Похідна 1,2,3,4-тетрагідрохіноліну, придатна для лікування діабету

Реферат: Цей винахід стосується сполуки наведеної нижче формули UA 110983 C2 (12) UA 110983 C2 O OH * O S O N або її фармацевтично прийнятної солі, способу лікування діабету з використанням цієї сполуки і способу одержання згаданої сполуки. UA 110983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Діабет становить серйозну проблему охорони здоров'я, з якою стикається світ, що розвивається. Бажаним було б надання безпечного та ефективного способу лікування діабету шляхом перерального введення лікарських засобів. Як вважають, деякі успішні наявні на ринку пероральні лікарські засоби для лікування діабету другого типу (T2D) діють шляхом модуляції PPAR-гамма-рецептора (гамма-рецептор, що активується проліфераторами пероксисом). Введення цих лікарських засобів пов'язане з небажаними побічними ефектами, які іноді включають гіпоглікемію, ураження печінки, шлунково-кишкові захворювання, збільшення маси тіла або інші небажані ефекти, які можуть бути пов'язані з активністю PPAR-гамма-рецептора. Нові варіанти лікарських засобів, які пропонують більш бажаний профіль безпеки для надання медичної допомоги у разі T2D, є бажаними для ефективного лікування або профілактики діабету у більшості пацієнтів. Зокрема, особливо бажаними є методи лікування на основі нових механізмів, які можуть звести до мінімального рівня або забезпечити уникнення наслідків, пов'язаних з активацією PPAR-гамма. Є повідомлення, що G-білок-зв'язаний рецептор 40 (GPR-40), також відомий як рецептор 1 вільних жирних кислот (FFA1 або FFAR1), експресується на високих рівнях переважно бетаклітинами підшлункової залози гризунів, лініями клітин інсуліноми та панкреатичними острівцями людини. Цей рецептор активується середньоланцюговими і довголанцюговими жирними кислотами. Глюкозозалежна секреція інсуліну є важливою особливістю активації GPR40, що робить цей рецептор відмінною мішенню для розробки ефективних методів лікування з бажаним профілем безпеки для використання при лікуванні цукрового діабету другого типу. Особливо бажаними можуть бути сполуки, які пропонують ефективність і більш бажаний профіль безпеки в порівнянні з існуючими лікарськими засобами, такими як інсулін і сульфонілсечовини. Дві нещодавно опубліковані патентні заявки, US20110092531 і WO2011066183, розкривають сполуки, що мають спіро-біциклічну групу, яка проявляє GPR-40 активність. Цей винахід пропонує сполуку для лікування діабету, зокрема T2D. Сполука за цим винаходом являє собою потужний активатор GPR-40. Цей винахід пропонує бажаний новий варіант лікарського засобу, фармакологічний механізм дії якого є специфічним у зіставленні з наявними на ринку лікарськими засобами, і також пропонує сполуку, яка селективно активує саме GPR-40 на противагу PPAR-гамма. Фармакологічний профіль сполуки за цим винаходом, яка є селективним активатором GPR40, може бути особливо бажаним для використання в лікуванні цукрового діабету другого типу. Крім того, селективна модуляція GPR-40 може забезпечити особливо бажаний профіль безпеки для використання при лікуванні цукрового діабету другого типу завдяки униканню впливу, пов'язаного з модуляцією PPAR-гамма. Цей винахід пропонує наведену нижче сполуку формули І: або її фармацевтично прийнятну сіль. Сполука за цим винаходом може мати хіральний атом вуглецю, позначений у наведеній вище структурі зірочкою (*). Сполука, якій віддають перевагу, має конфігурацію, показану вище, яка традиційно позначається як S-конфігурація. Цей винахід також пропонує фармацевтичну композицію, яка містить описану вище сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, розріджувачами або наповнювачами. 