Похідні піримідин-2-аміну і їх застосування як антагоністів аденозинового рецептора a2b

1. Сполука формули (І) H N N R1 R3 N R2 , (І) у якій R1 означає моноциклічну або поліциклічну арильну або гетероарильну групу, яка необов'язково містить 1, 2 або 3 замісники, вибрані із групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або розгалужений, необов'язково заміщений нижчий алкіл, гідроксигрупу, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", -CО2R', -C(О)-NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")C(О)NR'R", де R', R" й R'" незалежно означають атом водню або лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу алкільну групу або R' й R" разом з атомом, до якого вони приєднані, утворюють циклічну групу; R2 означає моноциклічну N-вмісну гетероарильну групу, вибрану із груп формул (ІІа) або (ІІb): 2 3 82563 4 атоми галогенів, лінійний або розгалужений, необов'язково містять 1, 2 або 3 замісники, вибрані необов'язково заміщений нижчий алкіл, оксогрупу, із групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену розгалужений, необов'язково заміщений нижчий нижчу алкоксигрупу, лінійну або розгалужену, алкіл, гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу й розгалужену, необов'язково заміщену нижчу ціаногрупу. алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, 7. Сполука за будь-яким з попередніх пунктів, у необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, якій R3 вибраний із групи, яка включає піридин і нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", -CO2R', -C(О)піридин-2(1Н)-он, кожний з яких необов'язково NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")-C(О)NR'R", де R', R" й містить замісник, вибраний із групи, яка включає R'" незалежно означають атом водню або лінійну атоми галогенів, лінійний або розгалужений, або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу необов'язково заміщений нижчий алкіл, оксогрупу, алкільну групу, або R' й R" разом з атомом, до лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. нижчу алкоксигрупу, лінійну або розгалужену, 3. Сполука за п. 2, у якій R3 означає моноциклічну необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу й або поліциклічну гетероарильну групу, яка ціаногрупу. включає азотвмісне шестичленне кільце, 8. Сполука за будь-яким з попередніх пунктів, у гетероарильні групи необов'язково містять 1, 2 або якій R' означає групу, вибрану із групи, яка 3 замісники, вибрані із групи, яка включає атоми включає феніл, фуран-2-іл, фуран-3-іл, тієн-2-іл, галогенів, лінійний або розгалужений, тієн-3-іл, піридин-2-іл, піридин-3-іл і піридин-4-іл, необов'язково заміщений нижчий алкіл, кожний з яких необов'язково містить 1, 2 або 3 гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або розгалужену, замісники, вибрані із групи, яка включає атоми необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, галогенів, лінійний або розгалужений, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену необов'язково заміщений нижчий алкіл, нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", гідроксигрупу, лінійну або розгалужену, -CО2R', -С(О)-NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, C(О)NR'R", де R', R" й R'" незалежно означають лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену атом водню або лінійну або розгалужену, нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", необов'язково заміщену нижчу алкільну групу, або -CО2R', -C(О)-NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")R' й R" разом з атомом, до якого вони приєднані, C(О)NR'R", де R', R" й R'" незалежно означають 4. Сполука за будь-яким утворюють циклічну групу. з попередніх пунктів, у атом водню або лінійну або розгалужену, якій R3 вибраний із групи, яка включає піридин, необов'язково заміщену нижчу алкільну групу, або піримідин, піридазин, ізохінолін, хінолін, R' й R" разом з атомом, до якого вони приєднані, нафтиридин, піридин-2(1Н)-он, фуран і тіофен, 9. Сполука циклічну якій R утворюють за п. 8, у групу. 1 означає групу, вибрану кожний з яких необов'язково містить 1, 2 або 3 із групи, яка включає феніл, фуран-2-іл, фуран-3-іл замісники, вибрані із групи, яка включає атоми і тієн-2-іл, кожний з яких необов'язково заміщений галогенів, лінійний або розгалужений, атомом галогену. необов'язково заміщений нижчий алкіл, 10. Сполука за п. 9, у якій R1 означає групу, гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або розгалужену, вибрану із групи, яка включає незаміщений фураннеобов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, 2-іл і незаміщений тієн-2-іл. лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену 11. Сполука за будь-яким з попередніх пунктів, у нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", якій R2 означає піримідинільну або піридазинільну -CO2R', -C(О)-NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")групу, яка необов'язково може містити 1, 2 або 3 C(О)NR'R", де R', R" й R'" незалежно означають замісники, вибрані із групи, яка включає атоми атом водню або лінійну або розгалужену, галогенів, лінійний або розгалужений, необов'язково заміщену нижчу алкільну групу, або необов'язково заміщений нижчий алкіл, R' й R" разом з атомом, до якого вони приєднані, гідроксигрупу, лінійну або розгалужену, 5. Сполука циклічну якій R утворюють за п. 4, угрупу. 