Гідроксііндол, спосіб його одержання, лікарська форма на його основі та спосіб її одержання

1 Гідроксиндол формули (І) та його солі, е Д1 5 R, R e -Сі 12-алкілом нормальної або розгалуженої будови, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -NHCi 6 -алкіл, -N(Ci 6алкіл)2, -NHC614-арил, -Г\І(Сє і4-арил)2, -N(Ci 6алкіл)-(С 6 14-арил), -NHCOR 6 , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci 6алкіл, -S-C 6 14-арил, -SOR 6 , -SO 3 H, -SO 2 R ti , OSO 2 Ci б-алкіл, -OSO 2 C 6 14-арил, -(CS)R 6 , -COOH, -(CO)R 6 , моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиче ними гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, -С 2 і 2 -алкенілом нормальної або розгалуженої будови, який містить один або кілька ненасичених зв'язків, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -NHCi 6 -алкіл, -N(Ci 6алкіл) 2 , -NHC614-арил, -Г\І(Сє і4-арил) 2 , -N(Ci 6алкіл)-(С 6 14-арил), -NHCOR 6 , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci 6алкіл, -S-C 6 14-арил, -SOR 6 , -SO 3 H, -SO 2 R b , OSO 2 Ci б-алкіл, -OSO 2 C 6 14-арил, -(CS)R 6 , -COOH, -(CO)R 6 , моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моноабо поліненасиченим карбоциклом з числом членів від 3 до 14, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -NHCi 6 -алкіл, -N(Ci 6алкіл) 2 , -NHC614-арил, -Г\І(Сє і4-арил) 2 , -N(Ci 6алкіл)-(С 6 14-арил), -NHCOR 6 , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci єалкіл, -S-C 6 14-арил, -SOR 6 , -SO 3 H, -SO 2 R b , OSO 2 Ci б-алкіл, -OSO 2 C 6 14-арил, -(CS)R 6 , -COOH, -(CO)R 6 , моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, О CO Ю 59443 моно-, ди- або трициклічним насиченим або моноабо поліненасиченим гетероциклом з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, Ота S, від 1 до 6, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH2, -NHCi 6-алкіл, -N(Ci 6алкіл)2, -NHC614-арил, -ІЧ(Сб і4-арил)2, -N(Ci єалкіл)-(С614-арил), -NHCOR6, -NO2, -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R6, -S-Ci 6алкіл, -S-C614-арил, -SOR6, -SO3H, -SO2R6, OSO2Ci б-алкіл, -OSO2C614-арил, -(CS)R6, -COOH, -(CO)R6, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, карбо- або гетероциклічним насиченим або моноабо поліненасиченим спіроциклом з числом членів від 3 до 10, в яких гетероциклічні системи містять від 1 гетероатома до 6 гетероатомів, серед яких перевага віддається N, Ота S, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH2, -NHCi 6-алкіл, -N(Ci 6алкіл)2, -ІЧНСє 14-арил, -ІЧ(Сб і4-арил)2, -N(Ci єалкіл)-(С614-арил), -NHCOR6, -NO2, -CN, -F, -СІ, -Br, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R6, -S-Ci 6алкіл, -S-C614-арил, -SOR6, -SO3H, -SO2R6, OSO2Ci б-алкіл, -OSO2C614-арил, -(CS)R6, -COOH, -(CO)R6, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, причому R1 і R5 можуть бути однаковими або різними, R2, R3 можуть бути атомами водню або -ОН, причому щонайменше одним з цих замісників має бути -ОН, R4e -Н, -ОН, -SH, -NH2, -NHCi 6-алкілом, -N(Ci 6-алкіл)2, -ІЧНСє 14-арилом, -ІЧ(Сб н-арил)2, -N(Ci б-алкіл)-(Сб 14-арил), -NHCOR6, -NO2, -CN, -COOH, -(CO)R6, (CS)R6, -F, -СІ, -Вг, -І, -О-Сі є-алкілом, -О-С614арилом, -O(CO)R6, -S-Ci є-алкілом, -S-Сє 14арилом, -SOR , -SO2R6, R6 може бути -H, -NH2, -NHCi 6-алкілом, -N(Ci 6-алкіл)2, -NHC614арилом, -Ы(Сб 14-арил)2, -N(Ci б-алкіл)(Сє 14-арил), О-Сі 6-алкілом, -О-Сб 14-арилом, -S-Ci є-алкілом, S-Сє 14-арилом, -Сі і2-алкілом нормальної або розгалуженої будови, -С2 і2-алкенілом нормальної або розгалуженої будови, який містить один або кілька ненасичених зв'язків, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моноабо поліненасиченим карбоциклом з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моноабо поліненасиченим гетероциклом з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, Ота S, від 1 до 6, А є або зв'язком, або -(CH2)m-, -(CH2)m-(CH=CH)n-(CH2)p-, -(CHOZ)m-, (С=О)-, (C=S)-, -(C=N-Z)-, -О-, -S-, -NZ-, де т , р=0-3 і п=0-2, і Ze -Набо -Сі і2-алкілом нормальної або розгалуженої будови, -С2 і2-алкенілом нормальної або розгалуженої будови, який МІСТИТЬ один або кілька ненасичених зв'язків, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моноабо поліненасиченим карбоциклом з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моноабо поліненасиченим гетероциклом з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, Ота S, від 1 до 6, В може бути атомом вуглецю або сірки, або (S=O)-, D може бути атомом кисню, сірки, СН 2 або N-Z, причому D може бути атомом сірки або СН 2 лише за умови, що В є атомом вуглецю, Е може бути або зв'язком, або -(СН2)т-, -О-, -S-, -(N-Z)-, де т і Z відповідають вищенаведеним значенням 2 Сполука за п 1, яка являє собою фізіологічно толерантну сіль сполуки формули (І) одержана нейтралізацією основ неорганічними або органічними кислотами чи нейтралізацією кислот неорганічними або органічними основами або перетворенням третинних амінів у четвертинні амонієві солі 3 Сполука за пп 1 або 2, що містить асиметричний атом вуглецю, у D-формі, L-формі, змішаних D,Lформах, а також, в разі присутності кількох асиметричних атомів вуглецю, у діастереомерних формах 4 Сполука за будь-яким з пп 1-3, зокрема, одна з нижчеперелічених сполук (1) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1-(4-фторбензил)5-пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (2) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1 -(4-фторбензил)5-пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, натрієва сіль, (3) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1 -(4-фторбензил)5-пдроксмндол-3-іл]-2-пдроксіацетамід, (4) N-(nipnflHH-4-in)-2-[1 -(2,6-дифторбензил)-5пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (5) М-(3,5-дихпорпіридин-4-іл)-2-[1 -(2,6дифторбензил)-5-пдроксмндол-3-іл]-2оксоацетамід, (6) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1 -(3-нітробензил)5-пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, натрієва сіль, (7) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-(1-пропіл-5-пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (8) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-(1-ізопропіл-5-пдроксиндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (9) ^(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-(1-циклопентилметил-5-пдроксиндол-3-іл]-2-оксоацетамід, 59443 (10) І\І-(2,6-дихлорфеніл)-2-[1 -(4-фторбензил)-5пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (11) М-(2,6-дихлор-4-трифторметилфеніл)-2-[1-(4фторбензил)-5-пдроксмндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (12) І\І-(2,6-дихлор-4-трифторметоксифеніл)-2-[1(4-фторбензил)-5-пдроксмндол-3-іл]-2оксоацетамід, (13) І\І-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1 -(4-фторбензил)-6-пдроксиндол-3-іл]-2-оксоацетамід, (14) М-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-5-пдрокси-1-(4-метоксибензил)-шдол-3-карбоновоі кислоти амід 5 Сполука за будь-яким з пп 1-4, призначена для використання як терапевтично активна речовина при виготовленні лікарської форми для лікування захворювань, при яких терапевтично корисним є пригнічення TNFa 6 Сполука за будь-яким з пп 1-4, призначена для використання як терапевтично активна речовина при виготовленні лікарської форми для лікування захворювань, при яких терапевтично корисним є пригнічення фосфодіестерази 4 7 Сполука за будь-яким з пп 1-4, призначена для використання як терапевтично активна речовина при виготовленні лікарської форми для лікування захворювань, пов'язаних зі впливом еозинофілів 8 Сполука за будь-яким з пп 1-4, призначена для використання як терапевтично активна речовина при виготовленні лікарської форми для лікування хронічних обструктивних захворювань легенів (COPD) 9 Спосіб одержання сполуки за будь-яким з пп 14, який відрізняється тим, що сполуку формули (І), де R2 або R3, або R2 та R3 є -O-R7, перетворюють у сполуку за цим винаходом шляхом відщеп Цей винахід стосується заміщених пдроксмндолів загальної формули 1, способу їх одержання, фармацевтичних композицій, які містять ці сполуки, а також фармацевтичного застосування цих сполук, які є інгібіторами фосфодіестерази 4, як засобів для