Процес очищення рекомбінантного людського еритропоетину (епо), епо, очищений таким чином, та фармацевтична композиція, що містить його

Реферат: Винахід належить до способу очищення біологічно активних ізоформ глікозилованого еритропоетину (ЕПО) від суміші складних білків, що містить етап аніонообмінної хроматографії, а також етап катіонообмінної хроматографії, які розділені етапом хроматографії з оберненою фазою, причому етап катіонообмінної хроматографії іде за етапом хроматографії з оберненою фазою. Також винахід належить до препарату біологічно активних ізоформ заявленого глікозилованого ЕПО та фармацевтичної композиції, що містить заявлений препарат ЕПО. UA 107678 C2 (12) UA 107678 C2 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область винаходу. Винахід відноситься до способу виробництва еритропоетину (ЕПО), зокрема рекомбінантного людського ЕПО (рлЕПО) з певним складом високоочищеної глікоформи, тобто з великою кількістю O-глікозильованих ЕПО ізоформ. Це досягається за допомогою певної комбінації хроматографічних етапів. Передумови винаходу Еритропоетин є основним гормоном, який регулює проліферацію та диференціацію еритроїдних клітин попередників та підтримує фізіологічний рівень циркулюючих еритроцитів. В плоді ЕПО перш за все виробляється спочатку в печінці та приблизно 90 % виробітку переходить на нирки після народження. При падінні ЕПО через хронічну чи гостру печінкову недостатність, необхідно вводити ЕПО ззовні з метою запобігання подальшого розвитку анемії. Терапевтично активний еритропоетин людини доступний нам з моменту відкриття гену ЕПО та його експресії в клітини гризунів. Нативний людський еритропоетин закодована геном в 7 хромосомі в 7q11-q22 (Закон та співав., Proc. Natl. Акад. Проф. США 83 (1986), 6920-6924). Рекомбінантний людський ЕПО з'явився на ринку в 1989, коли Управління з контролю якості харчових продуктів та лікарських засобів США дало дозвіл на його використання для лікування анемії, пов'язаної із хронічною нирковою недостатністю. Оскільки це є справедливим і для інших рекомбінантних глікопротеїнів, які використовуються в якості лікарських засобів, глікозилюовані структури ЕПО мають важливий вплив на біодуспність, біологічну активність та на імуногенні властивості глікопротеїну. В репродукції рлЕПО, в якості клітин господаря експресуючої системи використовувалися яєчник китайського хом'яка (ЯКХ) та та нирки дитинчати хом'яка (НДХ-21) та, відповідно, вони були детально вивчені (Сасакі та ін…, J. Biol. Chem. 262 (1987), 1205912076, Takeuchi та ін., J. Biol Chem 263 (1988), 3657-36633,…… Nimtz та ін., Eur J. Biochem 213 (1993), 39-56; Tsuda та співавт., Біохімія 27 (1988), 5646-5654). Добре відомо, що ці клітинні лінії виробляють глікоформи, які найбільше співпадають із глікоформами людини. Також відомо, що вуглеводи відіграють важливу роль в націлюванні глікопроїнів та їх виведенні (Drickamer та ін., Щорічне видання з клітинної біології 9 (1003), 237-264; Helenius та співавтори., Science 291 (2001), 2364-2369). Останнім часом новою формою еритропоетину з двома додатковими Nглікозилювання, називається дарбепоетин альфа (Aranesp ®), який був затверджений Європейським Агенством з оцінки лікарських препаратів, а також Управлінням з контролю якості харчових продуктів та лікарських засобів США. Ген ЕПО людини кодує 27 сигнальних пептидів амінокислоти 166 білків амінокислот із розрахунковою молекулярною масою 18396 Дальтон. Зрілий білок зазвичай має одну Nтермінальну делецію амінокислоти і 165 амінокислот в довжину. Сигнальна послідовність направляє пептид в ті відділи клітини, які беруть участь у відповідному процесі глікозилювання, що призводить до формування зрілого білка з трьома N- та одним О-полісахаридом. Молекули цукру, які можуть становити до 40 % загальної молекулярної ваги, дуже важливі для повної біологічної активності ЕПО в організмі. Кілька досліджень показали, що кількість термінальних залишків сіалової кислоти має позитивний вплив на напіврозпад в організмі, не дивлячись на активність в лабораторних умовах, наприклад при зв'язування з рецепторами у вищій, не глікозильованій або частково глікозильованій формі (Takeuchi і Kobata, Глікобіологія 1 (1991), 337-346). Рівень сіалатування прямо пропорційний періоду напіврозпаду, під час якого ці ізоформи з меншим вмістом сіалових кислот значно швидше виводяться з організму і, отже, показують низьку активність. В цьому контексті, Rush і співавт. (Аналіт. Хімія. 67 (1995), 14421452) описав О-ацетилювання сіалових кислотних залишків еритропоетину та їх впливу на збільшення часу циркуляції демонструючи, що високий етап О-ацетилювання сіалових залишків збільшує час циркуляції за рахунок зниження печінкового кліренсу. Як правило, препарати ЕПО отримані шляхом рекомбінантної експресії клітин ссавців, особливо в клітинах ЯКХ, містять до 50 % ізоформ ЕПО, в яких недостатньо O-полісахаридів, і, таким чином, вільного потенціалу для ще двох залишків сіалової кислоти на молекулу. Таким чином, було б бажано передбачити препарати ЕПО які значною мірою вільні від подібних недоліків, не-O-глікозильованих ізоформ, а також знайти способи забезпечення цими препаратами. Способи виділення / очищення ЕПО відомі з наукової, а також патентної літератури, являють собою різні хроматографічні щаблі. Найбільш часто використовувані з них, це аніонообмінна хроматографія (АОХ), обернено-фазова ВЕРХ (ОФ-ВЕРХ). Використовуються також і інші хроматографічні способи, як наприклад, гідроксіапатити, гідрофобні взаємодії (ГХ), катіонний обмін (CEX), афінність (тобто іммуноаффінність або контрастна біологічно-активна речовина), а також гель-фільтраційна (ГФХ) хромотография. Поширені також деякі проміжні етапи такі, як концентрація, діафільтрація, ультрафільтрація, діаліз, осадження етанолом, сіль, 1 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 а також інші. EP 205 564 описує очистку ЕПО за допомогою хроматографічної катіонообмінної стадії (етапу) з подальшою ОФ-ВЕРХ. EP 228 452, а також US 4,667,016 описують спосіб очищення ЕПО з використанням аніонного