3 вибраний із групи, яка необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, включає піридин і піридин-2(1Н)-он, кожний з яких лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену необов'язково містить 1, 2 або 3 замісники, нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", вибрані із групи, яка включає атоми галогенів, -CO2R', -C(О)-NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")лінійний або розгалужений, необов'язково C(О)NR'R", де R', R" й R'" незалежно означають заміщений нижчий алкіл, гідроксигрупу, оксогрупу, атом водню або лінійну або розгалужену, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену необов'язково заміщену нижчу алкільну групу, або нижчу алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, R' й R" разом з атомом, до якого вони приєднані, необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, 12. Сполука за групу. утворюють циклічну п. 11, у якій R2 означає нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R", -CО2R', -C(О)піримідинільну або піридазинільну групу, яка NR'R", -N(R'")C(О)-R', -N(R'")-C(О)NR'R", де R', R" й необов'язково може містити як замісник лінійну R'" незалежно означають атом водню або лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу 13. Сполука за п. 12, у якій R2 означає незаміщену алкілтіогрупу. алкільну групу, або R' й R" разом з атомом, до піримідин-4-ільну або незаміщену піридазин-4якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. ільну групу. 6. Сполука за будь-яким з пп. від 1 до 4, у якій R3 14. Сполука за будь-яким з попередніх пунктів, у вибраний із групи, яка включає піридин, піримідин, якій R1 означає групу, вибрану із групи, яка піридазин, ізохінолін, хінолін, нафтиридин і включає незаміщений фуран-2-іл і незаміщений піридин-2(1Н)-он, кожний з яких необов'язково тієн-2-іл, R2 означає незаміщений піримідин-4-іл містить замісник, вибраний із групи, яка включає 5 82563 6 або незаміщений піридазин-4-іл, і де R3 вибраний N-піримідин-5-іл-4'-(2-тієніл)-4,5'-біпіримідин-2'із групи, яка включає піридин, піримідин, амін, піридазин, ізохінолін, хінолін, нафтиридин і N-(1-оксидопіридин-3-іл)-4'-(2-тієніл)-4,5'піридин-2(1Н)-он, кожний з яких необов'язково біпіримідин-2'-амін, містить замісник, вибраний із групи, яка включає 5-піридазин-4-іл-N-піридин-3-іл-4-(2атоми галогенів, лінійний або розгалужений, тієніл)піримідин-2-амін, необов'язково заміщений нижчий алкіл, оксогрупу, 4-(2-фурил)-5-піридазин-4-іл-N-піримідин-5лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену ілпіримідин-2-амін. нижчу алкоксигрупу, лінійну або розгалужену, 16. Спосіб одержання сполуки формули І за будьнеобов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу й яким з пп. від 1 до 15, у якому сполуку формули ціаногрупу. (IX), у якій R1 й R2 є такими, як визначено вище в 15. Сполука за п. 1, яка є однією з наступних: даному винаході, вводять у реакцію сполучення зі 4'-(2-фурил)-N-піридин-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'-амін, сполукою формули (III), у якій R3 є таким, як 4'-(2-фурил)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)-4,5'визначено вище в даному винаході, і Х означає біпіримідин-2'-амін, галоген, переважно - бром, йод або хлор, 4'-(2-фурил)-N-піридин-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'-амін, R1 NH 2 N N'-(6-фторпіридин-3-іл)-4'-(2-фурил)-4,5'(ІХ) біпіримідин-2'-амін, N 4'-(2-фурил)-N-(4-метилпіридин-3-іл)-4,5'2 R біпіримідин-2'-амін, X N-піридин-3-іл-4'-тієн-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'-амін, (ІІІ). 3 4'-(3-фторфеніл)-N-піридин-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'R амін, 17. Сполука за будь-яким з пп. від 1 до 15, 4'-(3-фторфеніл)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)-4,5'призначена для застосування при лікуванні біпіримідин-2'-амін, патологічного стану або захворювання, перебіг 4'-(2-фурил)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)-2якого поліпшується при антагоністичному впливі (метилтіо)-4,5'-біпіримідин-2'-амін, на аденозиновий рецептор А2В. 4'-(3-фторфеніл)-2-(метилтіо)-N-піридин-3-іл-4,5'18. Фармацевтична композиція, яка містить біпіримідин-2'-амін, сполуку за будь-яким з пп. від 1 до 15 у суміші з 4-(2-фурил)-5-піридазин-4-іл-N-піридин-3фармацевтично прийнятним розріджувачем або ілпіримідин-2-амін, 19. Застосування сполуки за будь-яким з пп. від 1 носієм. 4'-(2-фурил)-N-(1-оксидопіридин-3-іл)-4,5'до 15 при виготовленні лікарського засобу, біпіримідин-2'-амін, призначеного для лікування патологічного стану 4'-(2-фурил)-N-піримідин-5-іл-4,5'-біпіримідин-2'або захворювання, перебіг якого поліпшується при амін, антагоністичному впливі на аденозиновий 4'-(2-фурил)-N-(5-метоксипіридин-3-іл)-4,5'рецептор А2В. біпіримідин-2'-амін, 20. Застосування за п. 19, у якому патологічним 4'-(2-фурил)-N-(6-метилпіридин-3-іл)-4,5'станом або захворюванням є астма, звуження біпіримідин-2'-амін, бронхів, алергічні захворювання, гіпертензія, 4'-(2-фурил)-N-піразин-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'-амін, атеросклероз, реперфузійне ураження, ішемія 5-{[4'-(2-фурил)-4,5'-біпіримідин-2'міокарда, ретинопатія, запалення, порушення іл]аміно}нікотинонітрил, шлунково-кишкового тракту, порушення, пов'язані 4'-(2-фурил)-N-(1-оксидопіримідин-5-іл)-4,5'із проліферацією клітин, цукровий діабет та/або біпіримідин-2'-амін, аутоімунні захворювання. 4'-(2-фурил)-N-[2-(метилтіо)піримідин-4-іл]-4,5'21. Спосіб лікування суб'єкта, який страждає від біпіримідин-2'-амін, патологічного стану або захворювання, перебіг N-[6-(бензилокси)піридин-3-іл]-4'-(2-фурил)-4,5'якого поліпшується при антагоністичному впливі біпіримідин-2'-амін, на аденозиновий рецептор А2В, який включає 5-{[4'-(2-фурил)-4,5'-біпіримідин-2'введення вказаному суб'єктові ефективної іл]аміно}піридин-2(1Н)-он, кількості сполуки за будь-яким з пп. від 1 до 15. 