лікування захворювань, на які можна вплинути шляхом пригнічення активності фосфодіестерази 4 у відповідальних за імунітет клітинах (наприклад, макрофагах та лімфоцитах) під впливом сполук у ВІДПОВІДНОСТІ з цим винаходом Активація рецепторів клітинних мембран дією трансміттерів викликає активацію систем "вторинних месенджерів" Аденілатциклаза спричиняє синтез із аденозинмонофосфату (AMP) та гліцинмонофосфату (GMP) активних сполук - циклічного аденозинмонофосфату й циклічного гліцинмонофосфату (ВІДПОВІДНО САМР та cGMP) Ці агенти викликають, наприклад, у клітинах гладких м'язів лення групи R7, причому R7 є замісником, придатним для використання як рухомої групи 10 Спосіб за п 9, в якому особлива перевага віддається сполукам формули (І), у яких R є алкілом, циклоалкілом, арилалкілом, арилом, гетероарилом, ацилом, алкоксикарбонілом, арилоксикарбонілом, амінокарбонілом, N-заміщеним амінокарбонілом, силілом, сульфонілом, а також комплексоутворювачем, наприклад, сполукою борної кислоти, фосфорної кислоти, а також ковалентно або координаційно зв'язаним металом, наприклад, цинком, алюмінієм або міддю 11 Спосіб одержання сполуки за будь-яким з пп 14, який відрізняється тим, що сполуку загальної формули (І) перетворюють в іншу сполуку формули (І) згідно з цим винаходом шляхом перетворення структурного фрагмента -R 3 А t D 12 Лікарська форма, яка містить одну або декілька сполук за будь-яким з пп 1-4 в комбінації зі звичайними фізіологічно толерантними носіями та/або розріджувачами й ВІДПОВІДНИМИ ДОПОМІЖНИ МИ речовинами 13 Спосіб виготовлення лікарської форми за п 12, який відрізняється тим, що одну або декілька сполук за пп 1-4 перетворюють разом з фармацевтичними носіями та/або розріджувачами і ВІДПОВІДНИМИ ДОПОМІЖНИМИ речовинами в фармацевтичну композицію і ВІДПОВІДНО переводять у форму, придатну для терапевтичного використання гальмування виділення медіаторів, а в клітинах запального інфільтрату - їх синтез Розклад "вторинних месенджерів" сАМР та cGMP відбувається під впливом фосфодіестераз (PDE) На сьогодні ВІДОМІ сім груп ферментів типу PDE (PDE1-7), які різняться за специфічністю до певного субстрату (сАМР, cGMP або до обох) та за залежністю від інших субстратів (наприклад, кальмодуліну) Ці ізоферменти виконують в організмі різні функції і виявляють різну активність щодо окремих видів клітин (дивись публікації Біво та інших "Багатофункціональні фосфодіестерази циклічних нуклеотидів" -J A Beavo, М Conti, RJ Heashp, Multiple cyclic nucleotide phosphodiesterases, Мої Pharmacol 1994, 46 399-405, і Холла "Інгібітори селективних ізоферментних фосфодіестераз потенціальне клінічне застосування" - І Р Hall, Isoensyme selective phosphodiesterase inhibitors potential clinical uses, Br J elm Pharmacol 1993, 35 1-7) Пригнічення різних ізоферментних типів PDE призводить до акумуляції в клітинах сАМР або cGMP, яку можна використати з терапевтичною метою (дивись Торфі та ІНШІ, "Нові інгібітори фосфодіестерази для лікування астми" - TJ Torphy, G P LIVI, S В Chnstensen, Novel Phosphodiesterase Inhibitors for the Therapy of Asthma, Drug News and Perspectives 1993, 6 203-214) 59443 У клітинах, які відіграють важливу роль при алергічних запаленнях (лімфоцитах, паличкових клітинах, еозинофільних гранулоцитах, макрофагах), переважаючим типом ізоферментної PDE є тип 4 (дивись Торфі та Ундем, "Інгібітори фосфодіестерази нові можливості лікування астми" - Т J Torphy, В J Undem, Phosphodiesterase inhibitors new opportunities for the treatment of asthma, Thorax 1991, 46 512-523) Тому пригнічення PDE 4 ВІДПОВІДНИМИ інгібіторами розглядається як важлива складова лікування багатьох захворювань алергічного походження (дивись Шудтта ІНШІ, "Інгібітори фосфодіестерази" -Ch Schudt, G Dent, K Rabe, Phosphodiesterase inhibitors, Academic Press, London 1996) Важливою властивістю інгібіторів фосфодіестерази 4 є пригнічення виділення а-фактора некрозу пухлин (TNFa) з клітин запального інфільтрату TNFa має істотне значення як цитокін, що сприяє запаленню, і впливає на різноманітні біологічні процеси TNFa виділяється, наприклад, із активованих макрофагів, активованих Тлімфоцитів, паличкових клітин, базофілів, фібробластів, клітин ендотелію та астроцитів у мозку Сам він викликає активацію нейтрофілів, еозинофілів, фібробластів та клітин ендотелію, внаслідок чого виділяються різноманітні медіатори, які сприяють руйнуванню тканин У моноцитах, макрофагах та Т-лімфоцитах TNFa викликає інтенсивне продукування подальших ЦИТОКІНІВ, що сприяють запаленню, наприклад, фактора стимулювання колоній гранулоцитарних макрофагів (GM-CSF) та штерлейкіну-8 Внаслідок свого запального та катаболічного впливу TNFa відіграє основну роль при багатьох захворюваннях, наприклад, при запаленнях дихальних шляхів, запаленнях суглобів, ендотоксичному шоку, відторгненнях тканин, СНІДі та багатьох інших захворюваннях імунологічного походження Таким чином, інгібітори фосфодіестерази 4 особливо ефективні при лікуванні таких захворювань, пов'язаних із дією TNFa Хронічні обструктивні захворювання легенів (ХОЗЛ, англомовна абревіатура COPD) дуже поширені серед населення і викликають також значні економічні втрати Так, витрати, пов'язані з захворюваннями типу ХОЗЛ, в розвинутих країнах складають приблизно 10-15% загальних витрат, пов'язаних із захворюваннями, на рахунок цих захворювань у СІЛА відносять приблизно 25% усіх летальних випадків (дивись П Норман, "ХОЗЛ нові розробки та терапевтичні можливості" — Р Norman, COPD New developments and therapeutic opportunities, Drug News Perspect 11 (7), 431-437, 1998), хоча слід зазначити, що більшість пацієнтів на день смерті має вік понад 55 років (дивись Д Нольте, "Хронічний бронхіт масове захворювання багатофакторного походження" -D Nolte, Chromsche Bronchitis — eme Volkskrankheit multifaktoneller Genese, Atemw -Lungenkrkh 20 (5), 260267, 1994) Згідно З оцінками Всесвітньої Організації охорони здоров'я, ХОЗЛ протягом найближчих 20 років буде третьою за частотою причиною смерті Поняття синдрому хронічного обструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ) об'єднує різноманіт 8 ні синдроми хронічних бронхіальних розладів, які включають як симптоми кашель та виділення мокротиння, а також прогресивне необоротне погіршення ДІЯЛЬНОСТІ легенів (особливо утруднюється процес видихання) Перебіг захворювання епізодичний і часто ускладнюється мікробними інфекціями (дивись Реннард, "ХОЗЛ Огляд визначень, епідеміологія і фактори впливу на розвиток" - S І Rennard, COPD Overview of definitions, epidemiology, and factors influencing its development, Chest, 113 (4) Suppl, 235S-241S, 1998) На протязі захворювання функція легенів поступово погіршується, посилюється їх емфізема, і утруднення дихання у пацієнта стає все більш помітним Це захворювання значно впливає на якість життя пацієнта (задишка, слабка витривалість) і істотно скорочує вірогідну тривалість життя Головним фактором ризику, окрім впливу навколишнього середовища, є паління (дивись Ф Куммер, "Астма та ХОЗЛ" - F Kummer, Asthma und COPD, Atemw-Lungenkrkh 20 (5), 299-302, 1994, а також вищезгадану роботу Реннарда - S I Rennard, COPD Overview of definitions, epidemiology, and factors influencing its development, Chest, 113 (4) Suppl, 235S-241S, 1998), тому в ЧОЛОВІКІВ це захворювання зустрічається значно частіше, ніж у жінок Однак ця картина в майбутньому зміниться внаслідок зміни життєвих звичок і збільшення числа жінок, які палять Сучасна терапія має на меті лише полегшення симптомів без істотного втручання в розвиток захворювання Застосування бета-2-агоністів тривалої дії (наприклад, сальметеролу) у можливій комбінації з мускаринерпчними антагоністами (наприклад, іпратропіумом) поліпшує роботу легенів шляхом розширення бронхів і використовується дуже широко (дивись вищезгадану роботу П Нормана - Р Norman, COPD New developments and therapeutic opportunities, Drug News Perspect 11 (7), 431-437, 1998) Значну роль при загостреннях ХОЗЛ відіграють бактеріальні інфекції, які слід лікувати антибіотиками (дивись Уілсон, "Роль інфекцій у ХОЗЛ" - R Wilson, The role of infection in COPD, Chest, 113 (4) Suppl, 242S-248S, 