обмінника з подальшою хроматографія із зверненою фазою, а також гель-хроматографії. EP 428 267 описує удосконалення способу відповідно до EP 228 452, який належить до ізоляції (особливо кислот) ізоформ, за допомогою використання аніонного обмінника після хроматографії з оберненою фазою. EP 1394179 описує процес очищення, що включає контрастну аффінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, гідроксіапатити, °F-ВЕРХ, а також аніонний обмінник. EP 1428878 описує спосіб очищення високосіалатованих ізоформ ЕПО спочатку за допомогою стадії аніонообмінної хроматографії як стадії уловлювання, а також опційної стадії кислотного промивання, гідрофобної хроматографії, афінної хроматографії, а також другої стадії аніонообмінної хроматографії зі стадією кислотного промивання. WO99/28346 описує очищення ЕПО у високому етапи в N-acetyl-lactosamine одиницях і / або тетра-антенальних відгалуженнях в структурі вуглеводів. Процес очищення починається з супернатанта культури клітин, збору шляхом афінної хроматографії, очищення шляхом гідрофобної хроматографії, гидроксіапатитів, а також хроматографії з оберненою фазою. WO03/045996 описує спосіб для відновлення, а також очищення рлЕПО від клітинної культури, що включає в числі іншого, щаблі аніонообмінної хроматографії, хроматографії з оберненою фазою, аніонообмінної хроматографії, а також ексклюзіонной хроматографії. WO 03/080852 описує процес виробництва ЕПО містить як мінімум контрастну аффінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, а також аніонообмінну хроматографію, опціонально з подальшою хроматографією. Miyake і співавтори., J. Biol. Chem 252 (1977), 5558-5564 описують очищення ниркового ЕПО шляхом семиступінчастої процедури, що містить іонообмінну хроматографію, преципітацію етанолу, а також адсорбційну хроматографію. Broudy і співавтори., Arch. Biochem. Biophys. 265 (1988), 329-336 використовували трансфіцірованну клітинну лінію ПНХ для очищення ЕПО шляхом афинной гелеву хроматографію, аніонообмінних хроматографію, а також хроматографію із оберненою фазою. Gokana і співавтори., J. хроматографія 791 (1997), 109-118 описують поділ рекомбінантної людської ізоформи ЕПО за допомогою хромотографії діетіламіноетілом, наступної після попереднім очищенням ЕПО шляхом іммуноаффінності. Відділення ізоформи ЕПО засноване на їх різних інгібіторах протеази. Goto і співавтори., Bio / Technology 6 (1988), 67-71 описують очищення ЕПО за допомогою іммуноаффінності, гель-хроматографії, а також гідроксіапатиту. Hokke і співавтори., Eur. J. Biochem. 228 (1995), 981-1008 описують полісахаридний аналіз ЕПО, що містить обробку ПНГаза для сепаратного аналізу N-полісахаридів і O-полісахаридів. Kishino, а також Miyazaki, J. хроматографія 699 (1997), 371-381 підготував огляд спосібів для глікопротеїнного аналізу, що містить очищення ЕПО від сечі за допомогою термінальної хроматографія із оберненою фазою. Nimtz і співавтори., Eur. J. Biochem. 213 (1993), 39-56 описують аналіз глікозилювання ЕПО, що містить розщеплення ПНГази F, який показує, що рекомбінантний людський ЕПО експресується і отримані з клітин нирки новонародженого хом'яка (ПНХ) тільки на 60 % Oглікозильовані. Quelle і співавтори., Blood 74 (1989), 652-657 описують очищення ЕПО з клітин комах, де процес очищення містить аніонообмінну хроматографію, а також ОФ-ВЕРХ, із подальшою афінною хроматографією з лектинами. Sasaki і співавтори., J. Biol. Chem. 262 (1987), 12059-12076, а також Sasaki і співавтори., Biochemistry 27 (1988) 8618-8626 описують аналіз вуглеводної структури рекомбінантного людського ЕПО експресований в, а також отримані з клітин яєчника китайського Хом'яка (ЯКХ). ЕПО був очищений за допомогою ОФ-ВЕЖХ, серед інших спосібів. Skibell і співавтори., Blood 98 (2001), 3626-3634 описують дослідження полісахаридної структури ЕПО з плазми людини в порівнянні із рекомбінантним ЕПО, які показали, O-глікозилювання також відбувається при циркуляції ЕПО в крові. Sytkowski, а також Donahue J. Biol. Chem. 262 (1987), 1161-1166 визначили ЕПО сайт рецепторного зв'язування, визначений (побічно за допомогою нейтралізації) за допомогою моноклональних антитіл (мАт). Таблиця II показує, що мАт спрямовані проти амінокислотної послідовності ЕПО 111-129 показує найсильніший ефект нейтралізації, показуючи, що O-полісахарид розташований в Ser126 може бути задіяний в рецепторному зв'язуванні. Хоча, незважаючи на відому значущість глікозилювання ЕПО, жоден з вищевказаних 2 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 документів не розкриває способу, що забезпечує виробництво препаратів ЕПО які б були (i) значно вільні від не-O-глікозильованих ізоформ, (ii) очищені відповідно до фармакологічної категорії, (iii) вільні від вірусних забруднень, а також (iv) мають можливість бути використаними в масовому виробництві. Дана технічна проблема вирішується шляхом даного варіанту здійснення винаходу, як представлено у формулі винаходу, а також описано далі в документі. Суть винаходу Даний винахід являє собою спосіб для відновлення, а також очищення еритропоетину людини (рлЕПО) з клітинних культур похідних від рекомбінантних клітин, який містить етап хроматографії з оберненою фазою, переважно ОФ-ВЕРХ, а також подальшу стадію (етап) хроматографії з катіонним обміном, причому етапу ОФ-ВЕРХ здебільшого передує стадія хроматографії з аніонним обміном. Рекомбінантний людський еритропоетин (рлЕПО), очищений відповідно до способу за винаходом піддавався декільком способам аналізу з метою описати статус N-, а також Oглікозилювання ЕПО. Як згадувалося в розділі обгрунтування, ЕПО має одним сайтом Oглікозилювання в S126, а також трьома сайтами N-глікозилювання в N24, N38, і N83. З'ясувалося, що загальний зразок глікозилювання препаратів ЕПО за винаходом досить схожий з міжнародним стандартом Британської Фармокопеї, і продуктами, які підлягають комерційному виробництву. Однак було відмічено, що для О-зчеплених олігосахаридів в порівнянні зі стандартом Британської Фармакопеї, кількість не-глікозильованих форм ЕПО була значно нижча, або вони