Циклічні антимікробні пептиди

Реферат: Винахід належить до застосування циклічного пептиду формули: ((X) 1(Y)m)n, де l і m - цілі числа від 0 до 10; n - ціле число від 1 до 10; X і Y є аргініном, як медикаменту для лікування грибкової інфекції. UA 97633 C2 (12) UA 97633 C2 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений винахід стосується циклічних катіонних пептидів та їх застосування у лікуванні мікробних інфекцій. Антимікробні пептиди (AMP) утворюють фундамент евкаріотного імунітету та забезпечують першу лінію захисту проти пошкодження поверхні шкіри та слизової мікроорганізмами. Приклади природних AMP охоплюють родини пептидів дефензин та кателіцидин. Ці AMP є гетерогенними за довжиною, послідовністю та структурою, але спільними для більшості є їх невеликий розмір, катіонний заряд та амфіпатичну структуру. Невеликі катіонні антимікробні пептиди також виділені з багатьох бактерій, грибків, рослин, безхребетних та хребетних та могли б тому також грати роль у прокаріотному захисті. Природні AMP виявляють широкий спектр активності проти Грам-позитивних та Грамнегативних бактерій, дріжджів, грибків та оболонкових вірусів. Мікробні патогени не викликають резистентності до цих катіонних пептидів та як такі, AMP збереглись як молекули уродженого імунного захисту хазяїна через тисячоліття еволюції. Це не є несподіваним, що тому AMP, як припускають, є потенційними цілями для лікування широких меж інфекцій. Однак, факт, що вони є технічно багатообіцяючими та цінними для продукування у рекомбінантних системах та мають потужні хемотактичні та запальними біологічні функції, виключає природні форми AMP як терапевтичні засоби. У нашій співподаній заявці ми показали, що лінійні пептиди, збагачені деякими основними залишками, як-то лізин або аргінін, виявляють антимікробну активність, та, зокрема, антигрибкову активність. Залишається, однак, необхідність в інших агентах, що можна застосовувати у лікуванні або попередженні мікробних інфекцій. У першому аспекті винаходу, запропоновано пептид, що містить 2-200 D та/або L амінокислот, котрі можуть бути однаковими або різними, де амінокислоти вибрані з групи: гідрофобні амінокислоти та/або катіонні амінокислоти, а пептидом є циклічним. Циклічний пептид може містити 3-100 D та/або L амінокислот, наприклад, 3-50 амінокислот D та/або L амінокислот, охоплюючи 4-50 D та/або L-амінокислот. Пептиди винаходу є корисними у лікуванні або попередженні мікробних інфекцій. Циклічні пептиди винаходу є бажаними як терапевтичні, оскільки вони є високо ефективними, протеолітично стабільними, по суті нечутливими до солей, не гепатотоксичними, негемолітичними та їх легко синтезувати. Катіонний заряд пептидів винаходу, можна думати, полегшує асоціацію пептиду із полярними головними групами мікробних мембран. Стабілізація заряджених груп у щільнішу конформацію циклізацією, можна думати, посилює це при тяжіння, таким чином посилюючи антимікробну потужність пептидів. У наступному аспекті винаходу запропоновано пептид, що містить амінокислоти, формули І: ((X)l(Y)m)n (I) де І та m - цілі числа від 0 до 10, такі, щоб І та m не дорівнювали 0; n - ціле число 1-10; X та Y, які можуть бути однаковими або різними, є амінокислотами, вибраними з групи: гідрофобні амінокислоти та/або катіонні амінокислоти, де пептидом є циклічним, для застосування як фармацевтичного засобу. Пептид може містити від 2 до 50 амінокислот, наприклад, 3, 4, 5, 6, або 7 і до 50 амінокислот, охоплюючи 3, 4, 5, 6, або 7 до 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 амінокислот. У кращому аспекті винаходу пептид містить 2-15 амінокислот, наприклад, 3-15 амінокислот. Переважно - пептид містить 5-13 амінокислот. Ще кращими є пептиди, що містять 3-7 амінокислот, наприклад, 7 амінокислот. Як відомо фахівцю, амінокислоти можна розміщати у різні класи залежно, передусім, від хімічних та фізичних властивості бічного ланцюга амінокислоти. Наприклад, деякі амінокислоти, які загалом вважають гідрофільними або полярними амінокислотами, а інші вважають гідрофобними або неполярними амінокислотами. Гідрофобна амінокислота може бути вибраною з групи гідрофобних амінокислот, як-то гліцин, лейцин фенілаланін, пролін, аланін, триптофан, валін, ізолейцин, метіонін, тирозин та треонін; катіонні амінокислоти можуть бути вибраними з групи: орнітин, гістидин, аргінін та лізин. Як застосовано тут, терміни "гідрофобні" та "катіонні" може стосуватися амінокислот, що мають гідрофобність не менше -1,10 та/або заряд не менше 0 як описано у Pauchere та Pliska Eur. J. Med Chem. 10:39 (1983). Гідрофобні або неполярні амінокислоти можуть також стосуватися амінокислот, що мають бічний ланцюг, що є незарядженим при фізіологічних рН, не є полярним та загалом відштовхується водним розчином. Амінокислоти можуть бути природно існуючими або синтетичними. У кращому аспекті винаходу, X та/або Y є катіонними амінокислотами, вибраними з групи: гістидин, орнітин аргінін та лізин. Переважно X та/або Y є аргініном або лізином. 1 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 X та/або Y можуть бути оптичними ізомерами гідрофобних або катіонних амінокислот, визначених тут, наприклад, D або L-амінокислот. Переважно X та/або Y є D-амінокислотами. У кращому аспекті винаходу, пептид формули (І) складається принаймні з 90 %, наприклад, принаймні 95 %, як-то 97-99 % або навіть 100 %, D-амінокислот. У кращому аспекті винаходу, пептид формули (1) складається принаймні з 90 %, наприклад, принаймні 95 %, як-то 97-99 % або навіть 100 %, L-амінокислот. Винахід також охоплює відомі ізомери (структурні, стерео-, конформаційні та конфігураційні), пептидоміметики, структурні аналоги вищезгаданих амінокислот, та амінокислот, модифікованих природно (наприклад, пост-трансляційною модифікацією) або хімічно, охоплюючи, але не виключно, фосфорилування, глікозилування, сульфонілування та/або гідроксилування. Загалом, пептид винаходу не охоплює амінокислоти: аспарагінова кислота, глутамінова кислота, аспарагін, глутамін або серин, але деякі пептиди винаходу можуть мати активність навіть у присутності цих амінокислот. У наступному кращому аспекті X та Y є однаковими. Переважно X та Y є однаковими та є лізином або аргініном. У пептиді формули (І) І та m можуть бути 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 та n може бути 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10. У пептиді формули (І) І може бути 1, n може бути 1, та m може бути між 4 та 9, наприклад, m може бути 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9. У пептиді формули (І) І, n та/або m можуть бути між 1 та 5, наприклад, 1, 2, 3, 4 або 5. У пептиді формули (І) І та m можуть бути цілим числом між 0 та 7 та n може бути цілим числом між 1 та 10. У пептиді формули (1) І та m можуть бути 0, 1 або 2 та n може бути цілим числом між 1 та 10. У пептиді формули (І) X та Y можуть бути однаковими, І може бути 0, m може бути 1 та n може бути 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10. У пептиді формули (І) X та Y можуть бути однаковими, І та m можуть бути 1 та n може бути 2, 3, 4 або 5. У пептиді формули (І) X та Y можуть бути однаковими, І може бути 1, m може бути 2 та n може бути 1, 2, 3 або 4. У