1998, Гроссман, "Значення антибіотиків та ефективність терапії антибіотиками при загостреннях ХОЗЛ" R F Grossman, The value of antibiotics and the outcomes of antibiotic therapy in exacerbations of COPD, Chest, 113 (4) Suppl, 249S-255S, 1998) Якість терапії цієї хвороби на сьогодні ще незадовільна, особливо з точки зору постійного погіршення функції легенів Значні перспективи могли б відкрити нові терапевтичні підходи, основані на впливі на медіатори запалення, протеази або адгезійні молекули (дивись Барнс, "Хронічне обструктивне захворювання нові можливості розроблення ЛІКІВ" - Р J Barnes,Chronic obstructive disease new opportunities for drug development, TiPS 10(19), 415-423, 1998) Незалежно від мікробних інфекцій, які ускладнюють захворювання, у бронхах існує осередок хронічного запалення, в якому домінують нейтрофільні гранулоцити За структурні зміни у дихальних шляхах (емфізему) ВІДПОВІДНІ, окрім інших факторів, медіатори та ферменти, які виділяються нейтрофільними гранулоцитами Пригнічення активності нейтрофільних гранулоцитів є, таким чи 59443 ном, раціональним прийомом для запобігання розвитку ХОЗЛ (погіршення параметрів функції легенів) або сповільнення такого розвитку Важливим чинником для активації нейтрофільних гранулоцитів є цитокін TNFa (фактор некрозу пухлин), який сприяє запаленню Так, наприклад, відомо, що TNFa стимулює утворення кисневих радикалів нейтрофільними гранулоцитами (Йєрсман та ІНШІ, "Підсилення продукування кисневих радикалів нейтрофілами, індукованого LPS, під впливом TNFa" - Н Р A Jersmann, D A Rathjen, A Ferrante, Enhancement of LPS-mduced neutrophil oxygen radical production by TNFa, Infection and Immunity, 4, 1744-1747, 1998) Інгібітори PDE 4 здатні з високою ефективністю приглушувати виділення TNFa з багатьох клітин і, таким чином, пригнічувати активність нейтрофільних гранулоцитів Неспецифічний інгібітор PDE - пентоксифілін (Pentoxiflllm) здатний пригнічувати як утворення кисневих радикалів, так і фагоцитозну активність нейтрофільних гранулоцитів (дивись Веніш та ІНШІ, "ВПЛИВ пентоксифіліну на продукування реакційно-здатного кисню нейтрофілами та на їх фагоцитарну здатність, оцінюваний цитометричним методом у потоці" - С Wemsch, К Zedtwitz-Liedenstem, В Parschalk, W Gramngen, Effect of pentoxifyllme on neutrophil reactive oxygen production and phagocyte ability assessed by flow cytometry, Clm Drug Invest, 13(2)99-104,1997) ВІДОМІ різноманітні інгібітори PDE 4 При цьому мова йде переважно про ПОХІДНІ ксантину, аналоги роліпраму (Rohpram) або ПОХІДНІ нітраквазону (Nitraquazon) (огляд таких сполук дивись Карлсон і Альдос, "Інгібітори фосфодіестерази 4 для лікування астми"- J -A Karlsson, D Aldos, Phosphodiesterase 4 inhibitors for the treatment of asthma, Exp Opm Ther Patents 1997, 7 989-1003) Жодну з цих сполук до цього часу не вдалося застосувати в КЛІНІЦІ Було встановлено, що ВІДОМІ інгібітори PDE 4 спричиняють різноманітні побічні ефекти, наприклад, нудоту й блювання, які до цього часу не вдається ефективно усунути Тому існує потреба в нових інгібіторах PDE 4, придатних до більш широкого терапевтичного застосування Незважаючи на те, що індолам вже тривалий час приділяється велика увага при розробленні нових терапевтичних агентів для різноманітних цілей, пдрокемндоли як інгібітори PDE 4 до цього часу невідомі Цей винахід стосується заміщених пдрокемндолів загальної формули 1, R1, R 5 e -Сі 12-алкілом нормальної або розгалуженої будови, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -ННСі 6 -алкіл, -N(Ci 6 10 алкіл)2 -NC614-арил, ~Г\І(Сб і4-арил)2, -N(Ci є-алкіл)(С 6 14-арил), -NHCOR 6 , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -ОСі 6-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci є-алкіл, S-C 6 14-арил, -SOR 6 , -SO 3 H, -SO 2 R 6 , -OSO 2 Ci 6 алкіл, -OSO 2 C 6 14-арил, -(CS)R 6 , -COOH, -(CO)R 6 , моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, -С 2 і 2 -алкенілом нормальної або розгалуженої будови, який містить один або кілька ненасичених зв'язків, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -NHCi 6 -алкіл, -Н(Сі 6 алкіл) 2 , -NHC614-арил, -Н(Сє і4-арил) 2 , -Н(Сі єалкіл)-(С 6 14-арил), -NHCOR 6 , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, -Br, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci 6 алкіл, -S-C 6 і-арил, -SOR 6 , -SO 3 H, -SO 2 R 6 , OSO 2 Ci б-алкіл, -OSO 2 C 6 14-арил, -(CS)R 6 , -COOH, -(CO)R 6 , моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моно- або поліненасиченим карбоциклом з числом членів від 3 до 14, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -МНСі 6 -алкіл, -N(Ci 6 алкіл)2, -NHC6 14-арил, N(C6 і4-арил) 2 , -Н(Сі єалкіл)-(С 6 14-арил), -NHCOR 6 , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci 6 алкіл, -8-Сб 14-арил, -SOR 6 , -SO 3 H, -SO 2 R 6 , OSO 2 Ci б-алкіл, -OSO 2 C 6 14-арил, -(CS)R 6 , -COOH, -(CO)R 6 , моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими карбоциклами з числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклічними насиченими або моно- або поліненасиченими гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні замісники, в свою чергу, можуть бути факультативно заміщені одним або кількома замісниками R4, моно-, ди- або трициклічним насиченим або моно- або полі ненасиченим гетероциклом з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, факультативно заміщеним одною або кількома групами -ОН, -SH, -NH 2 , -МНСі 6 -алкіл, -N(Ci 6 алкіл) 2 , -NHC614-арил, -Г\І(Сб н-арил) 2 , -К(Сі єалкил)-(С 6 14-арил), -NHCOR , -NO 2 , -CN, -F, -СІ, Br, -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб м-арил, -O(CO)R 6 , -S-Ci б-алкіл, -S-C 6 м-арил, -SOR , -SO 3 H, -SO 2 R 6 , OSO 2 Ci б-алкіл, -OSO 2 C 6 м-арил, -(CS)R 6 , -COOH, 12 11 59443 6 -(CO)R , моно-, ди- або трициклічними насиченими -Сі і2-алкілом нормальної або розгалуженої або моно- або поліненасиченими карбоциклами з будови, числом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трициклі-С2 і2-алкенілом нормальної або розгалуженої чними насиченими або моно- або поліненасичебудови, який МІСТИТЬ один або кілька ненасичених ними гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і зв'язків, числом гетероатомів, серед яких перевага віддамоно-, ди- або трициклічним насиченим або ється N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні моно- або поліненасиченим карбоциклом з числом групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні зачленів від 3 до 14, місники, в свою чергу, можуть бути факультативно моно-, ди- або трициклічним насиченим або 4 заміщені одним або кількома замісниками R , моно- або поліненасиченим гетероциклом з числом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, секарбо- або гетероциклічним насиченим або ред яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, моно- або поліненасиченим спіроциклом з числом членів від 3 до 10, в яких гетероциклічні системи В може бути атомом вуглецю або сірки, або містять від 1 гетероатому до 6 гетероатомів, серед (S=O)-, яких перевага віддається N, ОтаБ, D може бути атомом кисню, сірки, СН 2 або факультативно заміщеним одною або кількома N-Z, групами -ОН, -SH, -NH2, -NHCi 6-алкіл, -N(Ci 6причому D може бути атомом сірки або СН 2 алкіл)2, -ІЧНСє 14-арил, -ІЧ(Сб і4-арил)2, -N(Ci єлише за умови, що В є атомом вуглецю, алкіл)-(С614-арил), -NHCOR6, -NO2, -CN, -F, -СІ, -Вг, Е може бути або зв'язком, або -І, -О-Сі б-алкіл, -О-Сб 14-арил, -O(CO)R6, -S-Ci 6-(СН 2 ) т , -О-, -S-, -(N-Z)-, де т і Z відповідають алкіл, -S-C614-арил, -SOR6, -SO3H, -SO2R6, вищенаведеним визначенням OSO2Ci б-алкіл, -OSO2C614-арил, -(CS)R6, -COOH, Крім того, цей винахід стосується фізіологічне -(CO)R6, моно-, ди- або трициклічними насиченими толерантних солей сполук формули 1 або моно- або поліненасиченими карбоциклами з Фізіологічне толерантні солі одержують звичислом членів від 3 до 14, моно-, ди- або трицикчайним способом шляхом нейтралізації основ нелічними насиченими або моно- або поліненасичеорганічними або органічними кислотами чи, ВІДПОними гетероциклами з числом членів від 5 до 15 і ВІДНО, нейтралізації кислот неорганічними або числом