Фармацевтична композиція, що містить поліпептид, який являє собою білковий фактор дозрівання в-клітин (всма), що зв’язується з фактором активації в-клітин (baff), спосіб інгібування росту в-клітин, спосіб лікув

1. Спосіб інгібування росту В-клітин ссавця, що включає в себе стадію введення терапевтичнo ефективної кількості композиції, яка містить (a) поліпептид, який являє собою білковий фактор дозрівання В-клітин (ВСМА), який містить аміноки 2 (19) 1 3 75049 4 менше на 80 % ідентична амінокислотам 1-51 пос(d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ лідовності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що ID NO:1. зв’язується з BAFF; або 7. Спосіб лікування В-клітинного лімфопроліфера(b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну тивного порушення у ссавця, що включає в себе послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайстадію введення терапевтично ефективної кількоменше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 поссті композиції, яка містить лідовності SEQ ID NO:1; або (a) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну (c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайпослідовність відповідно до (а) або (b), злиту з менше на 80 % ідентична амінокислотам 1-51 посгетерологічною амінокислотною послідовністю; лідовності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що або зв’язується з BAFF; або (d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ (b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну ID NO:1. послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонай4. Спосіб лікування аутоімунного захворювання у менше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 посссавця, що включає в себе стадію введення тералідовності SEQ ID NO:1; або певтичнo ефективної кількості композиції, яка міс(c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну тить послідовність відповідно до (а) або (b), злиту з (a) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну гетерологічною амінокислотною послідовністю; послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайабо менше на 80 % ідентична амінокислотам 1-51 пос(d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ лідовності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що ID NO:1. зв’язується з BAFF; або 8. Спосіб інгібування запалення у ссавця, що (b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну включає в себе стадію введення терапевтичнo послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайефективної кількості композиції, яка містить менше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 пос(a) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну лідовності SEQ ID NO:1; або послідовність, що зв'язується з BAFF і щонаймен(c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну ше на 80% ідентична амінокислотам 1-51 послідопослідовність відповідно до (а) або (b), злиту з вності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що гетерологічною амінокислотною послідовністю; зв’язується з BAFF; або або (b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну (d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ послідовність, що зв'язується з BAFF і щонайменID NO:1. ше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 послі5. Спосіб лікування гіпертонії у ссавця, що включає довності SEQ ID NO:1; або в себе стадію введення терапевтичнo ефективної (c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну кількості композиції, яка містить послідовність відповідно до (а) або (b), злиту з (a) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну гетерологічною амінокислотною послідовністю; послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайабо менше на 80 % ідентична амінокислотам 1-51 пос(d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ лідовності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що ID NO:1. зв’язується з BAFF; або 9. Спосіб модулювання імунної відповіді, яка бере (b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну участь у передачі сигналу між ВСМА і BAFF, у ссапослідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайвця, що включає в себе стадію введення терапевменше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 постичнo ефективної кількості композиції, яка містить лідовності SEQ ID NO:1; або (а) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну (c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайпослідовність відповідно до (а) або (b), злиту з менше на 80 % ідентична амінокислотам 1-51 посгетерологічною амінокислотною послідовністю; лідовності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що або зв’язується з BAFF; або (d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ (b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну ID NO:1. послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонай6. Спосіб лікування ниркового порушення у ссавця, менше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 посщо включає в себе стадію введення терапевтичнo лідовності SEQ ID NO:1; або ефективної кількості композиції, яка містить (c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну (a) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну послідовність відповідно до (а) або (b), злиту з послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайгетерологічною амінокислотною послідовністю; менше на 80 % ідентична амінокислотам 1-51 посабо лідовності SEQ ID NO:1, або його фрагмент, що (d) антитіло, що зв'язується з послідовністю SEQ зв’язується з BAFF; або ID NO:1. (b) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну 10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид послідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайВСМА містить амінокислотну послідовність, що менше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 посзв'язується з BAFF і яка щонайменше на 90 % іделідовності SEQ ID NO:1; або нтична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ ID (c) поліпептид ВСМА, який містить амінокислотну NO:1. послідовність відповідно до (а) або (b), злиту з 11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид гетерологічною амінокислотною послідовністю; ВСМА містить амінокислотну послідовність, що або зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 90 % іде 5 75049 6 нтична амінокислотам 1-51 послідовності SEQ ID 25. Фармацевтична композиція за п. 23, де поліпеNO:1. птид ВСМА містить амінокислоти 1-51 послідовно12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид сті SEQ ID NO:1 або її фрагмент, що зв'язується з ВСМА містить амінокислоти 8-41 послідовності BAFF. SEQ ID NO:1. 26. Фармацевтична композиція за п. 23, де поліпе13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид птид ВСМА містить амінокислоти 8-41 послідовноВСМА містить амінокислоти 1-51 послідовності сті SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1. 27. Фармацевтична композиція за п. 23, де поліпе14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, ВСМА містить Fc-домен імуноглобуліну. що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 85 % 15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де антитіло явідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ ляє собою моноклональне антитіло. ID NO:1. 16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де антитіло зв'я28. Фармацевтична композиція за п. 27, де поліпезується з амінокислотами 1-51 послідовності SEQ птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, ID NO:1. що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 90 % 17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де ссавець є ідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ людиною. ID NO:1. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид 29. Фармацевтична композиція за п. 23, де поліпеВСМА є розчинним. птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, 19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де поліпептид що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 85 % ВСМА не містить трансмембранного домена ідентична амінокислотам 1-51 послідовності SEQ ВСМА. ID NO:1, або її фрагмент, що зв’язується з BAFF. 20. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де вказаний по30. Фармацевтична композиція за п. 29, де поліпеліпептид містить поліпептид ВСМА, який по суті птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, складається з що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 90 % (а) амінокислотної послідовності, що зв'язується з ідентична амінокислотам 1-51 послідовності SEQ BAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміноID NO:1, або її фрагмент, що зв’язується з BAFF. кислотам 1-51 послідовності SEQ ID NO:1, або її 31. Фармацевтична композиція, що містить фарфрагмента, що зв’язується з BAFF; або мацевтично прийнятний носій і кількість поліпеп(b) амінокислотної послідовності, що зв'язується з тиду ВСМА, ефективну для інгібування росту ВBAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміноклітин і/або продукування імуноглобуліну, де полікислотам 8-41 послідовності SEQ ID NO:1. пептид ВСМА містить: 21. Фармацевтична композиція, яка містить фар(a) амінокислотну послідовність, що зв'язується з мацевтично прийнятний носій і кількість антитіла, BAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична амінощо зв'язується з послідовністю SEQ ID NO:1, ефекислотам 1-51 послідовності SEQ ID NO:1, або її ктивну для інгібування росту В-клітин і/або продуфрагмент, що зв’язується з BAFF; або кування імуноглобуліну. (b) амінокислотну послідовність, що зв'язується з 22. Фармацевтична композиція, яка містить фарBAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміномацевтично прийнятний носій і кількість антитіла, кислотам 8-41 послідовності SEQ ID NO:1; або що зв'язується з амінокислотами 1-51 послідовно(c) амінокислотну послідовність відповідно до (а) сті SEQ ID NO:1, ефективну для інгібування росту або (b), злиту з гетерологічною амінокислотною В-клітин і/або продукування імуноглобуліну. послідовністю, 23. Фармацевтична композиція, що містить фарі де поліпептид ВСМА не містить трансмембранномацевтично прийнятний носій і кількість поліпепго домена ВСМА. тиду ВСМА, ефективну для інгібування росту В32. Фармацевтична композиція за п. 31, де поліпеклітин і/або продукування імуноглобуліну, де поліптид ВСМА містить амінокислотну послідовність, пептид ВСМА містить: що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 85 % (a) амінокислотну послідовність, що зв'язується з ідентична амінокислотам 1-51 послідовності SEQ BAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміноID NO:1, або її фрагмент, що зв’язується з BAFF. кислотам 1-51 послідовності SEQ ID NO:1, або її 33. Фармацевтична композиція за п. 32, де поліпефрагмент, що зв’язується з BAFF; або птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, (b) амінокислотну послідовність, що зв'язується з що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 90 % BAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміноідентична амінокислотам 1-51 послідовності SEQ кислотам 8-41 послідовності SEQ ID NO:1; або ID NO:1, або її фрагмент, що зв’язується з BAFF. (c) амінокислотну послідовність відповідно до (а) 34. Фармацевтична композиція за п. 33, де поліпеабо (b), злиту з гетерологічною амінокислотною птид ВСМА містить амінокислоти 1-51 послідовнопослідовністю. сті SEQ ID NO:1 або її фрагмент, що зв'язується з 24. Фармацевтична композиція за п. 23, де поліпеBAFF. птид ВСМА містить 35. Фармацевтична композиція за п. 31, де поліпе(a) амінокислоти 1-51 послідовності SEQ ID NO:1 птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, або її фрагмент, що зв’язується з BAFF; або що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 85 % (b) амінокислоти 8-41 послідовності SEQ ID NO:1; ідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ або ID NO:1. (c) амінокислотну послідовність відповідно до (а) 36. Фармацевтична композиція за п. 35, де поліпеабо (b), злиту з гетерологічною амінокислотною птид ВСМА містить амінокислотну послідовність, послідовністю. що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 90 % 7 75049 8 ідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ 45. Фармацевтична композиція, що містить фарID NO:1. мацевтичнo прийнятний носій і кількість розчинно37. Фармацевтична композиція за п. 36, де поліпего поліпептиду ВСМА, ефективну для інгібування птид ВСМА містить амінокислоти 8-41 послідовноросту В-клітин і/або продукування імуноглобуліну, сті SEQ ID NO:1. де розчинний поліпептид містить: 38. Фармацевтична композиція, що містить фар(a) амінокислотну послідовність, що зв'язується з мацевтично прийнятний носій і кількість поліпепBAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична амінотиду, ефективну для інгібування росту В-клітин кислотам 1-51 послідовності SEQ ID NO:1, або її і/або продукування імуноглобуліну, де поліпептид фрагмент, що зв’язується з BAFF; або містить поліпептид ВСМА, і по суті складається з (b) амінокислотну послідовність, що зв'язується з (a) амінокислотної послідовності, що зв'язується з BAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміноBAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ ID NO:1; або кислотам 1-51 послідовності SEQ ID NO:1, або її (c) амінокислотну послідовність відповідно до (а) фрагмента, що зв’язується з BAFF; або або (b), злиту з гетерологічною амінокислотною (b) амінокислотної послідовності, що зв'язується з послідовністю. BAFF і яка щонайменше на 80 % ідентична аміно46. Фармацевтична композиція за п. 45, де розкислотам 8-41 послідовності SEQ ID NO:1. чинний поліпептид ВСМА містить амінокислотну 39. Фармацевтична композиція за п. 38, де поліпепослідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайптид ВСМА по суті складається з амінокислотної менше на 85 % ідентична амінокислотам 1-51 поспослідовності, що зв'язується з BAFF і яка щонайлідовності SEQ ID NO:1, або її фрагмент, що менше на 85 % ідентична амінокислотам 1-51 посзв’язується з BAFF. лідовності SEQ ID NO:1, або її фрагмента, що 47. Фармацевтична композиція за п.46, де розчинзв’язується з BAFF. ний поліпептид ВСМА містить амінокислотну пос40. Фармацевтична композиція за п. 39, де поліпелідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонаймептид ВСМА по суті складається з амінокислотної нше на 90 % ідентична амінокислотам 1-51 послідовності, що зв'язується з BAFF і яка щонайпослідовності SEQ ID NO:1, або її фрагмент, що менше на 90 % ідентична амінокислотам 1-51 посзв’язується з BAFF. лідовності SEQ ID NO:1, або її фрагмента, що 48. Фармацевтична композиція за п. 47, де роззв’язується з BAFF. чинний поліпептид ВСМА містить амінокислоти 141. Фармацевтична композиція за п. 40, де поліпе51 послідовності SEQ ID NO:1 або її фрагмента, птид ВСМА по суті складається з амінокислотної що зв'язується з BAFF. послідовності 1-51 послідовності SEQ ID NO:1 або 49. Фармацевтична композиція за п. 45, де розїї фрагмента, що зв'язується з BAFF. чинний поліпептид ВСМА містить амінокислотну 42. Фармацевтична композиція за п. 38, де поліпепослідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайптид ВСМА по суті складається з амінокислотної менше на 85 % ідентична амінокислотам 8-41 поспослідовності, що зв'язується з BAFF і яка на 85 % лідовності SEQ ID NO:1. ідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ 50. Фармацевтична композиція за п. 49, де розID NO:1. чинний поліпептид ВСМА містить амінокислотну 43. Фармацевтична композиція за п. 42, де поліпепослідовність, що зв'язується з BAFF і яка щонайптид ВСМА по суті складається з амінокислотної менше на 90 % ідентична амінокислотам 8-41 поспослідовності, що зв'язується з BAFF і яка на 90 % лідовності SEQ ID NO:1. ідентична амінокислотам 8-41 послідовності SEQ 51. Фармацевтична композиція за п. 50, де розID NO:1. чинний поліпептид ВСМА містить амінокислоти 844. Фармацевтична композиція за п. 43, де поліпе41 послідовності SEQ ID NO:1. птид ВСМА по суті складається з амінокислот 8-41 52. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. послідовності SEQ ID NO:1. 23-51, де поліпептид ВСМА злитий з Fc-доменом імуноглобуліну. Даний винахід відноситься до використання рецептора для BAFF, фактора активації -клітин, що належить до сімейства факторів некрозу пухлини ("TNF"), і до його блокуючих агентів для стимуляції або інгібування експресії B-клітин і імуноглобулінів. Цей рецептор володіє протираковими і імунорегуляторними властивостями, а також використовується для лікування імуносупресорних розладів, таких як ВІЛ-інфекції. Крім того, цей рецептор і його блокуючі агенти грають певну роль у розвитку гіпертонії і споріднених їй розладів. Крім того, клітини, трансфіковані геном вказаного рецептора, можуть бути використані у генній терапії для лікування пухлин, лімфом, аутоімунних хвороб або спадкових генетичних порушень, у яких беруть участь В-клітини. Блокуючі агенти, такі як рекомбінантні варіанти або антитіла, специфічні для вказаного рецептора, застосовуються також як імунорегуляторні агенти. Розглядається також використання рецептора для BAFF як стимулятора В-клітин для лікування імуносупресорних захворювань, включаючи, наприклад, його використання для трансплантації органів пацієнтам (наприклад, трансплантату кісткового мозку), а також для відновлення після лікування рака з метою стимуляції продукування В-клітин. Розглядається також використання рецептора для BAFF як ад'юванта і/або костимулятора для посилення і/або віднов 9 75049 10 лення B-клітинних рівнів приблизно до нормальних багатьох подій, опосередкованих передачею сигрівнів. Розчинні форми вказаного рецептора для налу через рецептори сімейства TNF, буде мати BAFF, які блокують B-клітинну функцію, можуть широке застосування для лікування імунних хвобути також використані для інгібування захворюроб, а також широкого ряду захворювань людини, вань, опосередкованих В-клітинами. які мають патологічні ускладнення, зумовлені поДаний винахід відноситься до нового рецепторушеннями імунної системи. Розчинна форма нера сімейства TNF. Був ідентифікований новий рещодавно відкритого рецептора, остеопротегерину, цептор BAFF-R (або "ВСМА"). може блокувати втрату маси кісткової тканини, а Сімейство TNF складається з пар лігандів і їх тому події, регульовані передаючим сигнал рецепспецифічних рецепторів, що називаються лігандатором сімейства TNF, не обов'язково повинні бути ми сімейства TNF і рецепторами сімейства TNF обмежені регуляцією імунної системи. Антитіла