Похідні 1,2,4-триазину для лікування вірусних інфекцій

Реферат: Даний винахід належить до похідних 1,2,4-триазину, способів їх одержання, фармацевтичних композицій і їх застосування для лікування вірусних інфекцій. UA 114644 C2 (12) UA 114644 C2 UA 114644 C2 5 10 15 20 25 30 Область техніки, до якої має відношення винахід Даний винахід має відношення до похідних 1,2,4-триазину, способів їх одержання, фармацевтичних композицій і їх застосування для лікування вірусних інфекцій. Даний винахід має відношення до застосування похідних 1,2,4-триазину для лікування вірусних інфекцій, імунних або запальних порушень, у які залучене модулювання або агонізм Toll-подібних рецепторів (TLR). Toll-подібні рецептори є первинними трансмембранними білками, що характеризуються позаклітинним доменом, багатим лейцином, і цитоплазматичним доменом, який містить консервативну область. Уроджена імунна система може розпізнавати патоген-асоційовані молекулярні патерни за допомогою цих TLR, що експресуються на клітинній поверхні певних типів клітин імунної системи. Розпізнавання чужорідних патогенів активує вироблення цитокінів і підвищувальну регуляцію костимулюючих молекул на фагоцитах. Це приводить до модулювання поведінки Т-клітин. Попередній рівень техніки Було встановлено, що в більшості видів ссавців існує від десяти до п'ятнадцяти типів Tollподібних рецепторів. Тринадцять TLR (позначених з TLR1 по TLR13) ідентифіковано в людини і мишей, і еквівалентні форми багатьох з них виявлені в інших видів ссавців. Однак еквіваленти певних TLR, виявлених у людини, не присутні у всіх ссавців. Наприклад, ген, що кодує білок, аналогічний TLR10 у людини, є присутнім у мишей, але виявився ушкодженим у якийсь момент у минулому ретровірусом. З іншого боку, миші експресують TLR 11, 12 і 13, жоден з яких не є присутнім у людини. Інші ссавці можуть експресувати TLR, які не виявлені в людини. В інших видів, що не належать до ссавців, можуть існувати TLR, що відрізняються від TLR ссавців, наприклад TLR14, який виявлений у рибі фугу Takifugu. Це може ускладнювати процес використання експериментальних тварин як моделей для вивчення вродженого імунітету в людини. Для огляду TLR дивися наступні статті в журналах. Hoffmann, J.A., Nature, 426, p33-38, 2003; Akira, S., Takeda, K., and Kaisho, T., Annual Rev. Immunology, 21, p335-376, 2003; Ulevitch, R.J., Nature Reviews: Immunology, 4, p512-520, 2004. Сполуки, що проявляють активність у відношенні Toll-подібних рецепторів, були описані раніше, наприклад, похідні пурину описані в WO 2006/117670, похідні аденіну в WO 98/01448 і WO 99/28321 і піримідини в WO 2009/067081. Однак існує гостра потреба в нових модуляторах Toll-подібних рецепторів, що володіють бажаною селективністю, більш високою активністю, більш високої метаболічною стабільністю й поліпшеним профілем безпеки в порівнянні зі сполуками попереднього рівня техніки. Відповідно до даного винаходу пропонується сполука формули (I) R1 H 35 40 45 50 O N N R2 N N NH 2 (1) або її фармацевтично прийнятна сіль, таутомер(и), сольват або поліморф, у якій: R1 представляє собою С1-6алкіл, арилалкіл або гетероарилалкіл, кожний з яких необов'язково заміщено одним або декількома замісниками, незалежно обраними з галогену, гідроксилу, аміно, С1-6алкілу, ди-(С1-6)алкіламіно, С1-6алкіламіно, С1-6алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, гетероциклу, арилу, алкенілу, алкинілу, арилалкілу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу. R2 представляє собою С1-8алкіл, необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, незалежно обраними з галогену, гідроксилу, аміно, С 1-3алкілу, С1-3алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, ди-(С1-6)алкіламіно, С1-6алкіламіно, арилу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу. У першому варіанті здійснення в даному винаході пропонуються сполуки формули (I), у якій R2 представляє собою бутил або пентил, і в якій R1 є таким, як зазначено вище. У наступному варіанті здійснення винахід належить до сполук формули (I), у якій R2 представляє собою С1-8алкіл, заміщений гідроксилом, і в якій R1 представляє собою заміщену або незаміщену арилалкільну групу. У наступному варіанті здійснення даний винахід належить до сполук формули (I), у якій R 1 представляє собою арилалкіл, і R2 представляє собою С1-8алкіл, заміщений гідроксилом, або один з наступних прикладів у будь-якій стереохімічній конфігурації: 1 UA 114644 C2 OH HO 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 HO OH Крім того, у даному винаході також пропонуються сполуки формули (I), у якій R1 представляє собою CH3, і R2 є таким, як зазначено вище. В іншому варіанті здійснення в даному винаході пропонуються сполуки формули (I), у якій R 1 представляє собою гетероарилалкіл, і в якій R2 є таким, як зазначено вище. Сполуки формули (I) і їх фармацевтично прийнятна сіль, таутомер(и), сольват або поліморф мають активність у якості фармацевтичних засобів, зокрема, у якості модуляторів активності Toll-подібних рецепторів (особливо