Неімуносупресорний циклоспорин а для лікування м’язової дистрофії

Реферат: UA 101177 C2 (12) UA 101177 C2 Даний винахід стосується застосування циклоспорину А формули: 3 4 [D-MeAla] -[EtVal] -CsA для виготовлення лікарського засобу для лікування тазово-плечової форми м'язової дистрофії. UA 101177 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується застосування неімуносупресивного похідного циклоспорину A для зниження індукції некрозу м'язових волокон та дегенерації м'язових волокон у суб'єкта, у якого діагностована поясно-кінцивкова м'язова дистрофія (ПКМД), зокрема, саркогліканопатія. М'язові дистрофії (МД) включають різнотипну групу спадкових розладів, які широко вражають поперечносмугасту м'язову тканину, приводячи в результаті до прогресуючої м'язової слабкості, виснаження і в багатьох випадках до передчасної смерті. Багато охарактеризованих мутацій, які причинно пов'язані з МД у людей, обумовлені змінами в структурних зв'язувальних білках, які прикріплюють нижчерозміщені скорочувальні білки до базальної пластинки, забезпечуючи ригідність клітинної мембрани кістякових м'язів (сарколеми), або в білках, які безпосередньо стабілізують чи репарують клітинну мембрану, таких як, наприклад, саркоглікан або дистрофін. Наслідувані мутації генів саркоглікану (генів альфа-, бета-, гамма- та дельта-саркоглікану) викликають скелетно-м'язове захворювання із гетерогенними синдромами, ПКМД, та його підгрупу, саркогліканопатії. Синдроми або фенотипи саркогліканопатій залежать від того, який ген саркоглікану мутований, та від типу генетичних мутацій (алельного варіанта), і проявляють чотири форми конкретних розладів: ПКМД типів 2C, 2D, 2E та 2F (мутації генів гамма-, альфа-, бета- та дельта-саркоглікану, відповідно), які представляють 25 % усіх діагностованих випадків ПКМД. Зокрема, різні мутації, що специфічно виявляються в гені дельта-саркоглікану, приводять в результаті до важкого розладу ПКМД типу 2F або ПКМД2F (Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM] #601287, genetic mutations: [OMIM] 601411. Emery et al., The Lancet, 2002, 359:687-695.). Різні типи ПКМД характеризуються прогресуючим виснаженням та слабкістю з атрофією, що переважно охоплює м'язи рук та ніг, проксимальні до плеча і стегна, відповідно. Фенотипи захворювання нагадують синдроми важкої м'язової дистрофії типу Дюшенна або Беккера. Однак останні захворювання залучають інші молекулярні механізми і генетичні розлади. До того, як стали доступні молекулярні діагностики ПКМД, пацієнтів із ПКМД часто діагностували як осіб, що страждають м'язовою дистрофією Дюшенна. Початок захворювання варіює від раннього дитинства до дорослого стану із клінічними формами від легких до важких. Аж до 25 % пацієнтів проявляють важкі форми захворювання, і у них розвивається важкий поперековий лордоз, контрактури п'яткових сухожиль, м'язова гіпертрофія, кардіоміопатія і порушення серцевої провідності. Гіпертрофія ікроножних м'язів або язика, вибірковість залученості м'язів та серцеві ускладнення пізньої стадії більш-менш специфічно пов'язані з кожною із різних форм (Danièle et al., Int J. Biochem Cell Biol., 2007; 39:1608-1624). Прогресуюча слабкість приводить до рестриктивного легеневого процесу і гіповентиляції, що вимагає допоміжної вентиляції. В цілому захворюваність та смертність варіюють. При ранньому початку прогресування захворювання до смерті типово є дуже швидким. Смерть часто настає внаслідок респіраторних ускладнень. До теперішнього часу є недоступним специфічне лікування для пацієнтів, що страждають будь-яким із синдромів ПКМД. Інтенсивна підтримуюча терапія, наприклад, ортопедія, хірургія і фізіотерапевтичне лікування