зовсім відсутні. Це може призвести до виникнення покращених препаратів ЕПО в цьому винаході в порівнянні з іншими комерційними продуктами. Без прив'язки до теорії вважається, що практично селективне відділення Одеглікозильованих форм ЕПО при високоефективній рідинній хроматографії працює завдяки нестачі всього ланцюжка O-цукрів. У випадку N-полісахаридів відмінності не настільки виражені. В даному випадку бракує тільки окремих антен, і рідко або майже ніколи, цілого полісахариду. N-полісахариди з відсутніми ізоформами (мінус чотири сіалові кислоти на полісахарид) будуть вже сильно виснажені на стадії аніонообмінної хроматографії (АОХ). У випадку, коли Oланцюжок відсутній, виявляються гідрофобне вогнище (прибл. aa121-130), яке зазвичай приховане ланцюжком сахаридов. Насправді, при найближчому розгляді сайту Oглікозилювання, виявляється щільне скупчення гідрофобних амінокислот навколо Serin126. Serin126 безпосередньо оточують чотири аланіни, а також три проліни (121, 122, 129) явно визначають гідрофобну область. Додатково, Leucine130 також є гідрофобним і вносить свій вклад в цей ефект. Зазначений додатковий гідрофобний сайт в ЕПО збільшує загальне зв'язуюче зусилля з матрицею C4 колонки РХВД. При цьому, О-деглікозілірованіформи елюатіруються на більш пізньому етапі. Зокрема, кращим варіантом за винаходом представлено процес пятиколонкової хроматографії для очищення ЕПО в чисту форму, придатну для складання лікарських засобів. Цей процес містить: (A) контрастну афінну хроматографію для збору і концентрації ЕПО-який містить розчин, а також забезпечення значного зниження потенційних забруднювачів; (B) аніонообмінну хроматографію для збагачення кислотних ізоформ ЕПО, подальше видалення забруднюючих домішок (наприклад, ДНК, білків клітини-господаря), а також виключення будь-яких контрастних біологічно-активних речовин, які могли екстрагуватися з першої колонки; (C) ОФ-ВЕЖХ в умовах для видалення молекул ЕПО, які не глікозильовані в залишках Ser126, а також для видалення забруднень; (D) катіонно - обмінна хроматографія для видалення ОФ-ВЕРХ розчинників, а також агрегованих частинок, заміни буфера, а також для концентрації фракцій ЕПО; а також (E) ексклюзіонна хроматографія як заключна стадія хроматографії, яка застосовується для видалення будь-яких можливих залишкових агрегаційних та інших забруднень. Далі в процес виробництва ЕПО додаються дві окремі стадії видалення / інактивації вірусів. Спочатку, після ступеня ОФ-ВЕРХ, елюат витримують в кислотному ацетонітрилі: вода плюс 0.1 % (у співвідношенні один до одного) суміш трифтороцетної кислоти протягом від 60 до 180 хвилин при 22±3 °C. Потім, стадія нанофільтрації, що включає наступну сходинку фінальної хроматографії для підвищення вірусної безпеки активної речовини. Додатково, було продемонстровано, що аніонообмінна хроматографія також є ефективною стадією для видалення вірусів. Отримана в результаті активна речовина ЕПО може бути розподілена, за допомогою наприклад, перистальтичного насосу, в ємкості для зберігання активної речовини, об'ємом по 250 мл або 30 мл, і може зберігатися при температурі ≤ -70°C. Таким чином, даний спосіб забезпечує профільне виробництво ЕПО, а також дуже 3 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однорідний продукт високої якості. Крім того, даний винахід забезпечує масштабне виготовлення у великих кількостях біологічно активного ЕПО високого очищення, а також необхідних профільних О-глікозильованих ізоформ ЕПО. Чистота ЕПО дуже висока і досягає чистоти, яка перевищує мінімум 99 % загальної кількості білків, а також значно перевищує 99,9 % загальної кількості білків, визначених шляхом ВЕРХ, а також гель-електрофорезу. Крім того, ризик зараження вірусами і т.п. і, отже, клінічна безпека продукту підвищується за рахунок зниження ризику інфекції. У зв'язку з цим, переважний побічний ефект використання ОФ-ВЕРХ, а також органічних розчинників для елюювання і зберігання зразків ЕПО між проведенням наступних етапів в процесі очищення, полягає в інактивації вірусів, які в іншому випадку можуть залишатися життєздатними в інших розчинниках, які використовуються, наприклад, в гідрофобній взаємодії та іонообмінній хроматографії. У зв'язку з цим, фахівці в цій галузі визнають, що основна особливість за винаходом полягає у виконанні ОФ-ВЕРХ, а також подальшої стадії ексклюзіонної хроматографії, в той час, як будьякі інші хроматографічні стадії можуть бути змінені, або відсутні зовсім. Це також справедливо для стадії АОХ, яка, не дивлячись на свою бажаність в способі за цим винаходом, може бути замінена різними ступенями очищення або може зовсім бути пропущена, залежно від використовуваного зразка ЕПО та/або у випадку, коли пріоритет лежить у виготовленні гетерологічних або низько-сіалатованих та одночасно O-глікозильованих препаратів ЕПО. Той факт, що O-глікозилювання ЕПО, ізольованих у відповідності зі способом за винаходом, були більш повними, ніж за стандартом Британської Фармакопеї, вказує на те, що період напіврозпаду препаратів ЕПО може бути значно збільшений. Отже, розумно очікувати, що в умовах живого організму період напіврозпаду препаратів ЕПО в цьому винаході буде як мінімум схожим, якщо не більше, ніж рекомбінантні ЕПО продукти, комерційно доступні до цього часу. Це також передбачає, що фармакінетичний, а також фармакодинамічні властивості тим чи іншим чином будуть схожі з подібними властивостями ринкових продуктів. ЕПО, отримані відповідно до способу за винаходом, таким чином, практично підходять для використання в медицині людини. Короткий опис креслень Документація патенту або заявки може містити одне або більше креслень, виконаних в кольорі та/або одну або більше фотографій. Отримати копії цього патенту або публікації заявки можна через Європейське патентне відомство або Фармакопею США, а також в Патентному Відомстві за відповідним запитом, і після оплати відповідного збору. Фіг. 1: схема процесу очищення для ізоляції специфічної суміші високосіалатованих, а також O-глікозильованих ізоформ ЕПО. Значимість, також передбачувана область застосування стадії індивідуального очищення, викладена нижче в описі. Фіг. 2: фотографія фарбування 12.5 % Кумассі електрофорезом в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію фракцій ВЕРХ після розщеплення з використанням ПНГаза. 