Спосіб визначення культур penicillium candidum та geotrichum candidum методом полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Винахід належить до способу визначення видоспецифічних генів ДНК культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum у м′яких сичужних сирах методом полімеразної ланцюгової реакції. UA 101938 C2 (12) UA 101938 C2 UA 101938 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Праймери використовують у молекулярній біології та біотехнології для ідентифікації та детекції видоспецифічних генів. Праймери (англ. primer) - синтетичні олігонуклеотиди - короткі фрагменти нуклеїнової кислоти комплементарні послідовностям ДНК або РНК, які ініціюють синтез комплементарного ланцюга за участі ДНК-полімерази, а також під час реплікації ДНК. Праймери необхідні для ініціації синтезу ДНК-полімеразою нового ланцюга починаючи з 3'-кінця праймера. Праймерів має бути два - прямий та зворотній, які обмежують ділянку ДНК, що піддається ампліфікації. Полімеразна ланцюгова реакція, скорочено - ПЛР, передбачає ампліфікацію - чисельне копіювання ділянки ДНК, за допомогою термостабільної ДНК-полімерази, яка обмежена двома різноспрямованими олігонуклеотидними праймерами [1]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило метод ПЛР зручним та загальновживаним [2]. На сьогодні метод ПЛР широко використовується для ідентифікації та детекції видоспецифічних генів [3]. Для гену або ділянки ДНК, яка цікавить дослідників, підбирається пара праймерів, за допомогою якої можна провести ампліфікацію ділянки характерної довжини і отримати амплікони, зручні для ідентифікації після розділення у електричному полі методом електрофорезу в агарозному гелі [4]. Також можна проводити ПЛР у режимі реального часу на спеціальному ампліфікаторі з кількісною реєстрацією продукту ампліфікації за рахунок флуоресцентного зонда, який зв'язується з ампліфікатом. Довжина амплікону, призначеного для детекції методом ПЛР у режимі реального часу має бути коротшою за амплікон, призначений для розділення у електричному полі методом електрофорезу в агарозному гелі [5]. Відомі праймери для ідентифікації та детекції ДНК культур Penicillium camemberti та Penicillium roqueforti не є високоспецифічними для визначення даних культур і можуть розпізнавати культури усього роду Penicillium sp. [6]. Відомі праймери для ідентифікації та детекції ДНК культур Geotrichum candidum також не є високоспецифічними для визначення даних культур, оскільки спостерігається високий рівень подібності щодо послідовностей ДНК між промисловими та дикими штамами Geotrichum candidum, крім того ці праймери були підібрані для аналізу полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскрипцією, що передбачає ампліфикацію специфічного фрагмента рибонуклеїнової кислоти (скорочено - РНК) [7]. Праймери для визначення культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum методом полімеразної ланцюгової реакції є об'єктом даного винаходу. Запропоновані праймери можуть бути застосовані для дослідницьких та прикладних робіт з ідентифікації та дослідження динаміки росту культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum у м'яких сичужних сирах, для ідентифікації ДНК культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum методом полімеразної ланцюгової реакції. Для визначення та ідентифікації ДНК культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum у м'яких сичужних сирах методом полімеразної ланцюгової реакції, використовують підібрані пари праймерів: для культур Penicillium candidum застосовують пару синтетичних олігонуклеотидних праймерів до фрагменту ДНК гену гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази: прямий праймер gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' та зворотній праймер gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCA GCA-3'; для культур Geotrichum candidum застосовують пару синтетичних олігонуклеотидних праймерів до фрагмента ДНК гена піруват цистатіонін--ліази: ! прямий праймер cglF: 5 -ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3'. та зворотній праймер cglR: 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3'. Підбір пар синтетичних олігонуклеотидних праймерів проводили згідно з правилами молекулярного дизайну. Для підбору праймерів використовувались програми Primer, Oligo або