пептиді формули (І) X та Y можуть бути однаковими, І та m можуть бути 2 та n може бути 1, 2, 3 або 4. У наступному аспекті винаходу запропоновано циклічний пептид, що містить амінокислоти формули II. (Х)n (II) де X та n описані тут. Переважно X - лізин, аргінін або орнітин. Переважно n - ціле число між 3 та 15. В одному втіленні винаходу X - аргінін. В альтернативному втіленні винаходу X - лізин. В іншому альтернативному втіленні винаходу X - орнітин. Пептиди винаходу можуть містити один або більше залишків цистеїну, наприклад, до 6 залишків цистеїну, як-то 1, 2, 3,4, 5 або 6 залишків цистеїну. На додаток, амінокислотна послідовність пептиду може бути модифікованою, що призводить до варіанту пептиду, що містить заміщення принаймні одного залишку амінокислоти у пептиді на ще один залишок амінокислоти, охоплюючи заміщення, що застосовують форму D краще, ніж L. Один або більше залишків пептиду можуть бути обміненими на інші для зміни, посилення або запобігання біологічній активності пептиду. Такий варіант може мати, наприклад, принаймні 10 % біологічної активності відповідного неваріантного пептиду. Часто застосовуваними є консервативні амінокислоти, тобто заміщення амінокислот із подібними хімічними та фізичними властивостями, як описано вище. Тому, наприклад, заміщення консервативними амінокислотами може охоплювати обмін лізину на аргінін, орнітин або гістидин; або обмін аргініну на лізин або ізолейцин, орнітину на гістидин; або обмін одної гідрофобної амінокислоти на іншу. Після уведення заміщення варіанти скринують на біологічну активність. Термін "пептид", як застосовано тут, означає, загалом, численність амінокислотних залишків, зв'язаних разом пептидними зв'язками. Його застосовують поперемінно та він означає також поліпептид та білок. В одному втіленні винаходу, циклічний пептидом є вибраним з групи: K-K-K-K-K-K-K R-R-R-R-R-R-R 2 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пептиди винаходу загалом є синтетичними пептидами. Пептиди можуть бути виділеними, очищеними пептидами або їх варіантами, котрі можуть бути синтезованими in vitro, наприклад, твердо-фазним способом синтезу пептидів, каталізованим ферментами синтезом пептидів або за допомогою технології рекомбінантної ДНК. У наступному аспекті винаходу запропоновано спосіб отримання пептиду згідно з винаходом, спосіб полягає у циклізації пептиду формули (І) або (II) реакції пептиду з агентом сполучення. Агентом сполучення може бути будь-який агент, здатний до утворення пептидного зв'язку між двома кінцевими (С та N кінцевими) залишками амінокислот пептиду, коли він є в лінійній формі, наприклад, між двома основними амінокислотними ланцюгами або бічними ланцюгами. Вибір агенту сполучення може впливати на ефективність сполучення та тому вихід циклічного пептиду. Приклади агентів сполучення, корисних у способі винаходу, показано у таблиці 1, хоча фахівець повинен знати інші відомі агенти сполучення, що є також корисними у винаході. Переважно агентом сполучення є HATU - О-(7-Азабензотриазол-1-іл-N,N,N'N'-тетраметилуроній гексафлуорфосфат, Переважно реакція між пептидом та агентом сполучення має місце у присутності основи. Основа може охоплювати, але без обмеження, н-метилморфолін (NMM) або діізопропілетиламін (DIEA). Переважно реакція має місце при лужних рН, наприклад, рН 8,5-9. Пептид може бути модифікованим уведенням захисної групи перед її реакцією з агентом сполучення. Захисні групи можуть охоплювати Pbf (2,2;4,6,7-пентаметил-дигідробензофуран-5-сульфоніл), tBu (т-бутил-етер), Mtr (метокситриметилбензолсульфоніл), Pmc (2,2,5,7,8-пентаметил-хроман6-сульфонілхлорид), Mbh (4,4-диметилоксибензилгідрид), Tmob (2,4,6-триметоксибензил). Aloс (алілоксикарбоніл), Fmoc (9-флуоренілметоксикарбоніл) та Вос (т-бутилоксикарбоніл). Після реакції з агентом сполучення захисну групу можна видаляти відщепленням захисної групи у помірно кислотних умовах, наприклад, у присутності розчину трифлуороцтової кислоти (ТФОК). При циклізації основного ланцюга пептиду, пептид на С-кінці лінійного пептиду піддають дії активувальної групи агенту сполучення та при перебігу реакції утворюється кето-енольний інтермедіат на альфа-карбоні цієї амінокислоти. Енольний (або алкенольний) інтермедіат може тому призводити до отримання двох енантіомерів, коли активувальна група видаляється від суміжного карбону та утворюється пептидний зв'язок. Ця рацемізація, тобто утворення відповідних енантіомерів індивідуальної амінокислоти (наприклад правообертальної та лівообертальної форм (тобто d та І ізомерів відповідно)) та отримання діастереомерів пептиду, може відбуватися на ділянці циклізації при активуванні застосовуваним агентом сполучення. Оскільки для пептидів винаходу бажано бути енантіомерно чистими, отримання небажаних діастереомерів слід зменшувати або попереджувати. Для зменшення або попередження отримання діастереомерів та отримання діастереометрично чистого пептиду, пептид винаходу може бути модифікованим уведенням ахірального компоненту, що попереджає рацемізацію пептиду при циклізації. Таким чином у наступному кращому аспекті винаходу пептид винаходу, або пептид, визначений у способі винаходу, модифікують, уводячи компонент, що попереджає утворення діастереомерів пептиду при циклізації. Як застосовано тут, "рацемічний пептид" є пептидом, що містить кількості (звичайно однакові кількості) відповідних оптичних ізомерів, наприклад, правообертальної та лівообертальної форм (тобто d та І ізомерів відповідно), амінокислоти на С-закінченні пептиду перед циклізацією пептиду. Компонент, уведений у пептидом є загалом ахіральною амінокислотою, котрою може бути природно існуюча амінокислота або аналог амінокислоти. Ахіральна амінокислота може бути вибраною з групи: гліцин, п-апанін, 3амінопропанова кислота, 4-аміномасляна кислота, 5-амінопентанова кислота та 6аміногексанова кислота. В одному втіленні винаходу пептидом є модифікованим на С-кінці уведенням ахіральної амінокислоти, наприклад, гліцину. Також модифікування пептиду винаходу уведенням компоненту, який визначено тут, на Скінці, співвідношення двох енантіомерів, утворених при циклізації пептиду залежить від кількох фактори, як-то розчинник, час інкубування та температура при циклізації (тобто, реакції з агентом сполучення) та активувальних груп, застосовуваних для полегшення циклізації. Заявлений винахід крім того стосується циклізованих пептидів, що можна отримати способом винаходу. В одному втіленні винаходу, циклічний пептид містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи: K-K-K-K-K-K-K R-R-R-R-R-R-R О-О-О-О-О-О-О DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR DO-DO-DO-DO-DO-DO-DO 3 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 DK-DK-DK-DK-UK-DK-DK Для ідентифікації, чи не мають активні пептиди небажаної токсичності для клітин ссавців, можна зробити індивідуальні пептиди або бібліотеки пептидів, та індивідуальні пептиди або пептиди з цих бібліотек можна скринувати стосовно антимікробної активності та токсичності, охоплюючи, без обмеження, антигрибкову, антибактеріальну, антивірусну, протипротозойну, антипаразитичну активність та токсичність. Пептиди винаходу можуть існувати у різних формах, як-то вільні