для збереження м'язової функції, максимально збільшує функціональну здатність та продовжує очікувану тривалість життя. Однак ці заходи не можуть запобігти дегенерації м'язових волокон та виникненню, в остаточному підсумку, респіраторних ускладнень. Завдяки розробці моделей на тваринах, у яких відсутні специфічні гени, залучені в м'язову дистрофію, наблизилися до кращого розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі саркогліканопатій. Нещодавно було показано, що м'язові клітини мишей, у яких відсутній дельта-саркоглікан (мишей scgd-/-) внаслідок спрямованої інактивації гена дельта-саркоглікану (scgd), мають схильність до підвищеного клітинного припливу кальцію. Припускають, що втрата компонентів комплексу дистрофін-глікопротеїн (ДГК), такого як комплекс дистрофіну або саркоглікану, приводить в результаті до фундаментальної зміни фізичних властивостей клітинної мембрани м'язів та до підвищеної проникності і протікання сарколеми. Активація нерегульованих каналів припливу кальцію, викликана нестабільністю і ламкістю мембран, може ініціювати дистрофічне захворювання в кістяковому м'язі, що приводить до дегенерації м'язових волокон та індукції некрозу м'язових волокон. Авторами Parsons et al. (J. Biol. Chem., 2007, 282:10068-10078) показано, що інгібування активованої кальцієм/кальмодуліном активності серинової/треонінової протеїнфосфатази кальциневрину в результаті генетичної делеції зменшувало дегенерацію і запалення кістякового м'яза та м'язових волокон у мишей scgd-/-, а також було цитопротекторним. Аналогічні поліпшення захворювання внаслідок інгібування активності кальциневрину не спостерігали у мишей з відсутнім геном mdx (мутація гена дистрофіну), використовуваних як модель м'язової 1 UA 101177 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дистрофії Дюшенна, навіть незважаючи на те, що в обох моделях м'язової дистрофії спостерігали підвищений приплив кальцію. Дійсно, активований трансген для кальциневрину захищав мишей mdx (Chakkalakal et al., Hum. Mol. Genet., 2004, 13: 379-399; Stupka et al. Acta Neuropathol., 2004, 107: 299-310, але див. De Luca et al., Am. J. Pathol., 2005, 166: 477-489). Авторами Parsons et al. ідентифікований кальциневрин як потенційна мішень для терапевтичних агентів ПКМД. На підставі цих спостережень Parsons et al. припустили, що інгібування активності кальциневрину може забезпечити певну користь при вибраних типах м'язових захворювань, таких як поясно-кінцивкова м'язова дистрофія, і що, отже, циклоспорин A (CsA) міг би мати потенційну користь. Ефекторні механізми, які викликають прогресуючу дегенерацію м'язових волокон, індуковану зміненою проникністю мембрани при ПКМД, погано зрозумілі та є предметом активних досліджень, які можуть забезпечити основу для кінцевої розробки основаних на механізмі нових стратегій лікування для пацієнтів, що страждають цим розладом. Зараз, однак, відсутній ефективний спосіб, доступний для лікування пацієнтів, що страждають ПКМД. Тому існує необхідність у нових терапевтичних підходах, таких як описані в даній заявці. Мета даного винаходу полягає в забезпеченні лікарів терапією для лікування як індукції, так і прогресування некрозу м'язових волокон та дегенерації м'яза у пацієнта, що страждає ПКМД, і, зокрема, саркогліканопатією, більш конкретно, ПКМД типу 2F. Ця терапія повинна захищати проти некрозу дистрофічних кістякових м'язів, а також серцевого і діафрагмального м'яза, та повинна сповільнити прогресування захворювання. Автори даного винаходу несподівано виявили, що введення неімуносупресивного похідного циклоспорину A (CsA), що не інгібує кальциневрин, суб'єкту, який страждає розладами, діагностованими як