Комбінація інгібітора протеази ns3 hcv з інтерфероном і рибавірином

Реферат: Винахід стосується застосування терапевтичної комбінації, що містить (а) селективний та ефективний інгібітор серинової протеази NS3 HCV, (б) інтерферон альфа і (в) рибавірин, для готування лікарського засобу, призначеного для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (НCV), або полегшення одного або декількох її симптомів. UA 103496 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Дана заявка претендує на пріоритет попередніх заявок на патент США: 61/097753, зареєстрованої 17 вересня 2008 р., 61/109033, зареєстрованої 28 жовтня 2008 р. і 61/171935, зареєстрованої 23 квітня 2009 р. Область техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до терапевтичних комбінацій, що містять Сполуку (1), представлену у даному описі, інтерферон альфа й рибавірин. Даний винахід відноситься також до способів застосування зазначених терапевтичних комбінацій для лікування викликаної HCV інфекції або полегшення одного або декількох її симптомів у пацієнта. Даний винахід відноситься також до наборів, що містять терапевтичні комбінації, запропоновані у даному винаході. Передумови створення винаходу Інфекція, викликана вірусом гепатиту С (HCV), являє собою глобальну проблему, пов'язану зі здоров'ям людини, при цьому тільки у Сполучених Штатах щорічно фіксуються приблизно 150000 нових випадків. HCV являє собою одноланцюговий РНКовий вірус, що є етіологічним фактором, ідентифікованим у більшості випадків не-А, не-Б гепатиту, який передається при переливанні крові й при трансплантації, і є звичайним причинним фактором гострого спорадичного гепатиту. Встановлено, що більше 50 % пацієнтів, заражених HCV, стають хронічно інфікованими й протягом 20 років у 20 % з них розвивається цироз печінки. Для лікування хронічної інфекції, викликаної HCV, дозволено застосовувати декілька типів інтерферонів, зокрема, альфа-інтерферони, наприклад, інтерферон-альфа-2a (ROFERON®-A), інтерферон альфа-2b (INTRON®-A), консенсусний інтерферон (INFERGEN®), а також пегільовані форми цих та інших інтерферонів типу пегільованого інтерферону альфа-2a (PEGASYS®) і пегільованого інтерферону альфа-2b (PEG-INTRON®). Більша частина пацієнтів не має чутливості до лікування інтерфероном альфа, а серед респондерів виявлений високий рівень рецидивів протягом 6 місяців після припинення лікування (Liang та ін., J. Med. Virol. 40, 1993, с. 69). У клінічних дослідах було встановлено, що рибавірин, аналог гуанозину з широким спектром активності у відношенні багатьох РНКових і ДНКових вірусів, має ефективність у відношенні хронічної викликаної HCV інфекції при його застосуванні у сполученні з інтерферонами альфа (див., наприклад, Poynard та ін., Lancet 352, 1998, сс. 1426-1432; Reichard та ін., Lancet 351, 1998, сс. 83-87), і ця комбінована терапія дозволена при лікуванні HCV: REBETRON® (інтерферон альфа-2b плюс рибавірин, фірма Schering-Plough); PEGASYS®RBV® (комбінована терапія на основі пегільованого інтерферону альфа-2a плюс рибавірину, фірма Roche); див. також Manns та ін., Lancet 358, 2001, сс. 958-965 і Fried та ін., N. Engl. J. Med. 347, 2002, сс. 975982. Однак навіть при використанні комбінованої терапії рівень вірусологічної відповіді все ще перебуває на рівні 50 % або нижче. Крім того, з такими терапіями, як правило, асоційовані істотні побічні дії. Недоліками рибавірину є тератогенна активність, вплив на розвиток сперми, гемоліз, а також на такі фактори, як стомлюваність, головний біль, безсоння, нудота й/або анорексія. З інтерфероном альфа при його застосуванні у сполученні з рибавірином або без нього пов'язані багато побічних дій. Протягом періоду лікування потрібно здійснювати ретельний моніторинг пацієнтів відносно симптомів типу лихоманки, депресії, висипки, і аномальної формули крові. Пацієнти, яких можна піддавати лікуванню інтерфероном альфа-2b плюс рибавірином, не повинні мати станів у вигляді серйозної ниркової дисфункції, і тільки таких пацієнтів можна розглядати як придатних для лікування гепатиту C, при цьому потрібно здійснювати ретельний моніторинг. Певні комбіновані терапії, що включають застосування інтерферону, які призначені для лікування викликаної HCV інфекції, описані також у наступних опублікованих заявках на патент США: US 2005/0112093; US 2005/0129659 та US 2008/0138316. Наведена нижче Сполука (1): 1 UA 103496 C2 S Br O NH MeO N N O H N N CO2H O O NH O O (1) 5 10 відома в якості виборчого й ефективного інгібітора серинової протеази NS3 HCV та її можна застосовувати для лікування викликаної HCV інфекції. Сполука (1) відноситься до групи ациклічних пептидних інгібіторів HCV, які описані в US 6323180, 7514557 і 7585845. Сполука (1) описана конкретно як Сполука № 1055 в US 7585845 і як Сполука № 1008 в US 7514557. Сполука (1) і фармацевтичні препаративні форми, що включають її, можна одержувати за допомогою загальних процедур, які описані у процитованих вище посиланнях, які всі повністю включені у даний опис як посилання. Кращими формами Сполуки (1) є кристалічні форми, зокрема кристалічна форма у вигляді натрієвої солі, яку можна одержувати відповідно до методів, представлених у даному описі у розділі "Приклади". Сполуку (1) можна описувати також за допомогою іншої хімічної структури, що еквівалентна зазначеній вище структурі: 2 R 1 L 0 L N S N O O B O N H N O OH O N R H O O 15 20 25 30 в якій B означає 0 1 2 ; L означає MeO-; L означає Br; і R означає N H . Хоча встановлено, що Сполука (1) у цілому має ефективність відносно зниження вірусного навантаження й лікування викликаної HCV інфекції, при цьому виявлений певний рівень стійкості вірусів, що приводить до відновлення вірусного навантаження. Наприклад, установлено, що при здійсненні 14-денної монотерапії шляхом введення Сполуки (1) один раз на день пацієнтам, які не піддавалися раніше лікуванню, спостерігається сильна й противірусна дія, що дуже швидко проявляється, після чого через 5-6 днів формується певний рівень стійкості. Таким чином, продовжує зберігатися необхідність в інших терапіях для лікування й попередження викликаної HCV інфекції. Короткий виклад сутності винаходу Даний винахід відноситься до способу лікування викликаної HCV інфекції або полегшенню одного або декількох її симптомів у пацієнта, який полягає у тому, що вводять пацієнтові терапевтичну комбінацію, що містить Сполуку (1), представлену у даному описі, або її фармацевтично прийнятну сіль та інтерферон альфа й рибавірин, представлені у даному описі. Три діючі речовини, які входять у комбінацію, можна вводити одночасно або роздільно як частина схеми застосування. 2 UA 103496 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься також до набору, що містить першу фармацевтичну композицію, яка включає Сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль; другу фармацевтичну композицію, що включає інтерферон альфа; і третю фармацевтичну композицію, що включає рибавірин. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - середня зміна вірусного навантаження HCV у чотирьох групах пацієнтів, які складалися з пацієнтів, що не піддавалися раніше лікуванню, з хронічною інфекцією, пов'язаною з HCV генотипу-1, у процесі лікування шляхом введення натрієвої солі Сполуки (1) в якості 14денної монотерапії, з наступним застосуванням комбінованої терапії, що включає введення натрієвої солі Сполуки (1), пегільованого інтерферон альфа-2a і рибавірину протягом ще 14 днів; на фіг. 2 - середня зміна вірусного навантаження HCV у трьох групах пацієнтів, які складалися з пацієнтів, що піддавалися раніше лікуванню, з хронічною інфекцією, пов'язаною з HCV генотипу-1, у процесі лікування шляхом введення натрієвої солі Сполуки (1), пегільованого інтерферону альфа-2a і рибавірину в якості 28-денної комбінованої терапії. Докладний опис винаходу Визначення Поняття "Сполука (1)» відноситься до описаної вище сполуки. Поняття "інтерферон" відноситься до представника сімейства видоспецифічних білків, що мають високий ступінь гомології, які інгібують вірусну реплікацію й клітинну проліферацію й модулюють імунну відповідь. Людські інтерферони згруповані у три класи на основі їх клітинного походження й антигенності: α-інтерферон (лейкоцити), β-інтерферон (фібробласти) і γінтерферон (B-клітини). Створені й надходять у продаж рекомбінантні форми кожної групи. Поділ кожної групи на підтипи заснований на антигенних/структурних характеристиках. Ідентифіковано щонайменше 24 інтерферони альфа (згруповані у підтипи від A до H), які мають різні амінокислотні послідовності, шляхом виділення й секвенування ДНК, що кодують ці пептиди. Поняття «α -інтерферон", "альфа-інтерферон" й "інтерферон альфа" у контексті даного опису застосовують взаємозамінно для опису представників цієї групи. Для втілення винаходу на практиці можна застосовувати як зустрічаються у природних умовах, так і рекомбінантні альфа-інтерферони, включаючи консенсусний інтерферон. Придатними для застосування згідно з даним винаходом інтерферонами альфа є (але, не обмежуючись тільки ними) рекомбінантний інтерферон альфа-2b, такий як інтерферон Intron® і VIRAFERON®; рекомбінантний інтерферон альфа-2a, такий як інтерферон Roferon®; рекомбінантний інтерферон альфа-2c, такий як інтерферон Berofor® альфа 2; інтерферон альфа-n1, очищена суміш альфа-інтерферонів, що зустрічаються у природних умовах, така як SUMIFERON®, або інтерферон альфа-n1 (INS) Wellferon®; або консенсусний альфаінтерферон, наприклад, описаний в US 4897471 і 4695623; або інтерферон альфа-n3, суміш альфа-інтерферонів, що зустрічаються у природних умовах, така як ALFERON®. Кращим є застосування інтерферону альфа-2a або альфа-2b. Одержання інтерферону альфа-2b описане в US 4530901. Поняття "інтерферон альфа" відноситься також до інтерферону, що включає "пегільовані" аналоги, тобто модифіковані поліетиленгліколем кон'югати інтерферону альфа, переважно інтерферону альфа-2a і -2b. Кращий кон'югат поліетиленгліколь-інтерферон альфа-2b являє собою ПЕГ12000-інтерферон альфа-2b. Поняття "ПЕГ12000-інтерферон альфа" у контексті даного опису означає кон'югати, такі як отримані відповідно до методів, описаних у міжнародній заявці на патент WO 95/13090, і які містять уретанові зв'язки між аміногрупами інтерферону альфа-2a або -2b і поліетиленгліколем із середньою молекулярною масою 12000. Кращий кон'югат ПЕГ12000-інтерферон альфа-2b одержують шляхом приєднання полімеру