кислоти, вільні основи, естери та інші проліки, солі та таутомери, наприклад, а винахід охоплює усі форми варіантів сполук. Таким чином, винахід охоплює сіль або проліки пептиду або варіант пептиду винаходу. Пептид винаходу можна застосовувати у формі фармацевтично прийнятної солі. Фармацевтично прийнятні солі заявленого винаходу можуть бути синтезованими з вихідного пептиду, котрий містить основний або кислотний компонент, звичайними хімічними способами. Загалом, такі солі можна отримувати реакцією вільної кислоти або основи пептиду із стехіометричною кількістю прийнятної основи або кислоти у воді або в органічному розчиннику, або у суміш двох неводних середовищ типу етеру, етилацетат, етанол, ізопропанол, або ацетонітрил, що є кращими. Перелік придатних солі є у Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., US, 1985, p. 1418, розкриття якого уведено тут як довідку; дивись також Stahl et al, Eds, "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use", Verlag Helvetica Chimica Acta та Wiley-VCII 2002. Винахід таким чином охоплює фармацевтично прийнятні солі пептиду винаходу, де вихідна сполука є модифікованою створенням її кислотної або основної солі, наприклад, звичайної нетоксичної солі або солі четвертинного амонію, котра утворюється, наприклад, з неорганічної або органічної кислоти або основи. Приклади таких кислотно-адитивних солей охоплюють ацетат, адипат, альгінат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, гідросульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропіонат, диглюконат, додецилсульфат, етансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, гліцерофосфат, гемісульфат, гептаноат, гексаноат, гідрохлорид, гідробромід, гідройодид, 2-гідроксіетансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталінсульфонат, нікотинат, оксалат, палмоат, пектинат, персульфат, 3фенілпропіонат, пікрат, півалат, пропіонат, сукцинат, тартрат, тіоціанат, тозилат та ундеканоат. Солі основ охоплюють солі амонію, солі лужних металів, як-то натрію та калію, солі лужноземельних металів, як-то кальцію та магнію, солі з органічною основою, як-то дициклогексиламін, N-метил-О-глутамін, та солі із амінокислотами, як-то аргінін, лізин, тощо. Також, групи з вмістом основного нітрогену можуть бути кватернізованими нижчими алкілгалогенідами, як-то метил, етил, пропіл, та бутилхлорид, броміди та йодиди; діалкілсульфати типу диметил, діетил, дибутил; та діамілсульфатів, довголанцюгові галогеніди, як-то децил, лаурил, міристил та стеарилхлориди, броміди та йодиди, аралкілгалогеніди типу бензил та фенетилброміди та інші. Солі карбоксильної групи пептиду або варіанту пептиду винаходу можна отримувати звичайним чином контактуванням пептиду із одним або більше еквівалентами бажаної основи, як-то, наприклад, гідроксиду металу, наприклад, натрій гідроксиду; карбонату або гідрокарбонату металу, як-то, наприклад, натрій карбонату або гідрокарбонату; або амінооснови, як-то, наприклад, триетиламін, триетаноламін тощо. Винахід охоплює проліки активних фармацевтичних різновидів описаного пептиду, наприклад, в яких одна або більше функціональних груп є захищеними або дериватизованими, але можуть перетворюватися in vivo у функціональні групи, як у випадку естерів карбонових кислот, здатних перетворюватися in vivo у вільну кислоту, або у випадку захищених амінів, у вільну аміногрупу. Термін "проліки", як застосовано тут, представляє зокрема структури, котрі швидко перетворюються in vivo у вихідну структуру, наприклад, гідролізом у крові. У наступному аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично ефективну кількість пептиду винаходу, або два або більше різних пептидів винаходу. Композиція також містить фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розріджувач. Вираз "фармацевтично прийнятні" стосується сполук, матеріалів, композицій, та/або дозованих форм, котрі у рамках медичних вимог придатні для застосування у контакті з тканинами людини або тварини без надлишкової токсичності, подразнення, алергічної реакції, або інших проблем чи ускладнень, є відповідними розумному співвідношенню перевага/ризик. Пептид винаходу є корисним, серед іншого, як антимікробний пептид, наприклад, проти бактерій, грибків, дріжджів, паразитів, протозоа та вірусів. Термін, "антимікробний пептид" можна застосовувати тут для визначення будь-якого пептиду, що має мікроцидну активність та 4 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 охоплює, без обмеження, будь-який описаний пептид, що має антибактеріальні, антигрибкові, антимікотичні, анти-паразитичні, протипротозойні, антивірусні, антиінфекційні, альгіцидні, протиамебні, мікроцидні, бактерицидні, фунгіцидні, антипаразитичні, протозоацидні, протозоїцидні властивості. У кращому аспекті, винахід стосується застосування пептиду згідно з винаходом у виробництві медикаменту для лікування мікробної інфекції. Під "мікробною інфекцією" розуміють інфекцію, викликану бактеріями, паразитами, протозоа, вірусами або грибками, охоплюючи дріжджі. Під "патогеном" загалом, розуміють будьякий організм, що спричинює хворобу. Бактеріальний патоген може бути похідним від бактеріальних різновидів, що вибрані без обмеження з групи: Staphylococcus spp., наприклад, Staphylococcus aureus (наприклад, Staphylococcus aureus NCTC 10442), Staphylococcus epidermidis; Chlamydia spp., наприклад, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Enterococcus spp., наприклад, Enterococcus faecalis; Streptococcus pyogenes; Listeria spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., наприклад, Mycobacterium tuberculosis; Enicrobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., наприклад, Streptococcus Груп А або В, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., наприклад, Helicobacter pylori; Neisseria spp., наприклад, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Bvrrelia burgdorferi; Shigella spp., наприклад, Shigella flexneri; Escherichia coli (E.coli 0157.H7 NCTC 12900); Haemophilus spp, наприклад, Haemophilus influenzae; Francisella tidoremis; Bacillus spp., наприклад, Bacillus anthracis; Clostridia spp., наприклад, Clostridium botulinum; Yersinia spp., наприклад, Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp., наприклад, Burkholderia cepacia, B. mallei та Bpseudomallei. У кращому застосуванні згідно з винаходом бактеріальним патогеном є Staphyloccus aureus або E.coli. Вірусний патоген може бути похідним від вірусу, вибраного без обмеження з групи: вірус імунодефіциту людини (HTV1 & 2); вірус лейкемії Т-клітин людини (I1TLV 1 & 2); вірус ебола; вірус папіломи людини (наприклад, HPV-2, HPV-5, HPV-8 HPV-16, HPV-18, HRV-31, HPV-33, HPV-52, HPV-54 та HPV-56); паповавірус; риновірус; поліовірус; вірус герпесу; аденовірус; вірус Епштейна-Барра; вірус грипу, віруси гепатиту В та С, вірус віспи, ротавірус або коронавірус SARS. Паразитичний патоген може бути похідним від паразиту, вибраного без обмеження з групи: Trypanosoma spp. (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei), Leishmania spp., Giardia spp., Trichomonas spp. Entamoeba spp, Naegleria spp., Acanthamoeba.spp, Schistosoma spp., Plasmodium spp., Ctytosporidium spp., Isospora spp., Balantidium