Спосіб визначення аlрhа-томатиту в плодах томата різної стиглості

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано для диагностики плодов томата на содержание a-томатина. Известен экстракционно-фотометриче-ский метод определения содержания a-томатина в различных органах растения томата: в корнях, стеблях, листьях, цветках и плодах, включающий его экстракцию уксусной кислотой, окрашивание метилоранжем и установление концентрации веществ с помощью спектрофотометрирования [Ан-дрющенко В.К. Методы оптимизации биохимической селекции овощных культур. Кишинев, 1981, с.38]. Однако известный метод недостаточно точен для определения содержания a-томатина в плодах томата, так как в результате получают завышенные в несколько раз показатели. Это связано с образованием бурооранжевого комплекса метилоранжа с пигментами и/или их предшественниками. В основу изобретения поставлена задача повышения точности определения содержания a-томатина в плодах томата различной степени спелости. Для этого в процессе химического анализа, включающего экстракцию α-томатина уксусной кислотой, его окрашивание метилоранжем и установление концентрации веществ спектрофотометрировакием, из экстракта на плотный фильтр осаждают α-томатин концентрированным раствором аммиака при кислотности, равной рН 9,0-10,0, с последующим переводом концентрата в раствор уксусной кислоты. Введение концентрированного раствора аммиака при кислотности, равной рН 9,0-10,0, приводит 5 к осаждению a-томатина, что позволяет избавиться от сопутствующих пигментов, приводящих к завышению показателей содержания ct-томатина, т.е. выделить томатин в чистом виде и определить истинное его содержание в плодах. Способ осуществляется следующим образом. Навеску 0,5 г измельченного растительного материала помещают в коническую колбу емкостью 50 мл, заливают 25 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты и выдерживают в течение 17 ч при комнатной температуре. Затем экстрагируют на песочной бане с обратным холодильником в течение 1 ч от начала кипения, фильтруют в мерные колбы емкостью 25 мл и доводят до метки 5%-ным раствором уксусной кислоты, используемой для ополаскивания конической колбы. Фильтрат переносят в коническую колбу емкостью 50 мл и для удаления пигментов осаждают α-томатин концентрированным раствором аммиака при рН 9,0-10,0 (по лакмусной бумажке). Осаждение томатинового комплекса проводится в течение 16-20 ч. Осадок переносят на плотный фильтр (например, фильтровальная бумага с черной полоской или хроматографическая бумага для медленной разгонки), который помещают в стакан емкостью 250-300 мл, и смывают 25 мл 5%-ной уксусной кислоты путем перемешивания фильтра в растворе стеклянной палочкой и фильтруют. Затем 20 мл фильтрата помещают в коническую колбу емкостью 50 мл, приливают 3 мл концентрированной соляной кислоты (1-1,123). В течение 30 мин проводят гидролиз на песочной бане с обратным холодильником. Содержимое колбы охлаждают, доводят рН раствора до 3,0 сначала 50%-ным раствором (до показания рН 2,5), затем 1 %-ным раствором едкого натра (рН раствора проверяют на рНметре), приливают 2-3 мл 0,5%-ного водного раствора метилоранжа, после чего колбу встряхивают в течение 1 мин. Содержимое колбы переносят в делительную воронку, ополаскивая колбу хлороформом. Образовавшийся комплекс агликона с метилоранжем экстрагируют хлороформом. Хлороформные экстракты собирают в мерную колбу емкостью 25 мл, доводят до метки хлороформом и фильтруют через бумажный фильтр. Величину оптической плотности измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре (кювета - 10 мм, синий светофильтр), который предварительно настраивают на нулерое положение подготовленным холостым раствором. Для получения холостого раствора 25 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты в течение 1 ч кипятят на песочной бане. Затем к 2 мл раствора приливают 1,5 мл концентрированной соляной кислоты и кипятят 30 мин на песочной бане. Раствор охлаждают, доводят рН до 3,0 и добавляют 3 мл водного раствора метилоранжа, затем экстрагируют хлороформом в мерную колбу емкостью 25 мл. Расчет производят по формуле где X - количество α-томатина, %; а - количество томатидина, найденное по графику, мг; ν1 - объем уксуснокислого экстракта, мл; v2 - объем уксуснокислого экстракта, взятого для гидролиза, мл; v3 - объем хлороформного окрашенного раствора, мл; q - навеска растительного материала, г; 2,22 - коэффициент пересчета томатидина в a-томатин; 1,26 - поплавочный коэффициент на потери α-томатина при извлечении его в виде комплекса с аммиаком. Для построения калибровочного графика навеску томатидина в количестве 0,05 г растворяют хлороформом в мерной колбе емкостью 50 мл. Затем в делительные воронки вносят по 0,1-0,6 мл приготовленного раствора томатидина и по 2-3 мл 0,05%-но-го водного раствора метилоранжа, рН смеси доводят до 3,0 буфером (на 500 мл берут 10,5 г лимонной кислоты и 17,8 г натрия фосфорнокислого двузамещенного водного, доводят до метки дистиллированной водой). Образовавшееся окрашенное соединение экстрагируют хлороформом порциями по 5 мл. Хлороформные экстракты собирают в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре. Раствором сравнения служит хлороформ. Предложенным методом проверена эффективность выявления определенных количеств α-томатина из уксуснокислых растворов чистого реактива α-томатина (табл.1). Метод позволяет на 80% улавливать введенный в раствор a-томатин. Учитывая установленную погрешность, в формулу вычисления содержания α-томатина в растительном материале нами введен поправочный коэффициент, равный 1,26. Сравнительная характеристика двух методов показала, что экстракционно-фотометрический метод Тукало (в модификации) завышает содержание a-томатина в плодах молочной спелости в 2,0-3,6 раза, бурой - в 2,0-4,1, красной - в 4,1-6,2 раза (табл.2). Это связано с образованием буро-оранжевого комплекса метилоранжа с пигментами и/или их предшественники. Удаление пигментов при осаждении a-томатина аммиаком приводит при добавлении метилоранжа к окрашиванию хлороформного экстракта в золотистосоломенный цвет, что указывает на наличие a-томатина в растворе. При этом хлороформные экстракты из зрелых плодов томата имели те же максимумы поглощения, что и раствор чистого a-томатина.