гетероатомів, серед яких перевага віддаорганічними основами Прикладами неорганічних ється N, О та S, від 1 до 6, причому Сє н-арильні кислот можуть бути хлористоводнева, сірчана, групи і вказані карбоциклічні та гетероциклічні зафосфорна або бромистоводнева кислоти, прикламісники, в свою чергу, можуть бути факультативно дами органічних кислот є карбонові або сульфозаміщені одним або кількома замісниками R4, нові кислоти, наприклад, оцтова, винна, молочна, пропюнова, гліколева, малонова, малеїнова, фупричому R1 і R5 можуть бути однаковими або марова, дубильна, бурштинова, альпнова, бензорізними, R2, R3 можуть бути атомами водню або йна, 2-феноксибензойна, 2-ацетоксибензойна, ОН, причому щонайменше одним з цих замісників корична, мигдалева, лимонна, яблучна, має бути -ОН, саліцилова, 3-аміносаліцилова, аскорбінова, R*e ембонова, нікотинова, ізонікотинова, щавлева кис-Н, -ОН, -SH, -NH2, -ННСі б-алкілом, -N(Ci 6лоти, амінокислоти, метан сульфокислота, етансуалкіл)2, -ІЧНСє 14-арилом, -ІЧ(Сб і4-арил)2, -N(Ci єльфокислота, алкіл)(С614-арил), -NHCOR6, -NO2, -CN, -COOH, (CO)R6, -(CS)R6, -F, -СІ -Вг, -І, -О-Сі 6-алкілом, -O2-пдроксіетансульфокислота, етан-1,2C614-арилом, -O(CO)R , -S-Ci 6-алкілом, -S-C614дисульфокислота, бензол сульфокислота, 46 6 арилом, -SOR , -SO2R , метилбензолсульфокислота або нафталш-26 сульфокислота Як приклади неорганічних основ R може бути можна вказати гідроксид натрію, гідроксид калію та -H, -NH2, -NHCi 6-алкілом, -N(Ci є-алкіл)2, аміак, прикладами органічних основ є аміни, приЫНСб 14-арилом, -ІЧ(Сб н-арил)2, -N(Ci б-алкіл)(Сє чому перевага віддається третинним амінам, як, 14-арил), -О-Сі 6-алкілом, -О-Сє 14-арилом, -S-Ci єнаприклад, триметиламін, триетиламш, піридин, алкілом, -S-Сб 14-арилом, N.N-диметиланілін, ХІНОЛІН, ІЗОХІНОЛІН, а-піколін, р-Сі і2-алкілом нормальної або розгалуженої ПІКОЛІН, у-піколін, хінальдин або піримідин будови, -С2 і2-алкенілом нормальної або розгалуженої Крім того, фізіологічно толерантні солі сполук будови, який містить один або кілька ненасичених формули і можна одержати шляхом перетворення зв'язків, відомим способом похідних, які містять третинні моно-, ди- або трициклічним насиченим або аміногрупи, у ВІДПОВІДНІ четвертинні амонієві солі моно- або поліненасиченим карбоциююм з числом дією придатних для цієї мети агентів До таких членів від 3 до 14, агентів належать, наприклад, алкілгалогеніди, якот йодистий метил, бромистий етил та хлористий моно-, ди- або трициклічним насиченим або и-пропіл, а також арилгалогеніди, наприклад, хломоно- або поліненасиченим гетероциклом з чисристий бензил та бромистий 2-фенілетил лом членів від 5 до 15 і числом гетероатомів, серед яких перевага віддається N, О та S, від 1 до 6, Далі, цей винахід стосується сполук формули А є або зв'язком, або 1, які містять асиметричний атом вуглецю і, отже, -(CH2)m-, -(CH2)m-(CH=CH)n-(CH2)p-, -(CHOZ)m-, являють собою D-форми, L-форми, D.L-форми -(С=О)-, (C=S)-, -(C=N-Z)-, -О-, -S-, -NZ-, де т , р=0(суміші), а також, в разі присутності кількох асиме3 і п=0-2, і тричних вуглецевих атомів, діастереомерні форZe ми Сполуки формули і, які містять асиметричні атоми вуглецю і, як правило, зустрічаються у ви-Набо 14 13 59443 гляді рацемічних сумішей, можна розділити на ки формули 1 та їх солі здатні інгібувати як індукооптично аісгивні ізомери відомими способами, наване ліпополісахаридами (ЛПС, англомовна абреприклад, шляхом реакції з оптично активною кисвіатура LPS) виділення TNFa у крові людини m лотою Проте можливе також застосування при vitro, так і індуковану ЛПС легеневу інфільтрацію синтезах оптично активних вихідних сполук, принейтрофілів у тхорів та свійських свиней in vivo чому в таких випадках готовим продуктом буде Сукупність цих з'ясованих фармакологічно важливідповідна оптично активна або діастереомерна вих властивостей свідчить, що сполуки формули і сполука та їх солі, а також фармацевтичні композиції, які містять ці сполуки або їх солі, можуть бути застоЗ'ясовано, що сполуки згідно з цим винаходом совані для лікування хронічних обструктивних замають фармакологічно важливі властивості, які хворювань легенів можна використати для терапевтичних цілей Сполуки згідно з цим винаходом є інгібіторами Крім того, сполуки згідно з цим винаходом мавиділення TNFa ють нейропротекторні властивості і можуть бути використані для лікування захворювань, при яких Таким чином, предметом цього винаходу є той корисною є нейропротекція До таких захворювань факт, що сполуки формули і та їх солі, а також належать, наприклад, сенільне слабоумство (хвофармацевтичні композиції, які містять ці сполуки роба Альцгеймера), втрата пам'яті, хвороба Паркіабо їх солі, можуть бути застосовані для лікування нсона, депресії, нервові напади та переміжна кульзахворювань, при яких корисне інгібування TNFa гавість До таких захворювань належать, наприклад, До подальших можливостей застосування запалення суглобів, в тому числі артрит та ревмасполук згідно з цим винаходом належать профілатоїдний артрит, а також ІНШІ артритоподібні захвоктика та лікування захворювань простати, наприрювання, наприклад, ревматоїдний спондиліт і клад, доброякісної гіперплазії простати, прискореостеоартрит Подальшими можливостями застоного сечовиділення, нічного нетримання сечі, а сування є лікування пацієнтів, які страждають на також для лікування атонії сечового міхура та косепсис, септичний шок, грам-негативний сепсис, лік, викликаних каменями синдром токсичного шоку, синдром задишки, астму або ІНШІ хронічні захворювання легенів, захвоНарешті, сполуки згідно з цим винаходом морювання, пов'язані з резорбцією кісток або реакціжуть бути використані для запобігання виникненню ями відторгнення трансплантатів, або ІНШІ залежності від ЛІКІВ при тривалому вживанні аналзахворювання аутоімунного характеру, наприклад, гетиків, наприклад, морфіну, а також для обмечервоний вовчак, розсіяний склероз, гломеруложення розвитку звикання при повторному вживанні нефрит та увеїт, інсуліно-залежний цукровий діацих аналгетиків бет, а також хронічну демієлінізацію Для приготування лікарських засобів використовують, окрім звичайних допоміжних речовин, Крім того, сполуки згідно з цим винаходом моносив та домішок, ефективну дозу сполуки згідно з жуть бути застосовані для терапії інфекційних зацим винаходом або и солі хворювань, наприклад, вірусних та паразитарних інфекцій, як-от малярії, лихоманки інфекційного Дозування активних речовин можна варіювати походження, м'язових болів інфекційного похозалежно від способу вживання, віку та маси тіла дження, СНІДута кахексій пацієнта, виду й тяжкості захворювання, яке підлягає лікуванню, та інших факторів Сполуки згідно з цим винаходом є інгібіторами Добова доза може бути введена в організм фосфодіестерази 4 пацієнта у вигляді разової дози або поділена на Таким чином, предметом цього винаходу є той дві або більше часткових доз і складає, як правифакт, що сполуки формули 1 та їх солі, а також ло, від 0,001 мг до 100 мг фармацевтичні композиції, які містять ці сполуки або їх солі, можуть бути застосовані для лікування Виготовлювані лікарські форми можуть бути захворювань, при яких корисне інгібування фоспризначені для перорального, парентерального, фодіестерази 4 внутрішньовенного, черезшкірного, місцевого, інгаляційного та назального вживання Так, сполуки згідно з цим винаходом можуть Для вживання можуть бути застосовані звибути застосовані як бронхорозширювачі і для чайні лікарські форми, наприклад, таблетки, драпрофілактики астми же, капсули, порошки для дисперсій, гранули, водКрім того, сполуки формули 1 є інгібіторами ні розчини, водні або ОЛІЙНІ суспензії, сиропи, акумуляції еозинофілів, а також їх активності Таеліксири або краплі ким чином, сполуки згідно з цим винаходом можна застосовувати також при захворюваннях, у яких Тверді лікарські форми можуть містити інертні певну роль відіграють еозинофіли До таких занаповнювачі та носи, наприклад, карбонат кальхворювань належать, наприклад, запальні захвоцію, фосфат кальцію, фосфат натрію, лактозу, рювання дихальних шляхів, як-от бронхіальна аскрохмаль, маніт, альгінат, желатин, гуміарабік, тма, алергічний