універсальності гідролізату казеїну за даклітинно. Особливо переважною є група позакліним винаходом реакційну рідину можна переважно тинних ферментів, похідних Aspergillus oryzae і концентрувати і висушити до порошків. таких, що мають ізоелектричні точки в кислій діляТакі порошки можна використовувати як різні нці. функціональні харчові продукти, домішки для них, Група позаклітинних ферментів, похідних лікарські препарати та їх активні інгредієнти. ПоAspergillus oryzae, може являти собою комерційрошки можна необов'язково змішати з різними ний продукт, наприклад, SUMIZYME FP, LP або допоміжними домішками для поліпшення поживноМР (всі зареєстровані торгові марки виробництва го балансу або смаку. Приклади таких допоміжних SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.), UMAMIZYME домішок можуть включати різні вуглеводи, ліпіди, (зареєстрована торгова марка виробництва вітаміни, мінерали, підсолоджуючі речовини, смаAMANO ENZYME, INC.), Sternzyme В11024 і кові агенти, пігменти та агенти для поліпшення PROHIDROXY AMPL (обидві торгові марки виробтекстури. ництва HIGUCHI INC.), ORIENTASE ONS (зареєстПорошки, що містять гідролізат казеїну за дарована торгова марка виробництва HANKYU ним винаходом, можна використовувати, додаючи, BIOINDUSTRY CO.) і DENAZYME АР (зареєстронаприклад, до напоїв, йогурту, рідких харчових вана торгова марка виробництва NAGASE продуктів, желе, цукерок, стерилізованих в автокSEIKAGAKU), причому особливо переважний лаві (retort) харчових продуктів, таблетованих соSUMIZYME FP (зареєстрована торгова марка вилодощів, печива, бісквітів, хлібу, сухого печива, робництва SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.). шоколаду і подібному, або готуючи препарати у Такі ферменти, що є у продажу, зазвичай мавигляді капсул, таблеток і подібного. ють специфічні оптимальні умови. Умови, наприОскільки гідролізат казеїну за даним винахоклад, кількість ферментів, які використовуються, і дом можна використовувати вказаним вище спочас взаємодії можна відповідним чином відрегусобом, даний гідролізат можна ефективно застолювати в залежності від групи ферментів, що висовувати у виробництві функціональних харчових користовуються, таким чином, щоб можна було продуктів, таких як різні ізотонічні напої, звичайні отримати гідролізат казеїну за даним винаходом. напої, звичайні харчові продукти, харчові домішки, Для гідролізу можна, наприклад, додати групу поживні функціональні харчові продукти, що приферментів до водного розчину тваринного молочносять вкладену у них користь для здоров'я, або у ного казеїну при масовому співвідношенні група виробництві лікарських препаратів. ферментів/тваринний молочний казеїн не нижче У прикладах, що обговорюються далі, встано1/1000, переважно від 1/10 до 1/1000, більш перевлено, що гідролізат казеїну за даним винаходом важно від 1/10 до 1/100, найбільш переважно від має АСЕ-інгібуючу активність і гіпотензивний 1/10 до 1/40. ефект, так що даний гідролізат можна використоУмови реакції можна вибрати відповідним чивувати, наприклад, як агент для виробництва фунном в залежності від групи ферментів, що викорикціональних харчових продуктів, що мають таку стовуються, таким чином, щоб отримати цільовий активність і ефект, або як агент для виробництва гідролізат казеїну. Зазвичай можна здійснювати лікарських препаратів. взаємодію при температурі від 25 до 60°С, переЯкщо гідролізат казеїну за даним винаходом важно від 45 до 55°С, рН від 3 до 10, переважно використовують як агент, що має АСЕ-інгібуючу від 5 до 9, більш переважно від 5 до 8. Час ферактивність або гіпотензивний ефект, переважна ментативної взаємодії зазвичай складає від 2 до доза даного агента для перорального введення 48 годин, переважно від 7 до 15 годин. людині зазвичай така, що допускає прийом від 0,1 Ферментативну взаємодію можна припинити, до 100 мг/кг, переважно від 1 до 20 мг/кг пептидів і інактивуючи ферменти. Як правило, для