до [Bazzoni & Beutler, 1996]. Вказане сімейство бере цього рецептора можуть блокувати зв'язування участь у регуляції імунної системи і, можливо, інліганду, а отже, вони можуть також мати клінічне ших неімунологічних систем. Дана регуляція часто застосування. Такі антитіла часто є довгоживучивідбувається на рівні "головного перемикання", ми і можуть мати деяку перевагу у порівнянні з так, що передача сигналу членами сімейства TNF гібридними білками "рецептор-Ig", які мають більш може приводити до великого числа подальших короткий час напівжиття у кровотоці. подій, найбільш характерних для TNF. TNF може Хоча інгібування опосередкованого рецептоініціювати загальну протективну запальну відпором каскаду реакцій являє собою найбільш шировідь організму на інвазію чужорідного агента, що ко поширене терапевтичне застосування цих реприводить до зміни фетотипу адгезивних молекул, цепторів, однак спочатку таке застосування що беруть участь у транспорті клітин, до продукуполягало у активації рецепторів TNF, що вказувавання хемокінів для направлення специфічних ло на перспективність його клінічного застосуванклітин у конкретні дільниці і до примування різних ня [Aggarwai & Natarajan, 1996]. Активація рецепефекторних клітин. Таким чином, регуляція цих торів TNF може ініціювати клітинну загибель, а каскадів реакцій може мати клінічне застосування. тому їх застосування для лікування пухлин є ще Індукування різних клітинних відповідей, опобільш привабливим [Eggermont et al., 1996]. Цей середкованих вказаними цитокінами сімейства рецептор може бути активований або шляхом TNF, очевидно ініціюється їх зв'язуванням зі спевведення ліганду, тобто, ліганду, що бере участь у цифічними клітинними рецепторами. Були ідентикаскаді природних реакцій, або певних антитіл, які фіковані принаймні два різних рецептори TNF, що можуть перехресно реагувати з даним рецептором мають молекулярну масу приблизно 55кДа і також є сильними агоністами. Ці антитіла мають (TNFR1) і 75кДа (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. певну перевагу в онкології, оскільки вони можуть Chem. 264: 14927-14934 (1989) & Brockhaus et al., існувати у кровотоці протягом тривалого періоду PNAS, 87:3127-3131 (1990)]. Широкий поліморфізм часу, тоді як ліганди мають звичайно короткий час був асоційований з обома генами рецептора TNF. напівжиття у кровотоці. Оскільки багато які з цих Обидва TNFR мають загальну типову структуру рецепторів можуть бути експресровані більш селерецепторів клітинної поверхні, включаючи позакліктивно у пухлинах, або вони можуть тільки перетинні, трансмембранні і внутрішньоклітинні домедавати сигнал загибелі або диференціювання кліни. Вказана позаклітинна частина TNFR типу 1 і тин у пухлині, то антитіла-агоністи можуть бути типу 2 містить мотив амінокислотної послідовності, хорошою зброєю у боротьбі проти рака. Аналогічщо повторюється, який складається з доменів, ним чином, багато позитивних імунологічних подій багатих чотирма цистеїнами (CDR). Аналогічний опосередковуються рецепторами TNF, наприклад, мотив CDR, що повторюється, присутній і у деяких запальні реакції господаря, продукування антитіл і інших білках клітинної поверхні, включаючи рецепт.п., а тому антитіла-агоністи можуть володіти тор фактора зростання нервової тканини, антагосприятливою дією у інших неонкологічних застосуніста антигену CD40, присутнього на B-клітинах і ваннях. т.п. Парадоксально, але інгібування метаболічного Завдяки своїй здатності легко перетворюватишляху може виявитися клінічно ефективним для ся у гібридні білки імуноглобулінів рецептори явлікування пухлин. Так, наприклад, Fas-ліганд ексляють собою могутній інструмент для виявлення пресується деякими пухлинами і ця експресія мокаскадів біологічних реакцій. Такі димерні розчинні же приводити до загибелі Fas-позитивних лімфоформи рецепторів є хорошими інгібіторами подій, цитів, що, тим самим, дозволяє пухлині опосередкованих або секретованими, або поверх"вислизати" від нагляду імунної системи. У цьому невими лігандами. Шляхом зв'язування з цими випадку інгібування Fas-системи може потім давалігандами вони можуть перешкоджати взаємодії ти можливість імунній системі взаємодіяти з пухлігандів з клітинно-асоційованими рецепторами, линою іншими шляхами, доступ до яких у цей час які можуть передавати сигнал. Ці гібридні білки представляється можливим [Greene & Ware, 1997]. "рецептор-Ig" є цінними не тільки з експериментаАвторами даного винаходу був ідентифіковальної точки зору, але і у випадку TNF-R-Ig, вони ний кДНК-клон, який кодує поліпептид, позначений можуть бути успішно використані клінічно для ліу даній заявці "BAFF-R" або "ВСМА", який зв'язукування захворювань кишечнику, ревматоїдного ється з фактором некрозу пухлини, BAFF, фактоартриту і гострого клінічного синдрому, супровором активації В-клітин, що належить до сімейства джуючого введення ОКТ3 [Eason et al., 1996; факторів некрозу пухлини ("TNF"). BAFF являє Feldmann et al., 1996; van Dullemen et al., 1995]. собою ту ж саму молекулу, описану раніше у Можна чекати, що маніпуляції по відношенню до WO/9912964, яка вводиться у даний опис за допо 11 75049 12 могою посилання. лотна послідовність (SEQ ID NO:3) pJST538, плазУ одному з варіантів свого здійснення, даний міди, що кодує BAFF-R-Fc: залишки нуклеїнової винахід відноситься до способів використання кислоти 1-69, мишача сигнальна послідовність BAFF-R. Вказаними способами є способи інгібукаппа-ланцюга IgG; залишки нуклеїнової кислоти вання зростання В-клітин, індукованого дендрит70-222, BAFF-R (залишки нуклеїнової кислоти 1ними клітинами зростання і дозрівання B-клітин, 153); залишки нуклеїнової кислоти 223-906, IgG або продукування імуноглобуліну у тварин з виколюдини. ристанням поліпептиду BAFF-R. Даний винахід На Фіг.3 показана послідовність нуклеїнової також включає способи стимуляції зростання Bкислоти pJST535, плазміди, що кодує повнорозміклітин, зростання і дозрівання В-клітин, індуковарний BAFF-R людини, і виведена з неї амінокислоного дендритними клітинами, або продукування тна послідовність. імуноглобуліну у тварини з використанням поліпеНа Фіг.4 показане порівняння структури TNFптиду ВAFF-R, або ко-стимуляції зростання BR55 і BAFF-R. клітин, зростання і дозрівання В-клітин, індуковаНа Фіг.5 показані клітини 293EBNA, трансфіконого дендритними клітинами, або продукування вані або (а) СН269 (1,0мкг), або (b) pJST535 імуноглобуліну у тварини з використанням поліпе(0,1мкг), плазмідою, що експресує повнорозмірний птиду BAFF-R і антитіла проти Т, ліганду CD40 або BAFF-R і забарвленою 0,5мкг/мл flag-hBAFF у фоліганду проти CD40. рматі аналізу на планшетах. У іншому варіанті свого здійснення даний виНа Фіг.6(а) показано FACS-перекриття клітин нахід відноситься до способів з використанням 293EBNA, трансфікованих pJST535 і забарвлених BAFF-R для лікування аутоімунних хвороб, гіпертаким чином: без ліганду (чорна гістограма), тонії, серцево-судинних розладів, ниркоподібних 1мкг/мл flag-hCD40L (рожева) або flag-hBAFF (зезахворювань, лімфопроліферативних захворюлена). Потім всі зразки забарвлювали анти-flag вань, асоційованих з B-клітинами, імуносупресорМ2, а потім ослиним антитілом проти мишачих IgG них захворювань, захворювань, асоційованими з як описано у способах у прикладі 2. трансплантацією органів і ВІЛ-інфекцій. Даний На Фіг.6(b) показані FACS-гістограми зі статисвинахід також відноситься до способів використичними даними одного і того ж експерименту. тання агентів для нормалізації, придушення або Фарбування здійснювалося таким чином: (1) не зміни імунної відповіді, що бере участь у шляху забарвлювали, (2) тільки 7AAD, (3) у 2-ій стадії і передачі сигналу між BAFF-R і його лігандом, і до тільки 7AAD, (4) 9мкг/мл flag-hBAFF, (5) 3мкг/мл способів інгібування запалення шляхом введення flag-hBAFF, (6) 1мкг/мл flag-hBAFF, (7) 0,33мкг/мл антитіла проти BAFF-R або його епітопу. flag-hBAFF, (8) 0,11мкг/мл flag-hBAFF, (9) flagСпособи даного винаходу переважно здійсhCD40L, 1мкг/мл. нюють шляхом введення терапевтично ефективної На Фіг.7 показана імунопреципітація BAFF-Rкількості поліпептиду BAFF-R, химерної молекули, Fc, як описано у способах у прикладі 4. Стандарти що містить поліпептид BAFF-R, злитий з гетероломолекулярної маси у кДа помічені у лівій частині гічною амінокислотною послідовністю, або гомолофігури. Доріжки: (1) 12,5нг flag-hTWEAK, (2) 12,5нг га антитіла проти BAFF-R. flag-hBAFF, (3) імунопреципітація flag-hBAFF під У одному з варіантів свого здійснення, даний дією 0,5мл BAFF-R-Fc-кондиціонованого середовинахід відноситься до фармацевтичних композивища, (4) імунопреципітація flag-hTWEAK з викоцій, що містять поліпептид BAFF-R і фармацевтиристанням 0,5мл BAFF-R-Fc-кондиціонованого чно прийнятний носій. середовища, (5) імунопреципітація без ліганду з У іншому варіанті свого здійснення даний вивикористанням 0,5мл BAFF-R-Fc-кондиціонованого нахід відноситься до химерних молекул, що міссередовища, (б) імунопреципітація flag-hBAFF з тять поліпептид BAFF-R, злитий з гетерологічною використанням 0,5мл кондиціонованого середополіпептидною або амінокислотною послідовністю. вища від нетрансфікованих 293EBNA, (7) імунопПрикладом такої химерної молекули є BAFF-R, реципітація flag-hTWEAK з використанням 0,5мл