spp., Loa Loa, Ascaris lumbricoides, Dirofilaria immitis, Toxoplasma ssp., наприклад, Toxoplasma gondii. У кращому застосуванні згідно з винаходом мікробною інфекцією є грибкова інфекція. Грибковий патоген може бути похідним від грибку (охоплюючи дріжджі), вибраного, без обмеження, з родини Candida spp., (наприклад, C.albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., (наприклад, T.rubrum ma Tinier digitate), Tinea spp., Aspergillus spp.; Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (наприклад, Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidlomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phiahphora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporinm spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphimn spp., Leptosphaeria spp.,. Malassezia spp. (наприклад, Malassezia Furfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Faecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochacla spp., Rhizomucor spp, Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillwm spp., Wangiella spp. У кращому застосуванні згідно з винаходом грибковий патоген є з родини Trichophyton spp. або Cryptococcus spp. Наприклад грибковий патоген може бути Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale або Cryptococcus neoformans. Грибковою інфекцією може бути системна, місцева, підшкірна, шкірна інфекція або інфекція слизової. Місцеві грибкові інфекції нігтів та шкіри є загалом викликаними дерматофітами, хоча деякі недерматофіти, як-то дріжджі, можуть також викликати інфекції шкіри. Дерматофітна інфекція може охоплювати інфекцію кільцевим лишаєм, наприклад, Tinea barbae (волосся на обличчі), Tinea capitis (голова), Tinea corporis (тіла), Tinea cruris (пах), Tinea faciei (обличчя), Tinea manuum (руки), Tinea pedis (ноги), Tinea unguium (нігті), Tinea (Pityriasis) versicolor, Tinea incognito або Tinea nigra. Інфекція може бути похідною від родини грибків Epidermophyton, Microsporum та Trichophyton spp. (наприклад, T.rubrum та Т. interdigitale). 5 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дерматофітною інфекцією може бути інфекція шкіри, тонкого шару кісткової тканини, рогівки, нігтів (на руках та ногах) або волосся. Конкретно згадуваними є дерматофітні інфекції, викликані дерматофітами родини Trichophyton, Epidermophyton або Microsporum. Типові дерматофіти охоплюють Epidermophyton floccosum, Microsporum cants, Microsporum audouinii, Microsporum gypseum, Microsporum nanum, Microsporum ferrugineum, Microsporum distortum, Microsporum fiilvum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale, Trichophyton mentagrophytes var. nodulare, Trichophyton tonsurans, Trichophyton Soudanese, Trichophyton violaceum, Trichophyton megnini, Trichophyton schoenlenii, Trichophyton gallinae, Trichophyton krajdenii, Trichophyton yaoundei, Trichophyton equinum, Trichophyton erinacei та Trichophyton verrucosum. В особливому втіленні винаходу, дерматофітною інфекцією є оніхомікоз. Термін "оніхомікоз" охоплює, але без обмеження, периферичні бічні піднігтьові, поверхневі білі, проксимальні білі піднігтьові, вторинні дистрофічні, первинні дистрофічні, кінцевого нігтю, кандидазні (наприклад, оніхолізисні та хронічні слизово-шкірні хвороби) типи оніхомікозу та Tinea ungium. Недерматофітні грибки, пов'язані із оніхомікозом, охоплюють Aspergillus spp. Cephalporum spp. Fusarium oxysporum, Scopularis brevicaulis, Scytalidium spp. Пептиди винаходу є потужними антимікробними пептидами для багатьох патогенних організмів. Однак, пептиди винаходу можуть також бути корисними у лікуванні інших станів, охоплюючи, без обмеження, стани, пов'язані з інфекціями слизової, як-то кистозний фіброз, шлунково-кишкові, сечостатеві, сечові (наприклад, інфекція нирок чи цистит) або респіраторні інфекції. Пептиди винаходу можуть також бути корисними у лікуванні або попередженні інфекцій, пов'язаних звичайно із шкірою, охоплюючи, серед іншого, поранення, виразки та ураження, наприклад, шкірні поранення, як-то так порізи або опіки, та станів, пов'язаних з цим. У кращому аспекті винаходу пептиди є корисними у лікуванні бактеріальних інфекцій шкіри або "піодермій". Термін "лікування" стосується дії описаних тут пептидів, що полягає у корисності для пацієнтів уражених (інфекційною) хворобою, охоплюючи поліпшення стану пацієнта або затримування прогресії хвороби. Як застосовано тут "лікування поранення" може охоплювати загоєння поранення та, пов'язані стани та терапії, що сприяє, посилює, або прискорює загоєння тканин та охоплює постоперативне рубцювання, опіки, виразки, псоріаз, прискорення загоювання тканин, наприклад, після косметичної хірургії та трансплантації органів. Таким чином, у наступному аспекті винаходу запропоновано субстрат, до котрого пептид винаходу є застосованим або приєднаним. Переважно, субстрат є придатним для застосування до поранень або постачання до ділянки поранення. Переважно, субстрат дозволяє переніс пептидів винаходу від субстрату до поранення для досягнення їх антибіотичного впливу. Субстратом може бути матеріал для перев'язування, наприклад, матеріал для перев'язування поранень. Матеріал для перев'язування може містити штучний матеріал або це може бути матеріалом типу колагену. Пептиди винаходу можуть також знайти застосування як дезінфектанти. У цьому контексті пептид або фармацевтичні композиції винаходу можна застосовувати, поодинці або у комбінації з іншими дезінфектантами до поверхні, яку треба лікувати. Як застосовано тут, "поверхня, яку треба лікувати" може бути субстратом, визначеним тут або медичним пристроєм. У наступному аспекті винахід стосується способу лікування або попередження мікробної інфекції у особи, який полягає у застосуванні до вказаної особи терапевтично ефективної кількості пептиду згідно з винаходом. У кращому способі винаходу, мікробною інфекцією є грибкова інфекція. У способі винаходу пептидом є застосованим місцево до шкіри або нігтів вказаної особи. Ссавців, птиць та інших тварин можна лікувати пептидами, композиціями або способами, описаними тут. Такі ссавці та птиці охоплюють людей, собак, кішок та худобу, як-то коні, велика рогата худоба, вівці, кози, курки та індики тощо. Більш того, рослини можна також лікувати пептидами, композиціями або способами винаходу. Коли особа є твариною, спосіб винаходу можна застосовувати до утворень типу нігтів, охоплюючи, але не виключно, копита та пазурі. Спосіб винаходу може охоплювати, на додаток до лікування пептидом, лікування, що може посилювати проникнення пептиду у нігті. Це можна було б полегшувати хімічним або фізичним засобом. Фізичне лікування, як-то травлення нігтів або наповнення дорсального шару нігтів може посилювати проникність пептидів винаходу. Хімічного збільшення проникності у нігті пептидів винаходу можна досягти руйнуванням фізичних або хімічних зв'язків у кератинових пластинках нігтів. Агенти пом'якшення нігтів, охоплюючи, але не виключно, сечовину та 6 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 саліцилову кислоту, посилення гідратації нігтів для зниження густини нігтів та тому збільшення проникності пептидів винаходу. Сполуки з вмістом сульфгідрильних груп повинні розщеплювати дисульфідні зв'язки у кератині