TLR7 і/або TLR8). У наступному аспекті в даному винаході пропонується фармацевтична композиція, що містить сполуку формули (I) або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват або поліморф разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами, розріджувачами або носіями. Крім того, сполука формули (I) або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват або поліморф відповідно до даного винаходу, або фармацевтичну композицію, що містить зазначену сполуку формули (I) або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват або поліморф, можна застосовувати в якості лікарського засобу. Інший аспект винаходу полягає в тому, що сполука формули (I) або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват або поліморф, або зазначену фармацевтичну композицію, що містить зазначену сполуку формули (I) або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват або поліморф, можна застосовувати відповідним чином для лікування порушення, у яке залучене модулювання TLR7 і/або TLR8. Термін "алкіл" має відношення до насиченого аліфатичного вуглеводню з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що містить певне число атомів вуглецю. Термін "галоген" має відношення до фтору, хлору, брому або йоду. Термін "алкеніл" має відношення до алкілу, як визначено вище, що складається, щонайменше, із двох атомів вуглецю й, щонайменше, одного вуглець-вуглецевого подвійного зв'язку. Термін "алкиніл" має відношення до алкілу, як визначено вище, що складається, щонайменше, із двох атомів вуглецю й, щонайменше, одного вуглець-вуглецевого потрійного зв'язку. Термін "циклоалкіл" має відношення до карбоциклічного кільця, що містить певне число атомів вуглецю. Термін "арил" означає ароматичну кільцеву структуру, що необов'язково містить один або два гетероатоми, обрани з N, O і S, зокрема, з N і О. Зазначена ароматична кільцева структура може містити 4, 5, 6 або 7 кільцевих атомів. Зокрема, зазначена ароматична кільцева структура може містити 5 або 6 кільцевих атомів. Термін "гетероарил" означає ароматичну кільцеву структуру, як визначено для терміна "арил", що містить, щонайменше, 1 гетероатом, обраний з N, O і S, зокрема, з N і О. Термін "біциклічний гетероцикл" означає ароматичну кільцеву структуру, як визначено для терміна "арил", що складається із двох конденсованих ароматичних кілець. Кожне кільце необов'язкове складається з гетероатомів, обраних з N, O і S, зокрема, з N і О. Термін "арилалкіл" означає ароматичну кільцеву структуру, як визначено для терміна "арил", необов'язково заміщену алкільною групою. Термін "гетероарилалкіл" означає ароматичну кільцеву структуру, як визначено для терміна "гетероарил", необов'язково заміщену алкільною групою. Термін "алкокси" має відношення до алкільної групи (яка містить вуглець і водень у ланцюзі), пов'язаної з киснем простим зв'язком, таким як, наприклад, метоксигрупа або етоксигрупа. "Гетероцикл" має відношення до молекул, які є насиченими або частково насиченими, і включає етилоксид, тетрагідрофуран, диоксан або інші циклічні ефіри. Гетероцикли, що містять азот, включають, наприклад, азетидин, морфолін, піперидин, піперазин, піролідин і т.п. Інші гетероцикли включають, наприклад, тіоморфолін, диоксолінил і циклічні сульфони. "Гетероарильні" групи є гетероциклічними групами, які є ароматичними по своїй природі. Зазначені групи є моноциклічними, біциклічними або поліциклічними, що містять один або декілька гетероатомів, обраних з N, O або S. Гетероарильні групи можуть бути, наприклад, 2 UA 114644 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імідазолілом, ізоксазолілом, фурилом, оксазолілом, піролилом, піридонілом, піридилом, піридазинілом або піразинілом. Фармацевтично прийнятні солі сполук формули (I) включають їх солі приєднання кислоти й солі приєднання основи. Придатні солі приєднання кислоти отримані з кислот, які утворюють нетоксичні солі. Придатні солі приєднання основи отримані з основ, які утворюють нетоксичні солі. Сполуки за винаходом можуть також існувати в несольватованій і сольватованій формах. Термін "сольват" використовується тут для опису молекулярного комплексу, що містить сполуку за винаходом й одну або кілька молекул фармацевтично прийнятного розчинника, наприклад, етанолу. Термін "поліморф" має відношення до здатності сполуки за винаходом існувати в більш ніж одній формі або кристалічній структурі. Сполуки за даним винаходом можуть бути введені у вигляді кристалічних або аморфних продуктів. Вони можуть бути отримані, наприклад, у вигляді пресованої маси, порошків або плівок за допомогою способів, таких як осадження, кристалізація, ліофілізація, сушіння розпиленням або сушіння випарюванням. Вони можуть бути введені окремо або в комбінації з одним або декількома іншими сполуками за винаходом, або в комбінації з одним або декількома іншими лікарськими засобами. Як правило, їх уводять у вигляді лікарської форми в комбінації з однією або декількома фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами. Термін "допоміжна