1 UA 110983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Цей винахід також пропонує фармацевтичну композицію, яка містить описану вище сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, розріджувачами або наповнювачами і факультативно одним або декількома терапевтичними засобами. Цей винахід також пропонує спосіб лікування діабету у ссавця. Згаданий спосіб включає введення ссавцю, що потребує лікування, описаної вище сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, цей винахід пропонує спосіб лікування діабету другого типу у ссавця, що потребує лікування, шляхом введення ссавцю описаної вище сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий ссавець являє собою людину. Цей винахід також пропонує спосіб лікування діабету у ссавця шляхом введення ссавцю, що потребує лікування, фармацевтичної композиції, яка містить описану вище сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, цей винахід пропонує спосіб лікування діабету другого типу у ссавця, що потребує лікування, шляхом введення цьому ссавцю фармацевтичної композиції, яка містить описану вище сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий ссавець являє собою людину. Цей винахід пропонує описану вище сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль для застосування в терапії. За ще одним аспектом цей винахід пропонує описану вище сполуку Формули І, її фармацевтично прийнятну сіль або фармацевтичну композицію для застосування в лікуванні цукрового діабету у ссавця, що цього потребує. За варіантом, якому віддають перевагу, це застосування спрямоване на лікування діабету другого типу, і згаданим ссавцем є людина. Цей винахід пропонує застосування сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі у виготовленні лікарського засобу для лікування цукрового діабету. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий лікарський засіб призначений для лікування діабету другого типу і для лікування ссавця, зокрема людини. За ще одним аспектом цей винахід пропонує проміжну хімічну сполуку Формули II де R вибраний з групи, яку складають С1-4-алкіл, С1-4-галогеналкіл, С3-6-циклоалкіл, С1-4алкіл-С3-6-Циклоалкіл, феніл і С1-5-алкілфеніл, для одержання сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі. До груп R, яким віддають перевагу, належать С 1-2-алкіл, C1-2галогеналкіл, феніл і C1-2-алкілфеніл. До груп R, яким віддають особливу перевагу, належать метил, етил, феніл та бензил. Цей винахід також пропонує спосіб одержання описаної вище (3S)-3-[4-[[5-[(8-метокси-3,4дигідро-2Н-хінолін-1-іл)метил]-2-тієніл]метокси]феніл]гекс-4-инової кислоти Формули І. Цей спосіб включає відщеплення захисних груп або деестерифікацію проміжної хімічної сполуки Формули II з одержанням сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі. Фахівець в цій галузі легко зрозуміє і зможе здійснити реакції відщеплення захисних груп без зайвого експериментування. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що крім карбонової кислоти або захищеної карбонової кислоти і замість них можуть бути використані інші функціональні групи, які можуть бути легко перетворені на карбонову кислоту. Такі функціональні групи, препаративні методики і перетворення цих груп на карбонові кислоти можна знайти в 2 UA 110983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 "Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations" by Larock. R.C, Wiley VCH, 1999 та в "March's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms and Structure" Smith, M.B., and March, J., Wiley-Interscience, 6th Ed. 2007. Сполука за цим винаходом, (3S)-3-[4-[[5-[(8-метокси-3,4-дигідро-2Н-хінолін-1-іл)метил]-2тієніл]метокси]феніл]гекс-4-инова кислота, може бути надана у вигляді фармацевтично прийнятної солі. Словосполучення "фармацевтично прийнятна сіль" означає солі сполуки за цим винаходом, які вважаються прийнятними для клінічного та/або ветеринарного застосування. Фармацевтично прийнятні солі і загальна методологія їх одержання є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, P. Stahl, et al, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977. Словосполучення "фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач" означає, що носій, розріджувач та наповнювачі є фармацевтично сумісними з іншими інгредієнтами композиції. Певні замісники на наведених нижче Схемах не показані заради ясності, що не має на меті будь-якого обмеження суті вказаних Схем. Крім того, окремі ізомери, енантіомери або діастереоізомери можуть бути виділені в будь-якій зручній точці у процесі синтезу сполуки Формули І такими методами, наприклад, як хіральна хроматографія. Крім того, проміжні хімічні сполуки, розкриті у наведених нижче Схемах і препаративних методиках, містять ряд азотних, гідроксильних та кислотних захисних груп, таких як складні ефіри. Різні захисні групи можуть бути однаковими або різними у кожному випадку, залежно від конкретних реакційних умов і конкретних перетворень, що відбуваються. Умови захисту та відщеплення захисних груп добре відомі фахівцю у цій галузі і описані у літературі. Дивись, наприклад, Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (T. Greene and P. Wuts, eds., 2d ed. 1991). Скорочення, які вжиті у цьому описі, визначені за Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984. Інші скорочення визначені так: "ADDP" означає 1-(азодикарбоніл)дипіперидин; "BSA" означає бичачий сироватковий альбумін; "DIBAL-H" означає гідрид діізобутилалюмінію, "DIPEA" означає діізопропілетиламін; "DMEM" означає модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла; "DTT" означає дитіотреїтол; "ESI" означає іонізацію електророзпилюванням; "EtOAc" означає етилацетат; "EtOH" означає етиловий спирт або етанол; "F12" означає середовище Ham F12; "FBS" означає фетальну бичачу сироватку; "НЕК" означає лінію клітин нирок людського зародка; "ІС50" означає концентрацію агента, яка спричинює 50 % максимальну пригнічувальну реакцію, можливу для цього агента; "МеОН" означає метиловий спирт або метанол; "NBS" означає Nбромсукцинімід; "PPAR" означає рецептор, що активується проліфераторами пероксисом; "PPRE" означає чутливий елемент проліфератора пероксисом; "RFU" означає відносну одиницю флуоресценції; "RPMI" означає Онкологічний інститут імені Розуелла Парка (Roswell Park Memorial Institute); "к.т." означає кімнатну температуру; "THF" означає тетрагідрофуран; і "ТК" означає тимідинкіназу. Термін "алкіл", вжитий у цьому описі, означає алкіл з нерозгалуженим ланцюгом, такий як етил або н-пропіл, чи алкіл з розгалуженим ланцюгом, такий як ізопропіл або трет-бутил. Термін "С1-4-галогеналкіл" означає алкільну групу, яка має 1, 2, 3 або більше галогенових груп, приєднаних до атомів вуглецю алкільного ланцюга. За наявності двох або більше галогенів, ці галогени не повинні бути прикріпленими до одного й того самого атома вуглецю. Цей термін також означає пергалогеналкіли, де всі атоми водню алкільної групи замінені галогеном. Усі замісники на наведених нижче схемах, якщо не зазначено інше, відповідають наведеному вище визначенню. Зазначені реагенти та вихідні матеріали є, як правило, легкодоступними для будь-якого фахівця у цій галузі. Інші можуть бути одержані за стандартними методами органічної хімії та хімії гетероциклів, що є аналогічними методам синтезу відомих структурно подібних сполук, та за методиками, описаними у наведених нижче Препаративних методиках та Прикладах, в тому числі будь-якими новими методиками. 