нігтів та можуть призводити до дестабілізації та збільшення проникності ліків. У наступному аспекті винахід стосується способу лікування поранення у особи, який полягає у застосуванні до поранення терапевтично ефективної кількості пептиду або субстрату згідно з винаходом. Для досягнення бажаного впливу, пептид, варіант або їх комбінацію можна застосовувати як одиничні або поділені дози, наприклад, принаймні від 0,01 мг/кг до 500-750 мг/кг, принаймні від 0,01 мг/кг до 300-500 мг/кг, принаймні від 0,1 мг/кг до 100-300 мг/кг або принаймні від 1 мг/кг до 50-100 мг/кг маси тіла або принаймні 1 мг/кг - 20 мг/кг маси тіла, хоча інші дози можуть забезпечувати корисні результати. Кількість варіюватиме залежно від різних факторів, охоплюючи, без обмеження, вибраний пептид, його клінічну дію, хворобу, масу, фізичний стан, здоров'я ссавця, того, чого треба досягти - попередження або лікування, та чи є пептид хімічно модифікованим. Застосування терапевтичних агентів згідно з заявленим винаходом може бути одиничною дозою, багаторазовими дозами, безперервним або періодичним чином, залежно, наприклад, від фізіологічного стану реципієнта, будь-якої мети застосування, терапевтичної або профілактичної, та інших факторів, відомих фахівцям. Застосування пептидів винаходу може бути по суті безперервним протягом попередньо вибраного часу або може бути серією окремих доз. Розглядають як локальне, так і системне застосування. Для отримання композиції пептиди синтезують або отримують інакше, очищають, якщо необхідно, та тоді ліофілізують та стабілізують. Пептид можна тоді доводити до прийнятної концентрації та необов'язково комбінувати з іншими агентами. Абсолютна маса даного пептиду в окремій дозі може широко варіювати. Наприклад, можна застосовувати приблизно 0,01-2 г або приблизно 0,01-500 мг, принаймні одного пептиду винаходу, або кількох пептидів специфічних для конкретного типу клітин. Альтернативно, окрема доза може варіювати у межах приблизно 0,01 г - 50 г, приблизно 0,01 г - 35 г, приблизно 0,1 г - 25 г, приблизно 0,5 г - 12 г, приблизно 0,5 г - 8 г, приблизно 0,5 г - 4 г, або приблизно 0,5 г - 2 г. Таким чином, одну або більше придатних форм окремих доз, що містять терапевтичні пептиди винаходу, можна застосовувати багатьма шляхами, охоплюючи пероральний, парентеральний (охоплюючи підшкірний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий та інтраперитонеальний), ректальний, шкірний, трансдермальний, інтраторакальний, внутрішньолегеневий та інтраназальний (респіраторний) шляхи. Терапевтичні пептиди можна також формувати у ліпідній композиції або для подовженого вивільнення (наприклад, застосовуючи мікроінкапсулювання, дивись WO 94/07529, та патент США № 4,962,091). Композиції можуть, де прийнятно, бути у дискретних формах окремих доз та їх можна отримувати будь-якими добре відомими способами. Такі способи можуть охоплювати етап змішування терапевтичного агенту із рідкими носіями, твердими матрицями, напівтвердими носіями, мілко подрібненими твердими носіями або їх комбінаціями, а тоді, якщо необхідно, уведення або формування продукту у бажану систему постачання. Коли терапевтичні пептиди винаходу отримують для перорального застосування, їх загалом комбінують з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем для утворення фармацевтичної композиції або форми окремої дози. Для перорального застосування пептиди можуть бути порошком, гранульованою композицією, розчином, суспензією, емульсією або у природному або синтетичному полімері або смолі для ковтання активних інгредієнтів з жувальної гумки. Активні пептиди можуть також бути болюсами, електуаріями або пастами. Перорально застосовувані терапевтичні пептиди винаходу можна також формувати для подовженого вивільнення, наприклад, пептиди можуть бути покритими, мікро-інкапсульованими або інакше розміщеними у межах пристрою подовженого постачання. Загалом активні інгредієнти у таких композиціях складають 0,1-99,9 мас. % композиції. Фармацевтичні композиції з вмістом терапевтичних пептидів винаходу можна отримувати відомими у рівні техніки способами, застосовуючи добре відомі та легко доступні інгредієнти. Наприклад, пептид можна формувати зі звичайними наповнювачами, розріджувачами, або носіями, та формувати у таблетки, капсули, розчини, суспензії, порошки, аерозолі тощо. Приклади ексципієнтів, розріджувачів, та носіїв, що є придатними для таких композицій, охоплюють буфери, а також наповнювачі, як-то крохмаль, целюлоза, цукри, манітол, та похідні силіцію. Зв'язувальні агенти можуть також бути уведеними, як-то карбоксиметилцелюлоза, гідроксиметилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза та інші похідні целюлози, альгінати, желатин та полівінілпіролідон. Зволожувачі можуть бути уведеними, як-то гліцерин, 7 UA 97633 C2 5 10 15 20 2530 35 40 45 50 55 дезинтегратори, як-то кальцій карбонат та натрій гідрокарбонат. Агенти для уповільнення розчинення можуть також бути уведеними, як-то парафін. Прискорювачі ресорбції, як-то сполуки четвертинного амонію можуть бути уведеними також. ПАР, як-то цетиловий спирт та гліцерин моностеарат можуть бути уведеними. Адсорбційні носії, як-то каолін та бентоніт можна додавати. Лубриканти, як-то тальк, кальцій та магній стеарат, та тверді поліетилгліколі можуть бути уведеними також. Консерванти можна додавати також. Композиції винаходу можуть також містити загусники, як-то целюлоза та/або похідні целюлози. Вони можуть також містити камеді, як-то ксантанову, гуарову камедь або гуміарабік, або альтернативно поліетиленгліколі, бентоніти та монтморилоніти, тощо. Наприклад, таблетки з вмістом пептидів винаходу можуть містити буферувальні агенти, якто кальцій карбонат, магній оксид та магній карбонат. Придатні буферувальні агенти можуть містити також ацетат, цитрат, борат та фосфат. Таблетки можуть містити також неактивні інгредієнти, як-то целюлоза, пептизований крохмаль, силіцій діоксид, гідроксипропілметилцелюлоза, магній стеарат, мікрокристалічна целюлоза, крохмаль, тальк, титан діоксид, бензойна кислота, лимонна кислота, кукурудзяний крохмаль, мінеральна олива, поліпропіленгліколь, натрій фосфат, цинк стеарат, тощо. Тверді або м'які желатинові капсули з вмістом принаймні одного пептид винаходу можуть містити неактивні інгредієнти, як-то желатин, мікрокристалічна целюлоза, натрій лаурилсульфат, крохмаль, тальк, та титан діоксид, тощо, а також рідкі носії, як-то поліетиленгліколі (ПЕГ) та рослинні олії. Більш того, таблетки з ентеросолюбільним покриттям з вмістом одного або більше пептидів винаходу призначені для супротиву дезинтеграції у шлунку та для розчинення у більш нейтральному лужному середовищі дванадцятипалої кишки. Терапевтичні пептиди винаходу можна також формувати як еліксири або розчини для зручного перорального застосування, або як розчини, прийнятні для парентерального застосування, наприклад, внутрішньом'язово, підшкірно, інтраперитонеально або внутрішньовенно. Фармацевтичні композиції терапевтичних пептидів винаходу можуть також мати форму водного або безводного розчину або дисперсії, або альтернативно форму емульсії або суспензії чи цілющої мазі. Таким чином, терапевтичні пептиди можна формувати для парентерального