припивільних амінокислот у гідролізаті казеїну на ввенення взаємодії інактивують ферменти при темпедення. Таким чином, кількість гідролізату казеїну ратурі від 60 доП0°С. за даним винаходом або агента, що має АСЕПісля припинення ферментативної взаємодії інгібуючу активність або гіпотензивний ефект, якотриманий осад можна переважно видалити що його використовують при додаванні у різні нацентрифугуванням або за допомогою різних фільпої, харчові продукти або лікарські препарати, мотрів за бажанням. жна вибрати відповідним чином, беручи до уваги Крім того, з отриманого гідролізату можна вивказане вище дозування. далити пептиди, які мають гіркий смак або запах, Згідно зі способом за даним винаходом гідрощо можна здійснити, застосовуючи активоване лізом тваринного молочного казеїну при одноставугілля, гідрофобну смолу або подібне. Напридійній взаємодії з групою ферментів, що включає клад, можна додати до гідролізату від 1 до 20% вказану вище групу ферментів (X), можна отримамас. активованого вугілля відносно кількості казеїти Хаа-Pro-Pro, яка міститься в тваринному молону, що використовується, і провести взаємодію чному казеїні, зокрема, Ilе-Рrо-Рrо і/або Val-Proпротягом 1-10 годин для видалення таких гірких і Pro, різні функції яких, включаючи гіпотензивну і таких компонентів, які пахнуть. Використане актиантистресову дію, встановлені, з високим виходом, воване вугілля можна видалити звичайним способлизьким до теоретичного отримання, наприклад, бом, наприклад, центрифугуванням або мембранне нижче 60%, переважно не нижче 70% у порівним фільтруванням. нянні з традиційними способами. Отже, даний споРеакційну рідину, яка містить гідролізат казеїсіб є не тільки способом отримання гідролізату ну, отриману на стадії (А), можна додати, як є, до казеїну за даним винаходом, але також ефективрідких продуктів, наприклад, напоїв. Для підвиним способом виробництва перетравлених проду 11 89616 12 ктів, що містять значну кількість цільового Хаа-Рrоному розчиннику при придатній концентрації і Рrо, або очищених продуктів з тваринного молочцентрифугували при 15000 об/хв протягом 10 хв. ного казеїну або харчового білка, що має високий Відбирали 50 мкл супернатанту. Потім додавали 1 вміст Хаа-Рrо-Рrо. мл отриманого вище реагенту ΟΡΑ, ретельно пеПРИКЛАДИ ремішували і залишали при кімнатній температурі Тепер даний винахід буде пояснений більш на 5 хв. Вимірювали поглинання при 340 нм, викоконкретно з посиланням на приклади, приклад ристовуючи абсорбціометр (торгова марка Ubestаналізу і порівняльні приклади, які є тільки ілюст35 виробництва JASCO CORPORATION). ративними і не призначені для обмеження даного Отримували 1 % кислотний гідролізат казеїну, винаходу. розбавлений належним чином, і проводили на Приклад 1 і порівняльні приклади з 1 по 8 ньому аналогічні вимірювання, отримуючи калібДодавали 1 г казеїну з коров'ячого молока (вировочну криву, з якої визначали співвідношення робництва NIPPON NZMP) до 99 г дистильованої поглинання і молярної концентрації. Середню доводи приблизно при 80°С і ретельно перемішувавжину ланцюга розраховували згідно з наступною ли. До суміші додавали 1N розчин гідроксиду наформулою: трію (виробництва WAKO PURE CHEMICAL середня довжина ланцюга = (молярна конценINDUSTRIES, LTD.), доводячи рН до 7,0. Для трація 1 % кислотного гідролізату казеїотримання розчину субстрату доводили темперану)/(молярна концентрація кожного зразка 1% фетуру до 20°С. рментативного гідролізату казеїну). До отриманого таким чином розчину субстрату додавали кожний з різноманітних ферментів, показаних у таблиці 1, таким чином, щоб масове співвідношення фермент/казеїн складало 1/25. Здійснювали взаємодію суміші при 50°С протягом 14 годин і потім піддавали її автоклавній обробці при 110°С протягом 10 хв для інактивації ферментів, отримуючи при цьому розчин продуктів ферментативного перетравлювання казеїну. Отриманий розчин продуктів ферментативного