3 UA 110983 C2 5 10 Препаративні методики і Приклади Наведені нижче Препаративні методики і Приклади ілюструють винахід і являють собою типовий синтез сполуки Формули (І). Сполуки названі із застосуванням пакетів програм IUPACNAME ACDLABS або Symyx Draw 3.2. Препаративна методика 1 8 -Метоксихінолін До розчину 8-гідроксихіноліну (250 г, 1,724 моль) в THF (10 л) при температурі навколишнього середовища додають гідроксид калію (435 г, 7,76 моль), і перемішують. Додають 4 UA 110983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 краплями метилйодид (435 г, 2,58 моль), і перемішують протягом ночі. Реакційну суміш фільтрують, і одержану тверду речовину промивають THF (2 л). Розчин концентрують досуха, додають воду, екстрагують дихлорметаном (2 × 3 л), органічні шари об'єднують, і промивають розсолом. Органічні шари збирають, і сушать сульфатом натрію. Тверді речовини видаляють фільтруванням. Фільтрат збирають, концентрують при зниженому тиску до одержання червоного масла, яке твердне при відстоюванні, та одержують вказану в заголовку сполуку (281 г, 102 %), яка може бути використана без подальшого очищення. ESI (m/z) 160(M+H). Препаративна методика 2 8-Метокси-1,2,3,4-тетрагідрохінолін До розчину 8-метоксихіноліну (425 г, 2,673 моль) в EtOH (9 л) додають розчин ціаноборогідриду натрію (505 г, 8,11 моль) в ЕtOН (1 л), і перемішують. Реакційну суміш охолоджують до внутрішньої температури 0 °C, і впродовж 60 хв додають краплями НСl (35 %, 1,12 л, 10,962 моль) так, щоб внутрішня температура не піднімалася вище 20 °C. Реакційну суміш витримують для нагрівання до температури навколишнього середовища, після чого нагрівають зі зворотним холодильником протягом 2,5 год. Охолоджують до температури навколишнього середовища, і перемішують протягом ночі. Додають гідроксид амонію (25 %, 1 л), розбавляють водою (15 л), і одержану суміш екстрагують дихлорметаном (3 × 10 л). Органічні шари об'єднують, і сушать сульфатом натрію. Тверді речовини видаляють фільтруванням. Фільтрат збирають, і концентрують при зниженому тиску до одержання залишку. Залишок очищають хроматографією на силікагелі, елююючи сумішшю етилацетат:гексан (1:10), та одержують вказану в заголовку сполуку (357 г, 82 %). ESI (m/z) 164(M+H). Препаративна методика З Метил-5-метилтіофен-2-карбоксилат До розчину 5-метилтіофен-2-карбонової кислоти (100 г, 0,703 моль) в МеОН (1л) протягом 20 хв при температурі 0 °C додають краплями тіонілхлорид (153 мл, 2,1 моль), і перемішують. Після закінчення додавання реакційну суміш нагрівають зі зворотним холодильником протягом 3,5 год. Охолоджують, і концентрують у вакуумі до одержання густого масла. Масло розбавляють етилацетатом (500 мл), і послідовно промивають водою (300 мл), потім розсолом (300 мл). Органічний шар сушать сульфатом натрію. Тверді речовини видаляють фільтруванням. Фільтрат збирають, і концентрують при зниженому тиску до одержання вказаної в заголовку сполуки (106 г, 97 %), яку використовують без подальшого очищення. ESI (m/z) 156(M+H). Препаративна методика 4 Метил-5-(бромметил)тіофен-2-карбоксилат До розчину метил-5-метилтіофен-2-карбоксилату (258 г, 1,65 моль) в хлороформі (2,6 л) при кімнатній температурі додають свіжоперекристалізований NBS (323,8 г, 1,81 моль), і перемішують. Додають пероксид бензоїлу (3,99 г, 0,016 моль), і реакційну суміш нагрівають зі зворотним холодильником протягом 7 год. Реакційну суміш охолоджують до температури навколишнього середовища, і фільтрують через діатомову землю. Відфільтрований осад промивають хлороформом (250 мл). Органічні шари збирають, розчинник видаляють, та одержують вказану в заголовку сполуку (388 г, 100 %), яку використовують без подальшого очищення. ESI (m/z) 236(M+H). Препаративна методика 5 Метил-5-[(8-метокси-3,4-дигідро-2Н-хінолін-1-іл)метил]тіофен-2карбоксилат До розчину 8-метокси-1,2,3,4-тетрагідрохіноліну (300 г, 1,84 моль) в ЕtOН (1л) додають розчин метил-5-(брометил)тіофен-2-карбоксилату (432,5 г, 1,84 моль) в ЕtOН (500 мл), і перемішують. Додають краплями DIPEA (641 мл, 3,67 моль), і перемішують при кімнатній температурі протягом ночі. Після завершення реакції ЕtOН видаляють у вакуумі, та додають воду (5 л). Водний шар екстрагують етилацетатом (3 × 3 л), органічні шари об'єднують, і сушать сульфатом натрію. Розчин фільтрують, і концентрують при зниженому тиску до одержання залишку. Залишок очищають хроматографією на силікагелі, елююючи сумішшю етилацетат:гексан (6:94), та одержують