Відтворені сурфактанти, що мають поліпшені властивості

1. Відтворений сурфактант, що містить суміш фосфоліпідів та комбінацію аналога поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C з аналогом поліпептиду білка природного сурфактанта SP-B, а) де вказаний аналог поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C є поліпептидом з щонайменше 20 амінокислотних залишків та щонайбільше 40 амінокислотних залишків, що має послідовність загальної формули (І) FeGeIfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLpGpLp, (1) де: X - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: І, L та nL; 2 (19) 1 3 94477 4 6. Відтворений сурфактант за п. 5, де аналог поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C має загальну формулу (Іа): ІfPfSSPVHLKRXaBXbGALLpGpLp, (Іa) де X, В та  є визначеними вище; а дорівнює 1-8, краще 1-3; ще краще 1; b дорівнює 1-19, краще 5-15; ще краще 14; f тa p дорівнюють 0 або 1. 7. Відтворений сурфактант за п. 6, де аналог поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C має загальну формулу (Іb): IPSSPVHLKRXaBXbGALLpGpLp, (Ib) де: X, В,  та b є визначеними вище; р дорівнює 0 або 1. 8. Відтворений сурфактант за п. 7, де аналог поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C має загальну формулу (Іс): IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLpGpLp, (Іc) де:  визначено вище р = 0 або 1. 9. Відтворений сурфактант за п. 8, де аналог поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C є вибраним з групи: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL, (Id) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLIGL, (Іe) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL, (Іf) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLnLGL, (Іg) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL. (Ih) 10. Відтворений сурфактант за п. 1, де аналогом поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C є IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL, (Іf) а аналогом поліпептиду білка природного сурфактанта SP-B є CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS. (ІІа) 11. Відтворений сурфактант за п. 1, де аналогом поліпептиду білка природного сурфактанта SP-C є IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL, (If) а аналогом поліпептиду білка природного сурфактанта SP-B є CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS. (ІІс) 12. Відтворений сурфактант за будь-яким з попередніх пунктів, де фосфоліпідна суміш містить дипальмітоїлфосфатидилхолін (DPPC) та пальмітоїлолоїлфосфоліпід, вибраний з пальмітоїлолоїлфосфатидилгліцерину (POPG) або його суміші з пальмітоїлолоїлфосфатидилхоліном (РОРС) у мас-співвідношенні від 95:5 до 50:50. 13. Відтворений сурфактант за п. 12, де фосфоліпідна суміш містить DPPC та POPG у масспіввідношенні 68:31. 14. Фармацевтична композиція, що містить відтворений сурфактант за будь-яким з пп. 1-13. 15. Фармацевтична композиція за п. 14 у формі розчину, дисперсії, суспензії чи сухого порошку. 16. Фармацевтична композиція за п. 15 у формі водної суспензії. 17. Фармацевтична композиція за п. 16, що містить відтворений сурфактант у концентрації 2-160 мг/мл. 18. Фармацевтична композиція за п. 17, де концентрація відтвореного сурфактанту є 20-80 мг/мл. 19. Застосування відтвореного сурфактанту за будь-яким з пп. 1-13 для лікування чи профілактики респіраторного дистрес-синдрому (RDS) у передчасно народжених дітей або для лікування чи профілактики інших хвороб, пов'язаних з нестачею або дисфункцією сурфактанту. 