ПЕГ до епсилон-аміногрупі залишку лізину у молекулі інтерферону альфа-2b. Одну молекулу ПЕГ12000 кон'югують з вільними аміногрупами молекули інтерферон альфа-2b через уретановий зв'язок. Цей кон'югат відрізняється молекулярною масою приєднаного ПЕГ 12000. Кон'югат ПЕГ12000-інтерферон альфа-2b готують у вигляді ліофілізованого порошку для ін'єкцій. Мета кон'югації інтерферон альфа з ПЕГ полягає у поліпшенні характеристик білка, що вводиться, шляхом значного подовження часу його напівжиття у плазмі, забезпечуючи тим самим пролонговану активність інтерферону альфа. Найбільше кращими кон'югатами інтерферону альфа, які можна застосовувати згідно з даним винаходом, є пегільовані альфа-інтерферони, наприклад, пегільований інтерферон альфа-2a, пегільований інтерферон альфа-2b, пегільований консенсусний інтерферон або пегільований очищений продукт інтерферону альфа. Пегільований інтерферон альфа-2a 3 UA 103496 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описаний, наприклад, в EP 0593868, і він надходить у продаж, наприклад, під товарним знаком PEGASYS® (фірма Hoffmann-La Roche). Пегільований інтерферон альфа-2b описаний, наприклад, в US 5908621 і WO 98/48840, і він надходить у продаж, наприклад, під товарним знаком PEG-INTRON® A (фірма Schering Plough). Пегільований консенсусний інтерферон описаний у WO 96/11953. Кращими пегільованими альфа-інтерферонами є пегільований інтерферон альфа-2a і пегільований інтерферон альфа-2b. Кращим є також пегільований консенсусний інтерферон. Поняття "інтерферон альфа" відноситься також до інших кон'югатів інтерферону альфа, які можна одержувати шляхом зв'язування інтерферону альфа з водорозчинним полімером. Прикладами таких полімерів є (але не обмежуючись тільки ними) інші гомополімери поліалкіленоксиду, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ), поліпропіленгліколі, поліоксіетиленовані поліоли, їх співполімери та їх блок-співполімери. Як альтернатива полімерів на основі поліалкіленоксиду можна застосовувати ефективні матеріали, що не мають антигенних властивостей, такі як декстран, полівінілпіролідони, поліакриламіди, полівінілові спирти, полімери на основі вуглеводів тощо. Такі кон'югати інтерферон альфа-полімер описані в US 4766106, US 4917888, європейській заявці на патент 0236987, європейських заявках на патент 0510356, 0593868 і 0809996 (пегільований інтерферон альфа-2a) і в опублікованій міжнародній заявці на патент WO 95/13090. Поняття "інтерферон альфа" відноситься також до злитих білків інтерферону альфа, наприклад, злитих білків інтерферону-α-2a, інтерферону-α-2b, консенсусного інтерферону або очищеного продукту інтерферону-α, кожний з яких злитий з іншим білком. Конкретні кращі злиті білки, що містять інтерферон (наприклад, інтерферон-α-2b) і альбумін, описані в US 6972322 і в опублікованих міжнародних заявках на патент WO 2005/003296 і WO 2005/077042. Кращим інтерфероном, кон'югованим із людським альбуміном, є Albuferon®, що являє собою форму інтерферону альфа, яка має більше тривалу дію, створену за допомогою технології злиття з альбуміном. Albuferon® одержують шляхом генетичного злиття людського альбуміну й інтерферону альфа. До них відносяться також консенсусні інтерферони, такі як INFERGEN®. Поняття "фармацевтично прийнятна сіль" означає сіль Сполуки формули (1), яку з медичної точки зору можна використовувати у контакті з тканинами людини й нижчих тварин, не викликаючи при цьому ознак підвищеної токсичності, роздратування, алергійної реакції тощо, для якої має місце прийнятне співвідношення користь/ризик і яка, як правило, може розчинятися або диспергуватися у воді або маслі й має ефективність при її цільовому застосуванні. Поняття включає фармацевтично прийнятні кислотно-адитивні солі й фармацевтично прийнятні солі приєднання основ. Перелік прийнятних солей наведений, наприклад, у S.M. Birge та ін., J. Pharm. Sci., 66, 1977, сс. 1-19. Поняття "фармацевтично прийнятна кислотно-адитивна сіль" означає солі, які зберігають свою біологічну ефективність і властивості вільних основ і які не є небажаними з біологічної точки зору або з інших причин, утворені з неорганічними кислотами, такими як соляна кислота, бромистоводнева кислота, йодистоводнева кислота, сірчана кислота, сульфамінова кислота, азотна кислота, фосфорна кислота тощо, і з органічними кислотами, такими як оцтова кислота, трифтороцтова кислота, адипінова кислота, аскорбінова кислота, аспарагінова кислота, бензолсульфонова кислота, бензойна кислота, масляна кислота, камфорна кислота, камфорсульфонова кислота, корична кислота, лимонна кислота, диглюконова кислота, етансульфонова кислота, глутамінова кислота, гліколева кислота, гліцерофосфорна кислота, напівсірчана кислота, капронова кислота, мурашина кислота, фумарова кислота, 2гідроксіетансульфонова кислота (ізетіонова кислота), молочна кислота, гідроксималеїнова кислота, яблучна кислота, малонова кислота, мигдальна кислота, мезитиленсульфонова кислота, метансульфонова кислота, нафталінсульфонова кислота, нікотинова кислота, 2нафталінсульфонова кислота, щавлева кислота, памова кислота, пектинова кислота, фенілоцтова кислота, 3-фенілпропіонова кислота, півалінова кислота, пропіонова