риніт, алергічний кон'юнктивіт, стеарати магнію або алюмінію, метилцелюлозу, атонічний дерматит, екзема, алергічний ангмт, витальк, високодисперсні силікагелі, силіконову олію, кликані еозинофілами запалення, наприклад, еовисокомолекулярні жирні кислоти (наприклад, стезинофільний фасцмт, еозинофільна пневмонія та аринову кислоту), агар-агар або рослинні чи твасиндром легеневої інфільтрації з еозинофілією, ринні жири та олії, тверді високомолекулярні поліуртикарія, виразковий коліт, хвороба Крона та мери (наприклад, поліетиленгліколь), рецептури, проліферативні дерматологічні захворювання, призначені для перорального вживання, можуть в наприклад, псоріаз та кератоз разі необхідності містити додатково смакові та/або підсолоджувальні домішки Предметом цього винаходу є факт, що сполу 16 15 59443 РІДКІ лікарські форми можуть бути стерилізофоксид, диметилформамід, тетрапдрофуран, циквані та/або містити в разі необхідності ДОПОМІЖНІ логексанон тощо компоненти, наприклад, консерванти, стабілізатоЯк плівкоутворювачі можуть бути застосовані ри, змочувальні агенти, пенетрувальні агенти, прості ефіри целюлози, які розчиняються або наемульгатори, диспергатори, солюбілізатори, солі, бухають як у воді, так і в органічних розчинниках, цукри або цукрові спирти для регулювання осмонаприклад, пдроксипропілметилцелюлоза, метилтичного тиску або значення рН та/або регулятори целюлоза, етилцелюлоза або розчинні крохмалі в'язкості Можливі також змішані форми гелеутворювачів та плівкоутворювачів Для цієї мети можна заДо таких допоміжних компонентів належать, стосовувати, передусім, ІОННІ макромолекули, нанаприклад, тартратні та цитратні буферні солі, приклад, натрієву карбоксиметил целюлозу, етанол, комплексоутворюючі агенти (наприклад, поліакрилову кислоту, поліметакрилову кислоту та етилендіамштетраоцтова кислота та и нетоксичні їх солі, амілопектинсемігліколят натрію, альпнову солі) ДЛЯ регулювання в'язкості можна застосовукислоту або пропіленглікольальпнат у формі навати високомолекулярні полімери, наприклад, рідтрієвих солей, гуміарабік, ксантанову камедь, гуакий полюксіетилен, мікрокристалічну целюлозу, рову камедь або ісландський мох карбоксиметилцелюлозу, полІВІНІЛпіролідон, декстран або желатин До твердих носив належать, Крім того, як ДОПОМІЖНІ компоненти в рецептунаприклад, крохмаль, лактоза, маніт, метилцелюрах можуть бути використані гліцерин, парафіни лоза, тальк, високодисперсні силікагелі, вищі жирні різної в'язкості, триетаноламш, колаген, алантош, кислоти (наприклад, стеаринова кислота), желановантизолова кислота тин, агар-агар, фосфат кальцію, стеарат магнію, Може видатися необхідним введення у лікартваринні та рослинні жири і тверді високомолекуські форми поверхнево-активних речовин, емульлярні полімери, наприклад, поліетиленгліколь гаторів або змочувальних агентів, до яких належать, зокрема, лаурилсульфат натрію, сульфати ОЛІЙНІ суспензії для парентерального або місефірів жирних спиртів, динатрій-ІЧ-лаурил-рцевого вживання можуть містити рослинні, синтеімшодипропюнат, полюксіетилована рицинова олія тичні або напівсинтетичні олії, наприклад, рідкі або сорбітанмоноолеат, сорбітанмоностеарат, складні ефіри жирних кислот з числом вуглецевих полісорбати (наприклад, твіни), цетиловий спирт, атомів у ланцюгу від 8 до 22, наприклад, пальмітилецитин, глщеринмоностеарат, полюксіетиленстенової, лауринової, тридеканової, маргаринової, арат, простий ефір алкілфенолу з полігліколем, стеаринової, арахшової, міристинової, бегенової, хлорид цетилтриметиламонію або солі мопентадеканової, лінолевої, елаїдинової, брасидино/діалкілполіглікольефіру та ортофосфорної киснової, ерукової або олеїнової кислот, етерифіколоти з моноетаноламіном ваних одно-, дво- або трьохатомними спиртами з числом вуглецевих атомів від 1 до 6, наприклад, В деяких випадках може видатися необхідним метанолом, етанолом, пропанолом, бутанолом, введення в рецептури лікарських форм стабілізапентанолом або їх ізомерами, гліколем або гліцеторів, наприклад, монтморилоніту або колоїдних рином До таких ефірів жирних кислот належать, форм дюксиду кремнію з метою стабілізації емунаприклад, товарні міглюли (Miglyol), ізопропілмільсій або для запобігання розкладу активної речористат, ізопропілпальмітат, ізопропілстеарат, вини, наприклад, токоферолу або бутилпдроксіанізолу, або консервантів, наприклад, складних ПЕГ-6-капринова кислота, змішані ефіри капефірів /ьпдроксибензойної кислоти ринової та каприлової кислот з насиченими жирними спиртами, полюксіетиленгліцеринтриолеати, Лікарські форми для парентерального введенетилолеат, воскоподібні ефіри жирних кислот, наня можуть бути виготовлені у вигляді окремих приклад, штучний жир куприкової залози качок, одиниць дозування, наприклад, ампул або флакоізопропіловий ефір кислот кокосової олії, олеїнонів Перевага віддається використанню розчинів вий ефір олеїнової кислоти, дециловий ефір олеїактивних інгредієнтів, передусім водних розчинів, нової кислоти, етиловий ефір молочної кислоти, переважно ІЗОТОНІЧНИХ розчинів, а також суспензій дібутилфталат, дизопропіловий ефір адипінової Ці форми для ІН'ЄКЦІЙ можуть виготовлятися у викислоти, ефіри жирних кислот з по л ю лами тощо гляді готових до використання препаратів або з Придатними для цієї мети є також СИЛІКОНОВІ ОЛІЇ розрахунком на приготування безпосередньо перізної в'язкості або жирні спирти, наприклад, ізоред уживанням шляхом змішування активного інгтридециловий спирт, 2-октилдодеканол, цетилстередієнту, наприклад, люфілізованого і змішаного в ариловий спирт або олеїловии спирт та жирні кисразі протреби з іншими твердими добавками, з лоти, наприклад, олеїнова кислота Крім того, бажаним розчинником або суспензійним середоможна застосовувати рослинні олії, наприклад, вищем рицинову, мигдалеву, оливкову, кунжутну, бавовЛікарські форми для назального введення моняну, арахісову або соєву жуть бути виготовлені у вигляді водних або масляЯк розчинники, гелеутворювачі та солюбілізатори можуть бути використані вода або розчинники, що змішуються з водою Для цієї мети придатні, наприклад, спирти, як-от етанол або ізопропіловий спирт, бензиловий спирт, 2октилдодеканол, поліетиленгліколі, фталати, адипінати, пропіленгліколь, гліцерин, ди- або трипропіленгліколь, воски, метилцелозольв, целозольв, складні ефіри, морфоліни, діоксан, диметил суль них розчинів чи масляних або водних суспензій Вони можуть виготовлятися також у формі люфілізованих препаратів, які для вживання змішують з ВІДПОВІДНИМ розчинником або суспензійним середовищем Виготовлення, фасування та пакування препаратів виконують у звичайних антисептичних та асептичних умовах Окрім вищезазначеного, цей винахід стосуєть 17 59443 ся способу одержання сполук згідно з винаходом Згідно З ЦИМ винаходом, сполуки загальної формули 1 А 1 2 3 4 5 у яких R , R , R , R , R , А, В, D і Е відповідають вищенаведеним визначенням, одержують шляхом перетворення сполук згідно з формулою 2 3 2 3 7 1, у яких R або R , або R та R є -O-R , у сполуки згідно з цим винаходом шляхом відщеплення гру7 пи R При цьому R7 є замісником, придатним для використання як рухома група, наприклад, алкільною, циклоалкільною, арилалкільною, арильною, гетероарильною, ацильною, алкоксикарбонільною, арилоксикарбонільною, амінокарбонільною, Nзаміщеною амінокарбонільною, силільною, сульфонільною групою, а також комплексоутворювачем, наприклад, сполукою борної кислоти, фосфорної кислоти, а також ковалентне або координаційне зв'язаним металом, наприклад, цинком, алюмінієм або міддю Реакцією відщеплення групи R7, якій віддається особлива перевага у способі одержання згідно з цим винаходом, є омилення ВІДПОВІДНИМИ основами, наприклад, гідроксидом натрію, гідроксидом калію, карбонатом натрію або карбонатом калію Застосуванню такого омилення віддається перевага у випадках, коли R7 є ацилом, алкоксикарбонілом, арилоксикарбонілом, амінокарбонілом, Nзаміщеним амінокарбонілом, силілом, сульфонілом, а також комплексоутворювачем, наприклад, сполукою борної кислоти, фосфорної кислоти, а також ковалентно або координаційне зв'язаним металом, наприклад, цинком, алюмінієм або мідРеакцією відщеплення групи R , якій віддається особлива перевага у способі одержання згідно з цим винаходом у випадках відщеплення групи R7 від сполук, у яких R7 є алкілом, циклоалкілом, арилалкілом, арилом, гетероарилом, є розщеплення простих ефірів під впливом, наприклад, бромистоводневої, хлористоводневої, йодистоводневої кислот, а також активованих кислот Льюіса, наприклад, АІСІз, BF3, ВВгз або LiCI, у присутності чи у відсутності додаткових активаторів, наприклад, етан-1,2-дитюлу або бензилмеркаптану, а також розщеплення простих ефірів під впливом водню при підвищеному тискові або при нормальному тискові в присутності ВІДПОВІДНОГО каталізатора, наприклад, паладієвого або іридієвого каталізатора Згідно З винаходом, сполуки загальної формули 1, у яких R1, R2, R3, R4, R5, А, В, D і Е відповідають вищенаведеним визначенням, виготовляють також шляхом перетворення сполук загальної формули і згідно з цим винаходом в ІНШІ сполуки формули 1 згідно з цим винаходом з перетворенням структурного фрагменту 18 з використанням відомих реакцій Особлива перевага віддається використанню для перетворення сполук формули 1 згідно з цим винаходом, наприклад, реакцій відновлення групи А=-(С=О)- до А=(СН-ОН)- або А=-СН2- під впливом відомих відновлювальних агентів, наприклад, борпдриду натрію, або шляхом гідрування, яке в разі потреби можна провести стереоселективно Іншими реакціями перетворення, яким віддається перевага, є перетворення сполук, у яких D і Е є атомами кисню, у сполуки, в яких D є атомом кисню, але E=-(N-Z)-, причому Z відповідає вищенаведеному визначенню Приклади способів одержання сполук загальної формули 1 згідно з цим винаходом із вихідних сполук, у яких R7 є алкілом, циклоалкілом, арилалкілом, арилом, гетероарилом Приклад 1 г\І-(3,5-дихлорпірвдин-4-іл)-2-[1-(4фторбензил)-5-пдроксиндол-3-іл]-2-оксоацетамід (1) 1,4г І\І-(3,5-дихлортридин-4-іи)-2-[1-(4-фторбензил)-5-метоксмндол-3-іл]-2-оксоацетаміду (Зммоль) розчиняли в ЮОмл хлористого метилену Розчин нагрівали зі зворотним холодильником до кипіння і додавали при перемішуванні розчин 14ммоль ВВгз в 15мл хлористого метилену Реакційну суміш нагрівали протягом 3 годин зі зворотним холодильником Після охолодження розчин интенсивно перемішували протягом 3 годин з 200мл водного розчину гідрокарбонату натрію при 20°С При цьому продукт кристалізувався Кристали ВІДДІЛЯЛИ, сушили при 60°С і перекристалізували із 80мл етанолу Вихід 1,1г (80% ВІД теоретичного) Тпл 213-214°С Приклад 2 І\І-(3,5-дихлорІІірІІдин-4-іл)-2-[1-(4л фторбензІ л)-5-пдроксішдол-3-іл]-2-оксоацетамід (1) 5г (38ммоль) безводного хлористого алюмінію змішували з 50 мл етан-1,2-дитюлу При температурі 0°С додавали розчин 4,7г N-(3,5дихлорпіридин-4-іл)-2-[1-(4-фторбензил)-5метоксмндол-3-іл]-2-оксоацетаміду (Юммоль) в 50 мл хлористого метилену Перемішували масу протягом 4 годин при 0°С При температурі 0-10°С додавали крапля за краплею 50мл 10%-ноі хлористоводневої кислоти Кристалічний продукт ВІДДІЛЯЛИ, промивали водою і сушили при 20°С Шляхом перекристалізації з етанолу (180мл) одержали чистий продукт Вихід 3,1г (67% ВІД теоретичного) Тпл 212-214°С Приклад способу одержання сполук загальної формули і згідно з цим винаходом із вихідних сполук вищезазначеного характеру, у яких R7 є ацилом, алкоксикарбонілом, арилоксикарбонілом, амінокарбонілом, N-заміщеним амінокарбонілом, силілом, сульфонілом Приклад З г\І-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1-(4 19 59443 фторбензил)-5-пдроксиндол-3-іл]-2-оксоацетамід, натрієва сіль (2) 5г І\І-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[5-ацетокси-1(4-фторбензил)-шдол-3-іл]-2-оксоацетаміду (Юммоль) перемішували в 50 мл розбавленого розчину гідроксиду натрію протягом години при 4050°С Розчин нейтралізували хлористоводневою кислотою (10%-ною) при охолодженні льодом і випаровували досуха Залишок розчиняли в 80мл ацетону Нерозчинні компоненти ВІДДІЛЯЛИ ДО прозорого розчину додавали розчин 0,4г гідроксиду натрію в Змл води і перемішували протягом 2 годин при температурі 20°С Кристалічний продукт ВІДДІЛЯЛИ, промивали ацетоном и сушили при 60°С Вихід 2,44г (51% від теоретичного) ТШІ 265°С Приклад способу одержання сполук загальної формули 1 згідно з цим винаходом з інших сполук формули 1 згідно з цим винаходом Приклад 4 Т-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-2-[1-(4фторбензил)-5-пдроксивдол-3-іл]-2 20 пдроксіацетамід (3) 1 г І\І-(3,5-дихлортридин-4-іл)-2-[1 -(4-фторбензил)-5-пдроксиндол-3-іл]-2-оксоацетаміду (1, 2ммоль) суспендували в 75мл метанолу Після додавання розчину 0,2г борпдриду натрію в Змл розбавленого розчину гідроксиду натрію реакційну сумішперемішували протягом 6 годин при 20°С Відганяли розчинник і перекристалізували залишок із 40мл етанолу Вихід 0,5г (50% ВІД теоретичного) Тпл 205-207°С Використовуючи описані у прикладах способи, можна одержати численні ІНШІ сполуки формули і, деякі з них наведені нижче як приклади -R5 Сполука R1 R2 R3 R4 R5 1 4-фторбензил -он -Н -н 2 4-фторбензил -O-Na+ -Н -н 3 4-фторбензил -ОН -н -н 4 2,6-дифтор-бензил -ОН 5 2,6-дифтор-бензил -ОН -н -н -н -н 6 3-нітробензил -O-Na+ -н -н 7 п-пропіл -ОН -н -н 8 ізопропіл -ОН -н -н -ОН -н -н -ОН -н -н 3,5-дихлор-4піридил3,5-дихлор-4піридил3,5-дихлор-4піридил4-піридил3,5-дихлор-4піридил3,5-дихлор-4піридил3,5-дихлор-4піридил3,5 -дихлор-4піридил3,5 -дихлор-4піридил2,6-дихлорфеніл2,6-дихлор-4-трифторметилфеніл2,6-дихлор-4-трифторметоксифеніл3,5-дихлор-4піридил3,5-дихлор-4піридил 10 циклопентилметил4-фторбензил 11 4-фторбензил -ОН -н -н 12 4-фторбензил -ОН -н -н 13 4-фторбензил -Н -он -н 14 4-метоксибензил -ОН -н -н 9 Сполуки згідно з цим винаходом є потужними інгібіторами фосфодіестерази 4 і виділення TNFa їхній терапевтичний потенціал можна оцінити m vivo, наприклад, по пригніченню пізньої фази астматичної реакції (еозинофілії) у морських свинок, а також по впливу на алергенно-індуковану судинну проникливість у активно сенсибілізованих пацюків лінії Brown Norway Інгібування фосфодіестерази Активність PDE 4 визначають у препаратах ферментів із поліморфно-ядерних лімфоцитів (ПМЯЛ, англійська абревіатура PMNL) людини, А в D Е Т пл -(С=О) с О -(N-H) 215 -(С=О) с О -(N-H) 265 с О -(N-H) 205-207 О -(N-H) 327-329 -(С=О) с с О -(N-H) 266-268 -(С=О) с О -(N-H) 235-238 розклад -(С=О) с О -(N-H) 280-282 -(С=О) с О -(N-H) 245-247 -(С=О) с О -(N-H) 246-248 -(С=О) О -(N-H) 216-218 -(С=О) с с О -(N-H) 199-201 -(С=О) с О -(N-H) 176-178 -(С=О) с О -(N-H) 212-213 с О -(N-H) 239-241 (СНОН)-(С=О) активність PDE 2, 3 і 5 - з PDE із тромбоцитів людини Людську кров обробляли цитратом для запобігання коагуляції Шляхом центрифугування при 700дх протягом 20 хвилин при кімнатній температурі ВІДДІЛЯЛИ збагачену тромбоцитами плазму як надосадову рідину від осаду еритроцитів та лейкоцитів Тромбоцити руйнували ультразвуком і використовували для випробувань з PDE 3 та PDE 5 Для визначення активності PDE 2 цитозольну тромбоцитну фракцію очищали шляхом пропускання через колонку з аніонообмінною смолою 21 59443 (градієнтне елюювання розчином хлористого натрію) і відбирали збагачену PDE 2 фраісцію елюату для випробувань ПМЯЛ для визначення PDE 4 виділяли шляхом подальшого осадження декстраном і градієнтного центрифугування з використанням фільтрувального пристрою Ficoll-Paque Після дворазового промивання клітин залишкові еритроцити розчиняли шляхом обробленння 10 мл ГІПОТОНІЧНОГО буферу (155мМ хлористого амонію, ЮмМ гідрокарбонату натрію, 0,1мМ етилендіамштетраоцтової кислоти (ЕДТА), рН7,4) протягом 6 хвилин при 4°С Залишкові інтактні ПМЯЛ ще ДВІЧІ промивали сольовим розчином з фосфатним буфером (PBS) і руйнували ультразвуком Маточний розчин після центрифугування протягом години при 48000дх і температурі 4°С, який містив цитозольну фракцію PDE 4, використовували для вимірювань PDE 4 Активність фосфодіестерази визначали за дещо модифікованою методикою, описаною Томсоном та іншими (дивись Томсон, Епплман, "Проба на фосфодіестеразу циклічних нуклеотидів і розділення різних молекулярних форм ферменту" - W J Thompson, MM Appleman, Assay of cyclic nucleotide phosphodiesterase and resolution of multiple molecular forms of the enzyme, Adv Cycl Nucl