5 μg білка було поміщено в кожну ємність. MW, маркер молекулярної ваги; BRP, проба за стандартом Британської Фармакопеї 1 (= біологічний еталонний препарат = суміш епоетину альфа і бета); 1 = ЕПО зразок після аніонообмінної хроматографії (АОХпул), і до виконання стадії ОФ-ВЕРХ; 2-10 = зразки фракцій елюату ЕПО, отримані після того, як АОХ пул піддався ОФ-ВЕРХ, а також застосування лінійного градієнта розчинника, як описано в прикладах; див. також Таблицю 6. Кожна проба ЕПО показана в стані після розщеплення з використанням поліпептид N-глікодази (ПНГаза), яка видаляє всі N-полісахариди, але залишає прикріплений Oполісахарид, якщо такий є. Більш низький, тонкий зв'язок характерний для не O-глікозильованих (О-деглікозильованих) форм. Самі ензими можуть бути також виявлені в гелі у вигляді слідів зв'язок всередині гелю. Ліва доріжка показує стандарт Британської Фармакопеї, доріжка поруч з нею показує колонку застосування (містить О-деглікозильовану форму, відповідну стандарту Британської Фармакопеї), за якими йде дев'ять фракцій градієнтного елюювання. Можна побачити, що перші п'ять фракцій вільні від О-деглікозильованих форм, які в основному присутні в останніх трьох-чотирьох фракціях, будучи підтвердженням того, що Одеглікозильована ізоформа залишилася зв'язаною в хроматографічному матеріалі, а також елюатів з колонки на більш пізньому етапі. Критерій збору регулює залишкове співвідношення О-деглікозильованої ізоформи. Фіг. 3: Фотографія фарбування 12.5 % Кумассі електрофорезом в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію MW, маркер молекулярної ваги; 1-4 = препарати ЕПО отримані способом, описаним в прикладах; 5+6 = проба за стандартом Британської Фармакопеї 1 (= біологічний еталонний препарат = суміш епоетину альфа і бета); 7 = порожньо. Кожна проба ЕПО показана до (1, 3, 5), а також після розщеплення (2, 4, 6) з використанням ПНГази. 4 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сам біокаталізатор може також визначатися в слідах зв'язки. стандарт Британської Фармакопеї проявляє подвійний зв'язок після розщеплення. Більш низький, тонкий зв'язок є не-Oглікозильованою (О-деглікозильованою) формою. Можна побачити, що в препаратах ЕПО, отриманих відповідно до способу за винаходом як видно не вистачає нижньої зв'язки, яка підтверджує, що О-деглікозильована форма була видалена під час стадії ВЕРХ. Детальний опис винаходу Справжній винахід надає спосіб ізоляції, а також очищення поліпшених препаратів ЕПО з незначним вмістом не-O-глікозильованих ізоформ, або взагалі без них, а також значною мірою вільних від сполук. Подібна мета досягається шляхом зменшення вмісту не-O-глікозильованих ізоформ ЕПО за допомогою обернено-фазною (ОФ) рідинної хроматографії високого тиску (ВЕРХ) при певних умовах, а також з подальшим застосуванням щаблі катіонно - обмінної хроматографії (CEX). Зокрема, даний винахід відносяться до способу очищення ізоформ глікозильованого еритропоетину (ЕПО) від складної суміші білків, способом, який містить стадію хроматографії з аніонним обміном, а також стадію катіонно-обмінної хроматографії (CEX), які розділяються стадією хроматографії з оберненою фазою. Термін "ізоформа", в тому значенні, в якому він застосовується в даному випадку, відноситься до препаратів / фракцій глікопротеїнів, які містять глікопротеїни з ідентичними амінокислотними послідовностями, але різними ізоелектричними точками, як було виявлено, наприклад, шляхом використання гелів для ізоелектричного фокусування (ІЕФ) або певного числа зарядів, як визначається, наприклад, шляхом капілярного зонного електрофорезу (КЗЕ). Ці відмінності відображають гетерогенність у зразку глікозилювання. Окремі молекули ЕПО можуть відрізнятися в залежності від розміру, складності, природи, антенності, а також порядку приєднаних глікозилових, сіалілових, а також ацетилових груп. Навіть заряджені неорганічні групи, такі як фосфати, а також сульфати, можуть позначиться на природі окремих ізоформ. Таким чином, глікопротеїнові ізоформи, відповідно до винаходу, визначаються за їх певною ізоелектричною точкою, а також їх ідентичною амінокислотною послідовністю, а також кожна ізоформа може, відповідно, фактично включати в себе безліч різних молекул ЕПО строго в хімічному сенсі. Відповідно до способу за винаходом аніонообмінна хроматографія застосовується переважно для вибору ізоформи ЕПО, зокрема високо сіалатованих кислотних ізоформ ЕПО; див. також Фіг. 1. Відповідно до за винаходом, "кислотні ізоформи" ЕПО включають в себе ті ізоформи, які містять високий ступінь або вміст глікозілових, а також переважно сіалілових груп, таким чином маючи низьку (кислотну) ізоелектричну точку. Рекомбінантний людський ЕПО, при аналізі із супернатанта культури клітин шляхом ІЕФ, показує широкий профіль ізоформи ізоелектричної точки (pI) з присутністю до максимум 14 різних ізоформ понад діапазон ізоелектричної точки3-9 (Gokana і співавтори., J. Chromatogr. 