вказану в заголовку сполуку (325 г, 56 %). ESI (m/z) 318(M+H). Препаративна методика 6 [5-[(8-Метокси-3,4-дигідро-2Н-хінолін-1-іл)метил]-2-тієніл]метанол До розчину метил-5-(8метокси-3,4-дигідрохінолін-1 (2Н)-іл)метил)тіофен-2-карбоксилату (281 г, 0,886 моль) в THF (4 л) при температурі -70 °C при перемішуванні повільно через канюлю протягом 1,5 год. додають DIBAL-H (1 Μ розчин в толуолі, 2,7 л, 2,66 моль). Завершення реакції контролюють за допомогою тонкошарової хроматографії (TLC). Після завершення реакції реакційну суміш витримують для нагрівання до температури 20 °C, і додають насичений розчин хлориду амонію. Додають розчин калійнатрійтартрату (1,3 кг в 5 л води), і перемішують протягом ночі. 5 UA 110983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Органічний шар відділяють, водну фазу екстрагують етилацетатом (2 × 5 л), потім органічні шари об'єднують, і об'єднані органічні шари сушать сульфатом натрію. Тверді речовини видаляють фільтруванням. Розчинник з фільтрату видаляють при зниженому тиску, та одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді білої твердої речовини (252 г, 98 %). ESI (m/z) 290(M+H). Препаративна методика 7 Етил-(38)-3-[4-[[5-[(8-метокси-3,4-дигідро-2Н-хінолін-1-іл)метил]-2-тієніл]метокси] феніл] гекс4-иноат До розчину ADDP (282,5 г, 1,5 екв.) у THF (3 л) додають трибутилфосфін (50 % розчин в ЕЮ Ас, 543 мл, 1,34 моль), і суміш охолоджують до внутрішньої температури 0 °C, після чого перемішують протягом 15 хв. Протягом 15 хв додають краплями розчин (8)-етил-3-(4гідроксифеніл)гекс-4-иноату (173,5 г, 0,747 моль) в THF (3 л), потім додають краплями розчин 5((8-метокси-3,4-дигідрохінолін-1 (2Н)-іл)метил)тіофен-2-іл)метанолу (216 г, 0,747 моль) в THF (5 л). Реакційну суміш витримують для нагрівання до температури навколишнього середовища, і перемішують протягом ночі. Реакційну суміш фільтрують через діатомову землю, і відфільтрований осад промивають етилацетатом (2 л). Органічний фільтрат концентрують досуха. Додають воду (4 л), екстрагують етилацетатом (3 × 5 л), органічні шари об'єднують, і об'єднані органічні шари сушать сульфатом натрію. Тверді речовини відфільтровують, і концентрують при зниженому тиску до одержання масла. Залишок очищають хроматографією на силікагелі, елююючи сумішшю етилацетат:гексан (6:94), та одержують вказану в заголовку сполуку (167 г, 44 %). ESI (m/z) 504(M+H). Приклад 1 (З S)-3 - [4- [[5 -[(8-Метокси-3,4-дигідро-2Н-хінолін-1 -іл)метил] -2-тієніл]метокси] феніл]гекс До розчину (S)-етил-3-(4-((5-8-метокси-3,4-дигідрохінолін-1 (2Н)-іл)метил)тіофен-2іл)метокси)феніл)гекс-4-иноату (149 г, 0,296 моль) в ЕtOН (1,49 л) при кімнатній температурі додають розчин гідроксиду калію (49,76 г, 0,88 моль) у воді (372 мл), і перемішують протягом ночі. Реакційну суміш концентрують досуха, і додають воду (1,3 л). Одержаний розчин екстрагують етилацетатом (2 × 300 мл), і шари розділяють. Рівень рН водного шару доводять до рН=6, додаючи 2н розчин НС1. Утворені тверді речовини збирають. Тверді речовини перекристалізовують з гарячого МеОН (298 мл, 2 об'єми), та одержують вказану в заголовку сполуку (91 г, 65 %). ESI (m/z) 476(M+H). GPR40: Інформація Результати досліджень з використанням трансгенних мишей, що надекспресують ген GPR40 людини під контролем промотора інсуліну II, нещодавно повідомлені Нагасумі (Nagasumi), також підтверджують, що GPR40 відіграє важливу роль у регуляції GDIS (глюкозозалежна секреція інсуліну) і рівнів глюкози плазми in vivo, особливо в моделях інсулінової резистентності на гризунах. Nagasumi К., et. al., Over expression of GPR40 in pancreatic β-cells augments glucosestimulated insulin secretion and improves glucose tolerance in normal and diabetic mice, Diabetes 58: 1067-1076, 2009. Див ись також Briscoe CP et al., The orphan G protein-coupled receptor GPR40 is activated by medium and long chain fatty acids, Journal Biological Chemistry 