перетравлювання сушили розпиленням, отримуючи порошки. Проводили аналіз інгредієнтів отриманих таким чином порошків. Білок визначали методом Kjeldahl і амінокислоти за допомогою амінокислотного аналізатора. Кількість, отримана відніманням кількості амінокислот з кількості білка, приймали за кількість пептидів. Далі визначали кількість ліпідів способом із застосуванням кислотного гідролізу, золу прямим спалюванням і воду способом з використанням сушильної шафи. Кількість кожного інгредієнта віднімали з 100%, підсумок приймали за кількість вуглеводів. У результаті визначено, що порошки містять 35,8% мас. амінокислот, 45,7% мас. пептидів, 6,6% мас. води, 0,2% мас. ліпідів, 4,1% мас. золи і 7,6% мас. вуглеводів. Визначення середньої довжини ланцюга Визначення амінокислот, що складають пепСередню довжину ланцюга амінокислот і пептиди тидів, які містяться в отриманих порошках, встаноПорошки, отримані у прикладі 1, розчиняли у влювали, визначаючи кількість молей, що викорипридатній кількості дистильованої води і аналізустовують реагент ΟΡΑ, який взаємодіє з вали, використовуючи автоматичний аналізатор аміногрупами вільних амінокислот і пептидів у попептидів (торгова марка PPSQ-10 виробництва рошках, аналогічно визначаючи кількість молей SHIMADZU CORPORATION) для визначення амікислотного гідролізату казеїну, і оцінюючи співвіднокислотних залишків від N-кінця в порошках. Реношення цих двох величин. Результати показані в зультати показані у таблиці 2. До речі, автоматичтаблиці 1. ний аналізатор пептидів не детектує вільні Розчиняли 40 мг орто-фталальдегіду (гаранамінокислоти. Загальна кількість п'ятих амінокистований реагент для флуоресцентного аналізу, що лотних залишків становила 120 пмоль, і загальна проводиться NACALAI TESQUE, INC.) в 1 мл мекількість шостих амінокислот залишків становила танолу і додавали 100 мкл β-меркаптоетанолу. 100 пмоль. З даних результатів виявлено, що біРозчин орто-фталальдегіду розводили до 25 мл, льшість пептидів, які містяться в порошках, являвикористовуючи 25 мл 100 мМ розчину тетраборають собою дипептиди і трипептиди. Виявлено тату натрію, заздалегідь змішаного з 2,5 мл 20% докож, що процент пептидів, які мають Pro як другий децилнатрійсульфату, і потім до 50 мл дистильозалишок, становить 49,5%, що дуже багато, і прованою водою, отримуючи реагент ΟΡΑ. цент пептидів, які мають Pro як третій залишок, Кожний зразок порошку 1% ферментативного становить 29,8%, що також багато. гідролізату казеїну, отриманий взаємодією з кожТаким чином, очікується, що порошки містять ним ферментом (таблиця 1) розчиняли у придатзначну кількість Хаа-Рrо і Хаа-Рrо-Рrо, які мають 13 89616 14 високу стійкість до ферментативного перетравлювведення способом накладення манжети на хвіст вання in vivo протеазою, так що дані пептиди є за допомогою Tail-cuff PB-98 (виробництва оптимальними для використання як функціональні SOFTRON), оцінюючи зміну кров'яного тиску. Як пептиди. контроль замість порошків вводили казеїн і проводили таку саму оцінку. Перед вимірюванням кров'яного тиску щурів нагрівали у заздалегідь нагрітій камері (виробництва CSI JAPAN) при 45°С протягом 8 хв. Результати показані в таблиці 3. З таблиці 3 виявлено, що при використанні казеїну як контроля не спостерігали зміни кров'яного тиску, тоді як при введенні порошків прикладу 1 спостерігали гіпотензивну дію. З іншого боку, не спостерігали зміни кров'яного тиску при використанні порошків порівняльних прикладів. Таким чином, показано, що гідролізат казеїну прикладу 1, що містить конкретну кількість Хаа-Рrо і Xaa-ProPro і має середню довжину ланцюга не більше 2,1, надає чудову гіпотензивну дію. Крім того, згідно з описаним вище способом, гіпотензивну дію, що залежить від дози, досліджували, використовуючи порошки гідролізату казеїну, отримані у прикладі 1. Результати показані в таблиці 4 і на фіг.2. Оцінка АСЕ-інгібуючої активності АСЕ з бичачої легені (виробництва WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) розчиняли в 0,1М боратному буфері при рН 8,3 у кількості 0,1 Од., отримуючи розчин АСЕ. Вносили в пробірку 80 мкл розбавленого розчину ферментативного гідролізату, отриманого 50-разовим розбавленням порошків кожного представленого в таблиці 1 феОцінка абсорбційної здатності та стійкості до рментативного гідролізату дистильованою водою, перетравлювання Хаа-Pro-Рrо у живому організмі 200 мкл 5 мМ розчини гіпурил-гістидил-лейцин Для оцінки абсорбційної здатності і стійкості до (виробництва SIGMA) і 20 мкл отриманого вище перетравлювання в живому організмі пептидів, що розчину АСЕ і проводили взаємодію при 37°С промають послідовність Хаа-Рrо або Хаа-Pro-Pro і тягом 30 хв. Потім взаємодію припиняли, додаючи містяться в порошках ферментативного гідроліза250 мкл IN соляної кислоти. Потім додавали 1,7 мл ту казеїну, отриманого в прикладі 1 і показаного в етилацетату і перемішували. Відбирали 1,4 мл таблиці 1, досліджували на щурах абсорбцію пепетилацетатного шару, помішували в іншу пробірку тидів у кров після перорального введення таким і випарювали при 120°С протягом приблизно 60 чином. хв, отримуючи висушений продукт. Висушений Двом двотижневим щурам SD (Sprague продукт розчиняли в 1 мл дистильованої води і Dawley) вводили перорально 500 мг/тварину кожвизначали поглинання екстрагованої етилацетаного з Val-Pro-Pro, наприклад, Xaa-Pro-Pro і Glyтом гіпурової кислоти при 228 нм. Як контролі виGly як дипептиду, що не має Pro. Відбирали зразки значали поглинання розчину без розбавленого крові з воротної вени з інтервалами і визначали розчину ферментативного гідролізату і розчину абсорбцію кожного пептиду в кров. Результати без розбавленого розчину ферментативного гідпоказані на фіг. 1. ролізату і розчину АСЕ. З отриманого поглинання Фіг.1 підтверджує, що Gly-Gly легко перетраврозраховували АСЕ-інгубуючу активність згідно з люється in vivo, так що детектується Gly, тоді як наступною формулою. Результати показані в табVal-Pro-Pro вбирається в кров відносно стабільно. лиці 3. На основі даних результатів очікується, що дипепАСЕ-інгібуюча активність (%) = [(Α-Β)/Α]x100 тиди і трипептиди, які мають послідовності Хаа-Рrо А: (поглинання розчину без розбавленого розі Xaa-Pro-Pro, відповідно, демонструють високу чину ферментативного гідролізату, але з розчином абсорбційну здатність і стійкість до перетравлюАСЕ) - (поглинання розчину без розбавленого розвання в живому організмі. чину ферментативного гідролізату і розчину АСЕ) Оцінка гіпотензивного ефекту В: (поглинання розчину з розбавленим розчиКожний з порошків гідролізату казеїну, отрином ферментативного гідролізату і розчином і маних у прикладі і порівняльних прикладах, покаАСЕ) - (поглинання розчину з розбавленим розчизаному в таблиці 1, вводили перорально п'яти 27ном ферментативного гідролізату, але без розчину тижневим спонтанно гіпертензивним щурам (SHR) АСЕ) (самцям) при дозі 32 мг/кг маси тіла. Вимірювали кров'яний тиск до введення і через 5 годин після 15 Визначення пептидів у ферментативному гідролізаті Порошки ферментативного гідролізату прикладу 1, представленого в таблиці 1, розчиняли в дистильованій воді при концентрації 10 мг/мл. З іншого боку, готують розчини 25 мкг/мл, 50 мкг/мл і 100 мкг/мл кожного хімічно синтезованого стандартного пептиду, що має послідовність, показану в таблиці 5. Данні розчини аналізували способом РХ/МС у вказаних нижче умовах. Серед піків, показаних при аналізі розчинів порошків, ідентифіковані піки, що відповідають молекулярній масі і часам утримування, які є ідентичними відповідним величинам стандартних пептидів, які представляють ті самі послідовності, що і стандартні пептиди. Піки розчину порошку порівнювали з піками стандартних пептидів, визначаючи вміст кожного представленого в таблиці 4 пептиду в розчині порошку. Результати показані в таблиці 5. Виявлено, що кількість пептидів і вільних амінокислот у