речовина" використовується тут для опису будь-якого інгредієнта, відмінного від сполуки(сполук) за винаходом. Вибір допоміжної речовини в значній мірі залежить від факторів, таких як конкретний спосіб уведення, дія допоміжної речовини на розчинність і стабільність, а також природа лікарської форми. Сполуки за даним винаходом або будь-яку їхню підгрупу можна формулювати у вигляді різних фармацевтичних форм для цілей уведення. У якості придатних композицій можна згадати всі композиції, звичайно застосовувані для системного введення лікарських засобів. Для одержання фармацевтичних композицій за даним винаходом, ефективна кількість конкретної сполуки, необов'язково у формі солі приєднання як активного інгредієнта комбінують у вигляді однорідної суміші з фармацевтично прийнятним носієм, який може мати різноманітні форми залежно від форми препарату, необхідного для введення. Ці фармацевтичні композиції бажані у вигляді одиничної лікарської форми, наприклад для перорального, ректального або черезшкірного введення. Наприклад, при одержанні композицій у вигляді пероральної лікарської форми може бути використана будь-яке зі звичайних фармацевтичних середовищ, таких як, наприклад, вода, гліколі, олії, спирти й таке інше, у випадку пероральних рідких препаратів, таких як суспензії, сиропи, еліксири, емульсії й розчини; або твердих носіїв, таких як крохмалі, цукри, каолін, розріджувачі, речовини, що змащують зв'язуючі речовини, дезінтегруючі агенти й таке інше, в випадку порошків, пігулок, капсул і таблеток. Завдяки легкості їх уведення, таблетки й капсули є найбільш придатні пероральні стандартні лікарські форми, і в цьому випадку, безсумнівно, використовують тверді фармацевтичні носії. Також включеними є препарати у твердій формі, які можуть бути перетворені безпосередньо перед застосуванням у рідкі форми. У композиціях, що придатні для черезшкірного введення, носій необов'язково містить посилюючий проникнення агент і/або придатний змочувальний агент, необов'язково в комбінації з невеликими кількостями придатних добавок будь-якої природи, які не виявляють значного шкідливого впливу на шкіру. Зазначені добавки можуть сприяти введенню в шкіру й/або можуть бути корисними для одержання необхідних композицій. Ці композиції можна вводити різними шляхами, наприклад, у вигляді трансдермального пластиру, нанесенням плям або у вигляді мазі. Сполуки за даним винаходом можна також уводити шляхом інгаляції або інсуфляції за допомогою способів і лікарських форм, використовуваних у даній області для введення за допомогою такого шляху. Таким чином, у цілому, сполуки за даним винаходом можуть бути введені в легені у формі розчину, суспензії або сухого порошку. Особливо переважно формулювати зазначені вище фармацевтичні композиції у вигляді стандартної лікарської форми для полегшення введення й однорідності дозування. Стандартна лікарська форма, використовувана тут, належить до фізично дискретних одиниць, що придатні у якості стандартних доз, причому кожна стандартна доза містить попередньо визначену кількість активного інгредієнта, обчислену для одержання бажаного терапевтичного ефекту, у комбінації з необхідним фармацевтичним носієм. Прикладами таких стандартних лікарських форм є таблетки (у тому числі таблетки з рисками або таблетки, покриті оболонками), капсули, пігулки, пакетики порошків, облатки, супозиторії, розчини або суспензії для ін'єкцій і таке інше і їх сегреговані множини. Фахівець із лікування інфекційних захворювань зможе легко визначити ефективну кількість 3 UA 114644 C2 5 10 15 20 25 30 на підставі результатів тестів, представлених тут далі. Як правило, передбачається, що ефективна добова кількість буде становити від 0,01 мг/кг до 50 мг/кг маси тіла, більш переважно, від 0,1 мг/кг до 10 мг/кг маси тіла. Може бути кращим уводити необхідну дозу у вигляді двох, трьох, чотирьох або більш субдоз через відповідні інтервали протягом доби. Зазначені субдози можуть бути формульовані у вигляді стандартних лікарських форм, наприклад, що містять від 1 до 1000 мг і, зокрема, від 5 до 200 мг активного інгредієнта на стандартну лікарську форму. Точне дозування й частота введення залежать від конкретного застосовуваного сполуки формули (I), конкретного стану, що піддається лікуванню, тяжкості стану, що піддається лікуванню, віку, маси й загального фізичного стану конкретного пацієнта, а також інших лікарських засобів, які може приймати пацієнт, що добре відомо фахівцеві в даній області. Крім того, очевидно, що ефективна кількість може бути зменшена або збільшена залежно від реакції пацієнта, що піддається лікуванню й/або залежно від оцінки лікаря, що призначає сполуки за даним винаходом. Таким чином, зазначені вище діапазони ефективних кількостей є тільки рекомендованими й не передбачають обмеження в якому-небудь ступені об'єму або застосування даного винаходу. Одержання сполук формули (I) Експериментальна частина Одержання сполуки 2 Br2, H2O, У розчин сполуки 1 (20 г, 176,9 ммоль, 1 екв.) у Н 2О (320 мо) додавали Br2 (24 мл, 466,8 ммоль, 2,6 екв.) за кімнатної температури. Суміш перемішували при 60 °C протягом 15 годин з наступним додаванням NH4OH (50 мл) за кімнатної температури. Потім повільно додавали HCl (6N водяний розчин) до рН=5 і суміш екстрагували етилацетатом (3×800 мл). Об'єднані органічні шари промивали водою й сольовим розчином, сушили (MgSO 4), тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинники фільтрату концентрували за зниженого тиску з одержанням сполуки 2 (16 г). 