їх аналоги, які дозволяють здійснювати багатофакторний аналіз вибраних послідовностей ДНК. Вибирали найконсервативніші ділянки характерних послідовностей специфічних генів, які раніше не використовувалися при підборі праймерів для ДНК культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum. Порівняльний аналіз вибраних синтетичних олігонуклеотидних праймерів здійснювали за допомогою програми Blast для виключення фрагментів гомологічних до ДНК споріднених та неспоріднених видів мікроорганізмів. Досліджувана культура Penicillium candidum відноситься до - Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Pezizomycotina; Eurotiomycetes; Eurotiomycetidae; Eurotiales; Trichocomaceae; Mitosporic; Penicillium; Penicillium camemberti. 1 UA 101938 C2 Для визначення культур Penicillium candidum було обрано ген гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (англ. - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, скорочено - gapdh), штаму СЕСТ 2267 complete cds за даними GenBank peг. № HQ423172.1 (фрагмент 1820-2170 довжиною 350 п.н.) 5 10 Див. Фігура 1. "Послідовність Penicillium candidum» Досліджувана культура Geotrichum candidum належить до - Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Dipodascaceae; Galactomyces; Galactomyces geotrichum. Для визначення культур Geotrichum candidum було вибрано ген піруват цистатіонін--ліази (англ. - putative cystathionine gamma lyase, скорочено - cgl) за даними GenBank per. № AJ511875.1 (довжиною 261 п.н.): 15 20 Див. Фігура 2. "Послідовність Geotrichum candidum» Первинний синтез амплікону довжиною 131 п.н. 25 30 з досліджуваного гена HQ423172.1 культури Penicillium candidum було зроблено за допомогою пари синтетичних олігонуклеотидних праймерів прямий праймер gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3', який комплементарно зв'язується, починаючи з 37 нуклеотиду послідовності, зворотній праймер gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3', який комплементарно зв'язується, починаючи з 167 нуклеотиду послідовності, відслідковується за схемою: 2 UA 101938 C2 Первинний синтез амплікону довжиною 114 п.н. 5 10 з досліджуваного гена AJ511875.1 культури Geotrichum candidum було зроблено за допомогою пари синтетичних олігонуклеотидних праймерів прямий праймер cglF 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3', який комплементарно зв'язується, починаючи з 5 нуклеотиду послідовності зворотній праймер cglR 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3', який комплементарно зв'язується, починаючи з 118 нуклеотиду послідовності, відслідковується за схемою: 15 20 25 30 Перевірка нуклеотидних послідовностей підібраних пар праймерів: прямий праймер gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' та зворотній праймер gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' для ампліфікації фрагмента ДНК довжиною 131 п.н. гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (англ. - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, скорочено - gapdh) штаму СЕСТ 2267 культури Penicillium candidum; прямий праймер cglF: 5'-ACGGTGGTACCCACAGATA CTT-3' та зворотній праймер cglR: 5'f GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3 для ампліфікації фрагмента ДНК довжиною 114 п.н. гену піруват цистатіонін--ліази (англ. - putative cystathionine gamma lyase, скорочено - cgl) культури Geotrichum candidum; проводиться методом полімеразної ланцюгової реакції. Для проведення паралельних полімеразних ланцюгових реакцій використовували термостабільну Taq ДНК полімеразу, відповідний десятикратний ПЛР-буфер, розчини чотирьох дезоксирибонуклеотид-три-фосфатів в об'ємі: Н2О 97,5 мкл 10х буфер 25 мкл 25 мМ MgCl2 40 мкл 2 мМ dNTP 25 мкл Taq 2,5 мкл 190 мкл. 190 мкл розділили на 10 аліквот по 19 мкл та до кожної додали: праймер 1 - gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 2 - gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 3 - cglF: 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 4 - cglR: 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, 3 UA 101938 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 пробу ДНК - 1 мкл. Отримали реакції кожна об'ємом 25 мкл: Н2О 9,75 мкл, 10х буфер 2,5 мкл, 25 мМ MgCl2 4 мкл, 2 мМ dNTP 2,5 мкл, Taq ДНК-полімераза 0,25 мкл. праймер F (10 пкМ/мкл) 2,5 мкл, праймер R (10 пкМ/мкл) 2,5 