розчині, приготованому розчиненням порошків у дистильованій воді, становить 8,15 мг/мл, кількість пептидів становить 4,57 мг/мл і кількість Хаа-Рrо в пептидах становить 514,5 мкг, так що процент Хаа-Pro відносно загальної кількості пептидів і вільних амінокислот у порошках становить 6,3% мас. Крім того, кількість Хаа-Pro-Pro у пептидах становить 116,5 мкг, так що процент Хаа-Pro-Pro відносно загальної кількості пептидів і вільних амінокислот у порошках становить 1,4% мас. Апаратура, що використовується Високоефективний рідинний хроматографмас-спектрометр: LCMS-2010; системний регулятор: SCL-10Advp; автоматичний інжектор: SIL10Advp; насос для подачі розчинників: LC-10Advp 89616 16 x 2; піч колонного типу: CTO-10Avp; фотодіодний матричний детектор: SPD-M10AVP; системний дегазатор: DGU-14A (усі торгові марки виробництва SHIMADZU CORPORATION); колонка: Develosil C30-UG-3 (2,0 мм внутрішній діаметр x 150 мм довжина) (виробництва NOMURA CHEMICAL CO., LTD.) Умови для вимірювань Рухома фаза А: водний розчин 0,1% мас. мурашиної кислоти; рухома фаза В: 100% розчин ацетонітрилу; часова програма: 0% В (0 хв) - 7,5% В (30 хв) - 80% В (30,01 хв) -100% В (35 хв) - 0% В (35,1 хв) - СТОП (45 хв); кількість зразка для введення: 5 мкл; температура колонки: 50°С; довжина хвилі детектування: від 200 до 300 нм; спосіб іонізації: ESI (+); швидкість потоку газу, що розпилюється: 4,5 л/хв; прикладена напруга: +4,5 кВ; CDL температура: 250°С; температура нагрівача централізованого теплопостачання: 200°С; CDL вольтаж: 0,0 В; Q-вольтаж (Q-array voltage): SCAN; спосіб аналізу: SIM вимірювання; діапазон, що досліджується: ЕР (m/z=245,2), IP (m/z=229,3), MP (m/z=247,3), QP (m/z=244,2), RP (m/z=272,3), SPP (m/z=300,3), VPP (m/z=312,1), IPP (m/z=326,1); час введення: 0,5 сек./Ch. Приклад аналізу 1 Ідентифікація ферментів Серед позаклітинних ферментів, похідних Aspergillus oryzae, що використовуються в прикладі 1, ферменти, необхідні для отримання гідролізату казеїну за даним винаходом, аналізували наступним способом. До речі, усі наступні операції проводили при 4°С, якщо не вказано інше. Всі використані реагенти є гарантованими реагентами виробництва WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD., якщо не вказано інше. Вплив різних інгібуючих агентів на ферменти Розчиняли 2000 мг SUMIZYME FP (зареєстрована торгова марка виробництва SHINNIHON CHEMICAL CO., LTD.) у 10 мл 50 мМ фосфатного буфера при рН 7,2 і видаляли нерозчинні речовини за допомогою целюлозаацетатної мембрани (DISMIC-25cs, діаметр по ρ 0,45 мкм виробництва ADVANTEC), отримуючи сирий ферментний розчин. Взаємодію даного сирого ферментного розчину з 1% казеїном проводили так само як у прикладі 1. Потім додавали до реакційної системи інгібітор металопротеази EDTA (етилендіамінтетраоцтову 17 89616 18 кислоту) або інгібітор серинпротеази PMSF (феніність, і проводили діаліз відносно 5 л 5 мМ фосфалметансульфонілфторид), середня довжина лантного буфера з рН 7,2. Суспендували Sephacryl Sцюга була більшою, і не можна було отримати ці300 HR (виробництва AMERSHAM BIOSCIENCES льовий гідролізат. Даний факт передбачає, що К.К.) в 50 мМ фосфатному буфері з рН 7,2, що металопротеаза або серинпротеаза грають важмістить 200 мМ NaCl, повністю дегазували і набиливу роль у виробництві гідролізату казеїну за давали скляну колонку з діаметром 18 см x 100 см. ним винаходом. Дану колонку повністю врівноважували 50 мМ фоВиділення за допомогою іонообмінної смоли сфатним буфером з рН 7,2, що містить 200 мМ Активували 20 мл аніонообмінної смоли DEAE NaCl при постійній швидкості потоку 2 мл/хв. Діаліsephacel (виробництва AMERSHAM BIOSCIENCES зований зразок вносили в дану колонку і отримуK.K.), врівноважували її 50 мМ фосфатним буфевали 100 фракцій по 10 мл кожна. Для кожної фраром з рН 7,2 і набивали скляну колонку діаметром кції визначали поглинання при 280 нм і 1,5 см x 12 см. Притому, що весь ефлюент збирапротеїназну