20. Застосування за п. 19, де хвороба, пов'язана з нестачею або дисфункцією сурфактанта, охоплює RDS у дорослих (ARDS), синдром аспірації меконію (MAS) та бронхолегеневу дисплазію (BPD). Заявлений винахід стосується відтвореного сурфактанта, що містить ліпідний носій, та комбінацію певного аналогу поліпептиду білку природного сурфактанта SP-C з певним аналогом поліпептиду білку природного сурфактанта SP-B. Винахід також стосується їх фармацевтичних композицій та їх застосування для лікування або профілактики RDS та інших респіраторних розладів. Легені людини складаються з великого числа невеликих повітряних мішечків - альвеол, у котрих гази обмінюються між кров'ю та повітряними порожнинами легенів. У здорових осіб цей обмін опосередковується присутністю комплексу ПАР з вмістом білку, що попереджує легені від занепаду у кінці видиху. Комплекс ПАР легень складається головним чином з ліпіду та містить другорядні кількості різних білків. Відсутність адекватних рівнів цього комплексу призводить до дисфункції легень. Цей синдром називають респіраторний дистрессиндром (RDS) та він звичайно вражає недоношених дітей. Вказаний синдром ефективно лікують модифікованими природними препаратами сурфактантів, екстрагованими з легень тварин. Комерційно доступними модифікованими препаратами сурфактантів є, наприклад, куросурф, похідний від легень свині, інфасурф, лаваж екстрагованої форми легень теляти та сурванта, хімічно модифікований природний екстракт легень корів. Головними складовими цих препаратів ПАР є фосфоліпіди, як-то 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфохолін, звичайно відомий як дипальмітоїлфосфатидилхолін (DPPC), фосфатидилгліцерин (PG) та гідрофобні білкиПАР В та С (SP-B та SPC). Внаслідок недоліків препаратів ПАР з тканин тварин, як-то ускладнення отримання та стерилізації та можливе індукування імунної реакції, треба розробляти синтетичні сурфактанти, що імітують композицію модифікованих природних сурфактантів. Вказані синтетичні сурфактанти є відомими як відтворені сурфактанти. Однак розвиток клінічно активних відтворених сурфактантів виявився ускладненим, оскільки при 5 родні гідрофобні білки є надто великими для синтезу, структурно складними та є нестабільними у чистій формі. Для заміщення вказаних природних гідрофобних білків деякі синтетичні поліпептиди, частково відповідні їх послідовностям та аналогам, запропоновані у рівні техніки та є, наприклад, розкритими у WO 89/06657, WO 92/22315, WO 98/49191, WO 95/32992, US 6,660,833, ЕР 413,957 та WO 91/18015. У WO 00/47623 розкрито синтетичні поліпептиди, котрі є аналогами природного білку SP-C де: і) залишки цистеїну у позиції 5 та 6 заміщені залишками Ser; іі) залишки Val ''центрального регіону'' SP-C заміщені іншими нейтральними та гідрофобними залишками, вибраними з групи: Leu, lie та норлейцин (nL); ііі) деякі з нейтральних амінокислот у ''центральному регіоні'' SP-C заміщені об'ємистими або полярними залишками вибраними з групи: Lys, Try, Phe, Туr, та орнітин. Вказані штучні поліпептиди характеризуються тим, що вони є здатними складатися як природний білок SP-C та, звідси, взаємодіяти по суті з ліпідами ПАР та не схильні до самоолігомеризації. WO 00/76535 взагалі стосується препаратів легеневих сурфактантів, що містять принаймні одну модифікацію SP-B у комбінації з принаймні одною модифікацією білку SP-C. Waring AJ et al, (реферат у Paediatric Academy Society Annual, San Francisco, April 29-May 2, 2006) проводили дослідження для визначення активності синтетичних сурфактантів, що складаються з SP-C-імітувального SP-Cff, що є синтетичним 34залишковим SP-C з фенілаланіном замість цистеїну у позиціях 4 та 5, та SP-B-імітувального Міnі-В. Однак, згідно з доступною літературою, у дослідженнях тварин лікування відтвореними ПАР дає збільшення недостатнім об'ємам легеневого газу та ступеню альвеолярної прохідності у кінці видиху, та вентиляція є необхідною з позитивним кінцем експіраторного тиску (PEEP) для досягнення in vivo активності, порівнюваної з досягнутою з модифікованими природними ПАР (Johansson J et al J Appl Physiol 2003, 95, 2055-2063; Davis AJ et al Am J Respir Crit Care Med 1998; 157, 553-559). Доступні відтворені препарати ПАР насправді не є здатними утворювати стабільну фосфоліпідну плівку в альвеолах у кінці видиху. Усі