мкл, проба ДНК 1 мкл. Реакції наведені в таблиці 1 "Якісне визначення ДНК за праймерами". У кожній реакції використовували пари праймерів у поєднанні з різними пробами ДНК. Для позитивного контролю проводили ампліфікацію ДНК чистих культур Реnісіllіum candidum, Geotrichum candidum А та Geotrichum candidum С, використовуючи пари праймерів комплементарні до геномної ДНК чистої культури - таблиця 1, реакції № 1, № 5, № 6. Для ампліфікації суміші ДНК, виділеної з чистих культур Реnісіllіum candidum та Geotrichum candidum, використовували пари праймерів комплементарні до геномної ДНК кожної культури, або одночасно до обох, потенційно присутніх у суміші - таблиця 1, реакції № 2, № 7. Для ампліфікації геномної ДНК, виділеної з міцелію м'якого сиру Камамбер, використовували пари праймерів комплементарні до геномної ДНК культур Реnісіllіum candidum або Geotrichum candidum, або одночасно до обох імовірно присутніх у цьому сирі - таблиця 1, реакції № 3, № 8. Для негативного контролю використовували очищену ДНК інших плісеней, які завідомо не мають ділянок ДНК комплементарних до розроблених цільових праймерів - таблиця 1, реакції № 4, № 9, та реакцію при повній відсутності ДНК у пробі - таблиця 1, реакція № 10. Полімеразні ланцюгові реакції №1 - №10 проводили у апараті "GeneAmp PCR System 9600" з відповідним програмним забезпеченням, за параметрів: - початкова стадія денатурації ДНК при 94 °C впродовж 3 хвилин; - основна стадія - 30 циклів, які складаються з: - етапу при 94 °C впродовж 30 секунд, - етапу при 56 °C впродовж 40 секунд, - етапу при 72 °C впродовж 30 секунд; - кінцева стадія елонгації при 72 °C впродовж 5 хвилин. З кожної реакції відбирали по 2 мкл кінцевого продукту ПЛР і аналізували методом електрофорезу в 1,6 % агарозному гелі, який містив бромистий етидій для фарбування ампліконів і подальшої візуалізації під дією ультрафіолетового світла. Продукти ПЛР являють собою амплікони фрагментів вибраних генів, які мають характерну довжину, що дозволяє їх розрізняти при опроміненні ультрафіолетом після електрофоретичного розділення в агарозному гелі і фарбування бромистим етидієм для ідентифікації фрагментів ДНК: амплікон довжиною 131 п.н. специфічного фрагмента ДНК гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази штаму СЕСТ 2267 культури Реnісіllіum candidum; амплікон довжиною 114 п.н. специфічного фрагмента ДНК гена піруват цистатіонін--ліази ДНК культури Geotrichum candidum. Результати електрофорезу наведені на Фігурі 3 "Амплікони після електрофоретичного розділення в агарозному гелі фарбовані бромистим етидієм при опроміненні ультрафіолетом", номери реакцій відповідають номерам реакцій, наведених у таблиці 1. Ампліфікацію специфічного фрагмента в ДНК можна здійснювати для доведення присутності та ідентифікації досліджуваної послідовності у зразку ДНК. Результатами підбору пар олігонуклеотидних праймерів є ампліфікація фрагментів: специфічного фрагмента довжиною 131 п.н. гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази ДНК штаму СЕСТ 2267 культури Реnісіllіum candidum; специфічного фрагмента довжиною 114 п.н. гена піруват цистатіонін--ліази ДНК культури Geotrichum candidum, що дозволяє визначати присутність у м'яких сичужних сирах геномної ДНК культури Реnісіllіum candidum та/або Geotrichum candidum, або ідентифікувати присутність ДНК обох культур одночасно. Запропоновано пари олігонуклеотидних праймерів: прямий праймер gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' та зворотній праймер gapdhR 5'ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' - для визначення культур Реnісіllіum candidum; прямий праймер cglF: 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' 4 UA 101938 C2 5 10 15 20 25 30 та зворотній праймер cglR: 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' для визначення культур Geotrichum candidum, для ідентифікації культур Реnісіllіum candidum та/або Geotrichum candidum при проведенні моніторингу м'яких сирів та перевірки відповідності наявності культур Реnісіllіum candidum та Geotrichum candidum нормативним та супровідним документам при виробництві та у торгівельній мережі. Запропоновані праймери для визначення культур Реnісіllіum candidum та Geotrichum candidum методом полімеразної ланцюгової реакції можуть бути використані як при застосуванні ідентифікації ДНК