активність, використовуючи FITCли як неадсорбований зразок, сирий ферментний казеїн як субстрат. розчин адсорбувався при швидкості потоку 1,0 Електрофорез на поліакриламідному гелі мл/хв. Потім колонку ретельно промивали 50 мМ Відбирали 10 мкл кожної фракції, змішували з фосфатним буфером з рН 7,2 при 10-разовій за 10 мкл буфера для зразка, складеного з 0,125 Μ об'ємом кількості відносно гелю і елюювали 200 Трис-буфера з рН 6,8, 3% SDS, 5% βмл 50 мМ фосфатного буфера з рН 7,2, що містить меркаптоетанолу, 10% гліцерину і 0,01% бромфелінійний градієнт NaCl (від 0 до 600 мМ). Елюат нолового синього, нагрівали при 95°С протягом 5 фракціонували на 100 фракцій по 5 мл кожна. Для хв і охолоджували при кімнатній температурі. кожної фракції визначали поглинання при 280 нм, Отриманий зразок піддавали електрофорезу згідпротеїназну активність і АС-інгібуючу активність. но зі способом Laemmli (Nature, 227, 680 (1970)), Визначення протеїназної активності використовуючи міні-пластинки (виробництва АТРозчиняли 25 мг флуоресцентно-міченого ТО CORPORATION) і поліакриламідний гель з на(флуоресцеїнізотіоціанатом) казеїну (FITC-казеїн, міченою концентрацією за умови 30 mА на гель. виробництва SIGMA), в 5 мл 50 мМ фосфатного По завершенні електрофорезу гель занурювали в буфера при рН 7,2, отримуючи розчин субстрату. розчин барвника Coomassie Brilliant Blue, складеЗмішували 10 мкл кожної фракції з 20 мкл розчину ний з 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% субстрату і проводили взаємодію при 55°С протяметанолу і 7,5% оцтової кислоти, на 10 хв і пропугом 10 хв. Взаємодію припиняли, додаючи 120 мкл скали через фільтр у знебарвлюючий препарат, 5% розчину трихлорацетату, і отриману реакційну складений з 5% метанолу і 7,5% оцтової кислоти, рідину центрифугували при 1500 об/хв. Відбирали до повного знебарвлення фону. Молекулярну масу 60 мкл супернатанту, змішували з 3 мл 0,5 Μ трисотримували за допомогою розрахунку з рухомості гідрохлориду з рН 8,5 і проводили вимірювання, кожної смуги білка, використовуючи маркери мовикористовуючи флуориметр (F-1300, виробництлекулярної маси (виробництва AMERSHAM ва HITACHI, LTD.), визначаючи довжину хвилі збуBIOSCIENCES K.K.). дження при 485 нм і довжину хвилі флуоресценції Фракції, адсорбовані на аніонній іонообмінній при 525 нм. смолі і такі, що мають активність за генерацією З результатів визначення поглинання при 280 АСЕ-інгібуючих компонентів, піддавали гельнм кожні фракції DEAE sephacel-елюату встановфільтрації через смолу Sephacryl S-300 і спостерілено, що приблизно 73% білка абсорбується на гали активність у фракціях, які відповідають молеаніонній іонообмінній смолі. На фіг.3 показаний кулярній масі близько 45 кДа. Дані фракції аналіхарактер елюювання зв'язаного білка при лінійнозували методом електрофорезу на SDSму градієнті від 0 до 0,6М NaCl і протеолітична поліакриламідному гелі в 12,5% гелі, спостерігаюактивність. чи по суті окремі смуги при 44 кДа і 40 кДа. Дані Фракції з 21 по 60 містять особливо велику кісмуги вирізали і аналізували на N-термінальні полькість елюйованих білків. Крім того, елюйований слідовності. Виявлено, що смуга при 44 кДа має ферментний розчин кожної фракції оцінювали на послідовність, яка високо гомологічна відомій нейактивність за генерацією АСЕ-інгібуючих компонетральній протеазі І плісняви koji (Aspergillus), і смунтів при гідролізі казеїну. У результаті підтверджега при 40 кДа має послідовність, яка високо гомоно, що фракції з 20 по 60 переважно мають активлогічна відомій нейтральній протеазі II плісняви ність за генерацією АСЕ-інгібуючих компонентів. koji (Aspergillus). З іншого боку, протеїназну активність, виміряЗ даних результатів визначено, що протеїнази, ну з використанням FITC-казеїну як субстрату, адсорбовані на аніонообмінній смолі, які генеруспостерігали, головним чином, у фракціях з 19 по ють АСЕ-інгібуючі компоненти для казеїну, містять, 27 (при