Одержання триацилгліцеролів з камедей

1. Спосіб одержання триацилгліцеролів з камедей олії, який включає (a) забезпечення масляною композицією, що містить деяку кількість камедей олії, де вказані камеді містять фосфоліпіди, (b) відділення камедей олії від масляної композиції для одержання першої фракції, де домішки камеді відділені, і другої фракції, що містить відділені камеді олії, (c) обробку другої фракції одним або більше ферментами, що мають активність PLA, для утворення вільних жирних кислот, (d) обробку другої фракції одним або більше ферментами, що мають активність PLC, для утворення діацилгліцеролів, таким чином, що вказані жирні кислоти і вказані діацилгліцероли взаємодіють один з одним в присутності не менше одного з вказаних ферментів, утворюючи триацилгліцероли. 2. Спосіб за п. 1, де етапи (с) і (d) здійснюють практично одночасно. 3. Спосіб за п. 1, де етап (с) здійснюють перед етапом (d). 4. Спосіб за п. 1, де етап (d) здійснюють перед етапом (с). 2 (19) 1 3 96231 4 17. Спосіб за п. 16, де вказаний фермент PLC присутній в кількості близько 20 м. ч. активного ферменту або менше. 18. Спосіб за п. 17, де вказаний фермент PLC присутній в кількості близько 10 м. ч. активного ферменту або менше. 19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-18, де вказаний фермент PLA присутній в кількості близько 2 м. ч. активного ферменту або менше. 20. Спосіб за п. 19, де вказаний фермент PLA присутній в кількості близько 1 м. ч. активного ферменту або менше. 21. Спосіб за п. 20, де вказаний фермент PLA присутній в кількості близько 0,5 м. ч. активного ферменту або менше. 22. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, де суміш другої фракції і ферментів спочатку перемішують. 23. Спосіб за п. 22, де тривалість перемішування складає щонайменше приблизно 45 с. 24. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, що включає етап додавання деякої кількості води. 25. Спосіб за п. 24, де деяка кількість води складає щонайменше приблизно 1,5 % мас. з розрахунку на загальну суміш. 26. Спосіб за п. 25, де деяка кількість води складає щонайменше приблизно 3,0 % мас. з розрахунку на загальну суміш. 27. Спосіб за п. 26, де деяка кількість води складає щонайменше приблизно 4,5 % мас. з розрахунку на загальну суміш. За даною заявкою запитується пріоритет відносно заявки США №11/970270, зареєстрованої 7 січня 2008 року під назвою "ОДЕРЖАННЯ ТРИАЦИЛГЛІЦЕРОЛІВ З КАМЕДЕЙ" на ім'я Christopher L.G.Dayton. Даний винахід належить до способу одержання триацилгліцеролів з камедей, які відновлюються в процесі рафінації олій. Більш конкретно, даний винахід належить до ферментативного процесу обробки різних фосфоліпідів і лецитинів (відомих під загальною назвою "камеді") з рослинних олій для одержання або "генерації" триацилгліцеролів (тригліцериди або олії). Винахід, описаний в даному тексті, є подальшим етапом роботи на основі винаходів, описаних в заявці на патент США №11/668921, зареєстрованій 30 січня 2007 року, і заявці на патент США №11/853339, зареєстрованій 11 вересня 2007 року, які належать загальному заявнику і введені в даний текст у вигляді посилання. Необроблені рослинні олії, одержані методами пресування або екстрагування розчинниками, являють собою складну суміш триацилгліцеролів, фосфоліпідів, стеролів, токоферолів, вільних жирних кислот, слідових металів і інших мінорних сполук. Для одержання якісної салатної олії тривалого зберігання, що має світлий колір і м'який смак, необхідне видалення фосфоліпідів, вільних жирних кислот і слідових металів. У попередньому рівні техніки було вдосконалене подібне видалення фосфоліпідів, відомих як "камеді", за допомогою різних методик, включаючи водне дегумування, кислотне дегумування, лужне дегумування і ферментативне дегумування. Більшість з цих способів дегумування характеризуються значними втратами олії разом з відокремлюваними камедями. Вищезгадані патентні заявки описують способи видалення фосфоліпідів з масляних композицій шляхом спільної обробки масляних композицій ферментами PLA (фосфоліпаза А) і PLC (фосфоліпаза С). Обробка двома ферментами може бути послідовною або