вищенаведені документи замовчують проблему альвеолярної прохідності у кінці видиху та дію розкритих препаратів. Тому є ще потреба у відтворених сурфактантів із поліпшеними властивостями у термінах еластичності легень. Зокрема, є потреба у відтвореному препараті ПАР, котрий є здатним гарантувати альвеолярну стабільність, та звідси підтримування альвеолярної прохідності у кінці видиху без потреби вентиляції PEEP. Зараз виявлено, та це є об'єктом заявленого винаходу, що певні аналоги природного білку SPC, а краще поліпептиди з WO 00/47623, можна переважно комбінувати з певними аналогами природного білку SP-B для отримання відтвореного препарату ПАР із поліпшеними властивостями у 94477 6 термінах еластичності легень, та зокрема здатності до ефективного підтримування альвеолярної прохідності у кінці видиху без потреби вентиляції PEEP. Зокрема виявлено, що у моделі RDS, де передчасно новонароджених лікували екзогенними препаратами сурфактантів без застосування PEEP, комбінація вказаних певних аналогів білків SP-C та SP-B діє на об'єми легеневого газу, що є індексом альвеолярної прохідності у кінці видиху. Заявлений винахід стосується відтворених сурфактантів, що містять ліпідний носій, та комбінацію певного аналогу поліпептиду білку природного сурфактанта SP-C з певним аналогом поліпептиду білку природного сурфактанта SP-B. Зокрема винахід стосується відтворених сурфактантів, що містять: a) ліпідний носій; b) поліпептид з принаймні 20 амінокислотних залишків та не більше, ніж 40 амінокислотних залишків, що мають послідовність, репрезентовану загальною формулою (І) FeGelfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLnΩpGpLp (l) де: X - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: І, L, та nL; В - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: K, R, Н, W, F, Y, та Оrn; S - необов'язково заміщені ацили з вмістом 1222 атомів карбону, краще 16 атомів карбону, приєднаних до бічного ланцюга естерним зв'язком; Ω - амінокислота, вибрана з групи: Μ або М, окиснена на атомі сульфуру, І, L, та nL; а - ціле число, що має значення від 1 до 8; b - ціле число, що має значення від 1 до 19; с - ціле число, що має значення, незалежно вибране з3 до 8, e, f, g та p - цілі числа, що мають значення 0 або 1; n - ціле число, що має значення від 0 до 3; та за умови, що ХаВХb(ВХс)n - послідовність, що має максимум 22 амінокислоти c) поліпептид, репрезентований загальною формулою (II): CfΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPQLVCRLVLФC Sf (ll) де: Δ - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: W та L; Ω - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: М, І, L та nL; Φ - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: R та Т, краще R; та f - ціле число, що має значення 0 або 1. Винахід також стосується фармацевтично прийнятних солей вказаних поліпептидів та їх блокованих N- та/або С-кінцевих похідних, наприклад, ацетилуванням та амідуванням. Винахід крім того стосується їх фармацевтичних композицій та їх застосування для профілактики та/або лікування респіраторного дистрессиндрому (RDS) та інших респіраторних розладів. Винахід також стосується застосування поліпептидів загальної формули (II) для отримання 7 відтворених сурфактантів для поліпшення альвеолярної прохідності у кінці видиху. Зрештою, винахід стосується способу профілактики та/або лікування респіраторного дистрессиндрому (RDS) та інших респіраторних розладів, вказаний спосіб полягає у застосуванні до пацієнта при потребі такого лікування терапевтично ефективної кількості відтвореного сурфактанта, що містить ліпідний носій, поліпептид загальної формули (І), та поліпептид загальної формули (II). Фіг.1 показує послідовність білку SP-C людини. Залишки Cys є пальмітоїлованими у природному SP-C. Фіг.2 показує послідовність білку SP-B людини. Фіг.3 показує результати у термінах об'єми легеневого газу (мл/кг). Фіг.4 показує результати у термінах