4'-(2-фурил)-N-1,6-нафтиридин-8-іл-4,5'22. Спосіб за п. 21, у якому патологічним станом біпіримідин-2'-амін, або захворюванням є астма, звуження бронхів, 4'-(2-фурил)-N-ізохінолін-4-іл-4,5'-біпіримідин-2'алергічні захворювання, гіпертензія, атеросклероз, амін, реперфузійне ураження, ішемія міокарда, 4'-(2-фурил)-N-хінолін-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'-амін, ретинопатія, запалення, порушення шлунково4'-(3-фурил)-N-піридин-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'-амін, кишкового тракту, порушення, пов'язані із 4'-(3-фурил)-N-піримідин-5-іл-4,5'-біпіримідин-2'проліферацією клітин, цукровий діабет та/або амін, аутоімунні захворювання. Даний винахід стосується нових антагоністів аденозинового рецептора А2В. Ці сполуки застосовні для лікування, попередження або пригнічення захворювань і порушень, для яких відомо, що їх перебіг поліпшується при антагоністичному впливі на аденозиновий рецептор А2В, таких як астма, алергічні захворювання, запалення, атеросклероз, 7 82563 8 гіпертензія, порушення шлунково-кишкового NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й тракту, порушення, зв'язані із проліферацією R''' незалежно означають атом водню або лінійну клітин, цукровий діабет й аутоімунні або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу захворювання. алкільну групу або R' й R'' разом з атомом, до Аденозин регулює різні психологічні функції за якого вони приєднані, утворюють циклічну групу; допомогою специфічних рецепторів клітинних R2 означає моноциклічну N-вмісну мембран, які належать до групи рецепторів, гетероарильну групу, вибрану із груп формул (llа) зв'язаних з G-білком. Виявлено й класифіковані або (llb): чотири різні аденозинові рецептори: А1, А2А, А2В й А3. Підтип А2В аденозинового рецептора [див. Feoktistov, L, Biaggioni, I. Pharmacol. Rev. 1997, 49, 381-402] виявлений у різних тканинах людини й морських організмів і він бере участь у регуляції тонусу судин, росту гладеньких м'язів, ангіогенезі, групи формули (llа) і (llb) необов'язково містять виробленні глюкози печінкою, перистальтиці, 1, 2 або 3 замісники, вибрані із групи, яка включає секреції кишечнику й дегрануляції мастоцитів. атоми галогенів, лінійний або розгалужений, Внаслідок фізіологічних ефектів, необов'язково заміщений нижчий алкіл, опосередковуваних активацією аденозинового гідроксигрупу, лінійну або розгалужену, рецептора, недавно розкриті декілька антагоністів необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, рецептора А2В, призначених для лікування або лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену попередження астми, звуження бронхів, нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', алергічних захворювань, гіпертензії, -CO2R', -С(О)-NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')атеросклерозу, реперфузійного ураження, ішемії C(O)NR'R'', де R', R'' й R''' незалежно означають міокарда, ретинопатії, запалення, порушень атом водню або лінійну або розгалужену, шлунково-кишкового тракту, порушень, зв'язаних із необов'язково заміщену нижчу алкільну групу або проліферацією клітин та/або цукрового діабету. R' й R'' разом з атомом, до якого вони приєднані, [Див., наприклад, WO03/063800, WO03/042214, утворюють циклічну групу; WO 03/035639, WO02/42298, ЕР 1283056, WO R3 означає моноциклічну або поліциклічну 01/16134, WO 01/02400, WO01/60350 або WO гетероарильну групу, яка необов'язково містить 1,2 00/73307]. Відповідно до винаходу зараз виявлено, що або 3 замісники, вибрані із групи, яка включає деякі похідні піримідин-2-амін є новими активними атоми галогенів, лінійний або розгалужений, й селективними антагоністами аденозинового необов'язково заміщений нижчий алкіл, рецептора А2В і тому можуть застосовуватися для гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або розгалужену, лікування або попередження цих захворювань. необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, Іншими об'єктами даного винаходу є спосіб лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену одержання вказаних сполук; фармацевтичні нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', композиції, які включають ефективну кількість -CO2R', -C(O)-NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')вказаних сполук; застосування сполук для C(O)NR'R'', де R', R'' й R''' незалежно означають приготування лікарського засобу, призначеного атом водню або лінійну або розгалужену, для лікування патологічних станів або необов'язково заміщену нижчу алкільну групу або захворювань, перебіг яких поліпшується при R' й R'' разом з атомом, до якого вони приєднані, антагоністичному впливі на аденозиновий утворюють циклічну групу; або їх N-оксидів або рецептор А2В; і способи лікування патологічних фармацевтично прийнятних солей. станів або захворювань, перебіг яких поліпшується При використанні в даному винаході термін при антагоністичному впливі на аденозиновий нижчий алкіл включає необов'язково заміщені рецептор А2В, які включають введення сполук, лінійні або розгалужені радикали, які містять від 1 запропонованих у даному винаході, суб'єктові, до 8, переважно - від 1 до 6 і більш переважно якийТаким чином, даний винахід стосується нових потребує лікування. від 1 до 4 атомів вуглецю. Замісники в вказаних похідних піримідин-2-аміну формули (І) алкільних групах вибрані із групи, яка включає атоми галогенів і гідроксигрупи. Приклади включають метальний, етильний, нпропільний, ізопропільний, н-бутильний, вторбутильний і трет-бутильний, н-пентильний, 1метилбутильний, 2-метилбутильний, ізопентильний, 1-етилпропільний, 1,1диметилпропільний, 1,2-диметилпропільний, н1 R означає моноциклічну або поліциклічну гексильний, 1-етилбутильний, 2-етилбутильний, арильну або гетероарильну групу, яка 1,1-диметилбутильний, 1,2-диметилбутильний, необов'язково містить 1, 2 або 3 замісники, 1,3-диметилбутильний, 2,2-диметилбутильний, вибрані із групи, яка включає атоми галогенів, 2,3-диметилбутильний, 2-метилпентильний, 3лінійний або розгалужений, необов'язково метилпентильний й ізогексильний радикали. заміщений нижчий алкіл, гідроксигрупу, лінійну або При використанні в даному винаході термін розгалужену, необов'язково заміщену нижчу нижча алкоксигрупа включає необов'язково алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, заміщені лінійні або розгалужені радикали, які необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, містять оксигрупу, кожний з яких включає алкільні нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)фрагменти, які містять від 1 до 