одночасною. Несподівано виявилося, що кінетика ферментативних реакцій прискорюється в більшій мірі, ніж очікувалася, коли два ферменти застосовуються разом, ніж у випадках, коли використовується тільки будь-який один фермент. Додатково, було виявлено, що реакції протікають швидше очікуваного при спільному використанні ферментів, навіть якщо умови реакції не були підібрані хоча б для одного з ферментів. Також було встановлено, що при спільному використанні ферментів реакція може протікати менше ніж за приблизно 1 годину, і навіть може протікати за 30 хв. Очікується, що внаслідок обробки масляних композицій ферментами PLA і PLC будуть одержані певні супутні продукти реакції, які повинні бути видалені з обробленого масла. Ці супутні продукти включають фосфатовмісні залишки, відщеплені від фосфоліпідів ферментами PLC, вільні жирні кислоти, відщеплені від фосфоліпідів ферментами PLА, і лізо-фосфоліпіди, одержані внаслідок відщеплення вільної жирної кислоти від фосфоліпіду. Лізо-фосфоліпіди і будь-які фосфатовмісні супутні продукти повинні бути видалені з обробленої масляної композиції, і очікується, що інші вищеперелічені супутні продукти реакції будуть видалені разом з лізо-фосфоліпідами в складі важкої фракції, відомої як "камеді". Патент США 5061498 належить до способу перетворення жирів і масел, який включає обробку жирів і масел, що містять неповні гліцериди, ліпазами двох або більше типів, які відрізняються специфічністю відносно жирних кислот і/або специфічністю відносно положення етерифікації в присутності малих кількостей води, для одержання жирів і масел з низьким вмістом неповних гліцеридів. У розкритому прикладі здійснення використовується ліпаза Р, оскільки вона буде здійснювати реакцію в будь-якому з трьох положень кістяка гліцерину. До композиції, що містить неповні гліцериди, може бути додана цільова жирна кислота, така як олеїнова кислота, в присутності ліпази, специфічної до цільової жирної кислоти, такої як ліпаза F. Наявність ліпази F сприяє переважному проходженню реакції з участю переважної жирної кислоти в порівнянні з іншими жирними кислотами, які можуть бути присутнім, і наявність ліпази Р сприяє етерифікації переважної жирної кислоти в 5 будь-якому положенні на кістяку неповних гліцеридів. Концентрація води переважно складає менше 1500 м.ч. (мільйонних часток), більш конкретно від 10 до 200 м.ч. Завдання даного винаходу полягає в забезпеченні способу обробки відділених камедей для одержання придатних до вживання масляних продуктів, які в іншому випадку були б загублені. На додаток до роботи, описаної в двох вищезгаданих патентних заявках, були проведені дослідження камедей, які були відділені від масел, оброблених PLA/PLC. Очікувалося, що камеді будуть містити вільні жирні кислоти і діацилгліцероли, присутні в кількостях, пропорційних кількості фосфоліпідів, що були присутніми в вихідній масляній композиції, які зазнали дії ферментів. Замість цього, кількість вільних жирних кислот і діацилгліцеролів виявилася значно меншою, ніж очікувалася теоретично. Виходячи з так несподіваного результату, був зроблений висновок, що вільні жирні кислоти і діацилгліцероли, які були побічними продуктами реакцій фосфоліпідів з PLA і PLC, відповідно, реагували один з одним в присутності ферментів PLA і PLC, з утворенням корисних триацилгліцеролів, таким чином, по суті, генеруючи нові молекули масел, які не існували до початку процесу обробки PLA/PLC. Завдяки цьому було зроблене відкриття, що комбінація ферментів PLA і PLC може застосовуватися для обробки відділених фосфоліпідів, незалежно від способу відділення цих фосфоліпідів, для генерації нових молекул триацилгліцеролів. Відповідно, даний винахід належить до способу генерації триацилгліцеролів з камеді масел, способу, що включає (а) забезпечення масляної композиції, що містить деяку кількість масляних камедей, де вказані камеді містять фосфоліпіди, (b) відділення вказаних масляних камедей від вказаної масляної композиції для одержання першої фракції, яка практично не містить масляних камедей, і другої фракції, що містить вказані відділені масляні камеді, (с) обробку