застосування (наприклад, ін'єкціями, наприклад, болюсними ін'єкціями або безперервним вливанням) та можуть мати форму окремої дози в ампулах, попередньо заповнених шприцах, ємностях для вливання невеликого об'єму, або у багато-дозовій ємності. Активні пептиди та інші інгредієнти можуть утворювати суспензії, розчини, або емульсії в олійному або водному носії, та можуть містити формувальні агенти, як-то суспендувальні агенти, стабілізатори та/або диспергувальні агенти. Альтернативно, активні пептиди та інші інгредієнти можуть бути у формі порошку, отриманого асептичним виділенням стерильного твердого продукту або ліофілізацією з розчину для відтворення придатним носієм, наприклад, стерильною, водою без пірогену перед застосуванням. Ці композиції можуть містити фармацевтично прийнятні носії, наповнювачі та ад'юванти, що є добре відомими у рівні техніки. Можливо, наприклад, для отримання розчинів застосовувати один або більше органічних розчинників, що є прийнятними з фізіологічної точки зору, вибраними з розчинників, як-то ацетон, оцтова кислота, етанол, ізопропіловий спирт, диметилсульфоксид, етери гліколю, як-то продукти під назвою "Dowanol", полігліколі та поліетиленгліколі, С1-С4 алкіл-естери коротко-ланцюгових кислот, етил або ізопропіллактат, тригліцериди жирних кислот, як-то продукти, що є на ринку під назвою "Miglyol", ізопропілміристат, тваринний жир, мінеральна олив та рослинні олії та полісилоксани. Розчинники або розріджувачі, що містять пептиди винаходу можуть охоплювати розчини кислот, диметилсульфон, N-(2-меркаптопропіоніл)гліцин, 2-н-ноніл-1,3-діоксолан та етиловий спирт. Переважно розчинник/розріджувач є кислотним розчинником, як-то, наприклад, оцтова кислота, лимонна кислота, борна кислота, молочна кислота, пропіонова кислота, фосфатна кислота, бензойна кислота, масляна кислота, яблучна кислота, малонова кислота, щавлева кислота, бурштинова кислота або винна кислота. Також розглянутими є комбінації продуктів, що містять один або більше пептидів заявленого винаходу та один або більше інших антимікробних або антигрибкових агентів, наприклад, полієнів, як-то амфотерцин В, ліпідний комплекс амфотерцину В (ABCD), ліпосомальний амфотерцин В (L-AMB), та ліпосомальний ністатин, азоли та триазоли, як-то вориконазол, флуконазол, кетоконазол, ітраконазол, позаконазол тощо; інгібітори глюкан-синтази, як-то каспофунгін, мікафунгін (FK463), та V-ехінокандин (LY303366); гризеофульфін; аліламіни, як-то тербінафін; флуцитозин або інші антигрибкові агенти, охоплюючи описані тут. На додаток, вважають, що пептиди можна було б комбінувати із місцевими антигрибковими агентами, як-то циклопірокс оламін, галогенпрогін, толнафтат, 8 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ундециленат, місцевий нісатин, аморолфін, бутенафін, нафтифін, тербінафін та інші місцеві агенти. На додаток, пептиди можна формувати як дозовані форми подовженого вивільнення тощо. Композиції можуть бути створеними так, що вони вивільняють активний пептид, наприклад, у конкретній частині кишкового або респіраторного тракту, можливо протягом часу. Покриття, оболонки та захисні матриці можна зробити, наприклад, з полімерних речовин, як-то полілактид-гліколяти, ліпосоми, мікроемульсії, мікрочастинки, наночастинки, або воски. Ці покриття, оболонки та захисні матриці є корисними для покриття постійно діючих пристроїв, якто, наприклад, стенти, катетери, трубки для перитонеалного діалізу, дренувальні пристрої тощо. Для місцевого застосування, активні агенти можна формувати для безпосереднього застосування до цільової ділянки. Форми, створені головним чином для місцевого застосування мають форму, наприклад, кремів, молочка, гелів, порошків, дисперсій або мікроемульсій, лосьйонів, загущених до більшого або меншого ступеню, просочених прокладок, мазей або брусків, аерозольних композицій (наприклад, спреї або пінки), мила, ПАР, лосьйонів або брикетів мила. Інші звичайні форми цього охоплюють матеріал для перев'язування поранень, покриті бинти або інші полімерні покриття, мазі, креми, лосьйони, пасти, желе, спреї, та аерозолі. Таким чином, терапевтичні пептиди винаходу можна постачати за допомогою пластирів або бинтів для шкірного застосування. Альтернативно, пептид можна формувати як частину адгезивного полімеру, як-то поліакрилат або кополімер акрилат/вінілацетат. Для довготермінового застосування могло б бути бажаним застосування мікропористих та/або проникних для повітря ламінатів, так гідратацію або мацерацію шкіри можна мінімізувати. Шар може бути будь-якої прийнятної товщини, що повинна забезпечувати бажані захисні та підтримувальні функції. Придатна товщина повинна загалом бути приблизно 10-200 мікрон. Місцеве застосування може бути у формі покриття або лаку для нігтів. Наприклад, антигрибкові пептиди можна формувати у розчині для місцевого застосування, що містить етилацетат (NF), ізопропіловий спирт (USP), та бутилмоноестер полі[метилвінілетеру/малеїнової кислоти] в ізопропіловому спирті. Фармацевтичні композиції для місцевого застосування можуть містити, наприклад, фізіологічно прийнятний буферований фізіологічний розчин з вмістом приблизно 0,001 мг/мл 100 мг/мл, наприклад, 0,1 мг/мл - 10 мг/мл, одного або більше пептидів заявленого винаходу для специфічних показань або хвороб, що треба лікувати. Мазі та креми можна, наприклад, формувати з водною або олійною основою з добавкою придатних загусників та/або желатинувальних агентів. Лосьйони можна формувати з водною або олійною основою та вони загалом також містять один або більше емульгаторів, стабілізаторів, диспергувальних агентів, суспендувальних агентів, загусників, або барвників. Активні пептиди можна також постачати за допомогою іонофорезу, наприклад, як розкрито у патентах США №№ 4,140,122; 4,383,529; або 4,051,842. Процент за масою терапевтичного агенту винаходу у місцевій композиції залежить від різних факторів, але загалом повинен бути від 0,01 % до 95 % загальної маси композиції, та звичайно 0,1-85 мас. %. Краплі для очей краплі або носа можна формувати із одним або більше терапевтичними пептидами у водній або неводній основі, що містить також один або більше диспергувальних агентів, солюбілізаторів або суспендувальних агентів. Рідкі спреї можна накачувати, або зручно постачати з упаковки під тиском. Краплі можна постачати за допомогою крапельниці, адаптованої для постачання рідкого вмісту краплями, або за допомогою спеціально сформованої кришки. Терапевтичний пептид можна крім того формувати для місцевого застосування у роті або горлі. Наприклад, активні інгредієнти можна формувати як пастилку, що крім того містить ароматизовану основу, звичайно сахарозу та гуміарабік або трагакант; пастилки, що містять композицію в інертній основі, як-то желатин та гліцерин або сахароза та гуміарабік; та промивання для рота, що містять композицію заявленого винаходу у придатному рідкому носії. Певні необмежувальні приклади носіїв та/або розріджувачів, що є корисними у фармацевтичних композиціях заявленого винаходу, охоплюють воду та фізіологічно прийнятний буферований фізіологічний розчини, як-то буферовані фосфатом фізіологічні розчини з рН 7,08,0. Пептиди винаходу можна також застосовувати до респіраторного тракту. Для застосування інгаляцією або вдуванням композиція може мати форму сухого порошку, наприклад, суміш порошку терапевтичного агенту та придатної порошкової основи, як-то лактоза або крохмаль. Терапевтичні пептиди заявленого винаходу можна також застосовувати у водному розчині при застосуванні в аерозольній або інгаляційній формі. Таким чином, інші аерозольні фармацевтичні композиції можуть містити, наприклад, фізіологічно прийнятний буферований 9 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фізіологічний розчин з вмістом приблизно 0,001 мг/мл - 100 мг/мл, наприклад, 0,1 та 100 мг/мл, як-то 0,5-50 мг/мл, 0,5-20 мг/мл, 0,5-10 мг/мл, 0,5-5 мг/мл або І-5 мг/мл одного або більше пептидів заявленого винаходу, специфічних для показання або хвороби, що треба лікувати. Особливості, цілі числа, характеристики, сполуки, хімічні компоненти або групи, описані разом з конкретним аспект, втіленням або прикладом винаходу, як слід розуміти, є підхожими стосовно будь-якого іншого аспекту, втілення або прикладу, описаних тут. ПРИКЛАДИ Матеріали та Способи Приклад 1 Циклізацію полілізинового пептиду з 7 амінокислот проводили розчиненням 1 екв. захищеного пептиду 1 екв. (сq=еквівалентний об'єм) HATU у ДМФ (диметилформамід) при 100 мг/мл. Для збільшення рН 2,5 екв. DIEA (діізопропілетиламін) додавали та перебіг реакції контролювали ВЕРХ. Після завершення пептид осаджували у воді та промивали у воді ще. Пептид тоді сушили та знімали захист флуоридною кислотою для отримання кінцевого циклічного пептиду. Іонообмінну хроматографію тоді застосовують для заміни флуоридної кислоти оцтовою кислотою перед ліофілізацією. Приклад 2 Циклізацію поліаргінінового пептиду з 7 амінокислот проводили комбінуванням 1 екв. захищеного пептиду із 5 екв. NaHCO3 (натрій гідрокарбонат) та 2 екв. РуВОР у ДМФ при 28,5 мг/мл. Реакцію контролювали ІХС та після завершення пептид осаджували у воді та промивали у воді ще. Пептид тоді сушили та знімали захист флуоридною кислотою для отримання кінцевого циклічного пептиду. Іонообмінну хроматографію тоді застосовують для заміни флуоридної кислоти оцтовою кислотою перед ліофілізацією. Приклад 3 Циклізація поліаргінінового пептиду з 7 амінокислот Розчин 1: 57 мг HBTU (М=379,3, 0,15 ммоль) або 57 мг of HATU (M=380,3, 0,15 ммоль) та 60 мкл, 1 0,92 мг/мл NMM (н-метилморфоліну, М=101,2, 0,55 ммоль) розчиняли у 2,86 мл ДМФ. Розчин 2: 288 мг H-[Arg(Pbf)]7-OH (M=2877,6, 0,1 ммоль) (поліаргініновий пептид з 7 амінокислот) розчиняли у 0,71 мл ДМФ. Розчин 2 додавали краплями до розчину 1 протягом 30 хвилин. рН перевіряли вологим рНпапером та доводили до 8,5-9. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі*. Суміш концентрували під вакуумом. Розчин NaHCO 3 (5 %) додавали. Осад захищеного циклопептиду фільтрували та промивали водою. 150-200 мг отримували. Відщеплення груп Pbf проводили у ТФОК/Воді (95/5, за об'ємом) (10 мл для 1 г захищеного циклопептиду). Суміш концентрували та додавали ІРК для осадження сирого продукту. Отримували 100-110 мг сирого циклоАrg. (*Сполучення, застосовуючи HATU було завершено через 5 годин. Кількість NMM залежить від надлишку ТФОК у H-[Arg(Pbf)]7-OH.) Циклічні пептиди є синтезованими як принаймні 95 %, звичайно між 97 та 99 % енантіомерно чисті. Вони є принаймні 95 % енантіомерно чистими, коли синтезовані цим способом. Тестування антигрибкової чутливості розбавленням живильного середовища Чутливість важливих штамів грибів до циклізованих пептидів визначали, застосовуючи затверджені стандарти Clinical Laboratory Standard Institute (CLS1; раніше NCCLS). Грибкову чутливість тестували, застосовуючи "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing Tilamentous Fungi; Approved Standard M38-F", та дріжджі чутливість тестували, застосовуючи "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard-Second Edition M27-A". Тестування антибактеріальної чутливості розбавленням живильного середовища Чутливість важливих бактеріальних штамів до циклізованих пептидів визначали, застосовуючи затверджені стандарти Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI; раніше NCCLS). Бактеріальну чутливість тестували, застосовуючи "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Anaerobically; Approved Standard - Seventh Edition M7-A7" Аналізи гемолізу Пептид під дослідженням алкілували при бажаній концентрації при потроєнні у 96-лункових планшетах Nunc, та отримували серійні 1:1 розбавлення (100 мкл). 100 мкл промитих (3 8 промивання по 50 мл HBSS) поєднаних червоних клітин крові людини (RBC) (110 RBC/мл) додавали до тест-лунок та інкубували при 37 °C протягом 3 годин. Після інкубування ще 100 мкл HBSS додавали до усіх лунок та планшет інкубували при 4 °C протягом ночі. 100 мкл супернатанту видаляли та поміщали у новий мікротирувальний планшет, котрий зчитували у 10 UA 97633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 планшетному зчитувачі Sunrise (Tascam) при 450/620 нм. Контрольні лунки (чотирикратно) з буфером поодинці, буфером та RBC, та Н2О та RBC були також охоплені. Дані були наносили на графік та статистично аналізували, застосовуючи програму Graph Tad (Prism software). Результати Послідовність циклізованих пептидів Послідовність пептидів аналізували таким чином: Пептид 1: Циклічний-K-K-K-K-K-K-K Пептид 2: Циклічний-R-R-R-R-R-R-R Пептид 3: Циклічний-K-K-K-K-K-K-K-G Пептид 4: Циклічний-R-R-R-R-R-R-R-G Пептид 5: Циклічний-O-O-O-OO-O-O-G Пептид 6: Циклічний-DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR-G Пептид 7: Циклічний-DO-DO-DO-DO-DO-DO-DO-G Пептид 8: Циклічний-DK-DK-DK-DK-UK-DK-DK-G Префікс 'D-' свідчить, що у синтезі пептиду застосовуваний D-ізомер амінокислоти. 'О' представляє неприродну амінокислоту орнітин. Циклічні пептиди, що складаються 3, 5, 9, 11, 13 або 15 амінокислот аргініну або лізину синтезовані та їх активність визначено (дані не показані). Антибактеріальна активність циклізованих пептидів Культури Е. соїі та Staphylococcus aureus піддавали дії Пептиду 1 та МІС (мінімальна пригнічувальна концентрація) після росту протягом наступних 16 годин при 37 °C була 1 мМ для обох організмів (Таблиця 2). Пептид 1 загалом інгібує ріст Е. соlі та Staphylococcus aureus при цій концентрації. Це дослідження повторювали з Пептидом 2. МІС для Пептиду 2 у порівнянні з Е. соlі була 0,1 мМ; МІС для Пептиду 2 у порівнянні з S. aureus була 1,0 мМ. Це свідчить про значний вплив циклізованих пептидів на бактеріальну активність. Лінійні пептиди, відповідні за розміром пептидам 1 та 2 продемонстрували значно нижчу активність, ніж пептиди 1 та 2 відповідно. Антигрибкову активність циклізованих пептидів у порівнянні з Trichophyton ruhrum Тестували чутливість Т. rubrum до пептидів 1-8. Пептид 1 продемонстрував МІС 0,1 мМ у порівнянні з культури Т. rubrum (Таблиця 2). Пептид 2 продемонстрував МІС 0,25 мМ у порівнянні з культурами Т. rubrum. Лінійні пептиди, відповідні за розміром пептидам 1 та 2 продемонстрували значно нижчу активність, ніж пептиди 1 та 2 відповідно. Пептиди 3-8 мали одиничний залишок гліцину, уведений у циклічний пептид. Таким чином, Пептиди 3-8 мають 8 амінокислот у довжин, у порівнянні з 7 амінокислотами для Пептидів 1 2. Пептиди 3-6 продемонстрували