припливні об'єми (мл/кг) як функція час/тиск. Респіраторну функцію після in vivo лікування екзогенними препаратами сурфактантів проводять виміром двох параметрів: і) припливний об'єм, котрий є індексом еластичності легень та іі) об'єм легеневого газу, котрий є індексом альвеолярного розширення повітря або прохідності у кінці видиху, та звідси здатності утворювати стабільну фосфоліпідну плівку в альвеолах у кінці видиху. У цій заявці, термін "відтворений сурфактант" означає ліпідний носій, до котрого додані аналоги поліпептидів білків сурфактантів, зроблені рекомбінантним способом або способами синтезу. Термін "ліпідний носій" означає суміш фосфоліпідів та необов'язково крім того ліпідні компоненти, наприклад, нейтральні ліпіди як-то триацилгліцерини, вільні жирні кислоти та/або холестерин. Термін "аналоги поліпептидів білку природного сурфактанта SP-C", охоплює поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, у котрій, порівняно з природними білками, одна або більше амінокислот відсутні або заміщені іншими амінокислотами, за умови, що поліпептиди у суміші з ліпідним носієм показують активність легеневого сурфактанта. Термін "аналоги поліпептидів білку природного сурфактанта SP-B", охоплює пептиди, що мають амінокислотну послідовність, у котрій, порівняно з природними білками, одна або більш амінокислот відсутні за умови, що поліпептиди, у суміші з ліпідним носієм, показують активність легеневого сурфактанта. Термін "міні-В" означає 34-залишковий поліпептид на основі N-кінцевих залишків 8-25 та Скінцевих залишків 63-78 природного білку SP-B, структуру якого було вперше взагалі розкрито у вебсайті від California NanoSystems Institute. Його повну послідовність розкрито у RCSB Protein Data Bank. Waring AJ et aІ J Peptide Res 2005, 66, 364-374, дають ще інформацію стосовно його структури та активності. Термін "варіанти" означає аналоги поліпептидів пептиду Міні-В, що має амінокислотну послідовність, у котрій одна або більше амінокислот заміщені іншими амінокислотами, за умови, що 94477 8 пептиди, у суміші з ліпідним носієм, зберігають активність Міні-В. Амінокислотні послідовності є показаними згідно з трьох-літерним кодом з амінокислотою, котра несе вільну аміногрупу на лівому кінці (аміно кінець) та амінокислотою, котра несе вільну карбоксигрупі на правому кінці (карбокси-кінець). Термін "синергічний" означає, що ефективність двох поліпептиди є більшою, ніж могло б бути за сумою їх індивідуальних ефективностей у даному дослідженні. Усі амінокислотні залишки, ідентифіковані тут, є у природній L-конфігурації та послідовності, ідентифіковані тут, позначені стандартними скороченнями для амінокислотних залишків, як показано у нижченаведеній таблиці. Символи амінокислот Одно-літерні Три-літерні Гліцин G Gly L-пролін Р Pro L-ізолейцин І lle L-лейцин L Leu L-тирозин Y Tyr L-цистеїн C Cys L-триптофан W Trp L-аланін A Ala L-лізин K Lys L-аргінін R Arg L-глютамін Q Glu L-метіонін Μ Met L-серин S Ser L-валін V Val L-аспарагин N Asn L-аспарагинов кислота D Asp L-глютамінова кислота Ε Gln L-гістидин Η His L-треонін Τ Thr L-фенілаланін F Phe L-нор-лейцин nLeu L-орнітин Orn Заявлений винахід стосується відтворених сурфактантів, що містять ліпідний носій та комбінацію певних аналогів поліпептидів білку природного сурфактанта SP-C з певними аналогами поліпептидів білку природного сурфактанта SP-B, охоплюючи Міні-В пептид та його варіанти. Нами виявлено, що у моделі RDS, де передчасно новонароджених лікували екзогенними препаратами сурфактантів без застосування PEEP, комбінація поліпептиду загальної формули (І) з поліпептидом загальної формули (II) позитивно діє на еластичність легень. Зокрема, комбінація двох поліпептидів, як було виявлено, діє синергічно на об'єми легеневого газу, що є індексом альвеолярної прохідності у кінці видиху. Вказаний результат демонструє, що відтворений сурфактант винаходу є здатною до стабілізації фосфоліпідної