злитий з Fc-областю імуноглобуліну або послідовкондиціонованого середовища від нетрансфікованістю міченого епітопу. них 293EBNA. У іншому варіанті свого здійснення даний виНа Фіг.8 показаний графік результатів аналізу нахід відноситься до антитіла, яке специфічно проліферації спленоцитів, на якому представлені зв'язується з поліпептидом BAFF-R. Це антитіло є, криві, що відображають число імпульсів у хвилину але не обов'язково, моноклональним антитілом. (імп./хв.), включених у клітини мишачих спленоциНа Фіг.1 показана послідовність нуклеїнової тів, у залежності від кількості доданої BAFF людикислоти (SEQ ID NO:2) кДНК BAFF-R (ВСМА) люни (мкг/мл). дини і виведена з неї амінокислотна послідовність На Фіг.9 показаний графік результатів аналізу (SEQ ID NO:1). Можливий сайт ініціації трансляції блокування BAFF, у якому вивчається зв'язування знаходиться у будь-якому із залишків нуклеїнової BAFF з Raji-клітинами, і приведені криві даних зчикислоти (нуклеотидів) 219 або 228; багатий цистеїтування MFI (середньої інтенсивності флуоресценом домен (CRD) знаходиться у залишках нуклеїнції), у залежності від кількості R:hIgGl (нг/мл). нової кислоти 240-341 SEQ ID NO:2 (амінокислотні На Фіг.10(а) показані графіки експресії IgM у залишки 8-41 SEQ ID NO:1); а можлива трансмемзалежності від CD1 у FACS-аналізі Baff-Tg-мишей, бранна область знаходиться у залишках нуклеїнояким вводили h-Ig (середня панель) або hBCMA-Ig вої кислоти 375-459 SEQ ID NO:2. (нижня панель), і однопоносних контрольних миНа Фіг.2 показана послідовність нуклеїнової шей дикого типу, яким вводили PBS-ін'єкції (верхкислоти (SEQ ID NO:4) і виведена з неї амінокисня панель), як описано у прикладі 11. 13 75049 14 На Фіг.10(b) показані графіки експресії CD21 у містить трансмембранних і цитоплазматичних дозалежності від IgM у FACS-аналізі на виявлення менів BAFF-R. Звичайно позаклітинний домен (за дискримінаційними вікнами) IgD-позитивних BAFF-R має менш, ніж 1% з таких трансмембранпопуляцій для Baff-Tg-мишей, яким вводили h-Ig них і цитоплазматичних доменів, а переважно (середня панель) або hBCMA-Ig (нижня панель), і менш, ніж 0,5% таких доменів. BAFF-R-ECD місдля однопоносних контрольних мишей дикого титить, але не обов'язково, амінокислотні залишки 8пу, яким вводили PBS-ін'єкції (верхня панель), як 41 SEQ ID NO:1 або амінокислотні залишки 4-51 описано у прикладі 11. SEQ ID NO:1 або амінокислотні залишки 1-53 SEQ На Фіг.10(с) показані графіки експресії CD21 у ID NO:1. У переважному варіанті здійснення виназалежності від IgM у FACS-аналізі на виявлення ходу BAFF-R-ECD містить амінокислотні залишки (за дискримінаційними вікнами) IgD-негативних 1-51 SEQ ID NO:1. У іншому переважному варіанті популяцій для Baff-Tg-мишей, яким вводили h-Ig здійснення винаходу BAFF-R-ECD містить аміно(середня панель) або hBCMA-Ig (нижня панель) і кислотні залишки 1-50 SEQ ID NO:1. Потрібно задля однопоносних контрольних мишей дикого тизначити, що трансмембранний домен, ідентифікопу, яким вводили PBS-ін'єкції (верхня панель), як ваний для поліпептиду BAFF-R даного винаходу, описано у прикладі 11. ідентифікують відповідно до критеріїв, що звичайНа Фіг.11 показана маса селезінок для всіх но використовуються для ідентифікації гідрофобгруп Baff-Tg-мишей (виражені як маса у мг +/- станого домену такого типу. Точні межі трансмембндартне відхилення). ранного домену можуть варіюватися, але, На Фіг.12 показаний графік залежності протеїймовірно, не більш, ніж за 5 амінокислотами на нурії (мг/дл) від числа ін'єкцій для Baff-Tg-мишей, будь-якому кінці домену, конкретно згаданого у оброблених PBS, hlg, hBCMA-Ig і для однопоносданому описі. У відповідності з цим, BAFF-R-ECD них контрольних мишей. може, але не обов'язково, включати у себе аміноНа Фіг.13 показаний графік середнього артерікислоти 8-41 (SEQ ID NO:1). ального тиску (мм рт.ст.) у Baff-Tg-мишей і у конт"Варіант BAFF-R" означає активний BAFF-R, рольних мишей дикого типу. що визначається нижче і що має щонайменше На Фіг.14 показаний графік значень артеріальприблизно 80%-ну ідентичність амінокислотної ного тиску (мм рт.ст.) в окремих Baff-Tg-мишей і у послідовності з BAFF-R, що має виведену аміноконтрольних мишей дикого типу. кислотну послідовність, показану у SEQ ID NO:1 На Фіг.15 показана гістограма процентного відля повнорозмірної нативної послідовності BAFFдношення мишей SNF1, які виявляли важкий нефR або з послідовністю BAFF-R-ECD. Такими варіарит після обробки BAFF-R-Ig (BCMA-Ig), HuIgG або нтами BAFF-R є, наприклад, поліпептиди BAFF-R, PBS. у яких на кінці або С-кінці послідовності SEQ ID На Фіг.16 показаний графік загального числа NO:1 додані або делетовані один або декілька клітин CDllc+DC (в мільйонах) у мишей, оброблеамінокислотних залишків. Звичайно варіант BAFFних in vivo 20мкг BCMA-Ig, 50мкг BCMA-Ig, HuIgG R має щонайменше приблизно 80%-ну або 85%або PBS. Були оцінені клітинні популяції CDllc+DC: ну, більш переважно - щонайменше приблизно (1) CD8a-CD4-, (2) CD8a+CD4 і (3) CD8a-CD4+. 90%-ну, і навіть більш переважно - щонайменше 1. Визначення приблизно 95%-ну ідентичність амінокислотної Терміни "BAFF-R" і "ВСМА", що використовупослідовності з амінокислотною послідовністю ються у даному описі, охоплюють нативну посліSEQ ID NO:1. довність BAFF-R і варіанти BAFF-R (які будуть "Процент (%) ідентичності амінокислотної посдетально визначені нижче). BAFF-R може бути лідовності" по відношенню до послідовностей виділений з ряду джерел, таких, наприклад, як BAFF-R, ідентифікованих у даному винаході, видеякі типи тканин миші або людини, або з інших значають як процент амінокислотних залишків у джерел, або він може бути одержаний рекомбінанпослідовності-кандидаті, яка є ідентичною амінотними методами або методами синтезу. кислотним залишкам у послідовності BAFF-R, піс"Нативна послідовність BAFF-R" включає у селя зіставлення первинних послідовностей і ввебе поліпептид, що має таку ж амінокислотну посдення пропусків, якщо це необхідне для лідовність, що і BAFF-R, що походить від природдосягнення максимального проценту ідентичності них джерел. Така нативна послідовність BAFF-R послідовності, і не беручи до уваги які-небудь конможе бути виділена з природних джерел, або вона сервативні заміни, зроблені у процесі ідентифікації може бути продукована рекомбінантними методапослідовностей. Зіставлення первинних послідовми або методами синтезу. Існують природні усічені ностей з метою визначення проценту індентичносабо секретовані форми BAFF-R (наприклад, розті амінокислотної послідовності може бути досягчинні форми, що містять, наприклад, послідовність нуте різними способами, відомими фахівцям, позаклітинного домену), природні варіанти (напринаприклад, з використанням широко доступного клад, альтернативно сплайсовані форми) і приропрограмного забезпечення, такого як BLAST, дні алельні варіанти BAFF-R. в одному з варіантів ALIGN або Megalign (DNASTAR). Кожний фахівець здійснення винаходу нативна послідовність BAFFможе визначити відповідні параметри для провеR являє собою зрілу або повнорозмірну нативну дення порівняльного аналізу, включаючи будь-які послідовність поліпептиду BAFF-R, що містить алгоритми, необхідні для досягнення максимальамінокислоти 1-184 послідовність SEQ ID NO:1 або ного зіставлення за всією довжиною послідовносїї фрагмент. тей, що порівнюються. "Позаклітинний домен BAFF-R" або "BAFF-RТермін "мічений епітоп", що використовується ECD" означає форму BAFF-R, яка в основному не тут, відноситься до химерного поліпептиду, що 15 75049 16 містить BAFF-R або послідовність його домену, Термін "біологічно активний", що використовузлиту з "поліпептидною міткою". Поліпептидна ється тут, відноситься до in vivo або in vitroмітка має достатнє число залишків для одержання активності, яка може бути здійснена безпосередепітопу, проти якого може бути продуковане антиньо або опосередковано. Біологічно активні фрагтіло або який може бути ідентифікований якимменти BAFF-R можуть мати, наприклад, 70% амінебудь іншим агентом, але при цьому досить конокислотну гомологію, більш переважно ротким, таким, щоб він не перешкоджав активності щонайменше 80%, а найбільш переважно - щоBAFF-R. Поліпептидна мітка переважно також понайменше 90%-гомологію з активним сайтом ревинна бути абсолютно унікальною, так, щоб антицептора. Ідентичність або гомологія по відношентіло в основному не вступало у перехресну реакню до рецептора визначена тут як процент цію з іншими епітопами. Відповідні поліпетпидні амінокислотних залишків у послідовностімітки в основному мають щонайменше 6 амінокикандидаті, яка ідентична залишкам BAFF-R у SEQ слотних залишків, а звичайно від приблизно 8 до ID NO:1 або яка ідентична певній області аміноки50 амінокислотних залишків (переважно, приблизслотних залишків y SEQ ID NO:1. но від 10 до 20 залишків). Термін "ссавець", що використовується тут, Термін "виділений", що використовується для означає будь-яку тварину, класифіковану як ссаопису різних згаданих тут поліпептидів, відноситьвець, включаючи людину, корів, коней, собак, мися до поліпептиду, який був ідентифікований і вишей і кішок. У переважному варіанті здійснення ділений і/або відновлений з компонента його привинаходу таким ссавцем є людина. родного оточення. Домішковими компонентами Для здійснення