Res 1979, 10,69-92) Реакційні суміші містили 50мМ Трис-НСІ (рН7,4), 5мМ хлористого магнію, різні концентрації інгібіторів, ВІДПОВІДНІ препарати ферментів та додаткові компоненти, необхідні для розрізнення індивідуальних ізоферментів (дивись нижче) Реакцію ініціювали додаванням субстратів 0,5мкМ [3Н]-сАМР або, ВІДПОВІДНО, [3H]-cGMP (приблизно 6000 імпульсів за хвилину на одну пробу) Кінцевий об'єм становив 100 мл Тестові речовини вносили у вигляді розчинів у диметилсульфоксиді (ДМСО) Концентрація ДМСО в реакційних сумішах становила 1% (об'єми) Така концентрація ДМСО не впливає на активність PDE Після ініціювання реакції додаванням субстратів проби інкубували протягом ЗО хвилин при 37°С Реакцію припиняли шляхом нагрівання пробірок з пробами при 110°С протягом 2 хвилин Потім проби охолоджували льодом протягом 10 хвилин Після додавання ЗОмкл 5'-нуклеотидази (1мг/мл, із суспензії зміїної отрути Crotalus adamanteus) шкубували проби протягом 10 хвилин при 37°С Охолоджували проби льодом, додавали по 400мкл суміші препарату "Дауекс" (Dowex) з водою та етанолом (1+1+1), ретельно перемішували і знов витримували на льоду протягом 15 хвилин Реакційні пробірки центрифугували протягом 20 хвилин при ЗОООдх АЛІКВОТНІ частки освітленого розчину об'ємом по 200мкл переносили в комірки для рахування сцинтиляцій Додавали Змл сцинтилятора і виконували вимірювання у бета-лічильнику Для визначення активності PDE 4, 3 і 2 як субстрат використовували [3Н]-сАМР, для PDE 5 [3H]-cGMP Неспецифічні активності ферментів визначали у випадку PDE 4 у присутності ЮОмкМ роліпраму (Rohpram), а у випадках PDE 3 і PDE 5-у присутності ЮОмкМ IB MX і віднімали від одержаних результатів випробувань Інкубаційні суміші для випробувань PDE 3 містили ЮмкМ роліпраму для нейтралізації можливих домішок PDE 4 PDE 2 22 визначали за методикою випробування SPA фірми Amersham Випробування виконували у присутності активатора PDE 2 (5мкМ cGMP) Для сполук згідно з винаходом значення ICso стосовно до інгібування фосфодіестерази 4 були в межах від 10 9 М до 10 5 М Селективність відносно типів PDE 2, PDE 3 і PDE 5 характеризується коефіцієнтами від 100 до 10000 Пригнічення виділення TNFa із клітин носових ПОЛІПІВ Обладнання для виконання випробувань в основному відповідало методу, описаному Кемпбеллом і Буске в роботі під назвою "Антиалерпчна активність блокаторів НГ (AM Campbell, J Bousquet, Anti-allergic activity of hi blockers, Int Arch Allergy Immunol , 1993, 101, 308-310) За вихідний матеріал правили носові поліпи (матеріал ОР), одержані в результаті хірургічного лікування пацієнтів Тканину промивали препаратом RPMI 1640, а потім обробляли протеазою (2,0мг/мл), колагеназою (1,5мг/мл), палуронідазою (0,75мг/мл) і ДНКазою (0,05мг/мл) протягом 2 годин при 37°С (1г тканини і 4мл препарату RPMI 1640 з ферментами) Одержані препарати клітин, що являли собою суміш клітин епітелію, моноцитів, макрофагів, лімфоцитів, фібробластів і гранулоцитів, ВІДДІЛЯЛИ фільтруванням і промивали кілька разів живильним розчином шляхом центрифугування, пасивно сенсибілізували додаванням ІдЕ людини і розводили суспензію до концентрації 2млн клітин/мл препаратом RPMI 1640 (з добавками антибіотиків, 10% сироватки телячого ембріону, 2мМ глутамшу і 25мМ HEPES) Цю суспензію вміщували в 6коміркову чашку для вирощування культур клітин (по 1мл в комірку) Проби піддавали попередній інкубації з випробовуваними сполуками у різних концентраціях протягом ЗО хвилин, після чого збуджували виділення TNFa додаванням анти-ІдЕ (7,2мкг/мл) Максимальне виділення у такому живильному середовищі досягається приблизно через 18 годин На протязі цього часу клітини шкубували при 37°С у присутності 5% дюксиду вуглецю Живильне середовище (надосадову рідину) ВІДДІЛЯЛИ центрифугуванням (5 хвилин, 4000об/хв) і зберігали при -70°С до визначення цитокшу Визначення TNFa у надосадовій рідині виконували за допомогою так званих сендвічевих препаратів ELISA (виробництво фірми Gmndmatenal Pharmmgen), які дозволяють вимірювати концентрації цитокіну в діапазоні від 30пг/мл до 1000пг/мл Клітини, не стимульовані анти-lgE, практично не ВИДІЛЯЮТЬ TNFa, стимульовані ж клітини продукують великі КІЛЬКОСТІ TNFa, які можуть бути зменшені, наприклад, під впливом інгібіторів PDE 4 На основі даних про відносне пригнічення виділення TNFa (для клітин, стимульованих анти-ІдЕ, КІЛЬКІСТЬ TNFa прийнято за 100%) при різних концентраціях випробовуваних сполук були розраховані значенння ІС50 (концентрацій, що відповідають 50%-ному інгібуванню) Для сполук згідно з цим винаходом значення ІС5о становлять від 10 7 М до 10 5 М Пригнічення пізньої фази еозинофіли через 24 години після активної сенсибілізації інгаляцією яєчного альбуміну (випробування на морських 23 59443 свинках) Пригнічення легеневої інфільтрації еозинофілів під впливом досліджуваних сполук випробовували in vivo на самцях морських свинок лінії Dunkm-Hartley (маса тіла 200-250г), активно сенсибілізованих відносно яєчного альбуміну (ЯА) Сенсибілізацію виконували шляхом дворазового внутрішньочеревинного введення кожній тварині на протязі двох послідовних діб суспензії 20мкг ЯА в комбінації з 20мг гідроксиду алюмінію як підсилювача в 0,5мл фізіологічного розчину хлористого натрію Через 14 діб після другої ін'єкції тваринам вводили внутрішньочеревинно мепірамш-малеат (10мг/кг маси тіла) для запобігання смертельному анафілактичному шоку Через ЗО хвилин тварин вміщували у пластиковий бокс і змушували дихати протягом ЗО секунд аерозолем ЯА (0,5мг/мл), який генерували з допомогою розпилювача, що працював на стисненому повітрі (19,5кПа) (алергенна провокація) Контрольних тварин витримували в атмосфері аерозолю фізіологічного розчину хлористого натрію Через 24 години після провокації тварин наркотизували надлишковою дозою етилуретану (1,5г/кг маси тіла) і піддавали дворазовому бронхоальвеолярному промиванню (БАЛ) порціями по 5мл фізіологічного розчину хлористого натрію Промивну рідину збирали, центрифугували протягом 10 хвилин при 300об/хв і знов суспендували клітинний осад в 1мл фізіологічного розчину хлористого натрію Еозинофіли в промивній рідині рахували з використанням автоматичного приладу диференціації клітин (Bayer Diagnostics Techmcon НІ) Кожне випробування виконували на двох контрольних групах тварин (вдихання аерозолю ЯА і вдихання аерозолю фізіологічного розчину хлористого натрію) Відносне пригнічення еозинофіли у групах ПІДДОСЛІДНИХ тварин, що одержували випробовувані сполуки, розраховували за формулою %пригнічення=100-[100-(В-С)/(А-С)] де А - еозинофіли у тварин контрольної групи (провокованої та обробленої носієм), В - еозинофіли у тварин групи, обробленої випробовуваною сполукою та провокованої, С - еозинофіли у тварин контрольної групи (провокованої 0,9%-ним розчином хлористого натрію та обробленої носієм) Випробовувані сполуки вводили внутрішньочеревинно або перорально у формі суспензій в 10%-ному поліетиленгліколі 300 та 0,5%-ній 5пдроксіетилцелюлозі за дві години до провокації алергеном Контрольні групи замість введення випробовуваних сполук обробляли таким же способом носієм Сполуки згідно з цим винаходом пригнічують пізню фазу еозинофіли на 30-80% після внутрішньочеревинного введення в КІЛЬКОСТІ 10мг/кг маси тіла і на 40-70% після перорального введення в КІЛЬКОСТІ 30мг/кг маси тіла Таким чином, сполуки згідно з цим винаходом особливо придатні для приготування лікарських засобів для лікування захворювань, пов'язаних зі впливом еозинофілів Вплив на індуковану алергеном проникливість судин (досліди на активно сенсибілізованих пацюках лінії Brown-Norway) 24 Самців пацюків лінії Brown-Norway з масою тіла 280-ЗООг піддавали активній сенсибілізації шляхом дворазового внутрішньочеревинного введення кожній тварині на протязі двох послідовних діб суспензії 1мг яєчного альбуміну в комбінації зі ЮОмг гідроксиду алюмінію в 1мл Через 3 тижні після сенсибілізації тварин наркотизували тюпенталом натрію і фіксували в лежачому положенні на спині Для перфузп порожнин носа у трахею ретроградно вводили поліетиленовий катетер до внутрішнього отвору хоан, так що розчин міг стікати через носові порожнини Для забезпечення