плівки в альвеолах у кінці видиху краще, ніж відтворені, що містять тільки аналог білку SP-C або аналог білку SP-B. Більш того, заявлений відтворений препарат сурфактанта, як виявилося, поліпшує респіраторну функцію, яку виражено припливними об'ємами, до ступеню, порівнюваного або навіть трохи кращого, 9 ніж досягнутого після застосування модифікованих природних сурфактантів. Переважно, аналогом природного білку SP-C є поліпептид з принаймні 20 амінокислотних залишків та не більше, ніж 40 амінокислотних залишків, що мають послідовність, репрезентовану загальною формулою (І) FeGelfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLΩpGpLp (l) де: X - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: І, L, та nL; В - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: K, R, Н, W, F, Y, та Orn; S - необов'язково заміщені ацили з вмістом 1222 атомів карбону, краще 16 атомів карбону, приєднаних до бічного ланцюга естерним зв'язком; Ω - амінокислотний залишок, вибраний з групи: Μ або М, окиснена на атомі сульфуру, І, L, та nL; а - ціле число, що має значення від 1 до 8; b - ціле число, що має значення від 1 до 19; с - ціле число, що має значення, незалежно вибране з 3 до 8; е, f, g та p - цілі числа, що мають значення 0 або 1; n - ціле число, що має значення від 0 до 3; та за умови, що ХаВХb(ВХс)n - послідовність, що має максимум 22 амінокислоти, краще 10-22 амінокислоти. Краще, коли поліпептид загальної формули (І) складається з принаймні 30 та не більше, ніж 35 амінокислот, ще краще не більше, ніж 33 амінокислот. У конкретних втіленнях поліпептиди загальної формули (І) складаються з 30 або 33 або 35 амінокислот. Краще, коли аналог поліпептиду білку SP-C є репрезентованим загальною формулою (Іа), у котрій є та n=0, а г=1 lfPfSSPVHLKRXaBXbGALLΩpGpLp (la) де X, В та Ω є визначеними вище; а = від 1 до 8, краще від 1 до 3; ще краще 1; b = від 1 до 19, краще від 5 до 15, ще краще 14; f та р = 0 або 1. Ще краще, аналог поліпептиду білку SP-C є репрезентованим загальною формулою (Іb), у котрій f=1 IPSSPVHLKRXaBXbGALLΩpGpLp (Ib) де: Χ, Β, Ω, та b є визначеними вище; p = 0 або 1. Навіть ще краще, аналог поліпептиду білку SP-C є репрезентованим загальною формулою (Іс) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLΩpGpLp (lc) де: Ω визначено вище р = 0 або 1 Приклади поліпептидів формули (Іс) нижченаведені: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (Id) (SEQ ID:1) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLIGL (le) (SEQ ID:2) 94477 10 IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (If) (SEQ ID.3) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLnLGL (Ig) (SEQ ID:4) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL (Ih) (SEQ ID:5) Поліпептид (Id) також позначений у рівні техніки як SP-C33. Найкраще, аналогом SP-C є поліпептидом, вибраним з групи поліпептидів, що мають формули (le), (If), (Ig) та (Ih). У кращому втіленні винаходу, поліпептид загальної формули (І) є поліпептидом (If) позначе31 ним далі як SP-C33(Leu) . Переважно, аналог природного білку SP-B складається з двох частин, відповідних N-кінцевим залишкам 8-25 та 63-78 С-кінцевої частини природного білку SP-B (позначеного далі як пептид МініВ) або його варіанту. Більш переважно, аналог природного білку SP-B є поліпептидом, репрезентованим наступною загальною формулою (II): CfΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPΩLVCRLVLФC Sf (II) де: Δ - амінокислотний залишок, вибраний з групи: W та L; Ω - амінокислотний залишок, незалежно вибраний з групи: М, І, L, та nL; Φ - амінокислотний залишок, вибраний з групи: R та Т, краще R; та f - ціле число, що має значення 0 або 1. У певному втіленні винаходу, аналог SP-B є поліпептидом, репрезентованим формулою (llа) CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRC S (lla) (SEQ ID:6) В інших втіленнях винаходу аналог SP-B вибраний з поліпептидів, що мають наступні формули CLLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (llb) (SEQ ID:7) CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (lle) (SEQ ID:8) CLLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (lld) (SEQ ID 9) У кращому втіленні поліпептиди (llа), (llb), (lle) та (lld) можуть бути у формі поєднаної дисульфідом молекули, де внутрішньомолекулярний дисульфідний зв'язок є між двома залишками Cys у позиції 1 та 33 та/або між двома залишками Cys у позиції 4 та 27. З'єднаний дисульфідом поліпептид (llа) позначений у рівні техніки як окиснений Міні-В (окс МініВ). Поліпептид (lle) є позначеним далі як МініВ(LІеu), а його з'єднана дисульфідом форма як окс Міні-В(Lеu). Поліпептиди загальних формул (І) та (II) можна отримувати способами синтезу або рекомбінантними способами, добре відомими спеціалісту у рівні техніки. Багато доступних способів можуть бути виявленими у J.M. Steward та J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, та J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New 11 York), 1983 для твердо-фазного синтезу пептидів, та Ε. Schroder та К. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 для класичного синтезу у розчинах. Поліпептиди винаходу можна також отримувати твердо-фазним способом синтезу, спочатку описаним Merrifield, у J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Інші способи синтезу поліпептидів можуть бути виявленими, наприклад, у М. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976) а також у інших посиланнях, відомих спеціалістам. Прийнятні захисні групи для застосування у таких синтезах є у вищенаведених текстах, а також у J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973). Наприклад, поліпептиди загальної формули (І) можна отримувати способом, розкритим у WO 00/47623, а поліпептиди загальної формули (II) можна отримувати способом, наведеним у Waring AJ et al J Peptide Res 2005, 66, 364-374. Винахід також стосується фармацевтично прийнятних солей поліпептидів загальних формул (І) та (II) та їх блокованих N- та/або С-кінцевих похідних, наприклад, ацетилуванням та амідуванням. Фармацевтично прийнятні солі містять, наприклад, солі хлоридної кислоти, оцтової кислоти, та трифлуороцтової кислоти. Відтворені сурфактанти винаходу можна отримувати змішуванням розчину або суспензії поліпептидів загальної формули (І) та (II) та ліпідів та наступною сушкою суміші, інакше їх можна отримувати ліофілізацією або сушкою розпиленням. Краще, поліпептиди загальної формули (І) та поліпептиди загальної формули (II) є у відтворених сурфактантів винаходу у фіксованій кількості та кількісному співвідношенні як фіксована комбінація. Пропорцію поліпептидів загальних формул (І) та (II) відносно відтвореного сурфактанта можна варіювати. Переважно кожний поліпептид може бути у кількості між 0,5 та 10 мас.% на основі маси сурфактанта, краще між 1 та 5%, найкраще між 1 та 3%. У кращому втіленні відтворений сурфактант містить від 1 до 3 мас.% поліпептиду (If), від 1 до 3 мас.% поліпептиду (ІІа), краще в окисненій формі. У ще одному кращому втіленні відтворений сурфактант містить від 1 до З мас.% поліпептиду (If), від 1 до 3 мас.% поліпептиду (ІІе), краще в окисненій формі. Переважно, ліпідний носій містить фосфоліпіди, що містяться у препаратах природних легеневих сурфактантів, наприклад, фосфатидилхоліни (PC) як-то дипальмітоїлфосфатидилхолін (DPPC) та пальмітоїлолоїлфосфатидилхолін (РОРС), та фосфатидилгліцерини (PG), як-то пальмітоїлолоїлфосфатидилгліцерин (POPG) та дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (DPPG). Іншими фосфоліпідами, котрі можна переважно застосовувати, є фосфатидилінозитоли (РІ), фосфатидилетаноламіни (РЕ), фосфатидилсерини та сфінгомієліни (SM). 94477 12 У певному втіленні, ліпідний носій може містити інші компоненти, наприклад, нейтральні ліпіди, як-то триацилгліцерини, вільні жирні кислоти та/або холестерин. Переважно відтворений сурфактант згідно з винаходом містить 90-99 мас.