кислота, піровиноградна кислота, саліцилова кислота, стеаринова кислота, бурштинова кислота, сульфанілова кислота, винна кислота, пара-толуолсульфонова кислота, ундеканова кислота тощо. Поняття "фармацевтично прийнятна сіль приєднання основи" означає солі, які зберігають свою біологічну ефективність і властивості вільних кислот і які не є небажаними з позицій біології або з інших причин, утворені з неорганічними основами, такими як аміак або гідроксид, карбонат або бікарбонат амонію, або катіонами металу, такого як натрій, калій, літій, кальцій, магній, залізо, цинк, мідь, марганець, алюміній тощо. Найбільше кращими є солі амонію, калію, натрію, кальцію й магнію. Солі, отримані з фармацевтично прийнятних органічних нетоксичних основ, включають солі первинних, вторинних і третинних амінів, четвертинних амінових сполук, 4 UA 103496 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заміщених амінів, включаючи заміщені аміни, що зустрічаються у природних умовах, циклічні аміни й основні іонообмінні смоли, такі як метиламін, диметиламін, триметиламін, етиламін, діетиламін, триетиламін, ізопропіламін, трипропіламін, діетаноламін, етаноламін, діетаноламін, 2-диметиламіноетанол, 2-діетиламіноетанол, дициклогексиламін, лізин, аргінін, гістидин, кофеїн, гідрабамін, холін, бетаїн, етилендіамін, глюкозамін, метилглюкамін, теобромін, пурини, піперазин, піперидин, N-етилпіперидин, похідні тетраметиламонію, похідні тетраетиламонію, піридин, N, N-диметиланілін, N-метилпіперидин, N-метилморфолін, дициклогексиламін, дибензиламін, N, N-дибензилфенетиламін, 1-ефенамін, N, N'-дибензилетилендіамін, поліамінові смоли тощо. Найбільше кращими органічними нетоксичними основами є ізопропіламін, діетиламін, етаноламін, триметиламін, дициклогексиламін, холін і кофеїн. Поняття "рибавірин" відноситься до 1-β-D-рибофуранозил-1H-1,2,4-триазол-3-карбоксаміду, що випускає фірма ICN Pharmaceuticals Inc., Коста-Меса, шт. Каліфорнія, і який описаний у the Merck Index, 11-е вид. як сполука № 8199. Її одержують і включають у препаративні форми відповідно до методу, описаному в US 4211771. Кращими наявними на ринку продуктами на основі рибавірину є REBETOL® і COPEGUS®. Під поняття підпадають також похідні й аналоги рибавірину, наприклад, описані в US 6063772, 6403564 і 6277830. Наприклад, похідні або аналоги включають модифіковані рибавірини, такі як складні 5'-аміноефіри, розроблений фірмою ICN Pharmaceutical L-енантіомер рибавірину (ICN 17261), 2'-дезоксипохідні рибавірину й 3-карбоксамідинові похідні рибавірину, вірамідин (раніше відомий як рибамідин) тощо. Поняття "терапевтична комбінація" у контексті даного опису означає комбінацію, що включає одну або декілька лікарських субстанцій, тобто сполук, що мають терапевтичну застосовність. Як правило, кожна така сполука у терапевтичних комбінаціях, запропонованих у даному винаході, повинна бути присутньою у вигляді фармацевтичної композиції, що містить зазначену сполуку й фармацевтично прийнятний носій. Сполуки у терапевтичній комбінації, запропонованій у даному винаході, можна вводити одночасно або роздільно як частина схеми застосування. Варіанти здійснення винаходу Основний варіант здійснення даного винаходу відноситься до способу лікування викликаної HCV інфекції або полегшення одного або декількох її симптомів у пацієнта, який полягає у тому, що вводять пацієнтові терапевтичну комбінацію, яка містить Сполуку (1), зазначену у даному описі, або її фармацевтично прийнятну сіль у сполученні з інтерфероном альфа й рибавірином. Інший варіант здійснення даного винаходу відноситься до застосування Сполуки (1), зазначеної у даному описі, або її фармацевтично прийнятної солі, інтерферону альфа й рибавірину для готування фармацевтичного набору, призначеного для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (HCV), або полегшення одного або декількох її симптомів у пацієнта. Хоча очікується, що зазначена комбінована терапія повинна мати ефективність відносно всіх генотипів HCV, було продемонстровано, що вона має ефективність насамперед відносно лікування інфекції, викликаної генотипом 1 HCV, включаючи субгенотипи 1a і 1b. Популяцію пацієнтів, які підлягають лікуванню за допомогою комбінованої терапії, запропонованої у даному винаході, можна додатково класифікувати як пацієнтів, "які не піддавалися раніше лікуванню", тобто пацієнтів, які раніше не піддавалися ніякому лікуванню інфекції, викликаної HCV, і пацієнтів, які "піддавалися раніше лікуванню", тобто пацієнтів, які раніше піддавалися лікуванню інфекції, викликаної HCV. За допомогою комбінованої терапії, запропонованої у даному винаході, можна лікувати пацієнтів, що відносяться до кожного з цих класів. Конкретним класом пацієнтів, яких найбільше переважно лікувати таким шляхом, є пацієнти, що піддавалися раніше лікуванню, яких раніше лікували за допомогою терапії, що включає застосування інтерферону плюс рибавірину, але які не мали чутливість до зазначеної терапії (позначені у контексті даного опису як "нереспондери"). Зазначених нереспондерів підрозділяють на три різні групи пацієнтів: (1) пацієнти, у яких у процесі лікування інтерфероном плюс рибавірином максимальне зниження рівнів РНК HCV становило 2 