даного винаходу можуть бути його природного оточення є матеріали, які звичайвикористані, якщо це не обумовлене особливо, но перешкоджають діагностичному або терапевтистандартні методи клітинної біології, клітинного чному застосуванню даного поліпептиду і якими культивування, молекулярної біології, трансгенної можуть бути ферменти, гормони і інші білкові або біології, мікробіології, рекомбінантних ДНК і імунонебілкові розчинені речовини. У переважних варілогії, які відомі фахівцям. Вказані методи описані у антах здійснення винаходу вказаний поліпептид літературі. може бути очищений (1) до міри, достатньої для Далі приводиться докладний опис переважних одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої варіантів здійснення даного винаходу. Даний виабо внутрішньої амінокислотної послідовності з нахід відноситься до використання BAFF-R і спорівикористанням секвенатора з чашкою, що обертаднених BAFF-R молекул для ефективного зросється, або (2) до гомогенності за допомогою електання і дозрівання B-клітин і секреції трофорезу у ПААГ з ДСН у невідновлювальних імуноглобуліну. Даний винахід також відноситься або відновлювальних умовах з використанням до використання BAFF-R і споріднених BAFF-R кумаси синього або - переважно - срібного барвнимолекул для вироблення ефективних відповідей ка. Виділеним поліпептидом є поліпептид in situ у імунної системи, необхідних при розладах, пов'ярекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше заних з імунними порушеннями. Крім того, даний один компонент природного оточення BAFF-R у винахід відноситься до лікування рака та імунних них не присутній. Однак звичайно виділений полірозладів за допомогою використання гена BAFF-R пептид може бути одержаний щонайменше за одабо спорідненого ВAFF-R методами генної терапії. ну стадію очищення. BAFF-R і його гомологи, продуковані господаТермін "антитіло" використовується у самому рями, трансформованими послідовностями даного широкому значенні і конкретно включає у себе винаходу, а також нативний BÄFF-R, очищений моноклональні антитіла проти BAFF-R (включаючи відомими методами або продукований з відомих антитіла-агоністи, антитіла-антагоністи і нейтраліамінокислотних послідовностей, можуть бути визуючі антитіла) і композиції антитіл проти BAFF-R з користані у ряді методів протиракового, протипухполіепітопною специфічністю. Термін "моноклоналинного і імунорегуляторного застосування. Вони льне антитіло", що використовується тут, означає також можуть бути використані у терапії і у метоантитіло, одержане з популяції в основному гомодах, направлених на лікування інших хвороб. генних антитіл, тобто окремі антитіла, що складаВ іншому своєму аспекті, даний винахід відноють цю популяцію, є ідентичними, за винятком ситься до використання поліпептиду, що кодується можливих природних мутацій, які можуть бути виділеною нуклеїновою кислотою, що кодує BAFFприсутніми у незначних кількостях. R, у "антисмисловій" терапії. Термін "антисмислоТермін "очищений препарат", що використовува" терапія, що використовується тут, відноситься ється тут, або "в основному чистий препарат" подо введення або генерування in situ олігонуклеоліпептиду означає поліпептид, який був виділений тидів або їх похідних, які специфічно гібридизуз інших білків, ліпідів і нуклеїнових кислот, що є ються у клітинних умовах з клітинною мРНК і/або його природним оточенням. Переважно, вказаний ДНК, що кодує потрібний ліганд, з метою інгібуполіпептид також виділяють з інших речовин, навання експресії кодованого білка, тобто інгібуванприклад, антитіл, матриксів і т.п., які використовуня транскрипції і/або трансляції. Зв'язування може ють для його очищення. відбуватися за комплементарними стандартними Терміни "лікування", "курс лікування" і "терапарами основ або, наприклад, у разі зв'язування з пія", що використовуються тут, означають лікуваДНК-дуплексами, за допомогою специфічних взальну терапію, профілактичну терапію і превентивємодій у великій борозенці подвійної спіралі. У ну терапію. загальних рисах, "антисмислова" терапія відноТерміни "пептиди", "білки" і "поліпептиди", що ситься до ряду методів, що звичайно використовикористовуються тут, є взаємозамінними. вуються фахівцями, і включає у себе будь-яку те 17 75049 18 рапію, яка заснована на специфічному зв'язуванні вони можуть бути розділені на фрагменти потрібз олігонуклеотидними послідовностями. ної довжини, що перекриваються. Такі методи Антисмислова конструкція даного винаходу більш детально описані нижче. може бути доставлена, наприклад, у вигляді ексГенерування розчинних форм BAFF-R пресуючої плазміди, яка, при її транскрибуванні у Розчинні форми BAFF-R часто можуть ефекклітині, продукує РНК, комплементарну щонайметивно передавати сигнал, а тому вони можуть бути нше частині клітинної мРНК, що кодує BAFFвведені як лікарський засіб, який у цьому випадку ліганд. Альтернативно, антисмислова конструкція імітує природну мембранну форму. Передбачаєтьможе являти собою олігонуклеотидний зонд, що ся, що заявлений тут BAFF-R секретується у пригенерується ex vivo. Такі олігонуклеотидні зонди роді як розчинний цитокін, однак якщо це не має переважно являють собою модифіковані олігонукмісце, цей ген можна знов сконструювати для полеотиди, які є резистентними до ендогенних нуксилення секреції. Для створення розчинної секрелеаз і, таким чином, є стабільними in vivo. Приклатованої форми BAFF-R необхідно видалити - на дами нуклеїновокислотних молекул, що рівні ДНК - N-кінцеві трансмембранні області і певвикористовуються як антисмислові олігонуклеотину частину області-"стеблини" і замінити їх лідерди, є фосфорамідати, фосфотіоатні і метилфосною послідовністю типу І або лідерною послідовніфонатні аналоги ДНК (див., наприклад, 5176996, стю альтернативного типу II, яка забезпечує 5264564 і 5256775). Крім того, загальні підходи для ефективне протеолітичне розщеплення у вибраній конструювання олігомерів, що використовуються у експресійній системі. Кожний фахівець може варіантисмисловій терапії, були описані, наприклад, ювати кількість області-"стеблини", присутньої у [Van Der Krol et al., (1998) Biotechniques 6:958-976; секреторній експресійній конструкції з метою опі Stein et al. (1998) Cancer Res 48:2659-2668], які тимізації як властивостей зв'язування ліганду, так і вводяться у даний опис за допомогою посилання. ефективності ескпресії. Так, наприклад, конструкBAFF-R згідно з винаходом, що обговорюється ції, що містять всі можливі довжини "стеблини", вище, є членом сімейства рецепторів TNF. Вказатобто N-кінцеві усікання можуть бути одержані так, ний білок, його фрагменти і гомологи можуть мати щоб продукувались білки від амінокислоти 1 до широке терапевтичне і діагностичне застосування. амінокислоти 51. Внаслідок аналізів такого типу Поліпептиди згідно з винаходом специфічно повинна бути встановлена оптимальна довжина взаємодіють з BAFF, поліпептидом, раніше описапослідовності "стеблини". ним у заявці W099/12964, яка вводиться у даний У переважних варіантах здійснення винаходу, опис за допомогою посилання. Однак описані тут розчинний поліпептид BAFF-R являє собою видіпептиди і методи дозволяють ідентифікувати молений поліпептид з нативною послідовністю BAFFлекули, які специфічно взаємодіють з BAFF-R або R, що містить амінокислотні залишки 1-51 SEQ ID з його фрагментами. NO:1 або його фрагмент; виділений поліпептид У деяких своїх варіантах заявлений винахід BAFF-R, що має принаймні 80%-ну (а більш перевідноситься до способів використання пептидів, важно, 90%-ну) ідентичність амінокислотної посліщо походять від BAFF-R, здатних зв'язуватися з довності з нативною послідовністю поліпептиду BAFF. Фрагменти BAFF-R можуть бути продуковаBAFF-R, що містить амінокислотні залишки 1-51 ні декількома способами, наприклад, рекомбінантSEQ ID NO:1, або його фрагмент; виділений поліно, за допомогою ПЛР, шляхом протеолітичного пептид BAFF-R з нативною послідовністю, що місрозщеплення або хімічного синтезу. Внутрішні або тить амінокислотні залишки 1-50 SEQ ID NO:1 або кінцеві фрагменти поліпептиду можуть бути генейого фрагмент; або виділений поліпептид BAFF-R, ровані шляхом видалення одного або декількох що містить амінокислотні залишки 8-41 SEQ ID нуклеотидів від одного кінця або від обох кінців NO:1 або його фрагмент. нуклеїнової кислоти, що кодує даний поліпептид. Генерування антитіл, реагуючих з BAFF-R Експресія мутагенізованої ДНК приводить до проДаний винахід також відноситься до антитіл, дукування поліпептидних фрагментів. специфічно реагуючих із заявленим BAFF-R або з Химерні молекули, що використовуються у дайого ко-рецепторами. Антисироватка або монокному винаході, можуть бути також продуковані лональні антитіла проти білка/проти пептиду мовідомими методами. У даному винаході розглядажуть бути одержані стандартними методами [див., ється використання химерних молекул, що містять наприклад, Antibodies: A Laboratory Manual, ed. by поліпептид BAFF-R (або його варіант), злитий з Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)]. гетерологічною амінокислотною послідовністю, Ссавець, такий як миша, хом'як або кролик, може такою як домен IgG-Fc імуноглобуліну. Вказані бути імунізований імуногенною формою даного химерні молекули переважно є розчинними і