вмісті NaCl від 0,1 Μ до 0,2 М), цей факт щонайменше, дві протеїнази: нейтральну протеазу вказує, що протеїназна активність виконує важлиІ і нейтральну протеазу II. ву функцію в генерації АСЕ-інгібуючих компоненУ зв'язку з подальшим гідролізом компонентів, тів. З даних результатів виявлено, що протеїназна генерованих гідролізом казеїну протеїназами, анаактивність грає важливу роль у ферментативній лізували пептидази, які діють на пептиди, наступактивності, очищаючи АСЕ-інгібуючі компоненти ним способом. від казеїну. Для ідентифікації ферментів по виробництву Ідентифікація вмісних протеїназ пептидів, що мають високий вміст Хаа-Рrо і Хаа3 DEAE sephacel-елюйованих фракцій збирали Pro-Pro, які є відмінною ознакою даного винаходу, фракції з 21 по 35, що мають протеїназну активсинтезували різні пептиди-попередники для Val 19 89616 20 Pro-Pro і оцінювали можливість їх перетворення в CORPORATION), оцінюючи концентрацію отримаVal-Pro-Pro. ного Val-Pro-Pro. Очищення ферментів для обробки аміно-кінців Оцінювали карбоксил-термінальну технологічЗ DEAE sephacel-елюйованих фракцій збираність кожної DEAE sephacel-елюйованої фракції, ли фракцій з 21 по 37, що мають активність по виявивши, що фракції з 30 по 50 мають ферментагенерації АСЕ-інгібуючих компонентів, і проводили тивну активність по перетворенню Val-Pro-Proдіаліз відносно 5 л 5 мМ фосфатного буфера з рН Phe-Leu в Val-Pro-Pro. 7,2. Суспендували гідроксіапатит (виробництва Приклад 2 WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) в 5 Підтвердження АСЕ-інгібуючої активності гідмМ фосфатному буфері з рН 7,2, повністю дегазуролізату казеїну комбінацією очищених ферментів вали і набивали пластикову колонку з діаметром З прикладу аналізу 1 встановлено, що актив1,5 см x 12 см. Дану колонку промивали 5 мМ фоність за генерацією АСЕ-інгібуючих компонентів сфатним буфером з рН 7,2 у кількості не менше фракцій, адсорбованих на аніонообмінній смолі, 10-кратної кількості гідроксіапатиту. Діалізовані позаклітинного ферменту з Aspergillus oryzae фракції, що мають активність за генерацією АСЕ(SUMIZYME FP (зареєстрована торгова марка виінгібуючих компонентів, вносили в дану колонку з робництва SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.)) гідроксіапатитом і збирали всі фракції, що пройшвключає чотири ферментативних активності, а ли через колонку. саме, протеїназні активності, включаючи, щонайВизначення амінопептидазної активності менше, активність нейтральних протеаз І і II, аміАмінопептидазну активність визначали настунопептидазну активність, включаючи активність пним способом. Синтезований пептид Val-Val-Valлеицинамінопептидази, і активність по розщепPro-Pro розчиняли в 50 мМ фосфатному буфері з ленню карбоксильного кінця безпосередньо після рН 7,2 при концентрації 50 мкг/мл, отримуючи розпроліну. чин субстрату. Змішували 45 мкл даного розчини Серед адсорбованих фракцій (див. фіг.3) субстрату з 5 мкл ферментної фракції і проводили отримана фракція І, що має високу протеїназну взаємодію в інкубаторі при 55°С протягом 30 хв. активність (фракції з 1 по 35 на фіг.3), фракція II, Взаємодію припиняли за допомогою нагрівання яка має високу активність по розщепленню карбопри 98°С протягом 5 хв. Відбирали придатну кільксильного кінця безпосередньо після проліну кість даної реакційної рідини і піддавали аналізу (фракції з 36 по 55 на фіг.3), далі фракція III (франа високоефективному рідинному хроматографікції з 56 по 100 на фіг.3) і неадсорбовані фракції, мас-спектрометрі (виробництва SHIMADZU що мають протеїназну активність. CORPORATION), оцінюючи кількість генерованого Кожну фракцію додавали окремо або в комбіVal-Pro-Pro. нації, як показано в таблиці 6, до 1 мл 1% розчину Фракції, адсорбовані на аніонообмінній смолі і казеїну з коров'ячого молока, проводили взаємотакі, що мають активність за генерацією АСЕдію при 55°С протягом 13 годин, отримуючи гідроінгібуючих компонентів, піддавали