log10. Медіанне (з урахуванням діапазонів) максимальне зниження VL під час 28-денної комбінованої терапії у групах, оброблених дозами 48 мг, 120 мг і 240 мг, становило 4,8 (3,4-5,9), 5,2 (3,9-6,0) і 5,3 (4,8-6,1) log10 МО/мл відповідно. Було виявлене відновлення вірусного навантаження у процесі лікування протягом перших 28 днів застосування натрієвої солі Сполуки (1) + P+R у 2/6 пацієнтів при застосуванні дози 48 і в 1/7 пацієнтів при 14 UA 103496 C2 5 10 15 20 25 30 застосуванні дози 120 мг. Популяційне секвенування у цих пацієнтів протеази NS3/4A у вихідний момент часу (основний рівень) і при відновленні вірусного навантаження у процесі лікування дозволяло здійснювати відбір варіантів, що обумовлюють стійкість in vitro до натрієвої солі Сполуки (1). В одного пацієнта з групи, в якій здійснювали обробку дозою 120 мг, не виявлене відновлення вірусного навантаження, але виявлений вихід на плато з рівнем VL ~500 копій МО/мл до дня 28 і наявність кодованого мутанта R155K; у такий спосіб, рівень вірусного навантаження у зазначеному зразку перебував нижче нижньої межі виявлення у фенотипових аналізах стійкості, проведених при створенні даного винаходу. Протягом 28-денного лікування BI 201335 не було виявлено ніякого відновлення у групі, що обробляли дозою 240 мг qd: у 5/6 пацієнтів рівень VL становив < 25 МО/мл у день 28. У шостого пацієнта рівень VL знижувався до 4,7 log10 щодо вихідного рівня у день 28 і при наступному візиті у день 42 рівень VL становив < 25 МО/мл. Висновок: Лікування зі застосуванням натрієвої солі Сполуки (1) при введенні один раз на день у комбінованій терапії зі сполученні з P+R протягом 28 днів добре переносилося й викликало сильну й швидку противірусну відповідь у пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню. На фіг. 2 представлені дані про середню зміну вірусного навантаження HCV, отримані у цьому дослідженні, у пацієнтів із груп, яких обробляли трьома дозами, тобто у пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню, з хронічною інфекцією, викликаною HCV генотипу-1, яких лікували за допомогою комбінованої терапії, що включає застосування натрієвої солі Сполуки (1), пегільованого інтерферону альфа-2a і рибавірину протягом 28 днів. На кресленні зміну вірусного навантаження виражали в одиницях log10 МО/мл, а три групи пацієнтів, яким вводили зазначені дози, позначені у такий спосіб: "48 NR av" = середня зміна вірусного навантаження у групі, в якій здійснювали обробку дозою 48 мг; "120 NR av" = середня зміна вірусного навантаження у групі, в якій здійснювали обробку дозою 120 мг; "240 NR av" = середня зміна вірусного навантаження у групі, в якій здійснювали обробку дозою 240 мг. У наведеній нижче таблиці представлені деякі параметри вірусологічної відповіді (зниження вірусного навантаження) у пацієнтів у цьому дослідженні (де "D" означає день і "QD" означає один раз на день; "N" означає кількість пацієнтів; "нижче нижньої межі кількісного виявлення" означає менше 25 МО на мл сироватки). 35 Поява варіантів у процесі обробки пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню 15 UA 103496 C2 5 Виявлені значні зміни у залишках, які мають вирішальне значення, у домені протеази NS3 щодо еталонного субтипу (субгенотип 1a: AF009606 або субгенотип 1b: AJ238799) у процесі лікування у групах, оброблених різними дозами (більше докладні дані див. нижче у таблицях 57). У всіх таблицях Gt означає субгенотип HCV, а день 1 означає вихідну послідовність, і зазначені амінокислотні заміни являють собою поліморфізми амінокислот у NS3, що зустрічаються у природних умовах, які мають вирішальне значення. Додаткові зміни, які можуть кодувати або які можуть бути асоційовані зі стійкістю до лікарського засобу, зазначені у різні дні у процесі лікування. Таблиця 5 Переважні варіанти (щодо еталонного субтипу) залишків амінокислотних послідовностей, які мають вирішальне значення, виявлені у характерних для популяції пацієнтів із групи, які піддавалися раніше лікуванню, для обробки якої використовували дозу 48 мг Пацієнт Gt 48TE1 48TE2 48TE4 48TE3 48TE5 48TE6 1a 1a 1a 1b 1b 1b 1 Q80K Q80L Q80R немає Q86P Q86P День лікування 28 Q80K, R155K BLD BLD D168V BLD BLD 14 Q80K BLD BLD D168V BLD BLD 168 Q80K, R155K BLD BLD R155R/K/Q BLD Q86P, R155K 10 немає: BLD: ніяких замін не виявлено у відібраних положеннях нижче межі виявлення при ПЛР-ампліфікації й секвенуванні Таблиця 6 Переважні варіанти (щодо еталонного субтипу) залишків амінокислотних послідовностей, які мають вирішальне значення, виявлені у характерних для популяції пацієнтів із групи, які піддавалися раніше лікуванню, для обробки якої використовували дозу 120 мг Пацієнт 120TE1 120TE2 120TE3 120TE4 120TE5 120TE6 120TE7 15 Gt 1a 1a 1b 1b 1b 1a 1a 1 Q80K Q89Y Q86P, P89S Q86A P89[P, S] немає немає День лікування 14 Q80K, R155K BLD BLD BLD BLD BLD R155K* 28 Q80K, R155K BLD BLD BLD BLD BLD R155K* немає: ніяких замін не виявлено у відібраних положеннях BLD: нижче межі виявлення при ПЛР-ампліфікації й секвенуванні * рівень VL виходить на плато < 1000 МО/мл у ці моменти часу 16 UA 103496 C2 Таблиця 7 Переважні варіанти (щодо еталонного субтипу) залишків амінокислотних послідовностей, які мають вирішальне значення, виявлені