ПКМД, і, зокрема, саркогліканопатією, більш конкретно, ПКМД типу 2F, є ефективною терапією. Вони спостерігали, що введення неімуносупресивного похідного CsA [D3 4 MeAla] -[EtVal] -CsA зменшує м'язову патологію суб'єкта, у якого діагностований некроз м'язових волокон, зокрема, ПКМД, та більш конкретно, ПКМД типу 2F, а також дегенерацію і прогресування захворювання, а також нормалізує розподіл площі м'язових волокон шляхом зниження чутливості мітохондрій до латентного перевантаження кальцію. Суб'єкт може бути людиною або ссавцем, таким як, наприклад, миша, які проявляють фенотип м'язової дистрофії в результаті делеції гена або відсутності експресії гена, відповідального за фенотип захворювання. Таким чином, даний винахід стосується застосування неімуносупресивного похідного CsA формули I, більш конкретно, неімуносупресивного похідного CsA формули II, і найкраще, 3 4 неімуносупресивного похідного CsA [D-MeAla] -[EtVal] -CsA формули III, для одержання лікарського препарату для попередження або зменшення м'язової дегенерації у суб'єкта, що страждає ПКМД, і, зокрема, саркогліканопатією, більш конкретно, ПКМД типу 2F. Неімуносупресивні похідні CsA, придатні для застосування за даним винаходом, були також описані в міжнародній заявці на патент WO 2005/021028, Novartis AG, на сторінках 3-6. [D3 4 MeAla] -[EtVal] -CsA був розкритий авторами Wenger et al. у міжнародній заявці на патент WO 3 4 00/01715. [D-MeAla] -[EtVal] -CsA формули III наданий реєстраційний номер CAS 254435-95-5. Неімуносупресивні похідні CsA, застосовні в даному винаході, є циклічними ундекапептидами, описуваними наведеною нижче формулою: де W позначає MeBmt, дигідро-MeBmt, 8’-гідрокси-MeBmt або O-ацетил-MeBmt, X позначає αAbu, Val, Thr, Nva або O-метилтреонін (MeOThr), R позначає Pro, Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla або (D)-MeSer(O-ацетил), Y позначає MeLeu, тіоMeLeu, γ-гідрокси-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle або MeaThr; N-етилVal (EtVal), N-етилIle, N-етилThr, N-етилPhe, N-етилTyr або N-етилThr(O-ацетил), де Y не може бути MeLeu, коли R позначає Sar, Z позначає Val, Leu, MeVal або MeLeu, Q позначає MeLeu, γ-гідрокси-MeLeu, MeAla або Pro, T1 позначає (D)Ala або Lys, T2 позначає MeLeu або γ-гідрокси-MeLeu, та T3 позначає MeLeu або MeAla. 2 UA 101177 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 де W позначає MeBmt, дигідро-MeBmt, 8’-гідрокси-MeBmt; X позначає αAbu, Val, Thr, Nva або O-метилтреонін (MeOThr); R позначає Pro, Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla або (D)-MeSer(O-ацетил); Y позначає MeLeu, тіоMeLeu, γ-гідрокси-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle або MeaThr; N-етилVal (EtVal), N-етилIle, N-етилThr, N-етилPhe, N-етилTyr або N-етилThr(O-ацетил), де Y не може бути MeLeu, коли R позначає Sar; Z позначає Val, Leu, MeVal або MeLeu; Q позначає MeLeu, γ-гідрокси-MeLeu або MeAla; T1 позначає (D)Ala; T2 позначає MeLeu; та T3 позначає MeLeu. де W позначає MeBmt; X позначає αAbu; R позначає (D)-MeAla; Y позначає N-етилVal (EtVal); Z позначає Val; Q позначає MeLeu; T1 позначає (D)Ala; T2 позначає MeLeu; і T3 позначає MeLeu, і де MeBmt позначає N-метил-(4R)-4-бут-2E-ен-1-іл-4-метил-(L)треонін, αAbu позначає L-αаміномасляну кислоту, D-MeAla позначає метил-D-аланін, EtVal позначає N-етил-L-валін, Val позначає L-валін, MeLeu позначає N-метил-L-лейцин, Ala позначає L-аланін, (D)Ala позначає Dаланін, і MeVal позначає N-метил-L-валін. Загальноприйнята нумерація положень амінокислот, звичайно використовувана в посиланні на циклоспорин A, показана в наведеній нижче формулі. Складені назви використовують для похідних CsA, де ці складені назви