електрофорезу лізат казеїну. По завершенні взаємодії кожний з на SDS-поліакриламідному гелі в 10% гелі і виріотриманих гідролізатів казеїну оцінювали на АСЕзали смугу при 32 кДа. Основний білок екстрагуваінгібуючу активність і середню довжину ланцюга ли і очищали, отримуючи по суті окремий білок 32 згідно зі способом, описаним у прикладі 1. Як конкДа. Аналізували послідовність на N-кінці даного троль проводили такі самі визначення на сирому білка, виявивши, що послідовність до десятого ферментному розчині у кількості 1/10000, що залишку від N-кінця гомологічна послідовності віпройшла очищення. Результати показані в таблиці домої лейцинамінопептидази плісняви koji 6. (Aspergillus). Зроблений висновок, що фракції, які мають встановлену активність за генерацією АСЕінгібуючих компонентів, містять лейцинамінопептидазу. З даних результатів зрозуміло, що фракції, адсорбовані на аніонообмінній смолі і ті, що мають активність за генерацією АСЕ-інгібуючих компонентів, містять, щонайменше, лейцинамінопептидазу, яка має амінопептидазну активність, що грає важливу роль в активності за генерацією АСЕінгібуючих компонентів. Визначення карбоксилтермінальної технологічності ферментів Розчиняли синтезований пептид Val-Pro-ProPhe-Leu в 50 мМ фосфатному буфері з рН 7,2 при концентрації 45 мкг/мл, отримуючи розчин субстрат. Змішували 50 мкл даного розчину субстрату з 5 мкл розчину кожного ферменту і проводили взаємодію в інкубаторі при 55°С протягом 30 хв. Взаємодію припиняли за допомогою нагрівання при 98°С протягом 5 хв. Відбирали відповідну кількість даної реакційної рідини і аналізували на З таблиці 6 виявлено, що компоненти, які мависокоефективному рідинному хроматографі-масють сильну АСЕ-інгібуючу активність, містяться в спектрометрі (виробництва SHIMADZU неадсорбованих фракціях, фракціях, що мають 21 89616 22 високу протеїназну активність, і до фракцій, які До отриманого таким чином розчину субстрату мають активність по розщепленню карбоксильного додавали як групу ферментів SUMIZYME FP (закінця безпосередньо після проліну. Виявлено тареєстрована торгова марка виробництва SHIN кож, що група ферментів, елюйованих приблизно NIHON CHEMICAL CO., LTD.), яка являє собою при 300 мМ NaCl, генерує АСЕ-інгібуючі компоненпозаклітинні ферменти, похідні Aspergillus oryzae, ти таким чином, що фракція III не потрібна. так що масове співвідношення фермент/казеїн Визначали і порівнювали середню довжину складало 1/25. Проводили взаємодію даної суміші ланцюга гідролізату казеїну, отриманого гідролізом при 50°С протягом 20 годин, при цьому відбирали з використанням кожної фракції, що демонструє з інтервалами зразки реакційної рідини для оцінки високу активність за генерацією АСЕ-інгібуючих АСЕ-інгібуючої активності і середньої довжини компонентів. Виявлено, що середня довжина ланланцюга відносно часу, аналогічно прикладу 1. цюга для неадсорбованих фракцій, фракції І і фраРезультати показані на фіг.4 і 5. Ферментативно кції II, складає більше 2,1, але об'єднуючи дані перетравлений розчин, відібраний через 12 годин фракції, отримували гідролізат казеїну із середвзаємодії, яка демонструвала максимальну АСЕньою довжиною ланцюга не більше 2,1. інгібуючу активність, сушили розпиленням, отриПриклад 3 муючи порошки суміші пептидів. Додавали 15г казеїну з коров'ячого молока З фіг.4 і 5 встановлено, що АСЕ-інгібуюча ак(виробництва NIPPON NZMP) до 85 г дистильовативність зростає зі збільшенням часу взаємодії і ної води при температурі приблизно 80°С і ретезнижується після 12 год. взаємодії. З оцінки кількольно перемішували. Додавали до суміші IN розчин сті пептидів також встановлено, що АСЕ-інгібуюча гідроксиду натрію, доводячи рН до 7,0. Темпераактивність зростає при середній довжині ланцюга туру доводили до 20°С, отримуючи розчин субприблизно від 1,3 до 2,1. страту. 23 Комп’ютерна верстка І.Скворцова 89616 Підписне 24 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601