вказаної другої фракції одним або більше ферментами з активністю PLA для утворення вільних жирних кислот, і (d) обробку вказаної другої фракції одним або більше ферментами з активністю PLC для утворення діацилгліцеролів, таким чином, що вказані жирні кислоти і вказані діацилгліцероли взаємодіють один з одним в присутності не менше одного з вказаних ферментів, утворюючи триацилгліцероли. На фіг. 1 наведені структурні формули фосфоліпіду і триацилгліцеролу. На фіг. 2 показані три стереоспецифічні положення фосфоліпіду. На фіг. 3 наведені структури чотирьох поширених функціональних груп, які можуть бути приєднані до фосфатної групи фосфоліпіду. На фіг. 4 показані чотири різні сайти ферментативного впливу в молекулі фосфоліпіду. На фіг. 5 показана реакція фосфоліпіду в присутності ферменту PLA і води, що призводить до утворення лізо-фосфоліпіду і жирної кислоти. На фіг. 6 показана реакція фосфоліпіду в присутності ферменту PLC і води, що призводить до утворення діацилгліцеролу і фосфату. 96231 6 На фіг. 7 наведена структурна формула фосфатиділхоліну. На фіг. 8 наведена структурна формула фосфохоліну. Майже всі втрати, пов'язані з процесом рафінації рослинних олій, мають місце при видаленні фосфоліпідів. Як показано на фіг. 1, фосфоліпіди містять фосфатну групу на одному з двох кінців гліцеринового кістяка, тоді як триацилгліцерол містить три жирні кислоти. Щоб розрізнити похідні, використовується система стереоспецифічної нумерації ("Sn"). На фіг. 2 зображені три стереоспецифічні положення фосфоліпіду. Фосфатна група фосфоліпіду є "гідрофільною", або "водолюбною", що означає, що і фосфат, і функціональна група X притягуються до води. Ланцюжки жирних кислот фосфоліпіду R1 і R2 є "ліпофільними", або "жиролюбними", що означає, що вони притягуються до ліпідів. Оскільки молекула фосфоліпіду має і гідрофільну функціональну групу, і ліпофільні ланцюжки жирних кислот, то являє собою прекрасний природний емульгатор. Емульгувальні властивості фосфоліпідів будуть призводити до видалення двох молекул фосфоліпіду і однієї молекули триацилгліцеролу при видаленні фосфоліпідів з рослинних олій. Фосфатовмісна функціональна група фосфоліпіду, позначена на фіг. 1 як "X", зумовлює міру гідрофільності. Функціональна група X на фіг. 1 може бути групою будь-якого з декількох різних відомих типів, мала частина яких наведена на фіг. 3. Фосфоліпіди, що містять як функціональні групи холін і етаноламін, мають найбільшу спорідненість до води, тоді як кислоти, солі кислот (кальцієві, магнієві і солі заліза) і інозитол мають набагато більш низьку спорідненість до води. Фосфатидна кислота і солі фосфатидної кислоти широко відомі як "негідратовані фосфоліпіди" або NHP. Вміст фосфоліпідів в олії зазвичай визначається як "вміст фосфору" в мільйонних частинках. Таблиця 1 описує звичайні кількості фосфоліпідів, присутні в більшості культур для виробництва рослинної олії, і розподіл різних функціональних груп, в процентних частках, фосфоліпідів в оліях Таблиця 2 описує звичайний розподіл фосфоліпідів, присутніх в лецитині (соєві камеді). У таблиці 2 "як така" означає звичайний фосфоліпідний склад, відокремлюваний від рослинної олії із зосередженою олією (2 молекули фосфоліпіду і 1 молекула олії), що дає нерозчинний в ацетоні вміст в 67 %. "Нормалізований" означає фосфоліпідний склад без домішки олії, що дає нерозчинний в ацетоні вміст в 100 %. Таблиця 3 описує молекулярні маси основних типів фосфоліпідів, лізо-фосфоліпідів і відповідних не ліпідних сполук фосфору Термін "лізо-фосфоліпід", при використанні в таблиці 3 і скрізь в даний заявці, означає фосфоліпід, від якого одна з груп жирних кислот була відщеплена ліпазою. Молекулярна маса олеїнової кислоти становить 282,48, а молекулярна вага діацилгліцеролу, в якій жирні кислоти є олеїновою кислотою (С18:1), становить 620,99. 7 96231 8 Таблиця 1 Розподіл і кількості фосфоліпідів в оліях з поширених олійних культур Р (м.