8, переважно - від 1 9 82563 10 фурильний, оксадіазолільний, оксазолільний, до 6 і більш переважно - від 1 до 4 атомів вуглецю. імідазолільний, тіазолільний, тіадіазолільний, Замісники в вказаних алкоксильних групах вибрані тієнільний, піролільний, піридинільний, із групи, яка включає атоми галогенів і бензотіазолільний, індолільний, індазолільний, гідроксигрупи. пуринільний, хінолільний, ізохінолільний, Переважні алкоксильні радикали включають фталазинільний, нафтиридинільний, метоксильний, етоксильний, н-пропоксильний, хіноксалінільний, хіназолінільний, хінолізинільний, ізопропоксильний, н-бутоксильний, вторцинолінільний, триазолільний, індолізинільний, бутоксильний, трет-бутоксильний, індолинільний, ізоіндолинільний, ізоіндолільний, трифторметоксильний, дифторметоксильний, імідазолинільний, птеридинільний і піразолільний гідроксиметоксильний, 2-гідроксиетоксильний й 2радикали. Піридильний, тієнільний, фуранильний, гідроксипропоксильний. піридазинільний, піримідинільний і хінолільний При використанні в даному винаході термін радикали є переважними. нижча алкілтіогрупа включає радикали, які містять Якщо гетероарильний радикал містить 2 або необов'язково заміщені лінійні або розгалужені більшу кількість замісників, то замісники можуть алкільні радикали, які містять від 1 до 8, бути однаковими або різними. переважно - від 1 до 6 і більш переважно - від 1 до При використанні в даному винаході деякі 4 атомів вуглецю. Замісники в вказаних атоми, радикали, фрагменти, ланцюги або цикли, алкілтіогрупах вибрані із групи, яка включає атоми які містяться в загальних структурах, галогенів і гідроксигрупи. запропонованих у даному винаході, є Переважні необов'язково заміщені "необов'язково заміщеними". Це означає, що такі алкілтіоільні радикали включають метилтіоільний, атоми, радикали, фрагменти, ланцюги або цикли етилтіоільний, н-пропілтіоільний, можуть бути або незаміщеними або в будь-якому ізопропілтіоільний, н-бутилтіоільний, вторположенні заміщеними одним або більшою бутилтіоільний, трет-бутилтіоільний, кількістю, наприклад, 1, 2, 3 або 4 замісниками, так трифторметилтіоільний, дифторметилтіоільний, що атоми водню, зв'язані з незаміщеними гідроксиметилтіоільний, 2-гідроксиетилтіоільний й атомами, радикалами, фрагментами, ланцюгами 2-гідроксипропілтіоільний.даному винаході термін При використанні в або циклами, заміщені хімічно прийнятними циклічна група включає, якщо не вказане інше, атомами, радикалами, фрагментами, ланцюгами карбоциклічні й гетероциклічні радикали. Циклічні або циклами. Якщо міститься два або більша радикали можуть містити одну або більшу кількість кількість замісників, то всі замісники можуть бути кілець. Карбоциклічні радикали можуть бути однаковими або різними. даному винаході термін При використанні в ароматичними або аліциклічними, наприклад, атом галогену включає атоми хлору, фтору, брому циклоалкільні радикали. Гетероциклічні радикали або йоду, звичайно - атоми хлору, фтору або також включають гетероарильні радикали. брому, найбільше переважно - хлору або фтору. При використанні в даному винаході термін Термін галоген при використанні як приставка має ароматична група звичайно включає 5- - 14-членну такі ж значення. ароматичну кільцеву систему, таку як 5- або 6При використанні в даному винаході термін членне кільце, яка може містити одну або більшу фармацевтично прийнятна сіль включає солі з кількість гетероатомів, вибраних із групи, яка фармацевтично прийнятною кислотою або включає О, S й N. За відсутності в радикалі основою. Фармацевтично прийнятні кислоти гетероатомів його називають арильним включають неорганічні кислоти, наприклад, радикалом, а якщо міститься принаймні один хлористоводневу, сірчану, фосфорну, гетероатом, його називають гетероарильним дифосфорну, бромистоводневу, йодистоводневу й радикалом. Ароматичний радикал може бути азотну, і органічні кислоти, наприклад, лимонну, моноциклічним або поліциклічним, таким як феніл фумарову, малеїнову, яблучну, мигдалеву, або нафтил. Якщо ароматичний радикал або аскорбінову, щавлеву, янтарну, виннокам'яну, фрагмент містить 2 або більшу кількість бензойну, оцтову, метансульфонову, замісників, то замісники можуть бути однаковими етансульфонову, бензолсульфонову й пабо При використанні в даному винаході термін різними. толуолсульфонову кислоту. Фармацевтично арильний радикал звичайно включає С 5-С14прийнятні основи включають гідроксиди лужних моноциклічний або поліциклічний арильний металів (наприклад, натрію й калію) і радикал, такий як феніл або нафтил, антраніл або лужноземельних металів (наприклад, кальцію й фенантрил. Феніл є переважним. Якщо арильний магнію) і органічні основи, наприклад, алкіламіни, радикал містить 2 або більшу кількість замісників, арилалкіламіни й гетероциклічні аміни. в даному Інші переважні солі, запропоновані то замісники можуть бути однаковими або різними. винаході, являють собою четвертинні амонієві При використанні в даному винаході термін сполуки, у яких еквівалент аніону (Х-) зв'язаний з гетероарильний радикал звичайно включає 5- - 14позитивним зарядом атома N. X- може бути членну кільцеву систему, яка включає принаймні аніоном різних неорганічних кислот, таким як одне гетероароматичнe кільце й містить принаймні хлорид, бромід, йодид, сульфат, нітрат, фосфат, один гетероатом, вибраний із групи, яка включає або аніоном органічної кислоти, таким як, О, S й N. Гетероарильний радикал може включати наприклад, ацетат, малеат, фумарат, цитрат, одне кільце або два або більшу кількість оксалат, сукцинат, тартрат, малат, манделат, конденсованих кілець, причому принаймні одне трифторацетат, метансульфонат і пкільце містить гетероатом. толуолсульфонат. Переважно, якщо X- означає Приклади включають піридильний, аніон, вибраний із групи, яка включає хлорид, піразинільний, піримідинільний, піридазинільний, 11 82563 12 або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу бромід, йодид, сульфат, нітрат, ацетат, малеат, алкільну групу або R' й R'' разом з атомом, до оксалат, сукцинат і трифторацетат. Більш якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. переважно, якщо X- означає хлорид, бромід, Ще більш переважно, якщо в сполуках, трифторацетат або метансульфонат. запропонованих у даному винаході, R3 означає При використанні в даному винаході N-оксид залишок, вибраний із групи, яка включає піридин, утворюється із третинних основних амінів або піримідин, піридазин, ізохінолін, хінолін, імінів, які містяться в молекулі, з використанням нафтиридин, піридин-2(1Н)-он, фуран і тіофен, звичайного окисного реагенту. кожна з яких необов'язково містить 1,2 або 3 Переважними сполуками, запропонованими в замісники, вибрані із групи, яка включає атоми даному винаході, є такі, у яких R2 означає галогенів, лінійний або розгалужений, піримідинільну або піридазинільну групу, яка необов'язково заміщений нижчий алкіл, необов'язково може містити 1, 2 або 3 замісники, гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або розгалужену, вибрані із групи, яка включає атоми галогенів, необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, лінійний або розгалужений, необов'язково лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену заміщений нижчий алкіл, гідроксигрупу, лінійну або нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', розгалужену, необов'язково заміщену нижчу -CO2R', -C(O)-NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, C(O)NR'R'', де R', R'' і R''' незалежно означають необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, атом водню або лінійну або розгалужену, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)необов'язково заміщену нижчу алкільну групу або NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й R' й R'' разом з атомом, до якого вони приєднані, R''' незалежно означають атом водню або лінійну утворюють циклічну групу. У ще більш переважному варіанті здійснення або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу R3 вибраний із групи, яка включає піридин, алкільну групу або R' й R'' разом з атомом, до піримідин, піридазин, ізохінолін, хінолін, якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. нафтиридин і піридин-2(1Н)-он, кожний з яких Іншими переважними сполуками є такі, у яких необов'язково містить замісник, вибраний із групи, R2 означає піримідинільну або піридазинільну яка включає атоми галогенів, лінійний або групу, яка необов'язково може містити як замісник розгалужений, необов'язково заміщений нижчий лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену алкіл, оксогрупу, лінійну або розгалужену, нижчу алкілтіогрупу. Більш переважно, якщо R2 необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, означає групу, вибрану із групи, яка включає лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену піримідин-4-іл, 2-метилтіопіримідин-4-іл і нижчу алкілтіогрупу й ціаногрупу. піридазин-4-іл. Більш переважно, якщо R3 означає групу, Також переважними є сполуки, у яких R3 вибрану із групи, яка включає піридин і піридинозначає або моноциклічну або поліциклічну 2(1Н)-он, кожний з яких необов'язково містить гетероарильну групу, яка включає азотвмісне замісник, вибраний із групи, яка включає атоми шестичленне кільце, або моноциклічну галогенів, лінійний або розгалужений, п'ятичленну гетероарильну групу, яка не містить необов'язково заміщений нижчий алкіл, оксогрупу, азот у кільцевій структурі, гетероарильні групи лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену необов'язково містять 1, 2 або 3 замісники, вибрані нижчу алкоксигрупу, лінійну або розгалужену, із групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу й розгалужений, необов'язково заміщений нижчий ціаногрупу. Ще більш переважно, якщо R3 означає групу, алкіл, гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або вибрану із групи, яка включає 1-оксидопіридин-3розгалужену, необов'язково заміщену нижчу іл, піримідин-5-іл, 5-метоксипіридин-3-іл, 6алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, метилпіридин-3-іл, піразин-2-іл, 5-ціанопіридин-3необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, іл, 1-оксидопіримідин-5-іл, 2-(метилтіо)піримідин-4нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)іл, 6-(бензилокси)піридин-3-іл, 6-оксо-1,6NR'R'', -N(R"')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й дигідропіридин-3-іл, 1,6-нафтиридин-8-іл, R''' незалежно означають атом водню або лінійну ізохінолін-4-іл, хінолін-3-іл, піридин-3-іл, 6або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу метоксипіридин-3-іл, піридин-2-іл, 6-фторпіридиналкільну групу або R' й R'' разом з атомом, до 3-іл, 4-метилпіридин-3-іл і піридазин-4-іл. Ще якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. більш переважно, якщо R3 означає групу, вибрану Іншими переважними сполуками, із групи, яка включає піридин-3-іл, 6запропонованими в даному винаході, є такі, у яких метоксипіридин-3-іл, піридин-2-іл, 6-фторпіридинR3 означає моноциклічну або поліциклічну 3-іл, 4-метилпіридин-3-іл і піридазин-4-іл. гетероарильну групу, яка включає азотвмісне Найбільш переважно, якщо R1 означає групу, шестичленне кільце, гетероарильні групи вибрану із групи, яка включає феніл, фуран-2-іл, необов'язково містять 1, 2 або 3 замісники, вибрані фуран-3-іл, тієн-2-іл, тієн-3-іл, піридин-2-іл, із групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або піридин-3-іл і піридин-4-іл, кожний з яких розгалужений, необов'язково заміщений нижчий необов'язково містить 1,2 або 3 замісники, вибрані алкіл, гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або із групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу розгалужений, необов'язково заміщений нижчий алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, алкіл, гідроксигрупу, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, -SH, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й