включають першу частину, яка вказує ідентичність залишків, що відрізняються від залишків у циклоспорині A, і дає їх положення, та другу частину, позначену "CsA", яка вказує, що всі інші залишки ідентичні 4 залишкам у циклоспорині A. Наприклад, [MeIle] -CsA позначає циклоспорин, який ідентичний циклоспорину A, за винятком того, що MeLeu у положенні 4 замінений MeIle (метил-Lізолейцином). У наступній формі здійснення винахід стосується неімуносупресивного похідного циклоспорину A формули I, краще, неімуносупресивного похідного CsA формули II, і найкраще, 3 4 неімуносупресивного похідного CsA [D-MeAla] -[EtVal] -CsA формули III, для застосування при лікуванні ПКМД, зокрема, від саркогліканопатії, і більш конкретно, від ПКМД типу 2F. В іншій формі здійснення винахід стосується способу попередження або зменшення м'язової дегенерації у суб'єкта, що страждає ПКМД, і, зокрема, саркогліканопатією, більш конкретно, ПКМД типу 2F, який включає введення суб'єкту ефективної кількості неімуносупресивного похідного CsA формули I, краще, неімуносупресивного похідного CsA формули II, і найкраще, 3 4 неімуносупресивного похідного CsA [D-MeAla] -[EtVal] -CsA формули III. Ефективну кількість неімуносупресивного похідного циклоспорину А розуміють як кількість, яка при повторному введенні в ході терапевтичної схеми суб'єкту, що страждає ПКМД, і, зокрема, саркогліканопатією, та більш конкретно, ПКМД типу 2F, приводить в результаті до об'єктивної клінічної відповіді, такої як поліпшення, стабілізація або вповільнення прогресування захворювання. При введенні перорально ефективна кількість для добового введення або введення три рази на тиждень повинна становити від приблизно 1 мг/кг (маси тіла) до приблизно 100 мг/кг, краще, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг. Показане відповідне 3 UA 101177 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дозування для внутрішньовенного шляху може складати від приблизно 1 мг/кг до приблизно 50 мг/кг, краще, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 25 мг/кг. Крім того, винахід стосується фармацевтичної композиції для попередження або зменшення м'язової дегенерації у суб'єкта, що страждає ПКМД, і, зокрема, саркогліканопатією, та більш конкретно, ПКМД типу 2F, яка містить ефективну кількість неімуносупресивного похідного CsA формули I, краще, неімуносупресивного похідного CsA формули II, і найкраще, 3 4 неімуносупресивного похідного CsA [D-MeAla] -[EtVal] -CsA формули III, фармацевтично прийнятний носій і, можливо, але необов'язково, ексципієнт та розріджувач. Розріджувач типово є водою. Ексципієнти, які типово додають в парентеральні препарати, включають ізотонічний агент, буфер або інший pH-регулюючий агент та консервант. Композиції можуть містити інші активні інгредієнти, такі як антибіотик, глюкокортикоїд, кортикостероїд, такий як, наприклад, преднізон. Даний винахід буде додатково пояснений нижче за допомогою наведених нижче графічних матеріалів. - На фіг. 1(a) представлене набрякання базового рівня, вимірюване як поглинання при 540 нм, мітохондрій з кістякового м'яза 6-тижневих мишей дикого типу (Wt) (білий стовпчик) та мишей scgd-/- (чорний стовпчик). Мітохондрії з групи підошовних м'язів, чотириглавого та переднього великогомілкового м'язів об'єднували. Як показує більш низький вимір поглинання, мітохондрії з м'язів мишей scgd-/- були більшою мірою набряклими при базовому рівні, ніж мітохондрії від мишей Wt. - На фіг. 1(б) представлені зміни в набряканні мітохондрій через 10 хвилин після обробки 2+ кальцієм (Ca ) або ПЕГ-3350 (ПЕГ), вимірювані як різниця у поглинанні при 540 нм між необробленими і обробленими мітохондріями від 6-тижневих мишей дикого типу (Wt) (білий стовпчик) та мишей scgd-/- (чорний стовпчик). Мітохондрії із групи підошовних м'язів, чотириглавого і переднього великогомілкового м'язів об'єднували. 