у характерних для популяції пацієнтів із групи, які піддавалися раніше лікуванню, для обробки якої використовували дозу 240 мг Пацієнт 240TE1 240TE2 240TE3 240TE4 240TE5 240TE6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Gt 1a 1a 1a 1b 1b 1a День лікування 1 немає немає немає немає Q86P немає 28 BLD BLD BLD BLD BLD BLD немає: ніяких замін не виявлено у відібраних положеннях BLD: нижче межі виявлення при ПЛР-ампліфікації й секвенуванні Загальні висновки Ці результати продемонстрували наявність сильної й дуже швидкої противірусної відповіді при обробці пацієнтів, які не піддавалися раніше лікуванню, натрієвою сіллю Сполуки (1) при введенні один раз на день в якості 14-денної монотерапії, після чого відбувалося формування антивірусної стійкості й підвищення вірусного навантаження після 5-6 днів монотерапії. Однак після початку застосування потрійної комбінованої терапії, запропонованої у даному винаході, у день 14 (натрієва сіль Сполуки (1) у сполученні з пегільованим інтерфероном альфа-2a і рибавірином), вірусне навантаження поступово знижувалося, що демонструвало противірусну ефективність потрійної комбінованої терапії, запропонованої у даному винаході, при обробці пацієнтів, які не піддавалися раніше лікуванню (див. фіг. 1). Коли натрієву сіль Сполуки (1) вводили один раз на день пацієнтам, які піддавалися раніше лікуванню, (інтерферон плюс рибавірин, нульові респондери й часткові респондери) у сполученні з пегільованим інтерфероном альфа-2a і рибавірином протягом 28 днів, то результати продемонстрували таку ж сильну і дуже швидку противірусну відповідь, але при цьому була виявлена знижена здатність до формування стійкості (див. фіг. 2). Варто було очікувати, що у таких пацієнтів-нереспондерів, які піддавалися раніше лікуванню, також стійкість до вірусів повинна формуватися через 5 днів, оскільки ці пацієнти відібрані за ознакою відсутності чутливості до терапії на основі пегільованого інтерферону плюс рибавірину. Однак мало місце тривале придушення вірусів. У сутності було встановлено, що потрійна комбінована терапія, запропонована у даному винаході, може забезпечувати ефективне зниження вірусного навантаження у пацієнтів, які не піддавалися раніше лікуванню, і у пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню, що страждають хронічною інфекцією, викликаною вірусом гепатиту С генотипу-1, причому, у деяких пацієнтів вона підтримувалася на рівні нижче виявлення, за який приймали рівень, що становить нижче 50 міжнародних одиниць на мл сироватки пацієнта при оцінці за допомогою методології кількісної ПЛР, що складається з багатьох циклів, зі зворотньою транскриптазою відповідно до міжнародного стандарту ВОЗ. У кращих варіантах здійснення винаходу потрійна комбінована терапія, запропонована у даному винаході, може забезпечувати ефективне зниження вірусного навантаження у пацієнтів із хронічною інфекцією, викликаною вірусом гепатиту С генотипу-1, до рівня, що становив менше 10 міжнародних одиниць на мл сироватки. При створенні винаходу отримані наступні несподівані результати: (1) відсутність швидко виникаючої стійкості (наприклад, варіантів, що кодують амінокислотні заміни у NS3 у положеннях R155 і/або D168) у пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню, яким вводили натрієву сіль Сполуки (1) у сполученні з пегільованим інтерфероном альфа-2a і рибавірином у стандартних дозах (фіг. 2), на відміну від впливу натрієвої солі Сполуки (1) у такій же дозі індивідуально при обробці пацієнтів, які не піддавалися раніше лікуванню, у яких виявлена стійкість до вірусу (див. фіг. 1, перші 14 днів). Можна було очікувати, що у таких пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню, стійкість до вірусів повинна формуватися через 5 днів навіть при додаванні пегільованого інтерферону альфа-2a і рибавірину, оскільки ці пацієнти були відібрані за ознакою відсутності чутливості до комбінованої терапії на основі пегільованого інтерферону плюс рибавірину; і 17 UA 103496 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2) той факт, що доза, яка становила всього лише 120 мг QD (один раз на день), у сполученні з пегільованим інтерфероном і рибавірином індукувала вірусне виснаження до рівня нижче рівня кількісного визначення (встановленого на рівні менше 25 МО на мл сироватки) більше ніж у 50 % пацієнтів, які піддавалися раніше лікуванню, у яких раніше була відсутня чутливість до терапії на основі пегільованого інтерферону плюс рибавірину (див. таблицю). Приклад 8 - Методи ідентифікації варіантів NS3 HCV Екстракція й ПЛР-ампліфікація вірусної РНК Вірусну РНК виділяли з плазми HCV-інфікованих індивідуумів і спочатку синтезували ДНКфрагмент довжиною 2,4 т.п.н., що містить повну NS3-NS4A-область, за допомогою системи для TM одноступінчастої ЗТ-ПЛР Superscript (фірма Invitrogen) і з використанням двохспецифічних для гена праймерів, які охоплюють положеннях 3276 у NS2 і 5650 у NS4B. Після очищення першого ПЛР-продукту за допомогою другого циклу "напівгніздової" РНК з використанням ДНКполімерази KOD Hot Start (фірма Novagen) створювали два різних ПЛР-продукти довжиною або 2,3, або 0,7 т.п.