нижчу алкілтіогрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', R''' незалежно означають атом водно або лінійну 13 82563 14 -CO2R', -C(O)-NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')Також переважними сполуками, C(O)NR'R'', де R', R'' й R''' незалежно означають запропонованими в даному винаході, є такі, у яких атом водню або лінійну або розгалужену, R2 означає піримідинільну або піридазинільну необов'язково заміщену нижчу алкільну групу або групу, яка необов'язково може містити як замісник R' і R'' разом з атомом, до якого вони приєднані, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену утворюють циклічну групу. Більш переважно, якщо нижчу алкілтіогрупу. Найбільш переважною є R1 означає групу, вибрану із групи, яка включає сполука, у якій R2 означає незаміщену піримідин-4феніл, фуран-2-іл, фуран-3-іл, тієн-2-іл, кожний з ільну або незаміщену піридазин-4-ільну групу. яких необов'язково заміщений атомом галогену. Особливо переважними сполуками, Ще більш переважно, якщо R1 означає групу, запропонованими в даному винаході, є такі, у яких вибрану із групи, яка включає фуран-2-іл, тієн-2-іл R1 означає групу, вибрану із групи, яка включає й 3-фторфеніл, і найбільше переважно, якщо вону феніл, фуран-2-іл, фуран-3-іл і тієн-2-іл, кожний з обрана із групи, яка включає незаміщений фураняких необов'язково заміщений атомом галогену, R2 2-іл і незаміщений фуран тієн-2-іл. означає піримідинільну або піридазинільну групу, Переважними сполуками, запропонованими в яка необов'язково може містити як замісник лінійну даному винаході, є такі, у яких R2 означає або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу піримідинільну або піридазинільну групу, яка алкілтіогрупу й де R3 вибраний із групи, яка необов'язково може містити 1, 2 або 3 замісники, включає піридин, піримідин, піридазин, ізохінолін, вибрані із групи, яка включає атоми галогенів, хінолін, нафтиридин і піридин-2(1Н)-он, кожний з лінійний або розгалужений, необов'язково яких необов'язково містить замісник, вибраний із заміщений нижчий алкіл, гідроксигрупу, лінійну або групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу розгалужений, необов'язково заміщений нижчий алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, алкіл, оксогрупу, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, необов'язково заміщену нижчу алкоксигрупу, нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й нижчу алкілтіогрупу й ціаногрупу, а також їх R''' незалежно означають атом водню або лінійну фармацевтично прийнятні солі й N-оксиди. або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу Ще більш переважними є сполуки, у яких R1 алкільну групу, або R' й R" разом з атомом, до означає групу, вибрану із групи, яка включає якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. незаміщений фуран-2-іл і незаміщений тієн-2-іл, R2 Звичайно R2 означає моноциклічну означає незаміщений піримідин-4-іл або гетероарильну групу формули (llа): незаміщений піридазин-4-іл і де R3 вибраний із групи, яка включає піридин, піримідин, піридазин, ізохінолін, хінолін, нафтиридин і піридин-2(1Н)-он, кожний з яких необов'язково містить замісник, вибраний із групи, яка включає атоми галогенів, лінійний або розгалужений, необов'язково заміщений нижчий алкіл, оксогрупу, лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу гетероарильна група формули (llа) алкоксигрупу, лінійну або розгалужену, необов'язково містить 1, 2 або 3 замісники, необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу й вибрані із групи, яка включає атоми галогенів, ціаногрупу а також їх фармацевтично прийнятні лінійний або розгалужений, необов'язково соліКонкретні окремі сполуки, запропоновані в й N-оксиди. заміщений нижчий алкіл, гідроксигрупу, оксогрупу, даному винаході, включають: лінійну або розгалужену, необов'язково заміщену 4'-(2-фурил)-N-піридин-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'нижчу алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, амін необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, 4'-(2-фурил)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)-4,5'нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)біпіримідин-2'-амін NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й 4'-(2-фурил)-N-піридин-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'R''' незалежно означають атом водню або лінійну амін або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу N-(6-фторпіридин-3-іл)-4'-(2-фурил)-4,5'алкільну групу або R' й R'' разом з атомом, до біпіримідин-2'-амін якого вони приєднані, утворюють циклічну групу й 4'-(2-фурил)-N-(4-метилпіридин-3-іл)-4,5'де R3 означає піридинову групу, яка необов'язково біпіримідин-2'-амін містить 1, 2 або 3 замісники, вибрані із групи, яка N-піридин-3-іл-4'-тієн-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'включає атоми галогенів, лінійний або амін розгалужений, необов'язково заміщений нижчий 4'-(3-фторфеніл)-N-піридин-3-іл-4,5'алкіл, гідроксигрупу, оксогрупу, лінійну або біпіримідин-2'-амін розгалужену, необов'язково заміщену нижчу 4'-(3-фторфеніл)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)алкоксигрупу, -SH, лінійну або розгалужену, 4,5'-біпіримідин-2'-амін необов'язково заміщену нижчу алкілтіогрупу, 4'-(2-фурил)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)-2нітрогрупу, ціаногрупу, -NR'R'', -CO2R', -C(O)(метилтіо)-4,5'-біпіримідин-2'-амін NR'R'', -N(R''')C(O)-R', -N(R''')-C(O)NR'R'', де R', R'' й 4'-(3-фторфеніл)-2-(метилтіо)-N-піридин-3-ілR''' незалежно означають атом водню або лінійну 4,5'-біпіримідин-2'-амін або розгалужену, необов'язково заміщену нижчу 4-(2-фурил)-5-піридазин-4-іл-N-піридин-3алкільну групу або R' й R'' разом з атомом, до ілпіримідин-2-амін якого вони приєднані, утворюють циклічну групу. 