методом електрофорезу в агарозному гелі, так і методом ПЛР у реальному часі за умови підбору до них відповідних флуоресцентних зондів. Запропоновані пари олігонуклеотидних праймерів для визначення ДНК культур Реnісіllіum candidum та Geotrichum candidum методом полімеразної ланцюгової реакції, при їх використанні, дають переваги у значній економії витрат часу та точності ідентифікації ДНК культур Реnісіllіum candidum та Geotrichum candidum, діагностуванні наявності обох культур одночасно у м'яких сирах, у продуктах харчування, тощо. Джерела інформації: [1] Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia/RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p. 1350-1354. [2] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA.// Science, 1988, v. 239, p. 487-491. [3] Species-Specific Identification of Penicillium Linked to Patulin Contamination/ DombrinkKurtzman MA, McGovern AE.// J Food Prot, 2007, v. 70(11), p. 2646-2650. [4] PCR Protocols/ Innis et aT.// Academic Press. Inc., 1990, p.219-227. [5] Quantitative PCR for DNA identification based on genome-specific interspersed repetitive elements/ Walker JA, Hughes DA, Hedges DJ, Anders BA, Laborde ME, Shewale J, Sinha SK, Batzer MA.// Genomics, 2004, v. 83 (3) p. 518-527. [6] Quantification of Penicillium camemberti and Penicillium roqueforti mycelium by real-time PCR to assess their growth dynamics during ripening cheese. G. Le Drean G. Le, J. Mounier J., V. Vasseur V., D. Arzur D., O. Habrylo O., Barbier G. // Int J Food Microbiol. 2010 Mar 31; 138(1-2): 100-107. [7] Geotrichumcandidum dominates inyeast population dynamics in Livarot, a French red-smear cheese. Larpin S., Mondoloni C, Goerges S., Vernoux J.-P., Gueguen M., Desmasures N. //FEMS Yeast 2006, Res 6(8): 1243-1253. 35 Таблиця 1 ЯКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ДНК ЗА ПРАЙМЕРАМИ № реакції 1 2 3 4 5 6 7 8 Проба ДНК Культура Реnісіllіum candidum Культури Реnісіllіum candidum+Geotrichum candidum A Праймери Амплікон 1 gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' 2 gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' 131 п.н. 1 gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' 2 gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' 131 п.н. 1 gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' 2 gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' Культура Geotrichum 1 gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' candidum A 2 gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' Культура Geotrichum 3 cglF 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' candidum A 4 cglR 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' Культура Geotrichum 3 cglF 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' candidum С 4 cglR 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' Культури Реnісіllіum 3 cglF 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' candidum+Geotrichum 4 cglR 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' candidum A 3 cglF 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' Сир Камамбер 4 cglR 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' 131 п.н. Сир Камамбер 5 114 п.н. 114 п.н. 114 п.н. 114 п.н. UA 101938 C2 Таблиця 1 ЯКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ДНК ЗА ПРАЙМЕРАМИ № реакції 9 10 Проба ДНК Праймери Культура Реnісіllіum 3 cglF 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' candidum 4 cglR 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3' 1 gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' Вода 2 gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3' Амплікон ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб визначення культур Penicillium candidum та Geotrichum candidum у м'яких сичужних сирах методом полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що для ідентифікації фрагмента ДНК-культур Penicillium candidum застосовують пару синтетичних олігонуклеотидних праймерів: прямий праймер gapdhF 5'-CGCCAATCTGCCGTAGGCCAT-3' та зворотній праймер gapdhR 5'-ACCCTCAATGGTCTTTCAACCAGCA-3'; культур Geotrichum candidum застосовують пару синтетичних олігонуклеотидних праймерів: прямий праймер cglF: 5'-ACGGTGGTACCCACAGATACTT-3' та зворотній праймер cglR: 5'-GGGAGGTCTTGTCAGTGATGA-3'. 6 UA 101938 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7