міспептиду. Методами повідомлення імуногенності тять розчинний поліпептид BAFF-R. У переважнобілку або пептиду є кон'югування з носіями або му варіанті здійснення винаходу вказана химерна інші методи, добре відомі фахівцям. молекула містить амінокислотні залишки 1-50 SEQ Імуногенна частина BAFF-R або його коID NO:1, злиті з Fc-доменом. рецептори можуть бути введені у присутності Поліпептидні фрагменти можуть бути також ад'юванта. Хід імунізації може бути прослідковахімічно синтезовані відомими методами, такими як ний шляхом детекції титрів антитіл у плазмі або стандартний твердофазний синтез з використансироватці. Для оцінки рівнів антитіл можуть бути ням f-moc- або t-boc-хімії Мерифільда. Так, напризроблені стандартний метод ELISA або інші імуноклад, пептиди і ДНК-послідовності згідно з винахоаналізи з використанням імуногена як антигену. дом можуть бути довільно розділені на фрагменти У переважному варіанті здійснення винаходу потрібної довжини без перекриття фрагментів, або антитіла, що розглядаються, є імуноспецифічними 19 75049 20 для антигенних детермінант BAFF-R або його коантигеном, що походять від тварини, потім клонурецепторів, наприклад, антигенних детермінант ють у відповідне положення генів антитіла людини, поліпептиду SEQ ID NO:1 або його близькоспоріду яких були делеговані області зв'язування з антиненого людського або надлюдського гомолога (нагеном. "Гуманізовані" антитіла дозволяють мініміприклад, що має 70, 80 або 90%-ну гомологію, а зувати використання гетерологічних (наприклад, більш переважно принаймні 95%-ну гомологію). У міжвидових) послідовностей у антитілах людини, і іншому переважному варіанті здійснення винаходу тим самим знижують імовірність вироблення імунантитіла проти BAFF-R або проти BAFF-коної відповіді у індивідуумів, що проходять курс рецептора в основному не вступають у перехресну лікування. реакцію (тобто реагують специфічно) з білком, Конструювання рекомбінантних антитіл різних який, наприклад, менш, ніж на 80% гомологічний класів може бути також здійснене шляхом продуSEQ ID NO:1; а переважно, менш, ніж на 90% гокування химерних або "гуманізованих" антитіл, що мологічний SEQ ID NO:1; а найбільш переважно містять варіабельні домени і константні домени менш, ніж на 95% гомологічний SEQ ID NO:1. Терлюдини (СН1, СН2, СН3), виділені з імуноглобулімін "в основному не вступаючий у перехресну реанів різних класів. Так, наприклад, антитіла з підкцію" відноситься до антитіла, що має афінність вищеними валентностями антиген-зв'язуючого зв'язування негомологічного білка, яка складає центра можуть бути рекомбінантно продуковані менш, ніж 10%, більш переважно - менш, ніж 5%, і шляхом клонування антиген-зв'язуючого центра у навіть більш переважно - менш, ніж 1% від афінвектори, що несуть константні області ланцюга ності зв'язування білка з послідовністю SEQ ID антитіла людини [Arulanandam et al., J. Exp. Med., NO:1. 177:1439-1450 (1993), ця робота вводиться у даТермін "антитіло", що використовується тут, ний опис за допомогою посилання]. охоплює його фрагменти, які також специфічно Крім того, для зміни афінностей зв'язування реагують з BAFF-R або з його рецепторами. Антирекомбінантних антитіл з їх антигенами можуть тіла можуть бути фрагментовані стандартними бути використані стандартні методи рекомбінантметодами, і їх фрагменти можуть бути піддані них ДНК шляхом модифікації амінокислотних заскринінгу для з'ясування можливості їх викорислишків, що знаходяться поблизу антигентання у способі, описаному вище для цілих антизв'язуючих центрів. Афінність зв'язування "гуманітіл. Так, наприклад, F(ab')2-фрагменти можуть бути зованого" антитіла з антигеном може бути збільгенеровані шляхом обробки антитіла пепсином. шена за допомогою мутагенезу на основі молекуОдержаний F(ab')2-фрагмент може бути оброблелярного моделювання. [Queen et al., Proc. Natl. ний для відновлення дисульфідних містків з проAcad. Sсi. 86:10029-33 (1989), ця робота вводиться дукуванням Fab'-фрагментів. Крім того, антитіла у даний опис за допомогою посилання]. даного винаходу містять біоспецифічні і химерні Генерування аналогів: Продукування модифімолекули, що володіють активністю проти BAFF-R кованих ДНК і пептид них послідовностей. або проти BAFF-ко-рецептора. Так, наприклад, Аналоги BAFF-R можуть відрізнятися від примоноклональні і поліклональні антитіла (Ab), народного BAFF-R за своїми амінокислотними посліправлені проти BAFF-R і їх ко-рецепторів, і фрагдовностями або за присутністю або відсутністю менти антитіл, такі як Fab' і F(ab')2, можуть бути тих або інших послідовностей, або за тією або інвикористані для блокування дії BAFF-R і його відшою ознакою. Модифікації, що не відносяться до повідних ко-рецепторів. послідовностей, включають у себе in vivo або in Різні форми антитіл можуть бути також одерvitro хімічну дериватизацію BAFF-R. Модифікаціяжані стандартними методами рекомбінантних ДНК ми, що не відносяться до послідовностей, є, але [Winter & Milstein, Nature 349: 293-299 (1991), ця не обмежуються ними, зміни у ацетилюванні, меробота вводиться у даний опис за допомогою потилюванні, фосфорилюванні, карбоксилюванні або силання]. Так, наприклад, можуть бути сконструглікозилюванні. йовані химерні антитіла, у яких антиген-зв'язуючий Переважними аналогами є BAFF-R або його домен, що походить від антитіла тварини, приєдбіологічно активні фрагменти, послідовності яких наний до константного домену людини [наприклад, відрізняються від послідовності SEQ ID NО:1 заCabilly et ад., патент США 4816567, який вводитьвдяки одній або декільком замінам консервативних ся у даний опис за допомогою посиланняї. Химерні амінокислот, або завдяки одній або декільком заантитіла можуть знижувати імуногенні відповіді, мінам, делеціям або вставкам неконсервативних що спостерігаються, які виробляються антитілами амінокислот, які не руйнують активність BAFFтварини, при їх використанні у клінічній терапії ліганду. Консервативними замінами звичайно є пацієнта. заміни однієї амінокислоти на іншу з аналогічними Крім того, можуть бути синтезовані "рекомбівластивостями, наприклад, заміни всередині нанантні гуманізовані антитіла", які розпізнають ступних груп: валін, гліцин; гліцин, аланін; валін, BAFF-R або його ко-рецептори. "Гуманізовані" анізолейцин, лейцин; аспарагінова кислота, глутамітитіла являють собою химери, що включають у нова кислота; аспарагін, глутамін; серії, треонін; себе головним чином послідовності IgG людини, у лізин, аргінін; і фенілаланін, тирозин. які були вбудовані області, відповідальні за спеЗастосування цифічне зв'язування з антигеном. Тварин імунізуПовнорозмірний ген BAFF-R (SEQ ID NО:2) ють потрібним антигеном, виділяють відповідні або його частини можуть бути використані як гібантитіла і видаляють частину послідовностей варидизаційні зонди для бібліотеки кДНК з метою ріабельної області, відповідальних за специфічне виділення, наприклад, інших генів, які мають потзв'язування з антигеном. Області зв'язування з рібну послідовність, ідентичну послідовності BAFF 21 75049 22 R, описаній у SEQ ID NО:2. Нуклеотидні послідовформи, наприклад, у вигляді ліпосом, плівок або ності, що кодують BAFF-R, можуть бути також вимікрочастинок. Для кожного фахівця очевидно, що користані для конструювання гібридизаційних зондеякі носії можуть бути більш переважними у задів для картування гена, що кодує BAFF-R, і для лежності, наприклад, від шляху введення і конценгенетичного аналізу індивідуумів з генетичними трації поліпептиду BAFF-R, що вводиться. порушеннями. Скринуючі аналізи можуть бути роВведення може бути здійснене за допомогою зроблені для виявлення основних сполук, що іміін'єкції (наприклад, внутрішньовенної, внутрішньотують біологічну активність BAFF-R. Такими скричеревної, підшкірної, внутрішньом'язової) або іннінговими аналізами є аналізи, застосовні для шими методами, такими як інфузія, яка забезпечує високопродуктивного скринінгу хімічних бібліотек, доставку лікарського препарату у кровоток в ефекщо робить їх особливо придатними для ідентифітивній формі. кації невеликих молекул-кандидатів на лікарський Для здійснення даного винаходу можуть бути засіб. Вказаними невеликими молекулами є синтевикористані, якщо це не обумовлене особливо, тичні органічні або неорганічні сполуки. Нуклеїнові стандартні методи клітинної біології, культивуванкислоти, що кодують BAFF-R, або його модифіконя клітин, молекулярної біології, мікробіології, ревані форми, можуть бути також використані для комбінантних ДНК, хімії білків і імунології, які відомі генерування трансгенних тварин або "нокаут"фахівцям. Вказані методи описані у літературі. тварин, які, у свою чергу, можуть бути використані [Див., наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory для розробки і скринінгу терапевтично ефективних Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and реагентів. Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Як описано у даний заявці, в одному з своїх 1989; DNA Cloning, Volumes I and Π (D.N. Glover, варіантів, даний винахід відноситься до способів ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), стимуляції зростання B-клітин, зростання і дозрі1984; U.S. Patent No. 4,683,195 (Muilis et al.,); вання В-клітин, індукованого дендритними клітиNucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. нами, або продукування імуноглобуліну у тварини Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation з використанням поліпептиду BAFF-R, або ко(B.D. Hames and SJ. Higgins, eds.), 1984; Culture of стимуляції зростання В-клітин, зростання і дозріAnimal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., вання B-клітин, індукованих дендритними клітина1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, ми, або продукування імуноглобуліну у тварини з 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. використанням поліпептиду BAFF-R і антитіла Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 проти антигена Τ, ліганду CD40 або анти-СВ40and 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; ліганду. Відповідними є також способи інгібування Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. зростання B-клітин, зростання і дозрівання ВMiller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring клітин, індукованого дендритними клітинами, або Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell продукування імуноглобуліну у тварини з викорисand Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), танням поліпептиду BAFF-R. Academic Press, London, 1987; Handbook of У іншому варіанті свого здійснення даний виExperiment Immunology, Volumes І-IV (D.M. Weir нахід відноситься до способів використання BAFFand C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the R для лікування аутоімунних хвороб, гіпертонії, Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory серцево-судинних розладів, ниркоподібних захвоPress, 1986]. рювань, лімфопроліферативних захворювань, Нижченаведені приклади наводяться для ілюасоційованих з B-клітинами, імуносупресорних страції даного винаходу і не повинні розглядатися захворювань, порушень при трансплантації оргаяк його обмеження. нів, запалень і ВІЛ-інфекцій. Відповідними також є Приклади методи використання агентів для лікування, приПриклад 1: Детекція зв'язування BAFF з BAFFдушення або модифікації імунної відповіді, що R з використанням аналізу на планшетах бере участь у шляху передачі сигналу між BAFF-R У цьому прикладі описано зв'язування BAFF з і його лігандом. BAFF-R-трансфікованими клітинами з використанУ одному з своїх варіантів даний винахід відням аналізу на планшетах. носиться до фармацевтичних композицій, що місПовнорозмірний BAFF-R людини генерували з тять поліпептид BAFF-R і фармацевтично прийняроІуА + РНК BJAB з використанням набору для тний носій. Відповідні носії для поліпептиду BAFFпопередньої ампліфікації SuperscriptH (Life R і їх композиції описані, наприклад, у [Remington's Technologies) з метою генерування кДНК-матриці і Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack ампліфікували за допомогою PfuІ з використанням Publishing Co., edited by Oslo et al]. Звичайно для праймерів, комплементарних 5'- і 3'-кодуючим посприготування ізотонічної композиції використовулідовностям BAFF-R. ПЛР-продукт був клонований ють відповідну кількість фармацевтично прийняту СН269, похідне рСЕР4 (Invitrogen). Одержаний ної солі. Прикладами такого носія є буфери, такі як клон позначали pJST535. Ембріональні клітини фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декнирок людини, що містять ген EBNA-1 (293EBNA), стрози. pH даного розчину переважно складає висівали у 6-ямкові планшети, сенсибілізовані фіприблизно від 5 до 8, а більш переважно - приблибронектином, і трансфікували ліпофектаміном (Life зно від 7,4 до 7,8. Крім того, можуть бути викорисTechnologies) з використанням або pJST535 при тані носії для приготування препаратів пролонгорізних розведеннях, або СН269 як фоновий контваного вивільнення, такі як напівпроникні матриці з роль. Через 48 годин після трансфекції трансфікотвердих гідрофобних полімерів, де вказані матриці вані клітини аналізували на їх здатність до зв'язуможуть бути виготовлені у вигляді виробу певної вання з розчинним flag-hBAFF (амінокислоти L83 23 75049 24 L825) таким чином. Всі інкубації проводили при мивання клітин FASC-буфером їх ресуспендували кімнатній температурі. Кондиціоновані середовиу FASC-буфері, що містить 1% параформальдегіща відсмоктували з ямки, і клітини промивали буду. Внаслідок FASC-аналізу 7-AAD-позитивні кліфером ВНА (20мМ HEPES, pH 7,0, 0,5мг/мл BSA, тини (загиблі) були відсортовані. ОД % NaN3) і інкубували у присутності 0,5мкг/мл Результати FASC-аналізу показали, що фракFLAG-hBAFF, розведеному у PBS, що містить 1мМ ція клітин, трансфікованих BAFF-R, здатна зв'язуMgCl2, 1мМ СаСІ і 0,1% NаN3. Після інкубування ватися з BAFF. При концентрації BAFF 9мкг/мл протягом 1 години розчин BAFF видаляли, і клітиприблизно 28% клітин зв'язуються з BAFF зі серени промивали ВНА. Потім клітини інкубували продньою інтенсивністю флуоресценції (MFI) 366. При тягом 30 хвилин у розчині PBS, що містить 1мкг/мл використанні одного РЕ-міченого ослиного антимоноклонального антитіла проти FLAG, M2 мишачого реагенту значного зсуву клітин не спо(Sigma). Цей розчин відстоювали, і клітини промистерігали. Тільки 1,3% клітин мали MFI=23,5, при вали ВНА. Потім клітини інкубували протягом 30 цьому, середнє значення для всіх клітин становихвилин у розведенні 1:3000 кон'югованого з лужло 5,5. Сигнал від BAFF-R-трансфікованих клітин ною фосфатазою козячого F(ab')2 проти мишачого давав титри з кількостями BAFF, що знижуються. IgG (Jackson ImmunoResearch). Цей розчин відсПри 100нг/мл, 8,76% клітин мали MFI=78,9. тоювали, і клітини промивали ВНА. Для зниження Приклад 3: FASC-аналізи на ВAFF/BAFF-Rфонового фарбування, що викликається ендогенвзаємодію, що включають маркер GFP ною лужною фосфатазою, клітини інкубували проУ цьому прикладі описана здатність BAFF тягом 15 хвилин у 2,5мМ левамізолу (Vector зв'язуватися з клітинами, ко-трансфікованими Laboratories), розведеного у 100мМ NaCl, 100мМ BAFF-R і репортерною плазмідою GFP. Трис-СІ, pH 9,5 і 5мМ MgCl2. Для хромогенної деКлітини 293EBNA трансфікували pJST535 і ретекції лужної фосфатази, розчин інгібітора відстопортерною плазмідою GFP як описано у прикладі ювали, і клітини інкубували з розчином швидкого 2. Репортерна плазміда кодує заякорену на мемчервоного і нафтолфосфату (Pierce). Фарбування брані молекулу GFP. З використанням ко24 спостерігали і фотографували на мікроскопі трансфекції двох плазмід автори даного винаходу низької потужності. проаналізували процент трансфікованих клітин, які Осадження швидкого червоного барвника споздатні зв'язуватися з BAFF. Ці клітини видаляли з стерігали у всіх ямках, трансфікованих BAFF-Rпланшетів і піддавали зв'язуванню з BAFF і детекекспресуючою плазмідою, pJST535. Частота сигції, як описано у прикладі 2. І знов, 7-AAD включаналу, титрованого як кількість плазміди, трансфіли для того, щоб виявити загиблі клітини. Зразки кованої у клітини, знижувалася. При цьому для аналізували за допомогою FASC і будували криві. клітин, трансфікованих контрольним експресуюВерхній правий квадрант представляє клітини з чим вектором, СН269, якого-небудь фарбування пов'язаним BAFF (фікоеритрин-позитивні) і ексне спостерігалося. Не спостерігалося також фарпресуючі GFP. бування і на будь-яких трансфікованих клітинах, у Хоча не всі GFP-трансфіковані клітини виявяких, за схемою фарбування, був відсутній flagляли пов'язаний BAFF, однак у верхньому правому hBAFF або у випадку, коли flag-hBAFF був замінеквадранті була присутньою значна фракція клітин ний на інший ліганд, член сімейства TNF, FLAGу порівнянні з контролем. У цьому верхньому прамічений LIGHT. Тому фарбування BAFF-Rвому квадранті було тридцять три проценти трантрансфікованих клітин BAFF є специфічним. сфікованих клітин, тоді як контроль давав 8 проПриклад 2: Зв'язування BAFF з BAFF-Rцентів. Можливо, що для певного рівня експресії трансфікованими клітинами γ аналізі FASC BAFF-R необхідно, щоб BAFF зв'язувався з даниУ цьому прикладі описана детекція зв'язуванми клітинами. Можливо також, що для високоаня BAFF з BAFF-R-трансфікованими клітинами з фінної взаємодії потрібен ко-рецептор, і що цей використанням аналізу FASC. рецептор є обмежуючим на клітинах 293EBNA. Плазміду, що кодує повнорозмірний BAFF-R, Приклад 4: Імунопреципітація Hag-hBAFF з виpJST535, трансфікували у клітини 293EBNA з використанням гібриду BAFF-R-Fc користанням FuGene6 (Boehringer Mannhiem). ЧеУ цьому прикладі описана специфічна взаєморез 24 або 48 годин після трансфекції клітини видія flag-hBAFF з BAFF-R-Fc, молекулою, що складаляли з планшетів з використанням 5мМ EDTA у дається з цистеїн-багатого домену (CRD) BAFF-R, PBS і підраховували. Ці клітини два рази промиваутворюючого гібрид з Fc-доменом людського IgGl. ли FASC-буфером (PBS, що містить 10% фетальCRD BAFF-R генерували за допомогою ОТну бичачу сироватку, 0,1% NaN3 і 10мкг/мл hlgG ПЛР з роlуА + РНК BJAB, як описано у прикладі 1 з використанням 3'-оліго-праймера, комплементар(Jackson ImmunoResearch), а потім 2,5 105 клітин ного нуклеотидам 132-152 кодуючої послідовності інкубували протягом 1 години на льоду разом з hBAFF-R. Одержаний ПЛР-фрагмент клонували у flag-hBAFF, розведеним у FASC-буфері при конСН269 нижче сигнальної послідовності каппацентраціях у межах від 9мкг/мл до 0,037мкг/мл. Ці ланцюга мишачого IgG і вище Fc-частини IgG люклітини