% ліпідного носія, краще 92-98%, ще краще 94-96%, та 1-10 мас.% від суми обох пептидів, краще 2-8%, ще краще 46%. В одному з втілень винаходу відтворений сурфактант містить 96 мас.% ліпідного носія, 2 мас.% поліпептиду загальної формули (І) та 2 мас.% поліпептиду загальної формули (II). У певному втіленні ліпідний носій складається тільки з фосфоліпідів, ще краще з суміші DPPC та пальмітоїлолілфосфоліпіду, вибраного з POPG або суміші з РОРС у мас-співвідношеннях від 95:5 до 50:50, краще від 80:20 до 60:40. Mac-співвідношення між DPPC та POPG кращі від 75:25 до 65:35, та ще кращі 68:31. У випадку сумішей DPPC:POPG:POPC, фосфоліпіди краще застосовувати у мас-співвідношеннях 60:20:20 або 68:15:16. У ще одному втіленні ліпідний носій може складатися з DPPC, DPPG та холестерину. У кращому втіленні винаходу, відтворений сурфактант містить від 1 до 5 мас.% одного з поліпептидів загальної формули (Іа), від 1 до 5 мас.% одного з поліпептидів загальної формули (II) та суміші DPPC та POPG у мас-співвідношенні 68:31. Застосування відтвореного сурфактанту винаходу проводять відомим спеціалісту у рівні техніки чином, краще інтратрахеальною інсталяцією (вливанням або болюсом) або розпиленням. Заявлений винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять відтворений сурфактант винаходу. Вказані композиції переважно застосовують у формі розчину, дисперсії, суспензії або сухого порошку. Кращі вказані композиції містять відтворений сурфактант, розчинену або суспендовану у придатному розчиннику або ресуспензійному середовищі. Кращі вказані фармацевтичні композиції застосовують як суспензію у буферованому фізіологічному розчині у склянках для разового застосування. Переважно концентрація відтвореного сурфактанта (виражена як вміст фосфоліпіду) є у межах приблизно від 2 до 160 мг сурфактанта на мл, краще між 10 та 100 мг/мл, ще краще між 20 та 80 мг/мл. Вказані композиції можуть крім того містити електроліти, як-то солі кальцію, магнію та/або натрію, краще кальцій хлорид. Фармацевтичні композиції згідно з винаходом є придатними для профілактики та/або лікування респіраторного дистрес-синдрому (RDS) у передчасно народжених дітей або інших хвороб, пов'язаних з нестачею або дисфункцією сурфактанту, охоплюючи RDS у дорослих (ARDS), синдром аспирації меконію (MAS) та бронхолегеневу дисплазію (BPD). Вони можуть також бути корисними для профілактики та/або лікування інших респіраторних розладів як-то пневмонія, бронхіт, COPD (хронічна обструктивна хвороба легень), астма, та кистозний 13 фіброз а також для лікування середнього серозного отиту. Наступні приклади ілюструють винахід більш детально. Приклади Приклад 1 - Синтез та очистка поліпептидів 31 SP-C33(Leu) та SP-C33. 31 Поліпептид SP-C33(Leu) отримували стандартними способами SPPS (Твердо-фазним синтезом пептидів) на основі Fmoc-хімії та послідовних ТФОК-розщеплень. Загалом було отримано 186,0 г сирого SP31 C33(Leu) . Поліпептид очищали піддаванням матеріалу зворотному розподілу струму (CCD) застосуванням H2O/n-BuOH/AcOEt/AcOH 4:1:4:1 як двофазної системи розчинників. 31 Ця очистка дала 78,9 г SP-C33(Leu) з чистотою > 60%. Кінцеву очистку проводили препаративною ВЕРХ застосуванням PLRP-S як стаціонарної фази у сталевій колонці 50×300 мм із застосуванням лінійного градієнту 25% В - 100% В протягом 75 хвилин. Рухома фаза складається з буферу А = 0,1% ТФОК у АСN/Н2О 1:4 та буферу В = 0,1% ТФОК у ІРА. Очищений поліпептид розчиняли у 90% АсОН та пропускали через колонку з іонообмінною смолою Dowex (ацетатна форма), отримуючи після ліофілізації, 5,8 г (= 5,4%) кінцевого продукту як ацетат. Поліпептид SP-C33 отримували аналогічним чином. Скорочення ACN Ацетонітрил AcOEt Етилацетат АсОН Оцтова кислота Вос т-Бутилоксикарбоніл n-BuOH н-Бутанол Fmoc 9-Флуоренілметилоксикарбоніл ІРА Ізопропіловий спирт ТФОК Трифлуороцтова кислота Приклад 2 - Синтез та очистка поліпептидів окс