антигрибкову активність проти Т. rubrum (MIC (мМ) 4,0, 2,0, 4,0, 1,0, відповідно). Пептиди 7-8 не продемонстрували антигрибкової активності проти Т. rubrum при максимумі тестованої концентрації (4 мМ). Пептиди 3-6 демонструють антигрибкову активність, але уведення некатіонної амінокислоти гліцин значно зменшує антигрибкову активність. Наприклад, це можна бачити за активністю пептиду 2 (без Гліцину; МІС - 0,2 мМ) у порівнянні з Пептидом 4 (з Гліцинон; МІС = 2,0 мМ) (Таблиця 2). Це дані показують, що антигрибкова активність є у циклічних пептидів довжиною 7 та 8 амінокислоти, але пептиди зі зменшеною катіонністю є менш антигрибковими у порівнянні з T. rubrum. Інкубування Trichonhyton interdisitale циклізованими пептидами Тестували чутливість T. interdigitale до пептидів 2-8. Антигрибкову активність пептидів 2-8 проти T. interdigitale показано у таблиці 2. Пептиди 2, 4 та 6 активні у порівнянні з T. interdigitale. Інгібування Cryptococcus neoformans циклізованими пептидами Тестували чутливість С. neoformans до пептидів 4 та 6-8, застосовуючи "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard-Second Edition M27A". Таблиця 2 демонструє, що катіонні циклічні пептиди 4 та 6-8 є антигрибковими у порівнянні з патогенними дріжджами С. neoformans (МІС =1,0 мМ, 0,5 мМ, 2,0 мМ та 0,5 мМ, відповідно). Антимікробна активність пептиду 2 у порівнянні з вибраними мікробними патогенами Антимікробну активність пептиду 2 проти 60 вибраних мікробних патогенів продемонстровано у таблиці 3. Як можна бачити, найбільша антимікробна активність (тобто найнижчі МІС) є постійно показаною проти грибків, особливо дерматофітів, Scopulariopsis brevicaulis, Malassezia furfur, не-albicans Candida spp та бактерій Е. coli. 11 UA 97633 C2 5 10 15 Вплив застосування енантіомерних амінокислот у циклізованих пептидах Порівняння інгібіторної дії all-L та all-D циклічних катіонних пептидів продемонстровано у таблиці 2. Пептиди 4 та 6 є all-L та all-D еквівалентними циклічними катіонними пептидами з вмістом амінокислоти аргінін (7 ак) та гліцин (1 ак). Антигрибкова активність проти T. rubrum є більше для варіанту all-D, ніж варіанту all-L (МІС = 1,0 та 2,0 мМ, відповідно). Антигрибкова активність проти T. interdigitale є більше для варіанту all-D, ніж варіанту all-L (MIC=0,25 та 0,5 мМ, відповідно). Антигрибкова активність проти дріжджі С. neoformam є більше для варіанту allD, ніж варіанту all-L (МІС = 0,5 та 1,0 мМ, відповідно). Це свідчить, що варіант all-D цього пептидом є більш активним, ніж варіант all-L. Пептидами 3 та 8 є all-L та all-D еквівалентними циклічними катіонними пептидами з вмістом амінокислоти лізин (7 ак) та гліцин (1 ак). Антигрибкова активність проти T. rubrum є більше для варіанту all-L, ніж варіанту all-D (МІС = 4,0 та >4,0 мМ, відповідно). Жодний пептид не демонструє антигрибкової активності проти T. interdigitale (MIC >4,0 мМ для обох пептидів). Гематолітична активність циклізованих пептидів Гемолітична активність циклічних катіонних пептидів (Таблиця 4) є незначною при концентрації у надлишку їх, демонструючи антигрибкову активність. Гепатотоксичність циклізованих пептидів Пептиди 2, 9 та 10 не показують гепатотоксичності при концентрації подібній тій, що демонструє антигрибкову активність. 20 Таблиця 1 Агенти сполучення Таблиця 2 Антимікробна активність (МІС; мМ) циклізованих пептидів у порівнянні з вибраними мікробними патогенами Пептид 1 2 3 4 5 6 7 8 Мол. маса (Да) 879,2 1093,3 954,3 1150,4 856,1 1150,4 856,1 954,3 Т. rubrum 0,1 0,25 4,0 2,0 4,0 1,0 >4,0 >4,0 Т. interdigitale НВ 4,0 0,5 >4,0 0,25 >4,0 >4,0 12 Е. соlі 1,0 0,1 НВ НВ НВ НВ НВ HB S. aureus С. neoformans 1,0 НВ 0,25 НВ НВ НВ НВ 1,0 НВ НВ НВ 0,5 НВ 2,0 HB 0,5 UA 97633 C2 Таблиця 3 Антимікробна Активність (МІС; мМ) пептиду 2 у порівнянні з вибраними мікробними патогенами Грибок Т. rubrum Т. rubrum Т. interdigitale Т. mentagrophytes Т. mentagrophytes М. furfur S. brevicaulis S. brevicaulis A. niger NCPFU8 2 7 клінічних Ізолятів NCPF335 DM2006 978 DM2006 1023 DSM6170 NCPF2177 DM2006 1025 NCPF2022 A. terreus NCPF2722 DM2006 294 DM2006 495 DM2006 1026 NCTC3179 ATCC24433 ATCC90028 AM2003-D20 II1EM3742 s20122,073 C. krusei NCPT3953 C. krusei C. parapsilosis C. parapsilosis ATCC6258 ATCC22019 ATCC90018 S. aureus S. aureus S. aureus 2 S. aureus S. aureus 1 S. aureus S. aureus 1 S. aureus S. aureus S. aureus NCPF2729 Fusarium oxysporum Fusarium spp Fusarium spp Fusarium spp C. albicans C. albicans C. albicans C. albicans C. albicans C. albicans MIC (мM) 0,25 0,5-1,0 2 Номер >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 0,1280,256 0,125 0,25 1,0 Бактерії Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa B. cepacia E. coli Номер NCTC10442 NCTC6571 NCTC10788 ATCC12598 NCTC8325 Col N315 ANS46 MW2 16 Clinical Ізоляти ATCC27853 DSM50071 ATCC27853 ATCC25609 NCTC12900 MIC (мM) 0,25 >1,9 >1,9 0,95 >1,9 0,95 0,95 0,95 0,95 >3,8 >1,9 >2 >2 >1,9 0,1 1 MRSA (резистентна до метициліну S. aureus) Довідкові Номери: DM2006 517; DM2006 902; DM2006 932; DM2006 953; DM2006 1008; DM20061093; DM2006 1377 3 MSSA (чутлива до метициліну S. aureus) 4 Довідкові Номери: 97,2933.К; 98,1695.К; 97,2637.D; 98.2028.X; 05.5240.R; 00,9523.R; 03,8996.T; 98,1515.F; 00.5472.R; 00,1039.Р; 02.6225.Е; 03,3200.J; 01.7995.S; 03,8951.G; 00,9521.M; 97.1636.D 2 Таблиця 4 Гематолітична активність вибраних пептидів у порівнянні з червоними клітинами крові Пептид 1 2 3 4 5 6 7 8 Максимум тестованої концентрації (мМ) Гемоліз 73,7 10,0 10,0 10,0 5,0 10,0 10,0 Нема Нема Нема Нема Нема Нема Нема 13 UA 97633 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 1. Застосування циклічного пептиду, що складається з 3-50 амінокислот, формули ІІ: ((X)l(Y)m)n, (II) де l та m - цілі числа від 0 до 10, такі, щоб l та m не дорівнювали 0, n - ціле число від 1 до 10, а X та Y є однаковими і є аргініном, як медикаменту для лікування грибкової інфекції. 2. Застосування за п. 1, де грибковою інфекцією є дерматофітна інфекція. 3. Застосування за п. 1, де пептид складається з 3-15 амінокислот. 4. Застосування за п. 3 , де пептид складається з 3-7 амінокислот. 5. Застосування за п. 1, де пептид складається з 5-13 амінокислот. 6. Застосування за будь-яким одним з попередніх пунктів 1-5, де X та/або Y є D-амінокислотами. 7. Застосування за будь-яким одним з пп.1-5 , де Х та/або Y є L-амінокислотами. 8. Застосування за будь-яким одним з попередніх пунктів 1-7, де l та m є цілі числа від 0 до 7, а n - ціле число між 1 та 10. 9. Застосування за будь-яким одним з попередніх пунктів 1-8, де пептидом є R-R-R-R-R-R-R. 10. Застосування за будь-яким одним з попередніх пунктів, де дерматофітною інфекцією є інфекція кільцевим лишаєм. 11. Застосування за будь-яким одним з попередніх пунктів 1-10, де дерматофітна інфекція є викликаною дерматофітом родини Trichophyton, Epidermophyton або Microsporum. 12. Застосування за п. 11, де дерматофітом є Trichophyton spp. 13. Застосування за п. 12, де дерматофітом є Trichophyton interdigitale. 14. Застосування за п. 12, де дерматофітом є Trichophyton rubrum. 15. Застосування за будь-яким одним з попередніх пунктів 1-14, де інфекцією є оніхомікоз. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 14