15 82563 16 4'-(2-фурил)-N-(1-оксидопірвдин-3-іл)-4,5'біпіримідин-2'-амін 4'-(2-фурил)-N-піримідин-5-іл-4,5'-біпіримідин2'-амін 4'-(2-фурил)-N-(5-метоксипіридин-3-іл)-4,5'біпіримідин-2'-амін 4'-(2-фурил)-N-(6-метилпіридин-3-іл)-4,5'Реакцію проводять із використанням біпіримідин-2'-амін паладієвого та/або мідного каталізатора за 4'-(2-фурил)-N-піразин-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'загальними методиками арилування амінів [див. амін публікації Yin, J. et al. Org. Lett. 2002,4(20), 3481 й 5-{[4'-(2-фурил)-4,5'-біпіримідин-2'Buchwald S. L. et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 724, іл]аміно}нікотинонітрил 7421]. Проміжні сполуки формули (IX) можна 4'-(2-фурил)-N-(1-оксидопіримідин-5-іл)-4,5'одержати за реакцією відповідного похідного біпіримідин-2'-амін етанону (IV) у дві стадії. 4'-(2-фурил)-N-[2-(метилтіо)піримідин-4-іл]-4,5'біпіримідин-2'-амін N-[6-(бензилокси)піридин-3-іл]-4'-(2-фурил)4,5'-біпіримідин-2'-амін 5-{[4'-(2-фурил)-4,5'-біпіримідин-2'іл]аміно}піридин-2(1H)-он 4'-(2-фурил)-N-1,6-нафтиридин-8-іл-4,5'біпіримідин-2'-амін 4'-(2-фурил)-N-iзохінолін-4-іл-4,5'-біпіримідин2'-амін 4'-(2-фурил)-N-хінолін-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'амін 4'-(3-фурил)-N-піридин-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'амін 4'-(3-фурил)-N-піримідин-5-іл-4,5'-біпіримідин2'-амін Спочатку сполуку формули (IV) вводять у N-піримідин-5-іл-4'-(2-тієніл)-4,5'-біпіримідин-2'реакцію з діалкілацеталем формули (V) амін (переважно диметилацеталем) у N-(1-оксидопіридин-3-іл)-4'-(2-тієніл)-4,5'нерозбавленому диметилформаміді при кімнатній біпіримідин-2'-амін температурі. Потім відповідне 5-піридазин-4-іл-М-піридин-3-іл-4-(2диметиламінопропенонове похідне формули (VI) тієніл)піримідин-2-амін вводять у реакцію з гуанідином, який знаходиться 4-(2-фурил)-5-піридазин-4-іл-N-піримідин-5у вигляді солі (VII), наприклад, гідрогалогенідом ілпіримідин-2-амін. або карбонатом, в органічному розчиннику, Особливий інтерес представляють: переважно - полярному апротонному розчиннику, 4'-(2-фурил)-N-піридин-3-іл-4,5'-біпіримідин-2'такому як N,N-диметилформамід, діоксан, ацетон амін або тетрагідрофуран, у присутності основи, такої 4'-(2-фурил)-N-(6-метоксипіридин-3-іл)-4,5'як карбонат калію, і при температурі від 15 до біпіримідин-2'-амін 110°С й одержують сполуку формули (IX). можна Проміжні сполуки формули (IV) N-(6-фторпіридин-3-іл)-4'-(2-фурил)-4,5'одержати за реакцією метилзаміщеного біпіримідин-2'-амін гетероароматичного кільця (X) з ароматичним або N-піридин-3-іл-4'-тієн-2-іл-4,5'-біпіримідин-2'гетероароматичним ефіром карбонової кислоти амін (переважно - метиловим або етиловим ефіром) 4-(2-фурил)-5-пірвдазин-4-іл-N-піридин-3(XI), як це показано на представленій нижче схемі. ілпіримідин-2-амін 4'-(2-фурил)-N-(1-оксидопіридин-3-іл)-4,5'біпіримідин-2'-амін 4'-(2-фурил)-N-піримідин-5-іл-4,5'-біпіримідин2'-амін 5-{[4'-(2-фурил)-4,5'-біпіримідин-2'іл]аміно}піридин-2(1H)-он. Відповідно до іншої особливості даного Реакцію проводять в органічному розчиннику, винаходу, сполуки загальної формули (І) переважно - полярному апротонному розчиннику, одержують за реакцією сполучення сполуки такому як тетрагідрофуран, у присутності основи, формули (IX), у якій R1 й R2 є такими, як визначено такої як біс(триметилсиліл)амід літію, і при вище в даному винаході, зі сполукою формули (III), температурі від -70 до 50°С й одержують сполуку у якій R3 є таким, як визначено вище в даному формули (IV). винаході, і X означає галоген, переважно - бром, Альтернативно, сполуки загальної формули (І) йод або хлор. можна одержати шляхом конденсації відповідного диметиламінопропенонового похідного формули (VI) із заміщеними гуанідинами загальної формули (VIII) за схемою: 17 82563 18 (Hepes 20мМ рН 7,4, NaCl 100мМ, MgCl210мМ) з використанням планшетів (Мillіроге MAFCN0B50), попередньо інкубованих протягом 15хв в 250мкл цього ж буфера. Радіоактивність зразків підраховували за допомогою 30мкл LSC Universol (ICN) лічильником Wallac 1450 Microbeta. Неспецифічне зв'язування визначали за допомогою 10мкМ R-PIA. Радіолігандний аналіз конкурентного Гуанідини загальної формули (VIII) одержують зв'язування аденозинового рецептора підтипу 2А за методиками, які самі по собі відомі [див., Мембрани готували із клітин Неіа, стабільно наприклад, Barber, C.G. et al. Bioorg. Med. Chem. трансфікованих рекомбінантним рецептором А2А Lett. 2002, 72, 181-184]. людини. Для приготування мембран клітини Якщо групи від R1 до R3 здатні вступати в збирали із планшетів з культурами тканини з хімічну реакцію при описаних вище в даному використанням скребка для клітин, повторно винаході умовах проведення реакцій або несумісні суспендували в 10-15мл буфера для гомогенізації із вказаними реакціями, то легко можна (Tris-HCl 5мМ, ЕДТК 2мМ), гомогенізували й використовувати альтернативні реакції із центрифугували при 1000g протягом 10хв при 4°С. застосуванням методик синтетичної органічної Потім відбирали надосадову рідину й її хімії, наприклад, для захисту функціональних груп центрифугували при 50000g протягом 1год при і проведеного на закінчення видалення захисних 4°С. На закінчення осад після центрифугування груп. охідні піримідин-2-аміну формули (І) за П повторно суспендували в 100-500мкл буфера для методиками, які самі по собі відомі, можна перезберігання (Tris-HCl 50мм рН 7,4), у якому творити у фармацевтично прийнятні солі або Nвизначали повний вміст білка. проводили шляхом Аналізи конкурентності оксиди. Переважними солями є молекулярні солі з інкубування 5мкг мембран А2А, 3нМ [3H]-ZM241385 кислотами, одержуваними шляхом обробки орга(Tocris) як радіоліганду й 50мкМ неміченого нічними або неорганічними кислотами, такими як ліганду ZM241385 у загальному об'ємі 100мкл фумарова, виннокам'яна, янтарна або хлористобуфера (TrisHCl 50мкМ рН 7,4, ЕДТК 1мМ, MgCl2 воднева кислота. Крім того, похідні піримідин-210мМ, 2Од./мл аденозиндезамінази) протягом аміну формули (І), у яких міститься