791 (1997), 109-118). Ізоформи ЕПО виникають, в основному, завдяки різному вмісту глікозилу з різною кількістю негативно заряджених залишків термінальних сіалових кислот. Форми ЕПО з великою кількістю залишки сіалових кислот, а також, відповідно, великою кількістю кислотних ізоелектричних точок відомі своєю більш високою біологічною активністю, а також терапевтичною цінністю, через те, що термінальні залишки сіалових кислот в гліко-структурах перешкоджають швидкому вивільненню ЕПО в умовах живого організму асіало-рецепторним способом. Стадія аніонообмінної хроматографії може бути здійснена з використанням аніонообмінних смол або мембрани які містять діетіламіноетилові групи (ДЕАЕ), четвертинні аміноетілові групи (ЧАЕ), групи четвертинного амонію (Q), діметиламіноетилові групи (DMAE) та/або триметиламіноетилові групи (ТМАЕ) як групи. Типові матеріали аніонного обміну це Dowex.RTM. 1, доступні від компанії Доу Кемікал (Dow chemical), AG.RTM. (Наприклад, тип 1, 2, 4), BioRex.RTM. 5, ДЕАЕ Біо-гель 1, Macro-Prep.RTM. Всі ДЕАЕ доступні від виробника, БіоРад Лабораторіз (BioRad Laboratories), аніонообмінні смоли, тип 1, доступні від компанії Ейхром Текнолоджіз (Eichrom Technologies Inc.), Source Q, ANX Sepharose 4, ДЕАЕ Sepharose (наприклад, тип CL-6B, FF), Q Sepharose, Capto Q, Capto S все доступні від компанії Джі І Хелскеа (GE Healthcare), AX-300 доступні від компанії ПеркінЕлмер (PerkinElmer), Asahipak ES502C, AXpak WA (наприклад, тип 624, G), IEC ДЕАЕ всі доступні від компанії Шоко Америка (Shoko America Inc.), Amberlite.RTM. IRA-96, Toyopearl.RTM. ДЕАЕ, TSKгель ДЕАЕ все доступні від компанії Тосо Біосайнс (Tosoh Bioscience GmbH, Mustang Q доступний від компанії Полл Корпорейшн (Pall Corporation). В переважному варіанті способу за винаходом, стадія аніонообмінної хроматографії виконується з використанням Q-сефарози; див. також приклади. Як описано, отримання низько сіалатованих основних, а також вибір високо сіалатованих кислотних ізоформ ЕПО, відповідно, переважно виконується з використанням лінійного сольового градієнта від 0 до 200ммоль NaCl в буфері, що містять 20ммоль трис-HCl при pH 5 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 становить близько 7,0. Далі, відповідно до способу за винаходом, застосовується стадія хроматографії з оберненою фазою для вибору O-глікозильованиої ізоформи ЕПО. Як показано в прикладах, така ізоформа ЕПО може бути елюйована з використанням лінійного градієнта органічного розчинника, переважно із вмістом від 0 до 70 % ацетонітрилу в воді, а також містить близько 0.1 % ТФК. Додатково, або в якості альтернативи, застосовується ізократичне елюювання ЕПО з використанням розчинника, що містить ацетонітрил, а також близько 0,1 % ТФК у воді. Засоби, а також методи проведення хроматографії з оберненою фазою, добре відомі фахівцям; див. також раніше згадані способи в розділі передумов дослідження. Переважно, стадія хроматографії з оберненою фазою містить обернено-фазову високоефективну рідинну хроматографію (ОФ-ВЕРХ). Як правило, °F-ВЕРХ виконується з використанням смол, які містять метилові, бутилові, фінілові, пропілові та/або октілові групи в якості групи. В переважному варіанті способу за винаходом, °F-ВЕРХ виконується з використанням комерційно доступного для хроматографії з оберненою фазою матеріалу C4. Типовими обернено-фазними матеріалами є: Vydac 214TPB1015, C4 доступний від компанії Грейс Девісон (Grace Davison); Daisopak SP-300-15-C4-BIO доступні від компанії ДІАЗ Файн Ким (DAISO Fine Chem.GmbH); YMC гель Butyl Sphärisch C4, 15μ, 300A доступний від компанії Вай ЕМ Сі Юроп (YMC Europe GmbH); Jupiter 15μ, C4, 300A доступний від компанії Феноменекс (Phenomenex). Переважно, застосовується Vydac C4 (Vydac) складається із силікатного гелю, поверхня частинок якого містить C4-алкілові ланцюжки. Відділення ЕПО від білкових домішок засноване на різниці сили гідрофобних взаємодій. Елюювання виконується з використанням ацетонітрилового градієнта у воді з присутністю розведеної трифтороцетної кислоти. Зазвичай, частину "піку ЕПО" доводиться зрізати шляхом фракціонування. Наприклад, в числі, яке становить близько 9 або 10 фракцій елюату, що містять ЕПО, зразки з останнього по четвертий які, як правило, можуть складати до 40 % всього піку ЕПО, необхідно відбраковувати, в той час, як залишки збору елюату далі очищають на наступному рівні; див. також Фіг. 2. Відповідно з використанням за винаходом препаративна ОФ-ВЕРХ зазвичай виконується при високому тиску> 10 бар (за препаративною шкалою до 30-40 бар), а також невеликих кульок (5-10 µm) зазвичай силікогелеві, які ведуть до кращого розподілу. Переважно, pH розчинників, окислених з використанням ТФК, становить близько 2. Застосування елюату АОХ при низькій концентрації ацетонітрилу (наприклад, 10 % або в чистій воді), а також підвищення концентрацій градієнта ацетонітрилу елюює ізоформу ЕПО. У зв'язку з цим, спостерігається, що ОФ-ВЕРХ, який застосовується згідно зі способом за винаходом, значно відрізняється від звичайної хроматографії з оберненою фазою (ОФХ), яка виконується при низькому тиску (також згадується, як спосіб середнього тиску, 110,000 МО / мг, яка може бути досягнута завдяки збагаченню високо сіалатованих 9 UA 107678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ізоформ ЕПО. Таким чином, препарати ЕПО за винаходом якнайкраще підходять для терапевтичного застосування. Відповідно, даний винахід також відноситься до фармацевтичних складів, які включають препарати ЕПО за винаходом, як зазначено вище. У зв'язку з цим, даний винахід також відноситься до процесів виробництва фармацевтичного складу, процесів, що включають приготування, ізолювання ЕПО у вигляді суміші гліко-ізоформ, як описано вище, а також надає таким чином приготовану суміш, а також ізольованого ЕПО з використанням фармацевтично прийнятного носія. В одному варіанті даний винахід відноситься до стабільної фармацевтичної форми препарату EПО, яка містить трис-(гідроксиметил)-амінометан як стабілізатор, причому ця форма не містить амінокислот або людського сироваткового альбуміну, найбільш бажано, містить, як рН буферний агент, буфер фосфату натрію, як стабілізатор, трис-(гідроксиметил)амінометан в кількості від 10 до 200 мМ і / або NaCl у кількості 20-150 мМ та фармацевтичну кількість очищеного ЕПО. Інші варіанти ЕПО форм за винаходом можна побачити в заявці на європейський патент EP 1537876, розкриття змісту яких включено сюди у вигляді посилань. Лікарський препарат за винаходом описаний як стерильний та апірогенний. У тому значенні, в якому тут використовується термін "лікарський препарат" він містить склад для використання в медицині людини та ветеринарній медицині. Способи приготування лікарського препарату за винаходом відповідають сучасним способам, описаним в Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), а також оновленої версії Remington: Science and Practice of Pharmacy (2000) Філадельфійського Університету