1 H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6)δ ppm 12,56 (m, 1 H), 12,31 (m, 1 H) Одержання сполуки 3 35 40 У розчин сполуки 2 (16 г, 83,3 ммоль) в POCI3 (80 мл) додавали PCI5 (36,1 г, 173,4 ммоль) і N,N-Диетиланілін (35 мл, 221,7 ммоль) за кімнатної температури. Суміш перемішували при 120 °C протягом 5 годин, потім надлишковий розчинник видаляли за зниженого тиску. Залишок, сполука 3 (80 г), використовували безпосередньо на наступній стадії без додаткового очищення. Одержання сполуки 4 4 UA 114644 C2 HO NH 2 HCl (S) 4 5 10 15 20 25 Проміжну сполуку 4 синтезували відповідно до способу одержання сполуки 9, використовуючи бутиральдегід замість валеральдегіда. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): ppm 8,07 (s, 3H), 4,85 (br, 1 H), 3,57-3,45 (m, 2H), 3,14-3,12 (m, 1 H), 1,70-1,64 (m, 2H), 1,56-1,49 (m, 2H), 1,38-1,30 (m, 2H), 0,90-0,80 (t, J=6.8 Гц, 3H). Одержання сполуки 5 У перемішаний розчин сполуки 3 (80 г, сирий, 82,8 ммоль) в CH 2CI2 (300 мл) додавали сполуку 4 (12,8 г, 82,8 ммоль) і Et3N (34,7 мл, 250 ммоль) за кімнатної температури. Суміш перемішували протягом 15 годин за кімнатної температури. Реакційну суміш розбавляли водою (400 мл) і екстрагували CH2CI2 (3 × 500 мл). Об'єднані органічні шари промивали водою й сольовим розчином (MgSО4), тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинники з фільтрату видаляли за зниженого тиску. Залишок очищали колоночною хроматографією на силікагелі з використанням градієнта від петролейного ефіру до етилацетату. Кращі фракції поєднували, і розчинники видаляли за зниженого тиску з одержанням сполуки 5 (3 г). 1H ЯМР (400 МГц, CDCI3):δ ppm 6,85 (d, 1 H), 4,35 (m, 1 H), 3,83 (m, 2 H), 2,0 (m, 1 H), 1,71 (m, 3 H), 1,38 (m, 2 H), 0,98 (t, 3H). Одержання сполуки 6 Сполука 5 (3 г, 11,32 ммоль, 1 екв.) і NH4OH (20 мл) в THF (20 мл) поміщали в герметичну пробірку й нагрівали до 100 °C протягом 18 годин. Після охолодження до кімнатної температури реакційну суміш розбавляли водою й екстрагували етилацетатом (3 × 50 мл). Об'єднані 5 UA 114644 C2 5 органічні шари промивали сольовим розчином, сушили (MgSО 4), тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинник фільтрату концентрували за зниженого тиску. Залишок очищали колоночною хроматографією на силікагелі з використанням градієнта від CH 2CI2 до CH2CI2/CH3OH. Кращі фракції поєднували й розчинники з фільтрату видаляли за зниженого тиску з одержанням сполуки 6 (1,56 г). 1H ЯМР (400 МГц, CDCI3):δ ppm 5,65 (d, 1 H), 5,20 (brs, 2 H), 4,35 (m, 1 H), 3,65 (m, 2 H), 2,0 (m, 1 H), 1,60 (m, 3 H), 1,45 (m, 2 H), 0,93 (t, 3H). Одержання сполуки 8 10 15 20 25 Суміш сполуки 6 (1,2 г, 4,9 ммоль), сполуки 7 (4,13 г, 24,4 ммоль) і t-BuOK (1,6 г, 14,7 ммоль) у диоксані (48 мл) перемішували при 120 °C у мікрохвильовій печі протягом 1 години. Тверді речовини видаляли з розчину шляхом фільтрації, і фільтрат концентрували за зниженого тиску. Залишок очищали препаративною високоефективною рідинною хроматографією (стовпчик С18) з використанням градієнта від води (яка містить 0,05 N водяний розчин NH 3 у якості модифікатора) до ацетонітрилу. Бажані фракції поєднували, і розчинники видаляли за зниженого тиску з одержанням сполуки 8 (100 мг). 1H ЯМР (400 МГц, метанол-d4):δ ppm 8,56 (d, 1 H), 7,73 (d, 1 H), 5,69 (s, 2 H), 4,54 (m, 1 H), 4,25 (s, 3 H), 4,06 (s, 3 H), 3,65 (m, 2 H), 1,75 (m, 4 H), 1,35 (m, 2 H), 0,94 (t, 3H). Загальна схема одержання сполуки 9 Одержання проміжної сполуки 9а 6 UA 114644 C2 5 10 У розчин валеральдегіда (43 г, 500 ммоль) в THF (1 л) додавали (третбутоксикарбонілметилен)трифенілфосфоран (200 г, 532 ммоль), і реакційну суміш перемішували протягом 16 год. за кімнатної температури. Розчинник видаляли за зниженого тиску, і залишок розбавляли петролейним ефіром і фільтрували. Розчинники з фільтрату видаляли за зниженого тиску, і залишок очищали хроматографією на силікагелі з використанням градієнта від петролейного ефіру до 3 % етилацетату в петролейному ефірі з одержанням проміжної сполуки 9а (90 г) у вигляді безбарвної олії. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCI3):δ ppm 6,81-6,77 (m, 1 H), 5,68-5,64 (td, J=1,2 Гц, 15,6 Гц, 1 H), 2,112,09 (m, 2H), 1,406 (s, 9H), 1,38-1,26(m, 4H), 0,85-0,81 (t, J=7,2 Гц, 3H). Одержання сполуки 9b 15 20 25 н-Бутиллітію (290 мл, 725 ммоль) додавали в перемішаний розчин (S)-(-)-N-бензил-1фенілетиламіну (165 г, 781 ммоль) в THF (800 мл) при -78 °C. Реакційну суміш перемішували протягом 30 хвилин, потім додавали проміжну сполуку 9a (90 г, 488,4 ммоль) в THF (400 мл), і реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при -78 °C. Суміш потім гасили насиченим водяним розчином NH4CI і нагрівали до кімнатної температури. Продукт розділяли між етилацетатом і водою. Органічну фазу промивали сольовим розчином, сушили над сульфатом магнію, тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинники з фільтрату видаляли за зниженого тиску. Залишок очищали колоночною хроматографією, елююючи 5 % етилацетатом у петролейному ефірі, з одержанням безбарвної олії 9b (132 г). 1 H ЯМР (400 МГц, CDCI3):δ ppm 7,36-7,16 (m, 10H), 3,75-3,70 (m, 2H), 3,43-3,39 (d, J=15,2 Гц, 1 H), 3,33-3,15 (m, 1 H), 1,86-1,80 (m, 2H), 1,47-1,37 (m, 2H), 1,32 (s, 9H), 1,26-1,17 (m, 7H), 0,830,79 (t, J=7,2 Гц, 3H). Одержання сполуки 9с 30 7 UA 114644 C2 5 10 Сполуку 9b (130 г, 328 ммоль) розчиняли в THF (1,5 л) і малими порціями додавали LiAIH 4 (20 г, 526 ммоль) при 0 °C. Отриману суміш перемішували при цій же температурі протягом 2 годин і потім залишали нагріватися до кімнатної температури. Суміш гасили насиченим водяним розчином NH4CI. Продукт розділяли між етилацетатом і водою. Органічну фазу промивали сольовим розчином, сушили й випарювали. Об'єднані органічні шари сушили над сульфатом натрію, тверді речовини видаляли шляхом фільтрації й концентрували з одержанням сирої сполуки 9с (100 г), яку використовували на наступній стадії без додаткового очищення. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCI3):δ ppm 7,33-7,14 (m, 10H), 3,91-3,86 (m, 1 H), 3,80-3,77 (d, J=13,6 Гц, 1 H), 3,63-3,60 (d, J=13,6 Гц, 1 H), 3,43-3,42 (m, 1 H), 3,15-3,10 (m, 1 H), 2,70-2,63 (m, 2H), 1,651,28 (m, 10H), 0,89-0,81 (m, 3H). Одержання сполуки 9 15 20 Розчин сполуки 9с (38 г, 116,75 ммоль) і 10 % Pd/C у метанолі (200 мл) гідрували під тиском 50 psi при 50 °C протягом 24 годин. Реакційну суміш фільтрували, і розчинник випарювали з одержанням сполуки 9. 1 H ЯМР (400 МГц, Dmso-d6):δ ppm 8,04 (s, 3H), 3,60-3,49 (m, 2H), 3,16-3,15 (m, 1 H), 1,71-1,67 (m, 2H), 1,60-1,55(m, 2H), 1,33-1,26 (m, 4H), 0,90-0,87 (t, J=6,8 Гц, 3H). Одержання сполуки 10 25 30 35 У перемішаний розчин сполуки 3 (21,6 г, сирої, 22,1 ммоль) в CH 2CI2 (54 мл) додавали сполуку 9 (2,9 г, 22,1 ммоль) і Et3N (9,2 мл, 66,3 ммоль) за кімнатної температури. Суміш потім перемішували протягом ночі за цієї ж температури. Реакційну суміш розбавляли водою (200 мл) і екстрагували CH2CI2 (3 × 150 мл). Об'єднані органічні шари промивали водою й сольовим розчином, сушили (MgSО4), тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинники фільтрату концентрували за зниженого тиску. Сирий продукт очищали колоночною хроматографією на силікагелі з використанням градієнта від петролейного ефіру до етилацетату. Кращі фракції поєднували, і розчинники видаляли за зниженого тиску з одержанням сполуки 10 (0,91 г). 1 H ЯМР (400 МГц, CDCI3)δ ppm 6,71 (d, 1 H), 4,36 (m, 1 H), 3,83 (m, 2 H), 2,04 (m, 2 H), 1,70 8 UA 114644 C2 (m, 2 H), 1,35 (m, 4 H), 0,92 (t, 3H). Одержання сполуки 11 5 10 15 20 25 Сполуку 10 (0,91 г, 3,3 ммоль, 1 екв.) і гідроксид амонію (7 мл) в THF (7 мл) поміщали в герметичну пробірку й нагрівали до 110 °C протягом 12 годин. Після охолодження до кімнатної температури реакційну суміш розбавляли водою й екстрагували етилацетатом (3×150 мл). Об'єднані органічні шари промивали сольовим розчином, сушили (MgSО 4), тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинники з фільтрату видаляли за зниженого тиску. Залишок очищали препаративною тонкошаровою хроматографією з використанням 10 % метанолу в дихлорметані з одержанням 170 мг сполуки 11. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCI3)δ ppm 5,67 (d, 1 H), 5,29 (d, 2 H), 4,17 (m, 1 H), 3,66 (m, 2 H), 2,51 (brs, 1 H), 1,88 (m, 1 H), 1,55 (m, 3 H), 1,25 (m, 4 H), 0,83 (t, 3H). Одержання сполуки 12 Суміш сполуки 11 (170 мг, 0,64 ммоль) і метоксиду натрію (69 мг, 1,28 ммоль) в CH 3OH (10 мл) нагрівали до 100 °C у мікрохвильовій печі при перемішуванні протягом 1 години. Тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і фільтрат концентрували за зниженого тиску. Залишок очищали препаративною високоефективною рідинною хроматографією (стовпчик С18 з використанням градієнта ацетонітрилу у воді, що містить 0,05 % HCI). Кращі фракції поєднували й концентрували у вакуумі з одержанням сполуки 12. LC-MS m/z=256 (M+H). 1 H ЯМР (400 МГц, MeOH-d4)δ ppm 4,49 (m, 1 H), 4,02 (s, 3 H), 3,63 (m, 2 H), 1,84 (m, 2 H), 1,68 (m, 2 H), 1,33 (m, 4 H), 0,93 (t, 3H). Одержання сполуки 13 9 UA 114644 C2 Проміжну сполуку 13 одержували відповідно до способу одержання сполуки 5. Одержання сполуки 14 5 Проміжну сполуку 14 одержували відповідно до способу одержання сполуки 6. Одержання сполуки 15 10 15 20 У герметичній пробірці перемішували суміш сполуки 14 (100 мг, 0,5 ммоль), бензилового спирту (0,52 мл, 5 ммоль) і карбонату цезію (814,5 мг, 2,5 ммоль) у безводному THF (1 мл) при 100 °C протягом 24 годин. Реакційну суміш розбавляли водою (1 мл) і екстрагували етилацетатом (3×10 мл). Об'єднані органічні екстракти промивали водою й сольовим розчином, сушили (MgSО4), тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, і розчинники з фільтрату видаляли за зниженого тиску. Сирий продукт очищали хроматографією на силікагелі з використанням градієнта від петролейного ефіру до етилацетату з одержанням жовтої олії 15 (67,7 мг, 0,25 ммоль). Одержання 16 N H2N N H N N O O 16 Сполуку 16 одержували у відповідності зі способом одержання сполуки 15. 