кислотна група, 30хв при 25°С. Потім зразки фільтрували й 4 рази можна перетворити у фармацевтично прийнятні промивали за допомогою 250мкл буфера (TrisHCl солі за реакцією з гідроксидом лужного металу або 50мкМ рН 7,4, ЕДТК 1мМ, MgCl2 10мМ) з органічною основою, такою як гідроксид натрію використанням планшетів (МШіроге MAFCN0B50), або калію. Молекулярні шари, які утворилися тапопередньо інкубованих протягом 15хв в 250мкл ким чином, з кислотами або основами можуть цього ж буфера. Радіоактивність зразків замінятися підходящими фармацевтично прийнятпідраховували за допомогою 30мкл LSC Universol ними протиіонами за методиками, які самі по собі (ICN) лічильником Wallac 1450 Microbeta. відомі. Радіолігандний аналіз конкурентного Неспецифічне зв'язування визначали за зв'язування аденозинового рецептора підтипу 1 допомогою 50мкМ NECA. Радіолігандний аналіз конкурентного Клітини СНО-K1, які експресують зв'язування аденозинового рецептора підтипу 2В рекомбінантні рецептори А1 людини, придбані у Мембрани, отримані із клітин НЕК293, фірми Euroscreen (Belgium). Для приготування трансфікованих рекомбінантним рецептором А2В мембран клітини збирали із планшетів з людини, придбані у фірми Receptor Biology. культурами тканини з використанням скребка для Аналізи конкурентності проводили шляхом клітин, повторно суспендували в 10-15мл буфера інкубування 18мкг мембран А2В, 35нМ [3Н]-DPCPX для гомогенізації (Tris-HCl (Amersham) як радіоліганду й 400мкМ неміченого [Tris=трис(гідроксиметиламінометан)] 15мМ рН ліганду DPCPX у загальному об'ємі 100мкл 7,5, MgCl2 2мМ, ЕДТК (етилендіамінтетраоцтова буфера (Tris-HCl 50мМ рН 6,5, MgCl2 10мМ, ЕДТК кислота) 0,3мМ, ЕГТО (етиленглікольтетраоцтова 1мМ, бензамідину 0,1мМ, 2Од./мл кислота) 1мМ), гомогенізували й центрифугували аденозиндезамінази) протягом 30хв при 25°С. при 40000g протягом 25хв. Отриманий осад після Зразки 4 рази фільтрували з 250мкл буфера (Trisцентрифугування повторно суспендували в тому ж HCl 50мм рН 6,5) з використанням планшетів буфері й повторно центрифугували протягом 25хв. (Millipore MAFBN0B50), попередньо інкубованих На закінчення осад після центрифугування протягом 15хв в 250мкл цього ж буфера. повторно суспендували в 500мкл буфера для Радіоактивність зразків підраховували за зберігання (Tris-HCl 7,5мМ рН 7,5, MgCl2 12,5мМ,допомогою 30мкл LSC Universol (ICN) лічильником ЕДТК 0,3мМ, ЕГТО 1мМ, сахароза 250мМ), у якому Wallac 1450 Microbeta. Неспецифічне зв'язування визначали повний вміст білка. визначали за допомогоюаналіз NECA. Радіолігандний 400мкМ конкурентного Аналізи конкурентності проводили шляхом зв'язування аденозинового рецептора підтипу 3 інкубування 15мкг препаратів мембран А1, 2нМ Мембрани готували із клітин Неlа, стабільно [3H]-DPCPX (Amersham) як радіоліганду й 10мкМ трансфікованих рекомбінантним рецептором А3 неміченого ліганду DPCPX у загальному об'ємі людини. Для приготування мембран клітини 100мкл буфера (Hepes 20мМ рН 7,4, NaCl 100мМ, збирали із планшетів з культурами тканини з MgCl210мМ, 2Од./мл аденозиндезамінази) використанням скребка для клітин, повторно протягом 1год при 25°С. Зразки фільтрували й 4 суспендували в 10-15мл буфера для гомогенізації рази промивали за допомогою 250мкл буфера (Tris-HCl 5мМ, ЕДТК 2мМ), гомогенізували й 19 82563 20 центрифугували при 1000 g. протягом 10 хв при інкубаційного середовища й планшети інкубували 4°С. Потім відбирали надосадову рідину й її протягом 15хв при 37°С. Потім додавали NECA до центрифугували при 50000g протягом 1год при забезпечення кінцевої концентрації, що дорівнює 4°С. На закінчення осад після центрифугування 10мкМ, і планшети інкубували ще протягом ще повторно суспендували в 100-500мкл буфера для 15хв при 37°С. Після інкубації із всіх лунок зберігання (Tris-HCl 50мм рН 7,4), у якому видаляли середовище, додавали 200мкл визначали повний вміст білка. лізуючого буфера (реактив 1В, який випускається Аналізи конкурентності проводили шляхом фірмою Amersham RPN225) і планшети при інкубування 100мкг А3-membranes, 30нМ [3H]слабкому перемішуванні інкубували протягом 10хв NECA (Amersham) як радіоліганду й 50мкМ неміпри кімнатній температурі. Після лізису 100мкл ченого ліганду NECA у загальному об'ємі 100мкл лізату переносили в планшет, попередньо буфера (Tris-HCl 50мМ рН 7,4, MgCl2 5мМ, ЕДТК оброблений антикролячими антитілами, у лунки 1мМ, 2Од./мл аденозиндезамінази) протягом 3год додавали 100мкл сироватки анти-цАМФ (циклічний при 25°С. Зразки 4 рази фільтрували з 250мкл аденозинмонофосфат) кролика й планшети буфера (Tris-HCl 50мм рН 7,4) з використанням інкубували протягом 2год при 4°С. Потім додавали планшетів (Millipore MAFBN0B50), попередньо зв'язаний з пероксидазою цАМФ і планшети інкубованих протягом 15хв в 250мкл цього ж інкубували протягом 1год при 4°С. Потім планшети буфера. Радіоактивність зразків підраховували за 4 рази промивали за допомогою 100мкл буфера допомогою 30мкл LSC Universol (ICN) лічильником (промивний буфер, Amersham RPN225). Після Wallac 1450 Microbeta. Неспецифічне зв'язування промивання в лунки додавали 150мкл визначали за допомогою 100мкМ R-PIA. пероксидазного субстрату й планшети інкубували Аналіз функціонального клітинного цАМФ протягом 1год при кімнатній температурі. На аденозинового рецептора підтипу 2В закінчення для зупинки реакції додавали 100мкл Аналіз проводили з використанням клітин 1Μ сірчаної кислоти й вимірювали оптичну густину СНО-К1, трансфікованих рекомбінантним при довжині хвилі, що дорівнює 450-495нм. рецептором А2В людини, і наявного в продажі Результати наведені в таблиці 1. набору ЕІА (Amersahm, RPN225). Клітини висівали Функціональні Кі розраховували за наступною в 96-лункові планшети по 10000клітин/лунку. формулою (Cheng Υ. С. And Prusoff W. H. Biochem. Через 24год планшети поміщали на лід на 5хв, Pharmacol. 1973, 22,3099-3108): IQ (цАМФ, середовище видаляли й лунки двічі промивали за нМ)=[ІС50/(1+([С]/К