дихання у трахею ортоградно вводили короткий трахеальний катетер Для перфузм через носову порожнину безперервно пропускали за допомогою перистальтичного насоса сольовий розчин з фосфатним буфером (PBS) (0,5мл/хв), який збирали за допомогою збирача фракцій За маркер плазми правив барвник Evans Blue, який вводили внутрішньовенне по 1мл 1%-ного розчину в PBS кожній тварині через катетер, введений у яремну вену Випробовувані сполуки вводили місцевим способом Для цієї мети випробовувану сполуку додавали до перфузійного розчину (PBS) Слизову оболонку носа протягом ЗО хвилин обробляли розчином, який містив інгібітор PDE 4 Потім одразу ж вводили тваринам барвник Evans Blue безпосередньо перед початком перфузм розчином, який містив яєчний альбумін (провокація) Після початку провокації альбуміном (10 мг/мл яєчного альбуміну в PBS) через кожні 15 хвилин відбирали фракції у збирач на протязі 60 хвилин Концентрацію барвника у перфузатах вимірювали за допомогою фотометра типу Digiscan на довжині хвилі 620нм При цьому результати сліпих проб автоматично віднімалися Хід розвитку ефекту на протязі 60 хвилин розраховували з використанням програми AUC Ефективність випробовуваних сполук розраховували в процентах відносно результатів, одержаних на контрольній групі, що одержувала носій Для сполук згідно з цим винаходом значення ІС50 лежать у межах від 10 8 М до 10 М Можливості застосування сполук формули 1 згідно з цим винаходом для терапії хронічних обструктивних захворювань легенів оцінювали шляхом визначення ступеню пригнічення індукованого ліпополісахаридами (LPS) виділення TNFa у людській крові, а також пригнічення індукованої LPS легеневої інфільтрації нейтрофілів у тхорів та свійських свиней Стимулювати ізольовані лейкоцити до виділення цитокшу можна різними способами Одним із видів стимуляторів, придатних для дослідження виділення TNFa, є ліпополісахариди (LPS) LPS є складовою частиною клітинних оболонок мікроорганізмів і виділяється при загибелі останніх (під впливом антибіотиків або імунної системи) LPS стимулює, зокрема, активність фагоцитарних лейкоцитів (тканинних макрофагів, гранулоцитів, моноцитів) і спричиняє міграцію лейкоцитів із кровотоку в уражені тканини До ЦИТОКІНІВ, що відіграють важливу роль у цих механізмах, належить TNFa, який виділяється з уражених клітин (головними джерелами є моноцити та макрофаги) і сумісно з іншими медіаторами ІНІЦІЮЄ та підтримує запалення 25 Індуковане LPS виділення TNFa в розбавленій (1 5) людській крові Для дослідження впливу на виділення TNFa кров, відібрану від різних донорів і стабілізовану цитратом, розбавляли живильним середовищем RPMI 1640 у співвідношенні 1 5 Випробовувані сполуки додавали до проб у різних концентраціях перед провокацією LPS Через ЗО хвилин стимулювали лейкоцити додаванням ліпополісахариду (LPS) із Salmonella abortus equi в кінцевій концентрації Юмкг/мл Після інкубування проб протягом 24 годин при 37°С у присутності 5% дюксиду вуглецю в інкубаторі розбавлену кров центрифугували і визначали концентрацію TNFa у ВІЛЬНІЙ ВІД КЛІТИН надосадовій рідині за допомогою ELISA Для сполук згідно з цим винаходом були визначені значення ІС50 У межах від 10 7 М до 10 5 М Наприклад, для сполуки згідно з Прикладом 1 значення ІС50 склало 0,8мкмоль/л Для стандартної сполуки SB 207499 одержано значення ICso 7,0мкмоль/л Пригнічення індукованої LPS нейтрофіли у тхорів Пригнічення індукованої LPS легеневої інфільтрації нейтрофілів під впливом досліджуваних сполук визначали шляхом випробування in vivo на самцях тхорів (маса тіла 0,6-2кг) ПІДДОСЛІДНИХ тварин наркотизували пентобарбітал-натрієм (40мг/кг маси тіла внугрішньочеревинно), вміщували поодинці в герметизований інгаляційний бокс і обробляли протягом 10 хвилин розпилюваним за допомогою ультразвуку аерозолем 0,01%-ного розчину ліпополісахариду (з добавкою 0,1% гідроксил аміну в сольовому розчині з фосфатним буфером, PBS) Аерозоль генерували за допомогою розпилювача, що працював на стисненому повітрі (0,2МПа) Контрольних тварин обробляли аерозолем фізіологічного розчину хлористого натрію На протязі всієї процедури за тваринами стежили і після впуску свіжого повітря виймали з бокса Аерозоль LPS при вдиханні одразу ж викликає запалення дихальних шляхів, яке розпізнається за масивною інфільтрацією неитрофільних гранулоцитів у легені ПІДДОСЛІДНИХ тварин Нейтрофілія досягає максимуму через 4-6 годин після дії LPS Для визначення КІЛЬКОСТІ інфільтрованих неитрофільних гранулоцитів тварин через 6 годин після провокації LPS наркотизували надлишковою дозою етилуретану (1,5г/кг маси тіла внугрішньочеревинно) і піддавали дворазовому бронхоальвеолярному промиванню (БАЛ) порціями по Юмл фізіологічного розчину хлористого натрію КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН у нерозбавленій рідині, зібраній після БАЛ (ЮОмкл) визначали за допомогою приладу рахування клітин типу Techmcon HIE (фірми Bayer Diagnostics) і діференціювали КІЛЬКІСТЬ різних ТИПІВ лейкоцитів в розрахунку на 1мкл У кожному ДОСЛІДІ використовували дві контрольні групи тварин (інгаляція фізіологічного розчину хлористого натрію або розчину LPS) Сполуки, що мають протизапальну дію, особливо такі, що впливають на виділення TNFa або на функцію неитрофільних гранулоцитів, пригнічують інфільтрацію лейкоцитів Ступінь пригнічення 59443 26 інфільтрації визначали відносно КІЛЬКОСТІ інфільтрованих нейтрофілів у необроблених ПІДДОСЛІДНИХ тварин (провокованих і не провокованих LPS) Для сполук згідно з цим винаходом були визначені значення ІС50 У межах від 1мг/кг до 20мг/кг при внутрішньочеревинному введенні Наприклад, сполуку згідно з Прикладом 1 вводили внутрішньочеревинно в дозах 1мг/кг, Змг/кгта 10мг/кг маси тіла за дві години до провокації LPS, кожну дозу вводили трьом тваринам Нейтрофілія в рідині після БАЛ знижувалася залежно від дози (18%, 64% і 78%) Значення IDso при внутрішньочеревинному введенні складає 2,4мг/кг Введення селективного шпбітора PDE 4 RPR73401 (стандартна сполука) викликало зниження нейтрофіли на 49% при внутрішньочеревинніи дозі 1 мг/кг Для внутріпіньолегеневого введення у наркотизованих тварин (40мг/кг пентобарбітал-натрію внутрішньочеревинно у вигляді 3%-ного розчину, 1,3мл/кг) розкривали трахею, вводили ПОЛІВІНІЛхлоридний катетер довжиною 7см і через 2 години після провокації LPS вводили випробовувані сполуки у порошковій формі (у суміші з лактозою до 20мг/кг) в легені за допомогою шприца При внутрішньолегеневому введенні сполуки згідно з Прикладом 1 в дозах 1 мг/кг, Змг/кг і 10мг/кг індукована LPS нейтрофілія знижується залежно від дози (43%, 65% і 100%) Значення Ю5о при внутрішньолегеневому введенні складає 1,65мг/кг Пригнічення індукованої LPS нейтрофіли у свійських свиней Легеневу нейтрофілію можна викликати у свиней таким же чином, як у тхорів Тварин наркотизували (пентобарбітал, 10мг/кг внутрішньовенно) і піддавали інтубацп 3 використанням бронхоскопа виконували часткове бронхоальвеолярне промивання для визначення КІЛЬКОСТІ неитрофільних гранулоцитів за звичайних фізіологічних умов Потім вводили випробовувану сполуку і через трахеальний тубус давали тваринам вдихати генерований ультразвуком аерозоль 0,03%-ного розчину ліпополісахариду (з добавкою 0,1% гідроксиламіну в PBS) протягом 20 хвилин Інгальований LPS викликає запальну реакцію в дихальних шляхах і масивну міграцію неитрофільних гранулоцитів Нейтрофілія досягає максимуму через 4-6 годин після вдихання LPS Через 6 годин виконували повторне бронхоальвеолярне промивання і шляхом рахування визначали збільшення КІЛЬКОСТІ нейтрофілів Свині особливо придатні для таких досліджень внаслідок їх значної анатомічної та фізіологічної подібності до людини Сполуки згідно з цим винаходом при внутрішньолегеневому введенні кожній тварині в КІЛЬКОСТІ Юмг забезпечують значення пригнічення індукованої LPS нейтрофіли від 20% до 65% Внутрішньолегеневе введення сполуки згідно з Прикладом 1 у КІЛЬКОСТІ Юмг на одну тварину (приблизно 0,75мг/кг маси тіла) пригнічує індуковану LPS легеневу нейтрофілію на 51% 27 Комп'ютерна верстка С Волобуев 59443 28 Підписано до друку 06 10 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна