Очищені пептиди та сполуки, які їх містять

УКРАЇНА (19) UA (11) 84432 (13) C2 (51) МПК (2006) A61B 5/055 C07K 5/00 C07K 7/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ОЧИЩЕНІ ПЕПТИДИ ТА СПОЛУКИ, ЯКІ ЇХ МІСТЯТЬ C2 (13) 84432 (11) є фенілаланіном, заміщеним в одному з положень 3 або 4 компонентом, вибраним з групи, що складається з СН 3, СF3, NH2, СН2NН2, CN, F, Cl, Br, I, Et та ОMе, Y(3*) є тирозином, заміщеним в положенні 3 компонентом, вибраним з групи, що містить F, Сl, Br, І та NO2 ; Х2 є вибраним з групи, що містить E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr та Th; Х3 є вибраним з групи, що містить G та D; Х4 є вибраним з групи, що містить H, F, Y та W; Х5 є вибраним з групи, що містить І, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4Pal та F(3/4*), де F(3/4*) є фенілаланіном, заміщеним в одному з положень 3 або 4 компонентом, вибраним з групи, що містить СF3, Et, iPr, ОМе; Х6 є вибраним з групи, що містить N, Q, І, L та V або Х6 відсутній і де один з наведених X1, Х2, Х5, Р* та Y* є неприродним похідним амінокислоти. 6. Очищений пептид за п. 5, який відрізняється тим, що Р* є проліном або 4-гідроксипроліном та Y* є тирозином або неприродним похідним тирозину, заміщеним в положенні 3 компонентом, вибраним з групи, що містить F, Сl, Вr, І та NO 2. 7. Очищений пептид за п. 5, який відрізняється тим, що здатний утворювати дисульфідний зв'язок за відсутності умов для відновлення. 8. Очищений пептид за п. 7, який відрізняється тим, що містить дисульфідний зв'язок. 9. Очищений пептид за п. 8, який відрізняється тим, що має специфічну зв'язувальну спорідненість до фібрину. 10. Очищений пептид за п. 6, який відрізняється тим, що амінокислотну послідовність вибирають з групи, що складається з : W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:5), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:6), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ IDNO:7), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:8), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:9), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:10), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:11), UA (21) a200601920 (22) 30.07.2002 (24) 27.10.2008 (31) 60/308,721 (32) 30.07.2001 (33) US (62) 2004010709, 30.07.2002 (46) 27.10.2008, Бюл.№ 20, 2008 р. (72) ЖАНГ ЖАОДА, US/US, КАРАВАН ПІТЕР Д., CA/US, МАКМУРРІ ТОМАС ДЖ., US/US, КОЛОДЗЄЙ ЕНДРЮ, US/US, Н АІР ШРІКУМАР, IN/US, АМЕДІО ДЖОН С., US/US, ДЮМА СТЕФАН, FR/US, ВАНГ КСІФАНГ, CN/US, САН ВЕІ-ЧУАН, US/US, НІВОРОЖКІН АЛЄКСАНДР Л., RU/US, КОЕРНЕР ШТЕФФІ К., DE/US (73) ЕПІКС МЕДІКАЛ, ІНК. (56) US6517814, 11.02.2003 (57) 1. Очищений пептид, що має наступну амінокислотну послідовність: P*-Y*-Х1*-L* (SEQ ID NO:1), в якій Р* є проліном або його неприродним похідним; Y* є тирозином або його неприродним похідним; Х1* є гліцином або аспарагіновою кислотою, або неприродним похідним гліцину та аспарагінової кислоти; L* є лейцином або його неприродним похідним, де один з перерахованих Р*, Y*, Х1* і L* є неприродним похідним відповідної амінокислоти. 2. Очищений пептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х1* є гліцином або аспарагіновою кислотою та L* є лейцином. 3.Очищений пептид за п. 1, який відрізняється тим, що Р* є 4-гідроксипроліном та Y* є тирозином, заміщеним в положенні 3 компонентом, вибраним з групи, що складається з F, Сl, Вr, І та NO2 . 4. Очищений пептид за п. 3, який відрізняється тим, що здатний утворювати дисульфідний зв'язок за відсутності умов для відновлення. 5. Очищений пептид, що має наступну амінокислотну послідовність: Х1-Х2-С-Р*-Y*-Х3-L-С-Х4-Х5-Х6 (SEQ ID NO:2), в якій Р* є проліном або його неприродним похідним; Y* є тирозином або його неприродним похідним; Х1 є вибраним з групи, що складається з W, Y, F, S, Вір, Нх, Dpr, С у, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) та Y(3*), де F(3/4*) 2 (19) 1 3 84432 4 F(4-OMe)-H-C-P(4OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID ним в одному з положень 3 або 4 компонентом, NO:12), вибраним з групи, що містить СF3, Et, iPr, ОМе; Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID Х6 є вибраним з групи, що містить N, Q, І, L та V NO:13), або Х6 відсутній і де один з наведених Х1, Х2, X5 є W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:14), неприродним похідним амінокислоти. W-dE-C-P(4OH)-Y-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:15) та 15. Очищений пептид за п. 14, який відрізняється F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-C1)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID тим, що здатний утворювати дисульфідний зв'язок NO:16). за відсутності умов для відновлення. 11. Очищений пептид за п. 10, який відрізняється 16. Очищений пептид за п. 14, який відрізняється тим, що здатний утворювати дисульфідний зв'язок тим, що містить дисульфідний зв'язок. за відсутності умов для відновлення. 17. Очищений пептид за п. 15, який відрізняється 12. Очищений пептид за п. 11, який відрізняється тим, що має специфічну зв'язувальну споріднетим, що містить дисульфідний зв'язок. ність до фібрину. 13. Очищений пептид за п. 10, який відрізняється 18. Сполука, яка містить пептид за п. 1 і яка взаєтим, що має специфічну зв'язувальну споріднемозв'язана з тромболітичним агентом. ність до фібрину. 19. Очищений пептид, що має наступну амінокис14. Очищений пептид за п. 5, який відрізняється лотну послідовність: тим, що: С-P*-Y*-X1-L-С (SEQ ID NO:3), в якій Р* є проліном; Х1 є гліцином або аспарагіновою кислотою, Y* є тирозином; Р* є проліном або його неприродним похідним 4Х1 є вибраним з групи, що складається з W, Y, F, гідроксипроліном; S, Вір, Нх, Dpr, С у, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, Y* є тирозином або його неприродним похідним, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) та Y(3*), де F(3/4*) заміщеним в положенні 3 компонентом, вибраним є фенілаланіном, заміщеним в одному з положень з групи, що містить F, Сl, Вr, І та NO2 та один з на3 або 4 компонентом, вибраним з групи, що склазваних Р* або Y* є неприродними похідними віддається з СН 3, СF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Сl, Вr, І, Et повідних амінокислот. та ОМе, Y(3*) є тирозином, заміщеним в положенні 20. Очищений пептид за п. 19, який відрізняється 3 компонентом, вибраним з групи, що містить F, Сl, тим, що здатний утворювати дисульфідний зв'язок Вr, І та NO2 ; за відсутності умов для відновлення. X2 є вибраним з групи, що містить dE, H(Bzl), 2-Pal, 21. Очищений пептид за п. 19, який відрізняється Dpr та Th; тим, що містить дисульфідний зв'язок. Х3 є вибраним з групи, що містить G та D; 22. Очищений пептид за п. 20, який відрізняється Х4 є вибраним з групи, що містить Н, F, Y та W; тим, що має специфічну зв'язувальну споріднеХ5 є вибраним з групи, що містить І, L, V, N, Bpa, ність до фібрину. Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 423. Сполука, яка містить пептид за п. 19 і яка взаPal та F(3/4*), де F(3/4*) є фенілаланіном, заміщеємозв'язана з тромболітичним агентом. Цей опис заявляє пріоритет від [U.S. Provisional Applicatio Serial No.60/308,721 від 30.07.2001] та базується на [описі заявки PCT/US02/2426 (30.07.02) та заявки в Україні №2004010709]. Винахід стосується контрастних агентів для діагностичної томографії, більш конкретно - пептиднаправлених, мультимерних контрастних агентів, коли пептид функціонує як мішень або точка прикріплення для одного чи більше хелатів як на аміно-так і на карбоксильному кінці пептиду. Діагностичні томографічні способи, такі як ядерно-резонансна томографія (ЯМР), рентгенографія, ядерно-радіофармацевтична томографія, ультрафіолет-інфрачервона томографія, ультразвук, застосовуються в медичній діагностиці протягом багатьох років. Крім того, використовувані контрастні засоби покращували або підвищували дозволяючу здатність зображення чи зберігали специфічну діагностичну інформацію. Фактично, контрастні засоби повинні інтерферувати з довжиною хвилі електромагнітного випромінювання, що використовуються в гомографічних способах, змінюючи фізичні властивості тканини, що призводить до одержання зміненого сигналу, чи, як у випадку з радіофармацевтичними препаратами, самі забезпечувати джерело випромінювання. ЯМР та оптичні способи є унікальними серед томографічних способів, так як вони виробляють комплекс сигналів, чутливи х до хімічного середовища. В той час, як сигнал від рентгенівських променів або радіонуклідних променів зберігається однаковим незалежно від того, що самі ці агенти знаходяться в плазмі у вільному стані, приєднаними до протеїнів або інших мішеней, або захопленими в кістковій тканині, відомі контрастні агенти для ЯМР або оптичної томографії виявляють різні сигнальні характеристики в різних фізіологічних середовищах. Важливим є те, що контрастні агенти досить чутливі і присутні в досить високій концентрації для того, щоб можна було зареєструвати сигнальні зміни. Комплекси між гадолінієм або іншими фармацевтичними іонами та органічними лігандами широко використовувались для підвищення та покращення контрастності ЯМР. Гадолінієві комплекси підвищують контрастність шляхом підвищення швидкості ядерно-магнітної релаксації протонів, які знаходяться в молекулах води, що є доступними для контрастних агентів протягом 5 84432 6 ЯМР [Caravan, P., et al., R. В. Chem. Rev. 99, 2293 F, Cl, Br, І та NO2. Сполуки винаходу можуть вклю(1999)]. Швидкість релаксації протонів в цих молечати такі пептиди, що приєднані до тромболітичнокулах води зростає відносно протонів в інших мого агента. лекулах води, які недоступні для контрастних агеІншим аспектом винаходу є очи щені пептиди, нтів. Ця зміна швидкості релаксації призводить до що включають амінокислотну послідовність: удосконалення контрастності зображень. Крім тоX1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6 (SEQ ID NO:2), в го, це підвищення релаксивності в межах специфіякій чної популяції протонів молекули води може мати P* є проліном або його неприродним похідним; наслідком здатність збирати більше відеоданих за Y* є тирозином або його неприродним похідпевний проміжок часу. Це, в свою чергу, призвоним; дить до покращення сигналу відносно шумової X1 вибраний з групи, що складається з W, Y, F, потужності. S, Вір, Hx, Dpr, C y, Gu, Ad, Hfe, 3-PaI, 4-PaI, Томографію також можна виконувати, викориDopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) та Y(3*), де F(3/4*) стовуючи світло, в цьому випадку оптичні барвниє фенілаланіном заміщеним в одному з положень ки повинні забезпечувати сигнал. Наприклад, світ3 або 4 компонентом вибраним з групи, що склало в діапазоні 600-1300нм (видимої ближньої дається з СН 3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et інфрачервоної частини спектра) відносно легко та OMe і де Y(3*) є тирозином заміщеним в полопроходить через біологічні тканини і може бути женні З компонентом вибраним з групи, що склавикористане для томографічних цілей. Світло, що дається з F, Cl, Br, І та NO 2; пройшло або розсіялось, відобразилось або переX2 вибрано з групи, що складається з E, H, dE, випромінилось (флюоресценція) виявляється і S, H(BzI), 2-PaI, Dpr та Ер$ генерує зображення. Зміни оптичної густини, коеХ3 вибрано з групи, що складається з G та D; фіцієнта відображення або флуоресцентних хараХ4 вибрано з групи, що складається з H, F, Y ктеристик барвника, включаючи збільшення або та W; зменшення кількості піків поглинання або зміну Х5 вибрано з групи, що складається з І, L, V, N, довжини хвиль, можуть відбуватися при зв'язуванВра, BaI, Hfe, NIe, Tie, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, ні з біологічними мішенями, таким чином забезпе4-PaI та F(3/4*), де F(3/4*) є фенілаланіном замічуючи додаткову контрастність тканин. В деяких щеним в одному з положень 3 або 4 компонентом випадках, наприклад діагностика захворювань вибраним з групи, що складається з CF3, Et, iPr, локалізованих близько до поверхні тіла, ультрафіOMe; олет і видиме світло також можуть застосовуваХ6 вибрано з групи, що складається з N, Q, І, L тись. та V або Х6 відсутній, і де Й надалі зберігається потреба в контрастних один з X1, X2, Х5, P* та Y* є неприродним похіагентах, що можуть забезпечити достатню концендним амінокислоти. Наприклад, P* може бути протрацію формуючого зображення компонента в міліном або 4-гідроксипроліном і Y* може бути тирошені, покращуючи чутливість гомографічного спозином або неприродним похідним тирозину, собу, а також контрастних агентів, що мають заміщеним в положенні 3 компонентом вибраним з достатній період напіввиведення in vivo. групи, що складається з F, Cl, Br, І та NO2. ОчищеВинахід базується на пептидах і пептиднапрані пептиди можуть бути здатними до утворення влених мультимерних агентах для MP, оптичної і дисульфідного зв'язку в умовах відсутності відноврадіонуклідної томографії, коли пептид функціонує лення і можуть мати специфічну зв'язувальну спояк мішень або точка прикріплення для одного чи рідненість до фібрину. В одному з втілень, пептиди більше хелатів на обох аміно- і карбоксильному містять дисульфідний зв'язок. Сполуки винаходу кінцях безпосередньо або, необов'язково, через можуть включати такі пептиди, що приєднані до проміжний місток. Несподівано, контраст агенти тромболітичного агента. винаходу зберігають зв'язувальну спорідненість до Винахід також представляє очищені пептиди, біологічних мішеней, таких як фібрин, і високу рещо мають амінокислотну послідовність вибрану з лакситивність. Агенти винаходу мають достатній групи, що складається з W-dE-C-P(4-OH)-Y (3-Cl)період напіввиведення, який настає після застосуG-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3вання in vivo за умови, що будуть здійснені ефекCl)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:5), Y-dE-C-P(4-OH)тивні томографічні аналізи. Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:6), W-dE-C-P(4Одним із аспектів даного винаходу є очи щені OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:7), W-dE-Cпептиди, що містять амінокислотну послідовність: P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:8), Y-dEP*-Y*-X1*-L* (SEQ ID NO:1), в якій C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:9), YP* є проліном або його неприродним похідним; dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:10), Y* є тирозином або його неприродним похідW-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID ним; NO:11), F(4-OMe)-H-C-P(4OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L X1* є G або D, або їх неприродним похідним; (SEQ ID NO:12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-IL* є лейцином або його неприродним похідним Q (SEQ ID NO:13), W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q і де один з P*, Y*, X1* і L* є неприродним похідним (SEQ ID NO:14), W-dE-C-P(4OH)-Y-G-L-C-W-I-Q відповідної амінокислоти. X1* може бути G або D i (SEQ ID NO:15) та F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-HL* може бути лейцином. В одному з варіантів здійI-L (SEQ ID NO:16). Очи щені пептиди можуть бути снення винаходу P* є проліном або 4здатними до утворення дисульфідного зв'язку в гідроксипроліном і Y* є тирозином або неприродумовах відсутності відновлення і в одному з втіним похідним тирозину, заміщеним в положенні 3 лень пептиди містять дисульфідний зв'язок. Пепкомпонентом вибраним з групи, що складається з тиди можуть мати специфічну зв'язувальну спорі 7 84432 8 дненість до фібрину. Сполуки винаходу можуть MeBip-D (SEQ ID NO:25). Очищені пептида можуть включати такі пептиди, що приєднані до тромболібути здатними до утворення дисульфідного зв'язку тичного агента. в умовах відсутності відновлення і в одному з втіВ одному з втілень, P* є проліном; Y* є тиролень пептиди містять дисульфідний зв'язок. Пепзином; X1 вибрано з групи, що складається з W, Y, тида можуть мати специфічну зв'язувальну споріF, S, Вір, Hx, Dpr, Су, Gu, Ad , Hfe, 3-PaI, 4-PaI, дненість до фібрину. Сполуки винаходу можуть DopaMe2, nТуr, dW, dF, F (3/4*) та Y (3*), де F(3/4*) включати такі пептида, що приєднані до тромболіє фенілаланіном заміщеним в одному з положень тичного агента. 3 або 4 компонентом вибраним з групи, що склаЯкщо не зазначено інше, всі використані тут дається з CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, І, Et технічні та наукові терміни мають такі значення, та OMe, і де Y3* є тирозином заміщеним в полощо є загальнозрозумілими для спеціаліста компежені 3 компонентом вибраним з групи, що складатентного в галузі те хніки, до якої належить винається з F, Cl, Br, І та NO2; X2 вибрано з групи, що хід. Не дивлячись на те, що описані тут метода та складається з dE, H (BzI), 2-PaI, Dpr, та Th; X3 вибматеріали подібні або еквівалентні тим, що можуть рано з групи, що складається з G та D; X4 вибрано застосовуватись на практиці або тестуванні даного з групи, що складається з H, F, Y, та W ; X5 вибравинаходу, придатні методи та матеріали описані но з групи, що складається з І, L, V, N, Вра, BaI, нижче. Всі публікації, заявки на патент, патенти та Hfe, NIe, Tie, nVal, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-PaI та посилання, що тут наведені, включені як посиланF (3/4*), де F(3/4*) є фенілаланіном заміщеним в ня. В протилежному випадку, даний опис винахоодному з положень 3 або 4 компонентом вибраним ду, включаючи визначення, контролюватиметься. І з групи, що складається з CF3, Et, іРr, та OMe, де на додачу, матеріали, методи та приклада ілюстодин з X1, X2 або X5 неприродним похідним амінорують, але не обмежують винахід. кислоти; та Х6 вибрано з групи, що складається з Інші можливості та переваги винаходу стануть N, Q, І, L та V або Х6 відсутній. Такі пептиди моочевидними з наступного детального опису та з жуть бути здатними до утворення дисульфідного формули винаходу. зв'язку в умовах відсутності відновлення і в одноФіг.1 представляє хімічні структури неприродму з втілень пептиди містять дисульфідний зв'язок. них амінокислот. Пептиди можуть мати специфічну зв'язувальну Фіг.2 описує релакситивність Gd при 20MHz, спорідненість до фібрину. 35° C в Тріс-сольовому буфері (TBS) або 10мг/мл В іншому прикладі здійснення винахід предфібрину в TBS. ставляє очищені пептиди, що включають амінокиВизначення слотну послідовність: Загальноприйняті хімічні скорочення, що детаC-P*-Y*-X1-L* (SEQ ID NO:1), в якій X1 є G або льно не розкриті в цьому описі, можна знайти в D, P* є проліном або його неприродним похідним [Тhе American Chemical Society Style Guide, Second 4-гідроксипроліном; і Y* є тирозином або неприроEdition; American Chemical Society, Washington, DC дним похідним тирозину, заміщеним в положенні 3 (1997), "2001 Guidelines faбo Authaбos" J. Aбog. компонентом вибраним з групи, що складається з Chem. 66 (1), 24A 2001), "А Shaбot Guide to F, Cl, Br, І та NO2 ; за умови, що один з P* або Y* є Abbreviations та Their Use in Peptide Science" J. неприродним похідним відповідної амінокислоти. Peptide. Sci. 5, 465-471 (1999)]. Очищені пептиди можуть бути здатними до утвоДля цілей даної заявки, термін "специфічна рення дисульфідного зв'язку в умовах відсутності зв'язувальна спорідненість", що тут використовувідновлення і можуть мати специфічну зв'язувальється, відноситься до функціональної здатності ну спорідненість до фібрину. В одному з втілень, контрастного агента бути поміщеним в, утримувапептиди містять дисульфідний зв'язок. Сполуки ним в або зв'язаним з конкретним біологічним комвинаходу можуть включати такі пептиди, що припонентом в значно більшій мірі ніж з іншими комєднані до тромболітичного агента. понентами. Контраст агенти, що мають таку Винахід також представляє очищені пептиди, властивість, - це вищезгадані "направлені" до "міщо включають амінокислотну послідовність: C-Dшені" компоненти. Контрастні агенти, в яких відсуY-Y-G-T-C-X10 (SEQ ID NO:17), де Х10 вибрано з тні такі властивості, є ви щезгаданими "неспецифігрупи, що складається з n(децил)О, n(4-PhBu)G, чними" або "ненаправленими" агентами. MeL, Вра, Вір, Ме-Вір, F(4*), F(3-Me), F(3,4Специфічна зв'язувальна спорідненість певних дифторо), Amh, Hfe, Y (3,5-дийодо), Pff, INaI, dlNal, груп до мішені виражається в одиницях рівноважта MeL, де F (4*) є фенілаланіном заміщеним в ної константи дисоціації "Kd". положенні 4 компонентом вибраним з групи, що Використаний тут термін "очищений" відноскладається з Et, CF3, l та іРr. Очи щені пептиди ситься до пептидів, які відділені від тої чи іншої можуть включати амінокислотну послідовність Cприродної молекули, з якою вони були асоційоваD-Y-Y-G-T-C-X10-X11 (SEQ ID NO:18), в якій X11 вині, або до хімічно синтезованих пептидів, відділебрано з групи, що складається з D, dD, pD, Inр, них від будь-яких інших органічних молекул присуNip, Me-D, dC, Cop та Сmр. Наприклад, пептид тніх в хімічному синтезі. Типово, пептиди може мати наступну амінокислотну послідовність: розглядаються як "очищені", коли вони на 70% L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(децил)G-dD (SEQ ID NO:19), (тобто 70%, 80%, 90%, 95% та 99%), за вагою суL-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(децил)G-D (SEQ ID NO:20), хого залишку, звільнені від будь-яких інших протеL-P-C-D-Y-Y-G-T-C-BipD (SEQ ID NO:21), L-P-C-Dїнів або органічних молекул. Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID NO:22), L-P-C-D-Y-Y-GВикористаний тут термін "пептид" відноситься TC-MeL-Inp (SEQ ID NO:23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-Cдо амінокислотного ланцюга, довжиною від 2 до 75 MeL-Cmp (SEQ ID NO:24) або L-P-C-D-Y-Y-G-T-Cамінокислот (3-50 амінокислот). 9 84432 10 Використаний тут термін "біополімер" віднонацілені на інтегрін anb3 (вітронектиновий рецепситься до природних субстанцій, які природним тор) при виявленні новоутворень. шляхом утворились в біологічних системах. КонкВ принципі, будь-які пептиди із спорідненістю ретні біополімери можуть утворюватись з викорисдо біологічної мішені можуть бути використані в танням певного набору конструктивних субодиконтрастних агентах винаходу. Пептиди можуть ниць та з субодиниць, що зазвичай функціонують бути лінійними або циклічними. Звичайно, нерозяк зв'язуючі елементи. Як природні, так і неприрочинні ліпофільні пептиди вважаються непридатнидні пептиди звичайно утворюються із набору аміми для фармакологічного застосування, але такі нокислот через амідний зв'язок між лінкерними пептиди можуть бути придатними згідно з винахосубодиницями. дом тому що додавання хелатів гідрофільних меВикористаний тут термін "природна" або "приталів до дво х кінців пептиду може підвищува ти родним шляхом утворена" амінокислота віднорозчинність. Для зручності синтезу і з огляду на ситься до однієї з двадцяти виявлених в природі економію коштів найзручніше, щоб пептиди мали амінокислот. Природні амінокислоти, модифіковані від 3 до 50 амінокислот (тобто від 3 до 30, від 3 до шляхом введення мітки (тобто, радіоактивної міт20, від 3 до 15, від 5 до 30, від 5 до 20, від 5 до 15, ки, оптичної мітки або барвників) з метою їх вияввід 10 до 12 амінокислот завдовжки). лення, розглядаються як природні амінокислоти. В направлених пептидах згідно з винаходом Натуральні амінокислоти виражаються через стаможе бути використана велика різноманітність ндартний одно- або трибуквенний код. амінокислот. Придатні амінокислоти включають Термін "неприродні амінокислоти" або "неприприродні і неприродні амінокислоти. Амінокислоти родні" відноситься до похідних природних амінокиз великою кількістю захисних груп призначені для слот, включаючи D форми та b і g амінокислотні безпосереднього використання в твердофазовому похідні. Відомо, що деякі амінокислоти, наприклад синтезі пептидів є комерційно доступними. Недогідроксипролін, класифіковані тут як неприродні дачу до двадцяти найбільш загальних кислот, що амінокислоти, можуть утворюватись в природі в зустрічаються в природі, наступні неприродні амісередині певного організму або окремого протеїну. нокислоти або амінокислотні похідні можуть бути Термін "стабільність", який тут використано, складовими націлінех пептидних груп винаходу відноситься до сполук, які мають достатню для (загальнприйнятні абревіатури подані в круглих виробництва стабільність і яка підтримує цілісність дужках, див. Фіг.1: b-аланін (-AIa), g-аміномасляна сполуки впродовж періоду часу, достатнього для кислота (GABA), 2-аміномасляна кислота (2-Abu), використання або з метою зберігання для деталіa,b-дегідро-2-аміномасляна кислота (D-Abu), 1зованих тут цілей. Типово, такі сполуки стабільні аміноциклопропан-1-карбонова кислота (ACPC), при температурі 40°C або нижчій, за відсутності аміноізомасляна кислота (Aib), 2-амінотіазолін-4вологи або інших хімічно-реактивних умов, прикарбонова кислота, 5-аміновалеріанова кислота наймні протягом тижня. Комбінування передбаче(5-Ava), 6-аміногексанова кислота (6Ahx), 8них цим винаходом замісників та перемінних є амінооктанова кислота (8-Аос), 11лише такими, що призводять до утворення стабіаміноундеканова кислота (11-Aun), 12льних сполук. амінододеканова кислота (12-Ado), 2Для виявлення тромбів, фібрин є переважною амінобензойна кислота (2-Abz), 3-амінобензойна мішенню тому що він присутній у всі х згустках та кислота (3-Abz), 4-амінобензойна кислота (4-Abz), може бути виявлений без перешкод з боку норма4-аміно-3-гідрокси-6-метилгептанова кислота льного тромболітичного процесу. Додаткові деталі (Statine, Sta), амінооксиацетилова кислота (Аоа), стосовно мішень-приєднаних компонентів, що 2-амінотетралін-2-карбонова кислота (Ate), 4включають фібрин-зв'язані пептиди, наведені в аміно-5-циклогексил-3-гідроксипентанова кислота [PCT Patent Application WO 01/09188]. (ACHPA), пара-амінофенілаланін (4NH2-Phe), біРешта протеїнових мішеней включає, але не фенілаланін (Вір), пара-бромфенілаланін (4-Brобмежується, альфа глікопротеїнову кислоту, фібPhe), або орто-хлорфенілаланін (2-Cl-Phe), метариноген, солаген, плателет GPIIb/lllа рецептор, хлорфенілаланін (3-Cl-Phe), пара-хлорфенілаланін хемотаксичний пептидний рецептор, соматостати(4-Cl-Phe), мета-хлортирозин (3-Сl-Туr), парановий рецептор, рецептор вазоактивних інтестінабензоїлфенілаланін (Вра), трет-бутилгліцин (TIe), льних пептидів (VIP), рецептор вивільнення бомциклогексилаланін (Cha), циклогексилгліцин (Chg), безин/гастрінового пептиду та інтегриновий 2,3-диамінопропіонова кислота (Dpr), 2,4рецептор. диаміномасляна кислота (Dbu), 3,4Придатні для використання пептиди винаходу дихлорфенілаланін (3,4-C12-Phe), 3,4включають такі, що здатні специфічно зв'язуватись дифторфенілаланін (3,4-F2-Phe), 3,5з мішенню і включають такі пептиди, як RGD-вмісні дийодотирозин (3, 5-І2-Туr), орто-фторфенілаланін пептиди націлені на плателет GPIIb/lllа рецептор (2-F-Phe), мета-фторфенілаланін (3-F-Phe), парапри виявленні тромбів, хемотаксичні пептиди націфтор фенілаланін (4-F-Phe), мета-фторотирозин лені на білі кров'яні клітини при виявленні інфек(3-F-Tyr), гомосерин (Hse), гомофенілаланін (Hfe), ції/запалення, Octreotide та Р-829 пептид націлені гомотирозин (Htyr), 5-гідрокситриптофан (5-ОНна сомастатинові рецептори при виявленні новоТrр), гідроксипролін (Hyp), пара-йодофенілаланін утворень, вазоактивні інтестінальні пептиди (VIP) (4-IPhe), 3-йодотирозин (3-І-Туr), індолін-2націлені на VIP рецептор при виявленні новоутвокарбонова кислота (Idc), ізоніпекотинова кислота рень, бомбезинові аналоги націлені на рецептор (Іnp), мета-метилтирозин (3-Ме-Туr), lвивільнення бомбезин/гастрінового пептиду при нафтилаланін (1-Nal), 2 нафтилаланін (2-NaI), павиявленні новоутворень та RGD-вмісніпептиди ра-нітрофенілаланін (4-NO2-Phe), 3-нітротирозин 11 84432 12 (3-NO2-Tyr), норлейцин (NIe), норвалін (Nva), орніX4 може бути H, F, Y та W; тин (Orn), орто-фосфотирозин (Н2РО3-Туr), октагіX5 може бути І, L, V, N, Вра, BaI, Hfe, NIe, Tie, дроіндол-2-карбонова кислота (Оіс), пеніциламін Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-PaI та F(3/4*), де (Pen), пентафторфенілаланін (F5-Phe), фенілгліF(3/4*) є фенілаланіном, заміщеним в одному з цин (Phg), піпеколінова кислота (Pip), пропаргілгліположень 3 або 4 компонентом, таким як CF3, Et, цин (Рrа), піроглутамінова кислота (pGlu), саркозин iPr, OMe; (Sar), тетрагідроізохінолін-3-карбонова кислота Х6 може бути N, Q, І, L та V або Х6 відсутній. (Tic) та тіазолідин-4-карбонова кислота (Tioproline, Типово, один з наведених X1, Х2, X5 , P* та Y* є неTh). Стереохімія амінокислот може бути виражена природним похідним амінокислоти. Наприклад, P* додаванням до вищевказаних назв або абревіатур може бути проліном та Y* може бути неприродним позначень "D" або "d", або "L" або "l" відповідно. похідним тирозину, заміщеним в положенні 3 компонентом, таким як F, Cl, Br, І та NO2. АльтернатиНедодачу, aN-алкільовані амінокислотаи можуть бути застосовані, так само як і амінокислоти, що вно P* може бути неприродним похідним проліну, таким як 4-гідроксипролін та Y* може бути тирозимають амінвмісний бічний ланцюг (такі як Lys та ном. Такі пепти можуть утворювати дисуль фідний Orn), в якому амін ацетильований або заміщений зв'язок за відсутності умов для відновлення. на аліл. Інші приклади пептидів, що можуть зв'язувати Пептиди винаходу можуть мати основну формулу P*-Y*-X1*-L* (SEQ ID NO:1), в якій фібрин, відповідають основній формулі C-P*-Y*-X1L-C (SEQ ID NO:3), в якій X1 є гліцином або аспаP* є проліном або його неприродним похідним; рагіновою кислотою, P* є проліном або його неY* є тирозином або його неприродним похідприродним похідним 4-гідроксипроліном; Y* є тиним; розином або його неприродним похідним, X1* є гліцином або аспарагіновою кислотою, або неприродним похідним гліцину та аспарагінозаміщеним в положенні 3 компонентом, таким як F, Cl, Br, І та NO2. Типово, що один з названих P* або вої кислоти; Y* є неприродними похідними відповідних аміноL* є лейцином або його неприродним похідкислот. Наприклад, пептид може мати наступну ним. Типово, де один з перерахованих P*, Y*, X1* і послідовність: W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-IL* є неприродним похідним відповідної амінокислоти. X1* може бути гліцином або аспарагіновою Q (SEQ ID NO:4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-YI-Q (SEQ ID NO:5), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3Cl)-G-L-Cкислотою, L* може бути лейцином і один з перераW-I-Q (SEQ ID NO:6), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-Lхованих P* або Y* може бути неприродним похідC-Y-I-Q (SEQ ID NO:7), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-Dним, таким як гідроксипроліном або тирозином, L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:8), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3Cl)заміщеним в положенні 3 F, Cl, Br, І та NO2 . Сполуки винаходу також можуть мати основну D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:9), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:10), W-dE-C-P(4-OH)формулу Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:11), F(4-OMe)-H-CX1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6 (SEQ ID NO:2), в P(4OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID NO:12), Y-H-Cякій P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:13), WP* є проліном або його неприродним похідним; Y* є тирозином або його неприродним похідdE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:14), W-dEC-P(4OH)-Y-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:15) та F-H-Cним; P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID NO:16). Такі X1 є W, Y, F, S, Вір, Hx, Dpr, Су, Gu, Ad, Hfe, 3пепти можуть утворювати дисульфідний зв'язок за Раl, 4-Раl, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) та Y(3*), відсутності умов для відновлення. де F(3/4*) є фенілаланіном заміщеним в одному з положень 3 або 4 компонентом, вибраним з групи, Згідно зі стандартними методами синтезу, такими, як розкрито в [WO 01/09188 або у WO що складається з СН 3, CF3, NH2 , CH2NH2, CN, F, 01/08712], пептиди, що мають послідовність, пеCl, Br, І, Et та Оmе. Y(3*) може бути тирозином, редбачену в Таблиці 1, були синтезовані (структузаміщеним в положені 3 компонентом, таким як F, ра підтверджена масспектрометрично), циклізоваCl, Br, I та NO2 ; X2 може бути E, H, dE, S, H(BzI), 2-PaI, Dpr та ні та оцінені за спорідненістю до DD(E) фрагменту Th; фібрину. Кожен пептид має Kd£10mM ("-" вказує на Хз може бути G та D; зрізаний). 13 84432 14 15 84432 Пептиди також можуть мати основну формулу C-D-Y-Y-G-T-C-X10 (SEQ ID. NO:17), де X10 є n(децил)g, n(4-PhBu)G, MeL, Вра, Вір, Ме-Вір, F(4*), F(3-Me), Р(3,4-дифторо), Amh, Hfe, Y (3,5дийодо), Pff, 1NaI, d1Nal, та MeL, де F (4*) є фені 16 лаланіном, заміщеним в положенні 4 компонентом, вибраним з групи, що складається з Et, CF3 , l та іРr. В одному з втілень пептид може включати додаткові залишки Х10, P* та/або Х11 , що забезпечується основною формулою C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11 17 84432 18 (SEQ ID NO:18) або X1-P*-C-D-Y-Y-G-T-С-Х10-Х11 дно до винаходу з тромболітичними агентами (SEQ ID:26), де X1 є будь-якою природною або (тобто, такими тромболітичними протеїнами як неприродною амінокислотою, P* є проліном або плазмогенні активатори людини або бактерій). Такі кон'югати можуть активізувати плазмоген локальйого неприродним похідним та X11 є D, dD, bD, Inр, но або підвищити ендогенний рівень tPA. НаприNip, Me-D, Cop або Сmр. Наприклад, пептид може клад, фібрин-направлений пептид може кон'югувамати наступну амінокислотну послідовність: L-P-Cти з людським плазміногенним активатором, D-Y-Y-G-T-C-n(децил)G-dD (SEQ ID NO:19), L-P-CD-Y-Y-G-T-C-n(децил)G-D (SEQ ID NO:20), L-P-Cвключаючи рекомбінантні тканини типу плазмогенного активатора(іРА), проурокіназою та урокіD-Y-Y-G-T-C-BipD (SEQ ID NO:21), L-P-C-D-Y-Y-Gназою (обома - і простою, і дволанцюговою форT-C-Bip-dD (SEQ ID NO:22), L-P-C-D-Y-Y-G-TCмами), похідними бактеріальних плазміногенних MeL-Inp (SEQ ID NO:23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeLактиваторів, включаючи стрептокіназу, та тваринCmp (SEQ ID NO:24) або L-P- C-D-Y-Y-G-T-CMeBip-D (SEQ ID NO:25). ного плазміногенного активатора, включаючи плазміногенний активатор вампіра (летючої миші). Пептиди, що мають формулу SEQ ID NO:26 Крім того, фібрин-направлені пептиди можуть бути були синтезовані (структура підтверджена масспекон'юговані з фібринолітиками такими, як фібролактрометрично) згідно зі стандартними методиками, за мідноголової змії, яка демонструє пряму фібритакими як наведено в [WO 01/09188 або в WO 01/08712], та оцінені за спорідненостю до DD(E) нолітичну активність. Такі ензими і протеїни можуть бути одержані комерційним шляхом, фрагменту фібрину. Кожен пептид має Kd£10mМ (" екстраговані з природних джерел або одержані -" вказує на зрізаний). рекомбінацією. Композиції винаходу можуть бути зчепленими Таблиця 2 або вплавленими відомими способами, використовуючи ті ж самі типи лінкерів, які уже були вкаX01 X10 X11 зані в основній заявці стосовно конструювання L n(Decyl)G dD контрастних агентів для магнітно-резонансної теL n(Decyl)G D рапії MRI. Приєднання до протеїну може досягаL MeL Inp тись завдяки стандартним хімічним методам, L Bip D включаючи утворення амідних, естерних, дисульL Bip dD фідних та тіоетерних зв'язків. Наприклад, фібринзL Me-Bip D в'язуючий пептид може бути ковалентно приєдL MeL Cmp нанним до протеїну або безпосередньо, або через L Bip D лінкер, утворюючи амідний зв'язок між фібринзв'яL L D зуючим пептидом або лінкером та залишками ліCha Bip D зину на поверхні протеїну. Ці поверхневі лізинові залишки є найбільш віддаленими від ферментного Здатність пептидів зв'язувати таку мішень як каталітичного сайту. А тому, прив'язані компоненти HSA або фібрин може бути проаналізована за віне інтерферують з каталітичною активністю фердомими методиками. Наприклад, спорідненість менту. Мультиплетний ліганд може бути досягнепептиду до фібрину може бути проаналізована, ний завдяки одному кроку. Відношення фібриннавикористовуючи DD(E) фрагмент фібрину, який правленого пептиду до тромболітичного або містить субодиниці в 55kD (фрагментЕ) та 190kD фібринолітичного агента може бути проконтрольо(фрагмент DD). Фрагмент DD може бути оброблеване шляхом встановлення стехіометрії хімічного ний біотином та імобілізований за допомогою авіскладу, що зшивається. Мультиплетне зшивання є дину на твердому субстраті (multi-well plate). Пепособливо корисним у випадку помірно сильного тиди можуть бути інкубовані з !мобілізованим фібринзв'язуючого ліганда, тому що висока зв'язуDD(E) фрагментом в придатному буфері та утвовальна спорідненість може бути реалізована через рення зв'язку може бути виявлене, використовуютак званий "avidity" ефекти. Зокрема зчеплюючий чи знану методологію. [Див., наприклад, WO агент або складний ефір можуть бути використані 01/09188]. для досягнення утворення амідного зв'язку між Використання пептидів винаходу. лізином та фібринзв'язуючим компонентом або Пептиди винаходу можуть бути використанні лінкером. Нижченаведена схема демонструє придля удосконалення терапії при лікуванні тромболіклад гібридної молекули, утвореної хімічним зшитичних захворювань. Наявна тромболітична тераванням урокінази та мультиплетних фібринзв'язапія лімітована, включаючи суттєвий ризик кровотених пептидів за допомогою лінкерних компонентів. чі, порушення регенерації кровотоку, тромбозну Кількість поверхневих лізинових залишків та кільреоклюзію після припинення терапії та затримку кість фібринзв'язаних пептидів є ілюстративною. між ініціалізацією терапії та лізисом згустка. ПоАльтернативно, фібриннаправлений пептид може кращений терапевтичний індекс може досягатись бути інкорпорований в гібридну молекулу, викорикон’югацією фібрин-направленого пептиду відповістовуючи ДНК те хнології. 19 В одному з втілень, пептиди винаходу можуть бути приєднаними до тромболітичного агента з узагальненим лінкером ферментного клівейджсайту, тобто ферментний клівейдж-сайт нормально розчеплюється ферментами в коагуляційному каскаді, такими як фактор Xa, тромбін або клівейдж-сайтами плазміну тощо. Тромболітичний агент залишається неактивним до тих пір, поки не буде відщеплений від зв'язуючих згустки композицій винаходу в місцізнаходження згустку, ризик виникнення небажаних кровотеч у віддалених від згустку місцях буде мінімізований. Більше того, тромболітичні компоненти можуть бути приєднаними до пептид-направлених мультимерних контрастних агентів так, що згусток може бути ідентифікованим, візуалізованим і розчиненим. Композиції винаходу, включаючи пептиди, кон'юговані з тромболітиками пептиди та пептиднаправлені мультимерні контрастні агенти, можуть бути о формлені як фармацевтичні композиції згідно з рутинними процедурами. Як тут використано, композиції винаходу можуть включати їх фармацевтично придатні похідні. "Фармацевтично придатні" означає, що сполуки або композиції можуть бути застосовані до тварин без недопустимих несприятливих ефектів. "Фармацевтично прийнятні похідні" означає будь-які фармацевтично прийнятні солі, естери, солі естерів або інші похідні сполук цього винаходу, які при застосуванні реціпієнтом є здатними забезпечувати (прямо або опосередковано) сполуки цього винаходу або їх активні метаболіти та їх активні залишки. Інші похідні є такими, що підвищують біоаккумулювання сполук цього винаходу, коли такі сполуки вводяться ссавцям (тобто, дозволяють орально введеним сполукам бути швидше абсорбованими в кровоносну систему), або які підвищують доставку основної сполуки до біологічного компартменту (тобто, до нервової або лімфатичної системи), таким чином підвищуючи експонування відносно початкових видів. Фармацевтично прийнятні солі сполук дійсного винаходу включають протилежні іони, отримані з фармацевтично прийнятних неорганічних та органічних кислот та базуються на відомих з рівня техніки. Фармацевтичні композиції винаходу можуть бути введені будь-яким іншим шляхом, включаючи обидва - і оральне, і парентеральне введення. 84432 20 Парентеральне введення включає, але не обмежує, підшкірне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньотканинне, внутріпшьопорожнинне та інтрасекальне введення. Коли введення є внутрішньовенним, фармацевтична композиція може даватись як болюс, двома або більше розділеними в часі дозами, або як постійна чи нелінійно протікаюча інфузія. Таким чином, композиції винаходу можуть бути оформлені для будь-якого шляху введення. Зазвичай, композиції для внутрішньовенного застосування є розчиненими в стерильному ізотонічному водному буфері. Якщо необхідно, композиції також можуть включати солюбілізуючий агент та місцевий анестетик, такий як лідокаїн, для полегшення болю в місці ін'єкції. Як правило, інгредієнти будуть доставлятись або розділено, тобто у вигляді набору, або змішаними разом у вигляді єдиної дозованої форми, наприклад, як сухий ліофілізований порошок або вільний від води концентрат. Композиції можуть зберігатися в герметично запакованих контейнерах, таких як ампули або пакетики із зазначенням кількості активного агента в одиницях активності. Коли композиція вводиться інфузією, вона може бути перекачаною в інфузійну місткість зі стерильною водою класу "вода для інфузії", фізіологічним розчином або іншими придатними для цього рідинами. Коли композицію вводять ін'єкцією, ампули зі стерильною водою для ін’єкцій або фізіологічним розчином можуть бути передбачені, внаслідок чого інгредієнти можуть бути змішаними перед введенням. Фармацевтичні композиції цього винаходу містять сполуки даного винаходу та їх фармацевтично прийнятні солі з будь-якими фармацевтично прийнятними інгредієнтами, ексціпієнтами, носіями, ад'ювантами або розчинниками. Що стосується лікування тромболітичних станів, то кількість матеріалу для введення буде залежати від серйозності тромбоемболічних станів, місцезнаходження та розміру згустка. Точна доза для застосування та метод введення в цих обставинах можуть бути визначенні лікарем шляхом контролю за перебігом терапії. В основному, дози комбінації композиція/кон’югат тромболітичного агента будуть витікати виключно з доз, звичайно застосовуваних для тромболітичних аген 21 84432 22 тів, не дивлячись на те, що покращення спорідПопередник хелатного компонента: DOTAFAненості до зв'язування з фібрином/згустоком доOpft. До розчину DOTATA-OH (1екв.) та пентафдаванням композицій, розкритих тут, може доторфенолу (1.2екв.) в дихлорметані було додано зволяти зменшення стандартних тромболітичних PS-карбодиімід (1.2-1.5екв.). Суміш перемішувадоз. Конкретні тромболітики задумані для виколи протягом 3-5год. при кімнатній температурі. За ристання в цій терапії (з прикладами доз та споодержаними результатами LC-аналізу констатусобів введення) є наступними: вали завершення реакції, полімер видаляли фістрептокіназа 1-3 мегаодиниць через кожні льтрацією та розчинник випаровували при зни30хв. протягом 3год.; женому тиску до утворення неочищеного аністреплаза 30 одиниць; 2-5 хвилинною попередника хелатного компонента у вигляді ін’єкцією; білої піни. tPA (дикого типу) 50-150мг; інфузією протяАгент для магнітно-резонансної томографії. гом 6год.; До розчину попередника агента для MR томодволанцюгова урокіназа (40-100мг); інфузією графії (1екв.) та попередника хелатного компонепротягом 6год.; нта (4.0екв.) в DMF було додано DIPEA (4.0екв.). одноланцюгова урокіназа (scuPA) 3-12 мегаСуміш перемішували протягом ночі при кімнатній одиниць (30-100мг); інфузією протягом 5год.; температурі. За одержаними результатами LCгідрид-плазміногенні активатори та похідні аналізу констатували завершення реакції, роз20-100мг.; ін’єкцією або інфузією; чинник видаляють при зниженому тиску. Неочимутеїни плазміногенних активаторів 10щений продукт перемішували в суміші з TFA, фе100мг; ін’єкцією або інфузією. нолом, метилсульфоновою кислотою, анізолом Винахід далі буде проілюстрований наступта дихлорметаном (90%/2,5%/2,5%/2,5%/2,5%) ними прикладами, які ні в якій мірі не обмежують протягом 15хв. при кімнатній температурі. Додавинахід, заявлений в формулі. вали диетиловий етер та утворювався білий преПриклади ципітат, який збирали як неочищений продукт. Приклад 1 - синтез пептидвмісних агентів для Неочищений продукт реагував з GdCl3´H20 в магнітно-резонансої томографії: деіонізованій воді до утворення неочищеного Пептид з лінкерним субодиничним компоненагента для MR томографії, який очищали, викотом, приєднаним до С-кінців (P-[лінкерний субристовуючи препаративну HPLC (С-18 колонка, одиничний компонент]). Незахищений пептид був етанол/50ммол. AcONH4). Відповідні фракції об'одержаний, використовуючи стандартну Fmoc єднували та е танол видаляли при зниженому стратегію та диамінотритиловий полімер. Пептид тиску, після цього об'єднані фракції обробляли був зациклізований, використовуючи трифтораацетатом натрію для сольового обміну. Після цетат талію, на полімері або в розчині. Після чого ліофілізації надмір солі було видалено, викорисбув відділений від полімеру, незахищений пептид товуючи зворотнофазову хроматографію з був очищений за допомогою препаративної HPLC Waters Sep-PakÒ C-18, картриджі з водою та ета(C-18 колонка, HO2/CH3CN/TFA). нол:вода (50:50) елюантами. Відповідні фракції Лінкерний компонент: До розчину Bocоб'єднували, етанол видаляли при зниженому Dpr(Boc)-OH.DCHA (1екв.) та пентафторфенолу тиску та розчин ліофілізували, таким чином утво(1.2екв. ) в дихлорометані було додано PSрювався бажаний пептидний агент для MR томокарбодиімід (1.2-1.5екв.). Суміш перемішували графії у вигляді твердої білої речовини. протягом 3-5 годин при кімнатній температурі. За Подібні методи використовують для синтезу одержаними результатами LC-аналізу констатуінших агентів для магнітно-резонансної томогравали завершення реакції, полімер видаляють фії. фільтрацією та розчинник випаровують при зниПриклад 3 - полімери для твердофазового женому тиску до утворення неочищеного лінкерсинтезу модифікованих пептидів з Cного компонента (Boc-Dpr(Boc)-OPft(N-a-Boc-N-bтермінальними функціональними аміногрупами. Boc-L-диамінопропіонової кислоти пентафторфеПептиди можуть бути приготовані твердофанілового естеру, 356-128) у вигляді білої піни. зовим синтезом. При твердофазовому синтезі Попередник агента для магнітно-резонансної лінкери та полімери вибирають залежно від типу томографії: До розчину P-лінкерного субодиничпептидів, які будуть синтезовані (тобто, необхідні ного компонента (1екв.) та лінкерного компонента функціональні групи на С-кінцях, захищені або {Вос-Dpr(Boc)-Opft} (2.2екв. ) в DMF було додано незахищені пептиди), та від способу синтезу, DIPEA (4-6екв.). Суміш струшували протягом ночі який буде застосований (тобто, Fmoc або BOC при кімнатній температурі. За одержаними рехімія, ручний чи автоматизований синтез, зультатами LC-аналізу констатували завершення "continuous flow" чи "batch" реактор). Наприклад, реакції, розчинник видаляють при зниженому при синтезі пептидів з функціональними карбоктиску. Неочищений продукт потім струшують в сильними групами на С-кінцях захищені амінокисуміші з TFA, водою та анізолом (90%/5%/5%) слоти приєднуються до різних полімерів, таких як при кімнатній температурі протягом 3 годин. ДоHMPB полімери, 2-хлоротритилхлоридний полідають діетиловий етер до утворення білого премер та SUSRIN полімер. З іншого боку, при синципітату, який очищують препаративною HPLC тезі пептидів з аміногрупами на C-кінцях діаміни (C-18 колонка, HO2/CH3CN/TFA), наслідком чого є можуть бути приєднані до тритилового полімеру. попередник агента для MR томографії у ви гляді Полістерольні (PS) полімери можуть бути викобілої твердої речовини. ристані для "batch" синтезів, тоді як поліетиленглікольмодифіковані полімери (PEG) є придатни 23 84432 24 ми для "continuous flow" та "batch" синтезів. БагаСинтез 1,3-bis-(амінометил)-бензолтритил то трифенілметильних PS полімерів, включаючи полімеру обговорений в прикладі. Решта диамінів 1,3-біс-(амінометил)-бензолтритил PS полімер, є може бути приєднана до тритилового полімеру комерційно доступними. Якщо потрібний тритил аналогічним способом. PS полімер недоступний, то можуть бути викориПриготування 1,3-bis-(амінометил)стані аналогічні описаним для PEG полімерів бензолтритил PEG полімеру. процедури для приєднання диаміну до тритил PS полімеру. По-перше, тритилспиртовий полімер (25 , NovaSyn TGT полімер, NovaBiochem) було поміщено у воронку та послідовно промито DMF, СН2СІ2, та толуолом. Після повного видалення розчинника, матеріал перенесли до колби, обладнаної дефлегмаційним холодильником. Додали толуол (250мл) та ацетилхлорид (25мл), пульпу нагріли до 70°C та перемішували протягом 1,0 години. Додаткову порцію ацетилхлориду (25мл) було додано та пульпу перемішували протягом 2,0 годин при 70°C. Пульпу фільтрували та полімер послідовно відмивали толуолом та СН2СІ2. По-друге, свіжопроготований тритилхлоридполімер та THF (250мл) поміщали в колбу. До пульпи було додано 1,3-bis-(амінометил)-бензол (10екв., виходячи із заміщеного полімеру 0,23ммол/г) та суміш перемішували протягом 18.0 годин при кімнатній температурі. Пульпу відфільтрували та полімер послідовно промивали водою, DMF, СН2СІ2 , метанолом та СН 2СІ2. Полімер висушували під вакуумом (кімнатна температура, 1-5мм Hg) до постійної ваги (25,4г). Заміщуюча сте хіометрія була проведена, використовуючи кількісну нінгідринову процедуру. Приклад 5 - синтези фібринзв'язуючих агентів для магнітно-резонансної томографії 25 84432 26 27 Конструювання пептиду: 3,39г 1,3-bis(амінометил)-бензолтрифенилметилу NovaSyn TGT полімер (виміряні заміщення=0.59ммол) поміщали в стандартну пептидну колонку і загружали в пептидний синтезатор. Синтез проводили, застосувуючи стандартну Fmoc стратегію. Кеппіювання проводили після приєднання першої амінокислоти, використовуючи ацетатний ангідрид, 6% диізопропілетиламін в DMF. Після того, як синтез повністю завершиться, полімер видаляли з колонки та поміщали в реакційний резервуар. Полімер був промитий один раз СН2СІ2 та відфільтрований. Полімер потім був оброблений 1% трифтороцтовою кислотою в СН 2СІ2 та поміщений в механізм для струшування на 10 хвилин. Суміш відфільтровували через реакційний резервуар та фільтрат о холоджували. рН об'єднаних фільтратів доводили до приблизно 8 триетиленаміном, та розчин концентрували під вакуумом до маслоподібного стану. Після преципітації у воді білу тверду речовину відфільтровували та промивали водою і диетиловим ефіром. Осад висушували всмоктуючою фільтрацією, переносили в DMF та розводили ацетонітрилом. Розчин охолоджували на льодяній бані та обробляли 1,5г трифторацетатом талію протягом 2,0 годин. рН розчину доводили триетиленаміном до рН=8 та потім концентрували під вакуумом. Воду було додано до масла та одержаний преципітат збирали всмоктуючою фільтрацією. Осад відмивали водою та одержували 2,7г диетилового етеру неочищеного модифікованого пептиду, що має Стермінальну функціональну аміногрупу. Приклад синтезу H2N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gl y-Thr-C ysBip-Asp-CO-NHCH2C6H4CH2NH2 (SEQ ID NO:21) був підтверджений отриманими даними m/Z 1792.8 [M+Na]+. Модифікований пептид очищували препаративною HPLC. Фракції з близьким ступенем чистоти (98-100%) об'єднували та ліофілізували без нейтралізації. Модифікований пептид (32г) та ковалентний кон’югат (вищевказаний Synthon #2) (3,95г) розчиняли в дихлорметані. Диізопропілетиламін було додано крапля за краплею при показнику рН=9, диізопропілкарбодиімід (2екв.) та HOBt (2екв.) одночасно були додані до суміші. Після двохвилинного перемішування, диізопропілети 84432 28 ламін було додано крапля за краплею при значенні рН=9. Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом двох годин. Додатковий попередньо активований Synthon #2 (диізопропілкарбодиімід, диізопропілетиламін, та HOBt) було додано однією порцією. Розчинники видаляли у вакуумі та залишок розчиняли в етилацетаті, який послідовно промивали 0,1N соляною кислотою, насиченим бікарбонатом натрію та насиченим водним розчином хлориду натрію. Органічну фазу висушували над сульфатом натрію, фільтрували та концентрували при зниженому тиску до одержання світло-жовтої піноподібної речовини (7,8г). Піну розчиняли в дихлорметані та очищували флеш-хроматографією (дихлорметан:метанольний елюент), забезпечуючи 5,5г білого осаду. Білий осад перемішували в суміші з TFA, водою та триетилсиланом (90%/5%/5%, 30мл) при кімнатній температурі. Суміш нагрівали до 40°C та перемішували протягом 2 годин. Розчин концентрували до об'єму приблизно між 3 та 5мл, потім охолоджували до кімнатної температури. Діетиловий етер було додано та утворився білий преципітат. Суміш дозволено перемішувати протягом 10 хвилин, осад було зібрано фільтрацією та відмито диетиловим ефіром. Осад висушували під вакуумом, забезпечуючи 4,0г білого осаду. Осад розчиняли в суміші вода:ацетонітрил (20мл, 4:1 відношення) та очищували препаративною хроматографією до жовто-білого осаду попередника MR томографічного агента (1,6г). Попередник MR томографічного агента (1г) прореагував з одним еквівалентом GdCI3´6H2O в дистильованій деіонізовані воді при рН, доведеній до значення 6 додаванням 1M NaOH. Комплекс гадолінію очищували зворотнофазовою хроматографією (Waters Sep-PakÒ C-18), використовуючи дистильовану деіонізовану воду та 50:50 (v:v) метанол:водний елюент. Відповідні фракції об'єднували та метанол видаляли при зниженому тиску і при 50°C, та ліофілізували, що дало 811мг MR томографічного агента. Альтернативно наведеним тут 32 синтезам пептид може бути зациклізований на полімері, як проілюстровано в наступній схемі: 29 Специфічні параметри, включені в наступні приклади, призначені проілюструвати здійснення винаходу та ні в якій мірі не обмежують винахід. Обізнані в цій галузі спеціалісти розпізнають або зможуть встановити, використовуючи не більше як рутинні експерименти, багато специфічних втілень та методів, еквівалентних тим, що тут розкриті. 84432 30 Зрозумілим є те, що в той час як винахід було описано у відповідності з наведеним тут детальним описом, цей вищенаведений опис призначений проілюструвати, але ні в якій мірі не обмежувати обсяг винаходу, який визначений в формулі, що додається. Інші аспекти, переваги та модифікації знаходяться в межах, визначених обсягом наступної формули винаходу. 31 84432 32 33 84432 34 35 84432 36 37 84432 38 39 84432 40 41 84432 42 43 84432 44 45 84432 46 47 84432 48 49 84432 50 51 84432 52 53 84432 54 55 84432 56 57 84432 58 59 84432 60