Природничих Наук, ISBN 0-683-306472, повний опис обох документів включено в даний опис у вигляді посилання. Ці та інші варіанти розкрито та розглянуто в описі та прикладах до даного винаходу. Додаткова Джерела інформації: щодо будь-яких матеріалів, спосібів застосування та сполук, наприклад, може бути використана база даних "Medline", розміщена в Національному центрі біотехнологічної інформації та/або Національна медична бібліотека при Національному інституті охорони здоров'я. Інші бази даних та веб-адреса, такі як дані Європейського інституту біоінформатики (EBI), який є частиною Європейської лабораторії молекулярної біології (EMBL), відомої спеціалістам в цій галузі, також може бути отримана за допомогою пошукових систем в Інтернеті. Огляд патентної інофрмації в галузі біотехнологій та огляд відповідних джерел патентної інформації, корисної для ретроспективного пошуку та поточної поінформованості подано в Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364. Вищесказане в загальних рисах описує даний винахід. Якщо не вказано інше, терміни, що тут використовуються, визначаються відповідно до процедури, передбаченої Оксфордським словником біохімії та молекулярної біології, Oxford University Press, 1997, 2000 та його повторним виданням 2003, ISBN 0 19 850 673 2. Декілька документів наведено в тексті даної специфікації. Зміст усіх наведених посилань (у тому числі посилання на літературу, видані патенти, опубліковані патентні заявки, згадані в даній заявці та специфікації виробника, інструкції, і т.д.), подано в якості посилань, однак, це не означає, що будь-який поданий документ є необхідним для даного винаходу. Повніше розуміння можна отримати після ознайомлення с наведеними прикладами, розміщеними тут виключно для ознайомлення, а також не ставлять собі за мету обмежити рамки данного винаходу. Зокрема, приклади належать до переважних варіантів даного винаходу. Приклади Якщо не визначено інше, всі технічні та наукові терміни, що використовуються тут, мають ті ж значення, які зазвичай розуміють під ними фахівці даної галузі (наприклад, в клітинній культурі, молекулярній генетиці, полінуклеоїдній хімії, техніці гібридизації, білковій хімії та біохімії). Стандартні техніки використовуються для молекулярних, генетичних, а також біохімічних методів (див. здебільшого, Sambrook та співавтори., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, видання друге (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., а th також АЕsubel та співавтори., Short Protocols в Molecular Biology (1999) 4 Ed, John Wiley & Sons, Inc., а також повну версію під назвою Current Protocols в Molecular Biology, згадану тут у вигляді), а також хімічні способи. 55 60 Початковий матеріал Середовище, що містить білок ЕПО, утворюється великою перфузійною культурою трансформованих клітинних ліній яєчника китайського хом'яка (ЯКХ дигідрофолатредуктази-), що містить ампліфікований ЕПО ген людини як описано в рівні техніки; див., наприклад, вищевказану літературу. Концентрація білків ЕПО в середовищі культури відноситься до 10 UA 107678 C2 5 10 15 зростання клітин. На практиці, рівень експресії продукту (мг на одиницю об'єму) обмежений максимально досягнутою кількістю клітин. Таким чином, виробництво максимізоване за допомогою постійної системи клітинної перфузії, яка дозволяє підтримувати високу щільність клітинних культур протягом тривалого періоду вирощування. Перфузія ініціюється при певній клітинній щільності, і рівень перфузії підтримується вручну на певному рівні відносно кількості клітин. утримування клітин досягається шляхом таких стандартних процедур, як акустична сепарація, фільтрування або центрифугування. Перфузат клітин, які виросли в культурі, збирається частинами при температурі охолодження. Вся кампанія, як правило, складається з декількох тижнів перфузії культур, з яких встигають зібрати 5-10 зборів. Залишкові клітини, а також осад з перфузата видаляється шляхом глибинної фільтрації, а білок переважно концентрують шляхом ультрафільтрації тангенціальним потоком з використанням зрізу молекулярного ваги в 30 кДа. Концентрати поділяють на аліквоти, і зберігають при ≤ -70 °C поки не будуть зібрані всі збори. Концентровані збори перекладають у відділення розморожування. Змішані і відтануті збори очищають шляхом фільтрації крізь фільтр 0,45 μm. Усі стадії спрямованого очищення після розморожування проводять при кімнатній температурі (1725 °C).и Склади буферів і розчинів Розчини буферів для кожної стадії очищення описано нижче, в таблиці 1. Таблиця Склад буферів Етап використання Афінна хроматографія Діафіль-трація Аніоно-обмінна хромато-графія ОФ-ВЕРХ Катіономем-бранна хроматографія Буфер/розчин Використання Буфер попереднього 20 ммоль трис-,HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5 урівноваження 20 ммоль трис-,HCl, pH 7,5 Буфер урівноваження 20 ммоль трис-,HCl, pH 7,5 промивний буфер 20 ммоль трис-,HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5 буфер елюювання 5 M сечовина відновлення 0,5 M NaOH дезінфекція 0,01 M NaOH зберігання 1 M NaOH дезінфекція Буфер урівноваження та 20 ммоль трис-,HCl, pH 7,0 діафільтраціі буфер попереднього 20 ммоль трис-,HCl, 1,0 M NaCl, pH 7,0 урівноваження Буфер урівноваження і 20 ммоль трис-,HCl, pH 7,0 промивний буфер 20 ммоль трис-,HCl, pH 7,0 розчин для елюювання A 20 ммоль трис-,HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,0 розчин для елюювання B 20 ммоль трис-,HCl, 1,0 M NaCl, pH 7,0 відновний буфер 1 M NaOH дезінфекція 0,01 M NaOH зберігання 0,1 % (в співвідношенні один до одного) ТФК урівноважування 0,1 % (в співвідношенні один до одного) ТФК розчин для елюювання A у воді для інєкцій 100 % (в співвідношенні один до одного) ацетонітрил + 0,1 % (в співвідношенні один розчин для елюювання B до одного) ТФК 100 % (в співвідношенні один до одного) відновлення ацетонітрил 60 % (в співвідношенні один до одного) очищення, та зберігання ацетонітрил буфер попереднього 100 мм гліцин, HCl, pH 2,0 урівноваження 20 ммоль гліцин, HCl, pH 2,0 рівноважний буфер 20 ммоль гліцин, HCl, pH 