3 4 - На фіг. 2(a) представлене зменшення м'язової патології після введення D-[MeAla] -[EtVal] CsA у мишей scgd-/-. Відношення маси м'язів (MW) до довжини великогомілкової кістки (TL) (MW/TL) вимірювали в ікроножному (Gastroc.), чотириглавому (Quad.), передньому великогомілковому (TA) та серцевому м'язах від мишей дикого типу (Wt), оброблених або носієм 3 4 (білий стовпчик), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (чорний стовпчик), чи від мишей scgd-/-, 3 4 оброблених або носієм (сірий стовпчик чи другий від кінця в групі), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA 3 4 (стовпчик із точковою заливкою або останній стовпчик у групі). D-[MeAla] -[EtVal] -CsA запобігає збільшенню маси м'яза у мишей scgd-/-, обумовленому захворюванням. 3 4 - На фіг. 2(б) представлене зменшення м'язової патології після введення D-[MeAla] -[EtVal] CsA у мишей scgd-/-, спостережуване в репрезентативних зрізах, пофарбованих гематоксиліном та еозином, чотириглавого м'яза від мишей дикого типу (Wt) та мишей scgd-/-, оброблених D3 4 [MeAla] -[EtVal] -CsA. Також показані відповідні контролі носія. 3 4 - На фіг. 2(в) представлене зменшення м'язової патології після введення D-[MeAla] -[EtVal] CsA у мишей scgd-/-, оцінюване шляхом кількісного визначення площ волокон у зрізах, пофарбованих трихромом, з діафрагми (Diaph.), переднього великогомілкового м'яза (TA), ікроножного м'яза (Gastroc.), чотириглавого м'яза (Quad). Оцінювали зрізи від мишей дикого 3 4 типу (Wt), оброблених або носієм (білий стовпчик), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (чорний стовпчик), та від мишей scgd-/-, оброблених або носієм (сірий стовпчик чи другий стовпчик від 3 4 кінця в групі), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (стовпчик із точковою заливкою чи останній стовпчик 3 4 групи). D-[MeAla] -[EtVal] -CsA зменшував фіброз у мишей scgd-/-. - На фіг. 3(a) представлене зменшення гетерогенності площі м'язових волокон у м'язі від 3 4 мишей scgd-/- після введення D-[MeAla] -[EtVal] -CsA, яку оцінювали шляхом кількісного визначення розподілу площ волокон у передньому великогомілковому (м'язі). Дослідження 3 включало мишей дикого типу (Wt), оброблених або носієм (білий стовпчик), або D-[MeAla] 4 [EtVal] -CsA (чорний стовпчик), та мишей scgd-/-, оброблених або носієм (сірий стовпчик чи 3 4 другий стовпчик від кінця в групі), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (стовпчик із точковою заливкою чи 3 останній стовпчик у групі). (“” позначає "вище"). Обробка D-[MeAla] 4 [EtVal] -CsA нормалізувала гетерогенність площі волокон у мишей scgd-/-. - На фіг. 3(б) представлене зменшення гетерогенності площі м'язових волокон у м'язі від 3 4 мишей scgd-/- після введення D-[MeAla] -[EtVal] -CsA, яку оцінювали шляхом кількісного визначення розподілу площ волокон в ікроножному (м'язі). Дослідження включало мишей дикого 3 4 типу (Wt), оброблених або носієм (білий стовпчик), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (чорний стовпчик), та мишей scgd-/-, оброблених або носієм (сірий стовпчик або другий стовпчик від 3 4 кінця в групі), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (стовпчик із точковою заливкою або останній стовпчик 3 4 групи). (“” позначає "вище"). Обробка D-[MeAla] -[EtVal] -CsA 4 UA 101177 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нормалізувала гетерогенність площ волокон у мишей scgd-/-. - На фіг. 3(в) представлене зменшення гетерогенності площі м'язових волокон у м'язі від 3 4 мишей scgd-/- після введення D-[MeAla] -[EtVal] -CsA, яку оцінювали шляхом кількісного визначення розподілу площ волокон у чотириглавому м'язі. Дослідження включало мишей 3 4 дикого типу (Wt), оброблених або носієм (білий стовпчик), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (чорний стовпчик), та мишей scgd-/-, оброблених або носієм (сірий стовпчик чи другий стовпчик від кінця 3 4 в групі), або D-[MeAla] -[EtVal] -CsA (стовпчик із точковою заливкою чи останній стовпчик групи). 