25 10 UA 114644 C2 Таблиця 1 Сполуки формули (I). Наступні сполуки були синтезовані відповідно до одним зі способів, описаних вище № Структура Н ЯМР 1 Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 8.56 (d, 1H), 7,73 (d, 1H), 5,69 (s, 2H), 4,54 (m, 1H), 4,25 (s, 3H), 4,06 (s, 3H), 3,65 (m, 2H), 1,75 (m, 4H), 1,35 (m, 2H), 0,94 (t, 3H), А, 3,30 здатних до обміну протонів не спостерігається HO (S) N H 2N NH 8 N N Метод LC, Виявлена Час утримання маса (М+Н) (хв.) O O 379 O N 1 Н ЯМР (400 МГц, МеОН-d4) δ ppm 4,49 (m, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,63 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,33 (m, 4H), 0,93 (t, 3H), здатних до А, 3,55 обміну протонів не спостерігається HO (S) 12 H2 N N N N NH O N N H 2N N Н ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,48 (d, J=7,25 Гц, 2Н), 7,35-7,42 (m, 3H), 7,27-7,34 (m, 1H), 5,71 (s, 2H), 5,32 (s, 2H), 3,23-3,35 (m, 2H), 1,51 В, 2,61 (quin, J=7,25 Гц, 2H), 1,201,33 (m, 2H), 0,88 (t, J=7,25 Гц, 3Н) O N 15 1 H N N H2 N 256 1 H N N 274 O 16 O Н ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,25 (t, J=5,67 Гц, 1Н), 7,14 (d, J=8,51 Гц, 2Н), 6,84 (d, J=8,51 Гц, 2Н), 5,66 (s, 2H), 4,16 (t, J=6,46 Гц, 2Н), 3,71 (s, 3H), 3,26-3,35 (m, 2H), В, 2,79 2,69 (t, J=7,57 Гц, 2Н), 1,952,03 (m, 2H), 1,48-1,56 (m, 2H), 1,25-1,33 (m, 2H), 0,89 (t, J=7,41 Гц, 3Н) 332 1 17 H 2N N N N H N O Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 0,96 (t, J=7,4 Гц, 3H), 1,33-1,45 (m, 2H), 1,571,71 (m, 2H), 3,53 (t, J=7,3 Гц, A, 3,26 2H), 3,99 (s, 3H), здатних до обміну протонів не спостерігається 11 198 UA 114644 C2 1 N H 2N 18 N H N N O N H 2N N 19 H N N O O N H 2N N 20 H N N O F N H 2N N 21 H N N O N N H 2N 22 N H N N O O Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 0,99 (t, J=7,4 Гц, 3Н), 1,35-1,44 (m, 2H), 1,44 (d, J=1,0 Гц, 6Н), 1,59-1,75 (m, 2H), 3,55 (t, J=7,4 Гц, 2Н), 5,07-5,22 (m, 1H), здатних до обміну протонів не спостерігається 1 Н ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ ppm 0,86 (t, J=7,3 Гц, 3H), 1,23-1,36 (m, 2H), 1,44-1,56 (m, 2H), 3,273,37 (m, 2H), 3,77 (s, 3H), 4,44 (br.s., 2H), 5,36 (s, 2H), 5,47 (br.s., 1H), 6,81-6,93 (m, 2H), 7,27 (td, J=7,9, 1,8 Гц, 1H), 7,32 (dd, J=7,3, 1,5 Гц, 1H) 1 Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 0,97 (t, J=7,4 Гц, 3Н), 1,32-1,45 (m, 2H), 1,581,69 (m, 2H), 3,53 (t, J=7,3 Гц, 2H), 5,45 (s, 2H), 7,13-7,21 (m, 1H), 7,25 (td, J=7,5, 1,0 Гц, 1Н), 7,41-7,49 (m, 1H), 7,61 (td, J=7,5, 1,8 Гц, 1H, здатних до обміну протонів не спостерігалося 1 Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 0,96 (t, J=7,4 Гц, 3H), 1,33-1,47 (m, 2H), 1,601,73 (m, 2H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 5,65 (s, 2H), 8,20 (dd, J=7,9, 5,9 Гц, 1H), 8,86 (d, J=7,8 Гц, 1H), 8,92 (d, J=5,5 Гц, 1H), 9,17 (s, 1H), здатних до обміну протонів не спостерігалося 1 Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 0,97 (t, J=7,4 Гц, 3H), 1,34-1,45 (m, 2H), 1,65 (t, J=7,4 Гц, 2H), 3,54 (t, J=7,3 Гц, 2Н), 3,79 (dd, J=5,3, 3,5 Гц, 2H), 4,40-4,47 (m, 2H), здатних до обміну протонів не спостерігалося A, 3,94 226 C, 3,38 304 З, 3,36 292 D, 4,34 275 D, 3,99 242 Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 0,98 (t, J=7,4 Гц, 3H), 1,42 (dd, J=15,1, 7,3 Гц, 2H), 1,64 (quin, J=7,4 Гц, 2H), 3,40-3,52 (m, 2H), 4,62 (br.s., 2H), 4,81 (br.s., 1H), 5,41-5,53 A, 2,91 (m, 2H), 7,34-7,47 (m, 1H), 7,60 (d, J=7,8 Гц, 1H), 7,89 (td, J=7,8, 1,8 Гц, 1H), 8,57 (d, J=4,5 Гц, 1H) 275 1 23 12 UA 114644 C2 1 Н ЯМР (400 МГц, метанолd4) δ ppm 1,00 (t, J=7,4 Гц, 3H), 1,34-1,51 (m, 2H), 1,70 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,31 (dd, J=10,0, 5,5 Гц, 2H), 2,89-3,00 (m, 6H), 3,39-3,47 (m, 2H), 3,59 (t, J=7,4 Гц, 2H), 4,44 (t, D, 4,6 J=5,8 Гц, 2Н), здатних до обміну протонів не спостерігалося 24 5 Аналітичні способи Усі сполуки характеризували за допомогою LC-MS (рідинна хроматографія - масспектрометрія) відповідно до таких способів LC-MS. Спосіб А Стовпчик Рухлива фаза Швидкість потоку Довжина хвилі Температура стовпчика MS полярність LC-MS 10 15 269 YMC-PACK ODS-AQ, 50×2,0 мм 5 мкм А: H2O (0,1 % TFA) B: CH3CN (0,05 % TFA) Час (хв.) А% В% 0 100 0 1 100 0 5 40 60 7,5 40 60 8 100 0 0,8 мл/хв. УФ 220 нм 50 °C позитивна Agilent 1100 Спосіб В Обернено-фазова надпродуктивна рідинна хроматографія (UPLC) на колонці Waters Acquity BEH (гібрид мостиковий етилсилоксан/оксид кремнію) С18 (1,7 мкм, 2,1×100 мм) при швидкості потоку 0,343 мл/хв. Дві рухливі фази (рухлива фаза А: 95 % 7 мм ацетат амонію / 5 % ацетонітрил; рухлива фаза В: 100 % ацетонітрил) використовували