н. (які перекривали повну NS3/NS4A або тільки NS3-протеазний домен відповідно). З причин, пов'язаних із межею виявлення методу ЗТ-ПЛР-ампліфікації, аналіз зразків із організму пацієнтів був обмежений зразками з рівнем VL, що перевищує 1000 МО/мл. Аналіз послідовностей ДНК-продукт довжиною 2,3 т.п.н. потім застосовували для безпосереднього секвенування на популяційній основі повної NS3-NS4A-області, що складається з 2055 нуклеотидів, за ® допомогою Big Dye Terminator V3.1 (фірма Applied Biosystems) і генетичного аналізатора ABI ® Prism 3130XL (фірма Applied Biosystems). Послідовності одержували з використанням 10 праймерів, досягаючи щонайменше 90 %-ого перекриття подвійного ланцюга NS3-NS4A® області. Отримані нуклеотидні послідовності аналізували за допомогою пристрою SeqScape v2.5 (фірма Applied Biosystems). ДНК-фрагмент довжиною 0,7 т.п.н. застосовували для створення на клональній основі (набір ® ® для клонування ZeroBlunt TOPO , фірма Invitrogen) послідовностей області NS3-протеази, що складається з 543 нуклеотидів, що кодує перші 181 амінокислот NS3; з кожного зразка відбирали по 96 клонів і секвенували з використанням універсальних праймерів і термокомірки для ПЛР-секвенування ABI Prism® Big Dye™ Terminator Cycle. Здійснювали аналіз двох індивідуальних послідовностей кожного клону, забезпечуючи 90-100 %-ве перекриття подвійного ланцюга області, що складається з 543 нуклеотидів, за допомогою програми Mutation Surveyor™, версія 3.0 (фірма Softgenetics LLC). Для кожного зразка, отриманого з організму пацієнта, клони з низькою якістю послідовності або містять делеції, інсерції або стоп-кодони, не включали у подальший аналіз, тому кількість аналізованих клонів варіювала від 74 до 89 (медіанне й середнє значення становило 80 клонів). Отримані послідовності порівнювали з еталонними (референс) послідовностями відповідних субтипів, які попередньо визначали на фазі скринінгу досліду з використанням генотипування за допомогою Truegene™ HCV 5’NC. AF009606 служив як еталон для субтипу 1a, а AJ238799 для субтипу 1b. Найбільшу увагу приділяли мутаціям, які приводили до амінокислотних замін у 15 положеннях домену NS3-протеази. Для всіх цих положень раніше було встановлено, що вони потенційно можуть обумовлювати стійкість до цього класу сполук. Ці положення являють собою: 36, 41, 54, 71, 80, 86, 89, 109, 111, 155, 156, 168, 170, 176 і 178 (Посилання: [1.] Tong X., Bogen S., Chase R., Girijavallabhan V., Guo Z., Njoroge F.G., Prongay A., Saksena A., Skelton A., Xia E., Ralston R., Characterization of resistance mutations against HCV ketoamide protease inhibitors. Antiviral Res. 77(3), березень 2008 р., сс. 177-185. [2.] Lagace L., Marquis M., Bousquet C., Do F., Gingras R., Lamarre D., Lamarre L., Maurice R., Pause A., Pellerin C., Spickler C., Thieault D. і Kukolj G., BILN 2061 and beyond: pre-clinical evaluation of HCV subgenomic replicon resistance to a NS3 protease inhibitor. В: Framing the Knowledge of Therapeutics for Viral Hepatitis, під ред. R.F. Schinazi і E.R. Schiff, вид-во IHL Рress, 2006, сс. 263-278 [3.] Koev G., Kati W., The emerging field of drug resistance. Expert Opinion Invest Drugs 17(3), 2008, сс. 303-319 (P08-03895)). Аналіз чутливості до лікарських засобів Біфункціональний вектор, що містить біцистроний реплікон HCV (pIT2), який включав репортерний ген люциферази й був адаптований до Con-1 NS3/NS5B-області, модифікували з метою створення двох унікальних сайтів рестрикції (Mlu I і Spe I) на кодонах 11 і 225 NS3, які дозволяли здійснювати вбудовування сумісних ампліконів NS3, виділених зі зразків плазми HCV-інфікованих пацієнтів. Отриманий у першому циклі ПЛР-продукт, синтезований на основі очищеної з плазми пацієнта РНК (застосовуваний також при створенні фрагментів для секвенування на популяційній і клональній основі), застосовували для ампліфікації фрагмента довжиною 0,65 т.п.н. за допомогою пари праймерів, які містили відповідно унікальні сайти рестрикції MluI і SpeI для вбудовування у біфункціональний вектор. Амплікони вбудовували 18 UA 103496 C2 5 10 15 20 25 шляхом лігування у біфункціональний вектор pIT2 і реконструйовану плазмідну ДНК застосовували для створення РНК-транскриптів субгеномного реплікону HCV (набір T7 Ribomax™, фірма Promega). Транскрибованою in vitro РНК короткочасно трансфектували шляхом електропорації клітини Huh-7.5, які потім висівали у 96-ямкові планшети, інкубували протягом 24 год. і обробляли взятою у різних концентраціях натрієвою сіллю Сполуки (1) (або IFN-α) протягом 72 год. Наприкінці періоду інкубації люциферазну активність оцінювали за допомогою субстрату Bright-Glo™ для кількісної оцінки люмінесценції (CPS) у кожній лунці культурального планшета, що відбивало рівень реплікації РНК HCV. Ступінь інгібування (% інгібування) у кожній лунці, що містить інгібітор, розраховували з наступного рівняння: % інгібування = 100 - [100 × CPS (інгібітор)/CPS (контроль)]. Концентрацію, при якій відбувалося 50 %-ве інгібування реплікації РНК HCV (EC50), визначали за допомогою загальноприйнятої процедури системи статистичного аналізу (SAS) на основі нелінійної регресії NLIN. Значення EC50 для мутанта NS3 порівнювали з вихідним значенням EC50 з одержанням кратності змін. Переважні мутації генотипу 