2,0 Буфер для промивання 11 UA 107678 C2 Таблиця Склад буферів Етап використання Ультрафіль-трація Гель-фільтраційна хроматографія Нанофільтрація 5 10 Буфер/розчин 10 ммоль NaPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,2 10 ммоль NaPO4, 1,0 M NaCl, pH 7,2 0,01 M NaOH 1 M NaOH 1 M NaOH 10 ммоль NaPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,2 0,5 M NaOH 100 ммоль NaPO4, pH 7,2 10 ммоль NaPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,2 1,0 M NaOH 0,01 M NaOH 10 ммоль NaPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,2 Використання буфер елюювання відновний буфер зберігання дезінфекція дезінфекція рівноважний буфер дезінфекція буфер попереднього урівноваження рівноважний буфер дезінфекція зберігання рівноважний буфер П'ять наступних колонок хроматографічних процесів використовуються для очищення кожного зібраного концентрату для отримання партії високосіалатованих, а також Oглікозильованих ЕПО для використання в терапевтичних цілях; див. також Фіг. 1. Приклад 1: Захоплення ЕПО, і зниження потенційних забруднень шляхом афінної хроматографії з використанням сефарози Синьої 6FF Сефароза Синя 6FF - це агароза ковалентно пов'язана з барвником Cibacron синій, застосовується переважно для зв'язування ЕПО в присутності забруднюючих домішок, що містяться в ферментованому зборі. Потік продукту спочатку очищають шляхом афінної хроматографії, як зазначено в таблиці 2. Таблиця 2 Параметри виконання хроматографії з використанням сефарози Синьої… No. 1, 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 Виробнича операція Контроль Бажаний обсяг / толерантність сефароза Синя - 10 × 12 см = 1 L (ДФГ 100/500) - Установка: Bioprocess - Форма випуску: 2,4 л концентрату = макс, 3,000 мг ЕПО (1-1,5 мг ЕПО / мл) - Елюатів: ~ 500 мл пул в 100 мл Колба Schott (~ 4 мг ЕПО / мл) Завантаження і N > 2,500 / м ВЕТТ / асиметрія кваліфікація колонки 0,7 < As 0,15 ініціалізація збору оптична щільність < 0,15, але Критерії збору зупинка збору Vol.  0,5 КВ температура ТР = 22±2C Зберігання зразків час залишити на ніч, макс. 18 год. Пост-обробка колонки 1. сечовина: концентрація 5M 12 UA 107678 C2 Таблиця 2 Параметри виконання хроматографії з використанням сефарози Синьої… No. Виробнича операція Контроль час 2. NaOH: концентрація час Бажаний обсяг / толерантність 30 хв, 90см / хв, , 0,1 N 1 год., 90 см / хв, Тривалість: приблизно 5 год. 5 10 15 20 Колонку заправляють з використанням сефарози Синьої 6FF. Після заправки, колонку готують для теоретичних тарілок, а також фактора асиметрії. Колонку дезінфікують з використанням 0,5 M NaOH протягом 1:00, а потім прополіскують з використанням води для ін'єкцій. Перед завантаженням, колонку врівноважують з використанням 20 ммоль трис-.HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5, а потім 20 ммоль трис-.HCl, pH 7,5. Зразок поміщають в колонку, і колонку промивають з використанням 20 ммоль трис-.HCl, pH 7,5. Зразок елюірується за допомогою 20 ммоль трис-.HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5. Проби знімають після того, як оптична щільність між предпіком і головним піком складе не менше 0,15. Збір закінчується, коли оптична щільність дорівнює або менша 0,15. Елюати збирають в стерильний одноразовий пакет. Після елюювання, колонку прополіскують з використанням води для ін'єкцій, і потім знімають білок, шляхом промивання з використанням 5 M сечовини. Подальші промивання виконують з використанням води для ін'єкцій, колонку дезінфікують з використанням 0,5 M NaOH. Колонку прополіскують з використанням води для ін'єкцій, і зберігають в 0,01 M NaOH. Подальша інформація щодо хроматографічних смола надається в нормативних документах виробника (представника компанії Джі І Хелскеа (GE Healthcare) нормативна документація щодо сефарози Синьої). Приклад 2: Концентрація ЕПО шляхом діафільтраціі Елюати концентрують шляхом ультрафільтрації, виконуючи діафільтрацію за допомогою мембрани зі зрізом 10 кДа тангенціального поточного фільтра; див.таблицю 3. Таблиця 3 Параметри виконання діафільтраціі. No, 2. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Процедура виробництва Контроль Бажаний об'єм / толерантність Діафільтрація - Установка: Proflux - 0,1 m² 10 кДа мембрана Hydrosart - 500 мл BS елюіатів, концентрують до об'єму 300 мл, здійснюють діафільтрацію розчину з використанням 6-ти кратного обсягу розчину, промивають з використанням 2 × 200 мл = 700 мл ретентату Кваліфікація мембрани Водний еквівалент Дезінфекція мембрани Реагент 1 N NaOH реагент час Як мінімум 30 хв, Температура потоку 22±2ºC ретентата 1 бар Виконання діафільтраціі вхідний тиск 0,5 бар вихідний тиск 6-ти кратний обсяг діафільтраціі 4±2ºC температура Концентрат зберігання безпос, повторн, час використання макс, 24 ч Пост-обробка Реагент 1 N NaOH мембрани час Як мінімум 30 хв. Вивільнення IPC Провідність 4,000 / м ВЕТТ / асиметрія кваліфікація колонки 0,6 < As < 2,0 Розморожування Час концентрації NaOH 1±0,05 N концентратів 1 год., 90 см / год. 7,0±0,1 pH після врівноваження 45±3 мл / хв, = 90 см/год. швидкість потоку 22±2ºC Фільтрація концентратів температура макс, 3 мг ЕПО /мл гель Завантаження макс, 1,500 мг ЕПО Градієнт 0-25 M NaCl в 30 КВ оптична щільність ~ 85 % максимум піку, Ініціалізація збору Дезінфекція колонки оптична щільність ~ 25 % Зупинка збору максимум піку, для білків і ЕПО температура ТР = 22±2ºC Хід виробництва час Залишити на ніч, макс, 18 год. Концентрація NaOH 1±0,05 N Критерії збору Час 1 год., 90 см /год. Визначити 0,01 критерії збору Зупинка збору ~ 45 % максимума піку температура ТР = 22±2ºC Зберігання зразків час Залишити на ніч, макс, 18 год. ацетонітрил 100 % (співвідношенні один до Пост-обробка колонки час одного) 1 год. Тривалість: приблизно 6 год., 30 Колонку заправляють з використанням смол C4. Колонку врівноважують з використанням 0,1 % (у співвідношенні один до одного) ТФК у воді для ін'єкцій. Перед використанням, продуктивність колонки визначається шляхом визначення номера тарілки, а також фактора асиметрії. Зразок поміщають в колонку, і потім