для проходження умов градієнта від 84,2 % А і 15,8 % В (утримання протягом 0,49 хвилин) до 10,5 % А і 89,5 % B за 2,18 хвилин, утримання протягом 1,94 хв. і повернення до первинних умов за 0,73 хв., утримання протягом 0,73 хвилин. Використовували об'єм упорскування 2 мкл. Напруга на конусі становила 20 В для режиму позитивної й негативної іонізації. Мас-спектр одержували при скануванні від 100 до 1000 за 0,2 секунди з використанням інтервалу сканування 0,1 секунди. Спосіб С 13 UA 114644 C2 Стовпчик Рухлива фаза Швидкість потоку Довжина хвилі Температура стовпчика MS полярність LC-MS YMC-PACK ODS-AQ, 50×2,0 мм 5 мкм А: H2O (0,1 % TFA) B: CH3CN (0,05 % TFA) Час (хв.) А% В% 0 90 10 0,8 90 10 4,5 20 80 7,5 20 80 8 90 10 0,8 мл/хв. УФ 220 нм 50 °C позитивна Agilent 1100 Спосіб D Стовпчик Рухлива фаза Швидкість потоку Довжина хвилі Температура стовпчика MS полярність LC-MS Ultimate XB-C18, 50×2,1 мм 5 мкм C: H2O (10 ммоль/л NH4HCO3) D: CH3CN Час (хв.) C% 0 100 1 100 5 40 7,5 40 8 100 0,8 мл/хв. УФ 220 нм 50 °C позитивна Agilent 1100 D% 0 0 60 60 0 5 10 15 20 25 30 Біологічна активність сполук формули (I) Опис біологічних аналізів Оцінка активності TLR7 і TLR8 Здатність сполук активувати TLR7 і TLR8 людини оцінювали в клітинному аналізі активності репортерного гена з використанням клітин НЕK293, транзиентно трансфікованих експресійним вектором TLR7 або TLR8 і репортерною конструкцією NFkB-люцифераза. Коротко, клітини НЕK293 вирощували в культуральному середовищі (DMEM, доповненому 10 % FCS і 2 мМ глутаміну). Для трансфекції клітин у чашках діаметром 10 см клітини відкріплювали за допомогою трипсину-EDTA, трасфікували сумішшю плазміди CMV-TLR7 або TLR8 (750 нг), плазміди NFkB-Люцифераза (375 нг) і реагенту для трасфекції, і інкубували протягом ночі при 37 °C у зволоженій атмосфері 5 % CО2. Трансфіковані клітини потім відкріплювали за допомогою трипсину-EDTA, промивали в PBS і ресуспендували в середовищі до щільності 1,67×105 клітин/мл. Потім тридцять мікролітрів клітин вносили в кожну лунку 384ямкових планшетів, де вже було присутнє 10 мкл сполуки в 4 % DMSO. Після 6 годин інкубації в 5 % CО2 при 37 °C активність люциферази визначали шляхом додавання в кожну лунку 15 мкл субстрату Steady Lite Plus (Perkin Elmer) і зчитування виконували на обладнанні для візуалізації мікропланшетів Viewlux ultrahts (Perkin Elmer). Криві залежності доза-ефект будували на основі вимірювань, проведених у чотирьох повторностях. Для кожної сполуки визначали величини найнижчих ефективних концентрацій (LEC), які визначені як концентрація, яка викликає ефект, який щонайменше, у два рази перевищує стандартне відхилення в аналізі. Токсичність сполуки визначали паралельно з використанням однакових серій розведень сполуки з 30 мкл на лунку клітин, трансфікованих тільки конструкцією CMV-TLR7 (1,67×105 клітин/мл) в 384-ямкових планшетах. Життєздатність клітин вимірювали через 6 годин інкубації в 5 % CО2 при 37 °C шляхом додавання 15 мкл ATP lite (Perkin Elmer) на лунку й зчитування виконували на обладнанні для візуалізації мікропланшетів Viewlux ultrahts (Perkin Elmer). Дані представлені як СС50. 14 UA 114644 C2 5 10 15 20 25 30 Паралельно використовували однакові серії розведень сполуки (10 мкл сполуки в 4 % DMSO) з 30 мкл на лунку клітин, трансфікованих тільки репортерною конструкцією NFkBЛюцифераза (1,67×105 клітин/мл). Після 6 годин інкубації в 5 % CО2 при 37 °C активність люциферази визначали шляхом додавання 15 мкл субстрату Steady Lite Plus (Perkin Elmer) у кожну лунку й зчитування виконували на обладнанні для візуалізації мікропланшетів Viewlux ultrahts (Perkin Elmer). Дані зворотного скринінгу представлені як LEC. Активація елементів ISRE у промоторах Здатність сполук індукувати IFN-I також оцінювали шляхом вимірювання активації інтерферон-стимульованих реагуючих елементів (ISRE) кондиціонованим середовищем з PBMC. Елемент ISRE послідовності GAAACTGAAACT є високо реагуючим на транскрипційний фактор STAT1-STAT2-IRF9, активований при зв'язуванні IFN-I з його рецептором IFNAR (Clontech, PT3372-5W). Плазміда pISRE-люцифераза від фірми Clontech (номер за каталогом 631913) містить 5 копій цього елемента ISRE, за якими іде ORF люциферази світлячка. Лінію клітин HEK293, стабільно трансфіковану pISRE-люцифераза (HEK-ISREluc), створювали для визначення профілю кондиціонованого PBMC клітинного культурального середовища. Коротко, PBMC (моноцити периферичної крові) одержували з лейкоцитарної плівки, щонайменше, двох донорів за допомогою центрифугування у фіколі згідно зі стандартним протоколом. Ізольовані PBMC ресуспендували в середовищі RPMI, доповненому 10 % АВ сироваткою людини, і 2×105 клітин на лунку вносили в 384-ямкові планшети, що містять сполуки (загальний об'єм 70 мкл). Після інкубації протягом ночі 10 мкл супернатанта переносили в 384ямкові планшети, що містять 5×103 клітин HEK-ISREluc/лунку в 30 мкл (висіяних днем раніше). Після 24 годин інкубації активацію елементів ISRE вимірювали шляхом дослідження активності люциферази