Miнi-B(Leu) та окс-Міні-В. Поліпептид окс-Miнi-B(Leu) отримували стандартними способами SPPS (Твердо-фазним синтезом пептидів) на основі Fmoc-хімії та послідовних ТФОК-розщеплень. Сирий поліпептид очищали препаративною ВЕРХ застосуванням системи ТФОК та виділяли ліофілізацією. Окиснення повітрям очищеного пептиду дало моноциклічну послідовність дисульфідним зв'яз1 33 ком між Cys та Cys . Моноциклічний пептид очищали препаративною ВЕРХ застосуванням системи ТФОК та виділяли ліофілізацією 4 27 Другий дисульфідний місток між Cys та Cys створювали застосуванням йоду. Після окиснення продукт очищали препаративною ВЕРХ застосуванням системи ТФОК та виділяли ліофілізацією. 1,12 г (= 1,7%) кінцевої сполуки виділяли з чистотою > 89%. Поліпептид окс Міні-В отримували аналогічним чином. 94477 14 Приклад 3 - In vivo експерименти з відтвореним сурфактантом на основі окс Міні-В та SP-C33 Препарати сурфактантів досліджували у передчасно новонароджених кролів, отриманих гістеректомією у гестаційному віці 27 діб. Експерименти робили без застосування позитивного кінця експіраторного тиску (PEEP). Як аналог SP-C застосовували поліпептид, позначений далі як SP-C33, котрий отримували згідно з прикладом 1. Як аналог білку SP-B застосовували окиснений Міні-В (окс Міні-В), котрий отримували згідно з прикладом 2. Тварин лікували при народженні відтвореними препаратами сурфактантів з вмістом, як ліпідного носія, фосфоліпідної суміші DPPC:POPG у співвідношенні 68:31 за масою. Фосфоліпіди змішували з 2 або 4 мас.% SPC-33, 2 мас.% окс Міні-В або 2 мас.% SPC-33 плюс 2 мас.% окс Міні-В. Тварини з такою ж дозою Curosurf® були позитивним контролем, а неліковані тварини того ж походження - негативним контролем. Усі препарати сурфактантів співзастосовували при концентрації 80 мг/мл та при стандартній дозі 2,5 мл/кг. Передчасно новонароджених кролів вентилювали паралельно зі стандартизованою послідовністю пікових тисків вдування. Для відкриття легень, тиск спершу був при 35 см Н2О протягом 1 хвилин. Після цього тиск знижували до 25 см Н2О протягом 15 хвилин та далі до 20 та 15 см Н2О. Зрештою, тиск підвищували знов до 25 см Н2О протягом 5 хвилин, після чого легені вентилювали протягом ще 5 хвилин азотом та тоді вирізали для вимірів об'єму газу. Об'єми легеневого газу та припливні об'єми, виражені як мл/кг, вимірювали та результати, надані як середні значення, є наведеними у Фіг.фіг. З та 4, відповідно. З Фіг.3 можна зрозуміти, що тварини, ліковані відтвореним препаратом сурфактанта з вмістом 2 мас.% окс Міні-В мали нижчі об'єми легеневого газу, ніж тварини, що отримували 2 мас.% SP-C33 (приблизно 2 мл/кг проти приблизно 4 мл/кг). Додавання 2 мас.% окс Міні-В до сурфактанта SР-С33 продукувало значне збільшення об'ємів легеневого газу, ніж будь-якого пептиду поодинці (8 мл/кг проти приблизно 6 мл/кг). Як показано у Фіг.4, подібну тенденцію спостерігали для припливних об'ємів та, після застосування пептидів у комбінації спостерігали поліпшення, порівнянне або навіть трохи краще, ніж досягнуте після застосування Curosurf®. Також виявлено, що збільшення вмісту форми SP-C33 з 2 до 4 мас.% не збільшувало об'ємів легеневого газу, позначаючи, що стабілізувальний ефект фосфоліпідної плівки в альвеолах у кінці видиху є наслідком додавання окс Міні-В. Вказаний результат демонструє, що відтворений сурфактант винаходу є здатною стабілізувати фосфоліпідні плівки в альвеолах у кінці видиху краще, ніж відтворена, що містить тільки аналог білку SP-C або аналог білку SP-B. Більш того, заявлений препарат відтвореного сурфактанта, як виявилося, поліпшує респіраторну 15 функцію, що виражено припливними об'ємами, до ступеню, порівнюваного або навіть трохи кращого, 94477 16 ніж досягнутий після застосування модифікованої природного сурфактанта. 17 94477 18 19 94477 20 21 94477 22 23 Комп’ютерна верстка А. Рябко 94477 Підписне 24 Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601