елюірують з використанням лінійного градієнта, описаного в таблиці 1 та 6. Елюати збирають, як тільки абсорбція при 280 нм досягне 0,01 АЕ, а 15 UA 107678 C2 5 також переривають збір, при зниженні абсорбції до 40 % - 45 % пікового Максимуму слабшання скошенного живильного середовища. Елюати збирають в скляну пляшку. Як було згадано раніше, градієнт формують з води / ТФК 0,1 % (розчинник A), а також води 30 % / ацетонітрилу 70 % (у співвідношенні один до одного) / ТФК 0,1 % (розчинник B). Зокрема, в якості зразка був використаний пул розморожених фракцій елюіату Q сефарози HP, і відфільтрований крізь 0,2 μm фільтр. Після промивання колонки з використанням обсягів двох колонок (ОК) Milli-Q води, а також врівноваження з використанням 4 КВ розчинника A, зразок був завантажений в колонку, і був застосований градієнт відповідно до таблиці 6. Таблиця 6 Градієнт виконання ОФ-ВЕРХ Час (хв.) 0 9,2 18,3 52,7 59,5 75,6 91,6 108,8 Загальний об'єм (л) %A 100 50 50 20 0 0 100 100 ~5 %B 0 50 50 80 100 100 0 0 ~6 10 15 20 25 30 Елюати збирають в 50 мл фракції які зберігається при -20 C. Між використанням, смолу відновлюють, а колонку готують шляхом вимірювання теоретичних тарілок, а також фактора асиметрії. Спочатку, колонку промивають за допомогою градієнта з 70 % (у співвідношенні один до одного) ацетонітрил до 100 % (у співвідношенні один до одного) ацетонітрилу. Потім колонку промивають з використанням 100 % (у співвідношенні один до одного) ацетонітрилу. Концентрацію ацетонітрилу знижують шляхом промивання з використанням градієнта в 100 % (у співвідношенні один до одного) ацетонітрилу до 60 % (у співвідношенні один до одного) ацетонітрилу, а колонку потім зберігають в 60 % (у співвідношенні один до одного) ацетонітрилу. Подальша інформація про хроматографічні смоли надається в нормативних документах виробника (представника Vydac, нормативна документація про смоли С4). Приклад 5: Деактивація вірусу шляхом інкубації ЕПО в ацетонітрилі / ТФК Після етапу ОФ-ВЕРХ, елюати витримують від 60 до 180 хвилин при 22±3 °C. Концентрація ацетонітрилу в елюаті складає приблизно 41 % (у співвідношенні один до одного), а концентрація ТФК складає приблизно 0,1 % (у співвідношенні один до одного). Під час цієї стадії процесу, здійснюють контроль за температурою і часом витримки. Приклад 6: Видалення ОФ-ВЕРХ розчинників, і агрегованих частинок ЕПО за допомогою катіонно - обмінної хроматографії з використанням MacroPrep High S. Катіонно - обмінна хроматографія з використанням MacroPrep High S смоли застосовується для видалення ОФ-ВЕРХ розчинників, а також агрегованих частинок і для обміну буфера в досить короткий час. Елюати, отримані в результаті ОФ-ВЕРХ обробляють шляхом катіонно обмінної хроматографії, як зазначено в таблиці 7, з подальшою 0,2μm фільтрацією MacroPrep елюіатів. Таблиця 7 Параметр проведения катіонно - обмінної хроматографії. No. 5. 5.1 Операція Контроль Бажаний об'єм / толерантність Macroprep HighS - 5 × 12,5 см = 250 мл - Установка: ÄKTA Purifier - Форма випуску: 400-500 мл елюіатів з RP колонки = макс, 1,250 мг ЕПО - Елюіатів: ~ 250 мл в 50 мл пробірка фірми Falcon (~ 3 мг ЕПО / мл) Завантаження і N > 2,500 / м ВЕТТ / асиметрія кваліфікація 0,6 < As 0,03 оптична щільність 280 < 0,03 ТР = 22±2ºC Концентрувати негайно після проведення, макс, 24 год. 1±0,05 N 1 год., Тривалість: приблизно 3 год. + 3 год. перед-, а також пост-обробка 5 10 15 20 25 Колонку заправляють з використанням MacroPrep High S смол. Після заправки, колонку готують для теоретичних тарілок, а також фактора асиметрії. Колонку прополіскують з використанням води для ін'єкцій, а потім дезінфікують з використанням 1 M NaOH протягом мінімум 1:00. Після дезінфекції, колонку прополіскують з використанням води для ін'єкцій. Перед завантаженням, колонку попередньо врівноважують з використанням 100 ммоль гліцинHCl, pH 2,0, і потім врівноважують з використанням 20 ммоль гліцин-HCl, pH 2,0. Зразок поміщають в колонку, а колонку промивають з використанням 20 ммоль гліцин-HCl, pH 2,0. Зразок елюіруєтся за допомогою різкого градієнта, як описано в таблиці 1. Елюати збирають як тільки абсорбція при 280 нм досягне 0,03 АЕ, а також переривають, коли абсорбція досягне 0,03 АЕ. Елюіати зберігають у стерільному одноразовому пакеті. Елюати, отримані в результаті катіонно - обмінної хроматографії фільтрують за допомогою 0,2 μm фільтра перед подальшим очищенням та/або починають витримувати при 22±3 °C протягом до 20 годин в стерільному одноразовому пакеті. Між використанням, смолу відновлюють. Колонку промивають з використанням 10 ммоль NaPO4, 1,0 M NaCl, pH 7,2, і потім прополіскують з використанням води для ін'єкцій. Агрегати ЕПО елюірують в регенерат. Колонку дезінфікують з використанням 1 M NaOH протягом мінімум 1:00, і прополіскують з використанням води для ін'єкцій. Колонку зберігають в 0,01 M NaOH. Подальша інформація про смоли надається в нормативних документах виробника (представника BioRad, нормативна документація по MacroPrep High S). Приклад 7: Ультрафільтрація За бажанням, відфільтрований після катіонно - обмінної хроматографії елюат надалі концентрують, шляхом ультрафільтрації за допомогою тангенціального поточного фільтра з використанням 10 кДа зрізу для досягнення бажаного зменшення обсягу. Інформація про етапи фільтрації надається в таблиці 8. 17 UA 107678 C2 Таблиця 8 Параметри для проведення ультрафільтрації. No. 6. 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 Операція Контроль Бажаний об'єм/ толерантність ультрафильтрація - Установка: Amicon Stirred Cell - 76 мм плоска мембрана YM-10 кДа - Концентрувати від 250 мл до 80 мл, промити з використанням 2 × 10 мл = 100 мл Кваліфікація мембрани водний еквівалент 0,1 N NaOH Дезінфекція мембрани Час дії реагента Як мінімум 1год температура Тиск подачі 22±2ºC Виконання UV280 в ретентат бар ультрафильтрації UV280 в відфільтрований < 0,05 розчин температура ТР = 22±2ºC Зберігання концентрату час Залишити на ніч, макс, 18 год. Реагент 0,1 N NaOH Пост-обробка мембрани час Як мінімум 1 год., 5 < X 0,01 оптична щільність280