ч.) PC (-холін) РЕ (-етаноламін) РА (-кислота) РІ (-інозитол) Соєва олія 400-1200 12-46 % 8-34 % 2-21 % 2-15 % Олія каноли 200-900 25-40 % 15-25 % 10-20 % 2-25 % Соняшникова олія 300-700 29-52 % 17-26 % 15-30 % 11-22 % Таблиця 2 Звичайний розподіл і кількість фосфоліпідів в соєвих камедях Фосфатиділхолін Фосфатиділетаноламін Фосфатиділсерін Фосфатиділова кислота Фосфатиділінозітол Усього Процентна частка "як є" 33,9 14,3 0,4 6,4 16,8 71,8 Процентна частка "нормалізована" 47,2 19,9 0,6 8,9 23,4 100,0 Таблиця 3 Молекулярна вага поширених фосфоліпідів і сполук Холін-С18:1 Етаноламін-С18:1 Серин-С18:1 Кислота-С18:1 Інозитол СІ8:1 Фосфоліпід Молекулярна вага 786,15 744,00 787,03 721,90 863,98 Фосфоліпіди можуть бути частково або повністю видалені з рослинних олій за допомогою декількох різних технологій; найбільш поширеними є водне дегумування, кислотне дегумування, лужна рафінація і ферментативне дегумування. Даний винахід, що описує одержання олій з камедей, може застосовуватися у відношенні камедей, одержаних внаслідок будь-якого з цих процесів; з метою ілюстрації детально буде пояснено ферментативне дегумування. Ферментативне дегумування, також відоме як "ферментативна рафінація", використовується, коли метою є повне видалення фосфоліпідів з олії. В основному, згідно з попереднім рівнем техніки ферментативне дегумування застосовується відносно олій, які попередньо були дегумовані якимсь іншим способом, зазвичай водним дегумуванням. Для застосування як харчової добавки дегумована ферментативним способом олія може потім піддаватися освітленню і дезодорації, технології, відомій у виробництві як "фізична рафінація". Ферментативне дегумування забезпечує кращий вихід олії, ніж водне, кислотне або лужне дегумування, з поліпшеними економічними показниками. Лізо-фосфоліпід Молекулярна вага 521,67 479,52 522,55 457,42 599,50 Сполука фосфору Молекулярна вага 183 141 184 98 260 Ферментативна реакція змінює природу фосфоліпіду, відщеплюючи різні функціональні групи молекули. Функціональні групи і продукти розпаду в основному можуть розглядатися як "жирові речовини" і "фосфоровмісні речовини". Ферментативна реакція зменшує емульгувальні властивості одержаних фосфоліпідів таким чином, що при відділенні камеді від олії скорочуються втрати і зберігається олія. Ферменти, що виявляють активність у відношенні фосфоліпідів, зазвичай називають "фосфоліпазами". Класифікація фосфоліпаз основана на положенні в молекулі фосфоліпіду, з яким реагує фермент, і відомі типи фосфоліпаз PLA1, PLA2, PLC і PLD. Положення в молекулі фосфоліпіду, з якими взаємодіють різні типи фосфоліпаз, показані на фіг. 4. Фосфоліпаза В являє собою додатковий фермент, відомий в даній галузі техніки. Цей фермент відщеплює останню жирну кислоту в положенні Sn-1 або Sn-2 (фіг. 2) лізофосфоліпіду. Короткі відомості про різні фосфоліпази і продукти та здійснювані ними реакції викладені в таблиці 4. 9 96231 10 Таблиця 4 Фосфоліпаза А1 Фосфоліпаза А2 Фосфоліпаза В Фосфоліпаза С Фосфоліпаза D Жирові речовини Жирна кислота Жирна кислота Жирна кислота Діацилгліцерол Спирт Фосфоліпаза кожного типу має власну швидкість реакції і вимагає власних оптимальних умов реакції за параметрами рН, вмісту води і температури. PLA, що застосовується сама по собі, потребує час реакції не менше за 4 годин, в той час як PLC, що застосовується сама по собі, потребує час реакції близько однієї години. Відомо, що ферментативна обробка повинна відбуватися при рН менше або рівному 8, для зменшення небажаного омилення масла, але PLA має оптимальний для реакції рН 4,5, тоді як PLC має оптимальний для реакції рН 7,0. Також кожний з ферментів має різну термостійкість. Ферменти PLA денатурують приблизно при 50 °C, а ферменти PLC денатурують приблизно при 65 °C. Амінокислотні послідовності з активністю фосфоліпаз широко висвітлені в літературі і описані в патентах, і деякі з них відомі як такі, що мають активність відносно фосфоліпідів, присутніх в рослинних оліях. Все це відоме в даній галузі техніки. Одним з комерційних продуктів PLA1 з ферментативною активністю фосфоліпази є фосфолі® паза А1 фірми Novozymes (Lecitase Ultra). Як описано в інструкції з застосування Novozymes "Oils & Fats" № 2002-185255-01 і 2002-05894-03, цей продукт може змішуватися з дегумованою олією у 1-1,5 % водному цитрат-NaOH буфері при 4,5