з використанням 40 мкл/лунку субстрату Steady Lite Plus (Perkin Elmer) і вимірювали за допомогою обладнання для візуалізації мікропланшетів Viewlux ultrahts (Perkin Elmer). Активність кожної сполуки, що стимулює клітини HEK-ISREluc, представлена як величина LEC, визначена як концентрація сполуки, що застосовується до PBMC, що приводить до активності люциферази, яка щонайменше, у два рази перевищує стандартне відхилення в аналізі. У свою чергу, LEC указує на ступінь активації ISRE при переносі певної кількості культурального середовища PBMC. Рекомбінантний інтерферон альфа-2а (Роферон-A) використовували в якості стандартної контрольної сполуки. Таблиця II Біологічна активність TLR 7 людини (LEC), мкМ Структура TLR 8 людини (LEC), мкМ HEK-ISRE luc (LEC), мкМ 0,24 № 0,56 0,014 7,8 5,87 2,72 HO (S) N H 2N NH 8 N N O O O N HO (S) 12 H2 N N N NH N O 15 UA 114644 C2 N H N N H2 N O N 15 0,81 0,14 2,04 1,02 8,27 0,46 0,53 0,66 0,64 0,43 0,75 0,56 0,54 1,71 0,59 0,14 H N N 1,85 17,49 N 1,93 0,38 N H 2N 2,94 O 16 O 17 H 2N N N H 2N 18 N N O H N N 20 H 2N N H N N O O H N N O N H 2N O N N 19 N N H 2N 21 N H N F H N N O Hcl N Hcl 16 UA 114644 C2 N H N N O H 2N N 22 4,75 0,41 0,17 O 1,0 0,33 0,14 0,1 0,17 Hcl 23 ˃25 24 Hcl Усі сполуки показали відсутність токсичності аж до найвищої тестованої концентрації. Усі сполуки показали відсутність активності (LEC ? 25 мкм) в аналізі зворотного скринінгу HEK 293 NF-kB, описаного вище. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Сполука формули (І) R1 H O N N N N NH2 R2 10 15 20 25 або її фармацевтично прийнятна сіль або таутомер(и), де: R1 являє собою С1-6алкіл, арилалкіл або гетероарилалкіл, кожний з яких необов'язково заміщено одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з галогену, гідроксилу, аміно, С1-6алкілу, ді-(С1-6)алкіламіно, С1-6алкіламіно, С1-6алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, гетероциклу, арилу, алкенілу, алкінілу, арилалкілу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу; R2 являє собою С1-8алкіл, необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з галогену, гідроксилу, аміно, С1-3алкілу, С1-3алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, арилу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу. 2. Сполука за пунктом 1, яка відрізняється тим, що R2 являє собою бутил або пентил, і де R1 являє собою С1-6алкіл, арилалкіл, гетероарилалкіл, кожний з яких необов'язково заміщено одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з галогену, гідроксилу, аміно, С1-6алкілу, ді-(С1-6)алкіламіно, С1-6алкіламіно, С1-6алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, гетероциклу, арилу, алкенілу, алкінілу, арилалкілу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу. 3. Сполука за пунктом 1, яка відрізняється тим, що R2 являє собою С1-8алкіл, заміщений гідроксилом, і де R1 являє собою заміщену або незаміщену арилалкільну групу. 17 UA 114644 C2 4. Сполука за пунктом 1, яка відрізняється тим, що R1 являє собою арилалкіл і R2 являє собою С1-8алкіл, заміщений гідроксилом, або один з наступних прикладів у будь-якій стереохімічній конфігурації: OH HO 5 10 15 OH HO , , , . 5. Сполука за пунктом 1, яка відрізняється тим, що R1 являє собою СН3, і в якій R2 являє собою С1-8алкіл, необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з галогену, гідроксилу, аміно, С1-3алкілу, С1-3алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, ді-(С1-6)алкіламіно, С1-6алкіламіно, арилу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу. 6. Сполука за пунктом 1, яка відрізняється тим, що R1 являє собою гетероарилалкіл, і де R2 являє собою С1-8алкіл, необов'язково заміщений одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з галогену, гідроксилу, аміно, С 1-3алкілу, С1-3алкокси, С3-6циклоалкілу, карбонової кислоти, складного ефіру карбонової кислоти, аміду карбонової кислоти, ді-(С1-6)алкіламіно, С1-6алкіламіно, арилу, гетероарилу, гетероарилалкілу або нітрилу. 7. Сполука за пунктом 1, яка відрізняється тим, що вибрана з: HO HO (S) N H2 N N N (S) NH O N O N N NH N H2N O N H2 N H N N O O N , N H2 N N N , , H N O N H2 N H2 N O N N , N H2 N N H N N O O O N H2 N N , N H N O 18 O , N H2 N N F N , H N N N H N , H N N O N , UA 114644 C2 H2 N N NH2 NH2 H N N N N N N O N NH N NH N O O O , N і 5 N . 8. Фармацевтична композиція, що містить сполуку формули (І) або її фармацевтично прийнятну сіль або таутомер(и) за будь-яким з пунктів 1-7 разом з однією або декількома фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами, розріджувачами або носіями. 9. Сполука формули (І) або її фармацевтично прийнятна сіль або таутомер(и) за будь-яким з пунктів 1-7 або фармацевтична композиція за пунктом 8 для застосування як лікарського засобу. 10. Сполука формули (І) або її фармацевтично прийнятна сіль або таутомер(и) за будь-яким з пунктів 1-7 або фармацевтична композиція за пунктом 8 для застосування в лікуванні порушення, у яке залучене модулювання TLR7 і/або TLR8. 10 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19