3 4 (“” позначає "вище"). Обробка D-[MeAla] -[EtVal] -CsA нормалізувала гетерогенність площ волокон у мишей scgd-/-. Якщо підвищена концентрація кальцію служить ініціатором ПКМД шляхом некрозу м'язових волокон, ряд нижчележачих кальцій-залежних ефекторів можна потенційно вважати причинними факторами. Наприклад, підвищений кальцій може призвести до некрозу м'язових трубочок шляхом активації активованої кальцієм протеази калпаїну, сигнального білка, критично залученого у регенерацію кістякових м'язів після ушкодження і в диференціацію скелетном'язових клітин. Автори Parsons et al. (2007) показали в мишачій моделі ПКМД, що інгібування активності активованої кальцієм/кальмодуліном серинової/треонінової протеїнфосфатази кальциневрину в результаті генетичної делеції зменшувало дегенерацію і запалення кістякового м'яза та м'язових волокон, тобто, поліпшувало патологію кістякового м'яза. Цього не було у випадку мишачої моделі дистрофії Дюшенна, де інгібування кальциневрину CsA було шкідливим для м'язової патології (Stupka et al., Acta Neuropathol., 2004, 107:299-310). Ця розбіжність у наслідках інгібування активності кальциневрину при різних дистрофіях, що характеризуються підвищеними концентраціями кальцію в м'язових клітинах, переважно, є наслідком їх відповідних різних генетичних делецій, що залучають, та діють на, різні зміни мембран м'язових клітин та різні шляхи передачі сигналу. Іншим основним механізмом, який веде до клітинного некрозу, є перевантаження мітохондріального кальцію, яке вторинно підсилює утворення активних форм кисню (АФК) та додатково сприяє MPT (зміні мембранної проникності мітохондрій). Підвищений субсарколемний кальцій також сприяє локальному підвищенню активних форм кисню (АФК), що приводить до більш значних дефектів у клітинній мембрані і додатковому надходженню кальцію, що додатково сприяє клітинному некрозу та/або апоптозу. Були проведені експерименти з експериментальної перевірки існування причинного зв'язку між відсутністю гена scgd, прогресуючою дегенерацією м'язових волокон та клітинним некрозом та/або апоптозом, індукованим мітохондріальною дисфункцією. Щоб оцінити, чи може індукована кальцієм мітохондріальна дисфункция ініціювати і направляти прогресуючу дегенерацію м'язових волокон, обумовлену ПКМД, автори даного винаходу порівнювали мітохондрії, виділені з дистрофічного кістякового м'яза мишей scgd-/- та мишей дикого типу. Мітохондрії, виділені шляхом гомогенізації в буфері, що містить сахарозу (250 мМ сахарози, 10 мМ трис (pH 7,4), 1 мМ ЕДТА), із групи підошовних м'язів, чотириглавого і переднього великогомілкового м'язів, суспендували після промивань та центрифугування в ізотонічному буфері (120 мМ KCl, 10 мМ трис (pH 7,4), 5 мМ KH2PO4) та тестували в аналізі набрякання. Цей аналіз полягав в інкубації виділених мітохондрій з 200 мкМ CaCl 2 (набрякання) або 5 % (мас./об.) ПЕГ-3350 (зморщування). Набрякання дає зменшення, а зморщування збільшення поглинання при 540 нм. Результати представлені у вигляді середніх значень ± СОС (стандартна похибка середніх) (фіг. 1 (a) та фіг. 1 (б)). Використовували двовибірковий tкритерій Стьюдента, і значення вважали значущими тільки при p