1a, що обумовлюють стійкість, яка проявляється у відновленні вірусного навантаження у процесі лікування, що кодують заміну R155K і крім того інші мінорні варіанти, були виявлені шляхом клонального аналізу послідовностей у цьому положенні. Варіанти R155K обумовлювали зниження чутливості до BI 201335, що характеризувалося діапазоном значень EC50 1,8-6,5мкМ. У вірусів генотипу 1b, як установлено за допомогою чутливого клонального секвенування, в основному кодувалися зміни у положенні D168, при цьому валін був замісником, який найбільше часто зустрічається, виявлені також інші мінорні варіанти. Значення EC50 для варіантів D168 становили 3,6-15мкМ. Такий профіль частково може бути пов'язаний з різним бар'єром до виникнення мутації, що обумовлює стійкість, у кодоні R155 у генотипі 1a (транзиційні однонуклеотидні заміни кодону на лізин) у порівнянні з генотипом 1b (у цьому випадку потрібні дві нуклеотидні заміни для того, щоб кодувати заміну на лізин). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 1. Застосування комбінації, що включає: (а) сполуку наступної формули (1) або її фармацевтично прийнятну сіль: S Br NH MeO N O N O H N N CO2 H O O O NH O 35 (1); (б) пегільований інтерферон альфа; і (в) рибавірин, для готування лікарського засобу, призначеного для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (НCV), або полегшення одного або декількох її симптомів. 2. Застосування за п. 1, в якому лікарський засіб містить (а) першу фармацевтичну композицію, що містить сполуку наступної формули (1) або її фармацевтично прийнятну сіль: 19 UA 103496 C2 S Br NH MeO N O N O H N N CO2 H O O O NH O 5 10 15 20 25 30 35 40 (1); (б) другу фармацевтичну композицію, що містить інтерферон альфа; і (в) третю фармацевтичну композицію, що містить рибавірин. 3. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому компоненти (а), (б) і (в) присутні у лікарському засобі у терапевтично ефективній кількості. 4. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому HCV, що викликає інфекцію, належить до генотипу 1. 5. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому лікарський засіб призначений для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (HCV), або полегшення одного або декількох її симптомів у пацієнта, який не піддавався раніше лікуванню. 6. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому лікарський засіб призначений для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (HCV), або полегшення одного або декількох її симптомів у пацієнта, нечутливого до комбінованої терапії, заснованої на застосуванні рибавірину й інтерферону альфа. 7. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому лікарський засіб призначений для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (HCV), або полегшення одного або декількох її симптомів у пацієнта, при цьому у результаті лікування відбувається зниження рівнів РНК HCV в організмі до рівня, що перебуває нижче межі виявлення. 8. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому лікарський засіб застосовують протягом щонайменше 4 тижнів. 9. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому кількість сполуки (1) або її фармацевтично прийнятної солі, що вводиться, становить щонайменше 40 мг на день. 10. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому кількість рибавірину, що вводиться, вибирають з 400, 600, 800, 1000 або 1200 мг/день. 11. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому інтерферон альфа вводять один раз на тиждень. 12. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому пегільований інтерферон альфа являє собою пегільований інтерферон альфа-2а, що вводять у дозі від приблизно 90 до приблизно 200 мкг/тиждень, або являє собою пегільований інтерферон альфа-2b, що вводять у дозі від приблизно 0,5 до приблизно 2 мкг/кг/тиждень. 13. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому лікування являє собою лікування інфекції, викликаної HCV генотипу 1, у пацієнта, який не має чутливості до комбінованої терапії, заснованої на використанні рибавірину й інтерферону, сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у кількості від приблизно 48 до приблизно 240 мг на день та інтерферон альфа являє собою пегільований інтерферон альфа-2а або пегільований інтерферон альфа-2b. 14. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому сполуку (1) або її фармацевтично прийнятну сіль вводять один раз на день; рибавірин вводять двічі на день; й інтерферон альфа вводять один раз на тиждень. 15. Застосування за п. 1 або п. 2, в якому відбувається обмежене виникнення або взагалі не відбувається виникнення варіантів HCV, які кодують амінокислотні заміни у NS3-пpoтeaзі HCV в одному або декількох наступних положеннях: R155, D168 aбo A156. 16. Набір для лікування інфекції, викликаної вірусом гепатиту С (HCV), який містить: (а) першу фармацевтичну композицію, що містить сполуку наступної формули (1) або її фармацевтично прийнятну сіль: 20 UA 103496 C2 S Br NH MeO N O N O H N N CO2 H O O O NH O (1); (б) другу фармацевтичну композицію, що містить інтерферон альфа; і (в) третю фармацевтичну композицію, що містить рибавірин. 21 UA 103496 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 22