278: 11303-11311, 2003. Ці результати також підтверджують, що розробка нових модуляторних сполук GPR40 6 UA 110983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 може бути особливо бажаною для використання в лікуванні цукрового діабету другого типу. Первісне дослідження надлишкового виділення кальцію. Сполуку Прикладу 1 випробовують по суті так, як описано нижче. При проведенні первісного дослідження надлишкового виділення кальцію випробовувана сполука демонструє значення ЕС50 нижче ніж 1 мкМ. Це дослідження використовується для скринінгу сполук шляхом визначення підвищення рівнів внутрішньоклітинного кальцію, яке відбувається, коли ліганд зв'язує і активує GPR40, демонструючи тим самим активність і ефективність агоністів GPR40. Для проведення цього дослідження використовують клітини НЕК293, що надекспресують кДНК людського GPR40, які підтримують у модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла із середовищем F12 у співвідношенні 3:1, доповнених 10 % FBS і 800 мкг/мл генетицину, при температурі 37 °C і 5 % СО2. Дослідження агоністів виконують із застосуванням аналітичного набору Calcium 4 Dye assay kit (Molecular Devices) у присутності 0,1 % BSA без жирних кислот в аналітичному буфері (lxHBSS (збалансований сольовий розчин Хенкса) і 20 мМ розчині ГЕПЕС-буфера (4-(2гідроксіетил)-1-піперазинетансульфонова кислота). Активацію рецептора визначають як підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію із застосуванням флюорометричного томографічного планшет-рідера (FLIPR). Для визначення реакції агоніста використовують максимальну зміну флуоресценції в порівнянні з базовою лінією. ЕС 50 (ефективна концентрація, що забезпечує половинне значення максимальної реакції) сполуки обчислюють за допомогою програми Excel Fit (версія 4; IDBS) шляхом побудови кривої залежності між концентрацією та відносними одиницями флуоресценції (RFU). Відсоткову ефективність обчислюють на основі максимальної реакції, продемонстрованої сполукою, у порівнянні з природним лігандом, лінолевою кислотою. Згадана досліджувана сполука Прикладу 1 у цьому дослідженні продемонструвала ЕС50 152+/-52 нМ з 84+/-24 % ефективністю. Ці результати також демонструють бажану активність і ефективність цієї сполуки як агоніста GPR40. Дослідження глюкозозалежної секреції інсуліну (GDIS) Оскільки відомо, що активація GPR40 призводить до секреції інсуліну, яка залежить від високих концентрацій глюкози, були розроблені дві окремі аналітичні системи (лінія клітин інсуліноми і ембріональні острівці гризунів) для подальшого визначення характеристик сполук, які, як відомо, збільшують рівні внутрішньоклітинного кальцію в обговореному вище первісному дослідженні GPR40. Дослідження GDIS виконують з використанням лінії клітин мишачої інсуліноми Міпб. Клітини Мin6 підтримують у модифікованому за методом Дульбекко середовищі Ігла (DMEM), яке містить замінні амінокислоти, 10 % FBS, 50 мМ 2-меркаптоетанолу та 1 % пеніциліну і стрептоміцину, при температурі 37 °C, плюс 5 % СО2. У день експерименту клітини двічі промивають 200 мкл попередньо підігрітого буферного розчину Кребса-Рінгера без глюкози. Додавання 200 мкл попередньо підігрітого буферного розчину Кребса-Рінгера, який містить 2,5 мМ глюкози, використовують для виснажування клітин з подальшим додаванням сполук у присутності високої концентрації глюкози (25 мМ). Планшет інкубують при температурі 37 °C протягом 2 год. Наприкінці 2 год. інкубації супернатант обережно переносять на фільтраційний планшет Мilipore, і центрифугують при 200 g (гравітаційна сила) протягом 3 хв. Вміст інсуліну аналізують із застосуванням набору для визначення вмісту інсуліну Mercodia Insulin estimation kit. Додання сполуки Прикладу 1 (0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1,0 мкМ та 10,0 мкМ) і 25 мМ глюкози до клітин Мin6 спричинює дозозалежне підвищення секреції інсуліну зі статистично значущим (Р