промивали FASC-буфером і інкубували з дини. Цю конструкцію позначали pJST538. Консмоноклональним антитілом проти FLAG, M2, при трукцію pJST538 або СН269 трансфікували у кліконцентрації 5мкл/мл протягом 30 хвилин на льотини 293EBNA за допомогою ліпофектаміну. ду. Ці клітини промивали FASC-буфером і інкубуКондиціоноване середовище і клітинні екстракти вали протягом 30 хвилин на льоду у розчині, що збирали через 20 годин після трансфекції. Клітини містить розведений 1:100 R-фікоеритрин, кон'югосолюбілізували у 20мМ Триса, pH 7,5/50мМ ваний з F(ab')2-фрагментом ослиного антитіла NaCl/0,5% №40/0,5% дезоксихолінової кислоти і проти мишачих IgG і 10мкг/мл 7-AAD. Після про 25 75049 26 дебрис центрифугували. Аліквоту кондиціонованих варіювати. Ця ампліфікована дільниця повинна середовищ і клітинних екстрактів об'єднували з бути сконструйована так, щоб вона включала у рівним об'ємом 2 х ДСН-редукуючого буферу, кисебе відповідні сайти рестрикції, що дозволило б її п'ятили і піддавали електрофорезу у ДСН-ПААГ і клонувати у різні С-кінцеві Ig-злиті химерні вектовестерн-перенесенню. Для підтвердження експрери. Альтернативно, у 3'-кінця можна вбудувати сії мембрану зондували розведеним 1:3000 мишастоп-сигнал і одержати розчинну форму рецепточим антитілом проти людських IgG, кон'югованим з ра, не вдаючись до техніки з використанням Igпероксидазою хрону (ПХ), у 5% знежиреному сузлитої химери. Одержані вектори можуть бути ексхому молоці у TBST при кімнатній температурі пресовані у більшості систем, що використовуютьпротягом 30 хвилин, і промивали TBST. Блоти вися у біотехнології, включаючи дріжджі, клітини коявляли з використанням ЕХ Л (Amersham) і експомах, бактерійні клітини і клітини ссавців, і такі нували з плівкою. приклади існують для експресії всіх типів експресії. Імунопреципітацію здійснювали шляхом інкуПри необхідності, для оптимізації або видалення бування 25нг flag-hBAFF або flag-hTWEAK з 0,5мл взаємодій між FcR і комплементом, різні домени кондиціонованого середовища від клітин Fc людини можуть бути пов'язані. Альтернативно, 293EBNA, трансфікованих або pJST538, або мутовані форми цих Fc-доменів можуть бути викоСН269, при 4°С протягом 1 години при помішуванристані для селективного видалення взаємодій ні, з подальшим додаванням 30мкл Білка Аміж FcR або комплементом, або для приєднання Сефарози (Pharmacia) і безперервним помішуванN-пов'язаних цукрів до домену Fc, що має деякі ням протягом ночі. Гранули Білка А-Сефарози двіпереваги. чі промивали PBS і ресуспендували у 2 x ДСНПриклад 6: Генерування антитіл-агоністів і анпоновлюючому буфері для зразка. Після електротитіл-антагоністів форезу у ДСН-ПААГ і вестерн-перенесення, блоти Вищеописані розчинні форми рецепторів моінкубували з 5мкг/мл моноклонального антитіла жуть бути використані для імунізації мишей і для проти Hag M2 (Sigma), у 5%-ному знежиреному одержання моноклональних антитіл стандартними сухому молоці у TBST при кімнатній температурі методами. Одержані mAbs, які ідентифікуються протягом 1 години. Блоти промивали TBST і інкуметодами ELISA, можуть бути потім скриновані на бували з розведеним 1:3000 козячим антитілом їх агоністичну активність або як розчинні антитіла, проти мишачих IgG, кон'югованих з ПХ (Jackson або як антитіла, імобілізовані на пластиковій підкInmunoresearch), у 5% знежиреному сухому молоці ладці, у різних клітинних аналізах in vitro. Часто у TBST при кімнатній температурі протягом 30 загибель клітинної лінії НТ29 являє собою зручну хвилин. Блоти виявляли з використанням ЕХЛ систему, яка є чутливою до передачі сигналу че(Amersham) і експонували з плівкою. рез множину рецепторів TNF. Якщо ця лінія не має Після трансфекції pJST538 у клітини 293EBNA потрібного рецептора, то повнорозмірний рецепекспресію білка з молекулярною масою приблизно тор може бути стабільно трансфікований у клітин43кДа визначали у клітинному екстракті і у кондину лінію НТ29, що дозволило б у цьому випадку ціонованому середовищі шляхом Вестерн-блотпровести аналіз на цитотоксичність. Альтернативаналізу з використанням мишачого антилюдського но, вказані клітини можуть бути використані у апаIgG (Jackson Immunoresearch), що вказувало на те, раті Cytosensor, з тим, щоб визначити, чи може що гібрид BAFF-R-Fc був ефективно експресоваактивація даного рецептора виявити зміну pH, вканий і секретований. зуючу на подію передачі сигналу. Рецептори сіПри імунопреципітаціях смугу спостерігали мейства TNF передають сигнал у такому форматі тільки внаслідок інкубування BAFF-R-Fc і Flagдосить добре, і цей спосіб не вимагає знання про hBAFF. Ця смуга мігрувала разом з безпосередньо дійсні біологічні події, що запускаються даним резавантаженим зразком flag-hBAFF. Жодна з інших цептором. Для клінічного застосування mAbsдоріжок не продукувала сигнал, що вказувало на агоністи повинні бути "гуманізованими". Ця процете, що злиття BAFF-R-Fc з flag-hBAFF є специфічдура може бути також використана для визначенним. ня mAbs-антагоністів. Такі mAbs повинні бути виПриклад 5: Генерування розчинних форм резначені за відсутністю агоністичної активності і за цептора здатністю інгібувати взаємодію рецептора з ліганДля одержання інгібітора рецептора з метою дом, що прослідковується за допомогою ELISA, його введення людині необхідна кДНКметоду класичного зв'язування або методу ВІАпослідовність позаклітинного домену рецептора соrе. І нарешті, індукування секреції хемокіну різлюдини. Якщо мишача форма є відомою, бібліотеними клітинами у відповідь на антитіло-агоніст ки кДНК людини скринують з використанням миможе бути покладено в основу скринуючого аналішачої кДНК-послідовності, і такі маніпуляції є рузу. тинними для фахівців у цій області. З Приклад 7: Скринінг інгібіторів взаємодії "ревикористанням кДНК-послідовності людини можна цептор-ліганд" сконструювати олігонуклеотидні праймери для З використанням злитого білка "рецептор-Ig" ПЛР-ампліфікації позаклітинного домену рецептоможна піддати скринінгу будь-які комбінаторні бібра у відсутності трансмембранних і внутрішньокліліотеки на предмет визначення молекул, які мотинних доменів. Звичайно більшість амінокислот жуть безпосередньо зв'язуватися з рецептором. Ці включають між останнім дисульфідом, пов'язаним молекули потім можуть бути протестовані у форз "доменом TNF", і трансмембранним доменом. матованому ELISA-аналізі з використанням злитоДля оптимізації активності одержаного розчинного го білка "рецептор-Ig" і розчинної форми ліганду на рецептора кількість областей "стеблини" можна їх здатність інгібувати взаємодію рецептора з ліга 27 75049 28 ндом. Вказаний ELISA може бути використаний FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, СА) і безпосередньо для скринінгу бібліотек різних прианалізували з використанням програмного забезродних продуктів, наприклад, на присутність інгіпечення CBLLQuest (Becton Dickinson). буючих сполук. Цей рецептор може бути трансфіПісля обробки hBAFF-R-Ig спостерігалося прикований у клітинну лінію, таку як лінія НТ29 для близно 50% зниження числа В-клітин у периферирозробки біологічного аналізу (в цьому випадку чній крові і у периферичних лімфоїдних органах, цитотоксичності), який може бути потім встановщо розглядаються. В220highlgMlow-В-клітини, за лений в основу скринуючого аналізу. оцінками, становили 23,4% і 21,5% клітин у PBSПриклад 8: BAFF-R-IaG приводить до зниженоброблених і HuIgG-оброблених мишах, відповідня числа B-клітин γ нормальних мишей но, тоді як ця популяція у hBAFF-R-Ig-оброблених 8-Тижневих самиць мишей BALB/c закуповумишей була представлена тільки 9,9%-ми клітин. вали у лабораторії Джексона (The Jackson Очевидно, що число клітин плазми (синдеLaboratory) (Bar Harbor, ME). Мишам (3 на групу) кан/СD138+) злегка зменшувалося, становлячи внутрішньочеревно (і.р.) вводили або PBS, або 5,7% і 4,8% у крові PBS-оброблених і HuIgG400мкг людського гібридного білка BAFF-R-huIgGl оброблених мишей, відповідно, тоді як у hBAFF-R(hBAFF-R-Ig) (що поставляється Teresa Ig-оброблених мишей воно становило 3,9%. МолеCacheroBiogen), або 400мкг очищеного людського кула В7.2 була активована на 3,1% і 4,5% В220+IgG (HuIgG)(Sandoz, Basel, Switzerland) на дні -8, клітин у PBS-оброблених і HuIgG-оброблених ми5,-1 і +2. Мишам вводили 100мкл 10% овечих еришей, відповідно, a у hBAFF-R-Ig-оброблених митроцитів (SRBC) (Colorado Serum Company, шей вона була активована на 1,9% клітин. Denver, CO) на день 0. У селезінці число В220high-В-клітин помітно Після умертвіння кров, за допомогою серцевої знижувалося у hBAFF-R-Ig-оброблених мишей і пункції, збирали у пробірки, що містять EDT, і еристановило 18,8%, тоді як у PBS-оброблених і троцити піддавали лізису у гіпотонічному буфері. HuIgG-оброблених мишей воно становило 36,7% і Кров також збирали без EDTA для одержання си40%, відповідно. Спад спостерігався в обох IgMhigh роватки. З селезінки і мезентеріальних лімфовузі lgМlow-субпопуляцій (див. таблицю 8А). Якихлів (МЛВ) приготовляли суспензії з одиночних клінебудь змін у новоутвореному B-клітинному комтин, і еритроцити лізували у гіпотонічному буфері. партменті у селезінці, B220lowIgMhigh, не спостеріПроточну цитометрію здійснювали з використангалося (дані не приводяться). Число клітин плазми ням РЕ-кон'югованого антитіла проти CD45R/B220, (синдекан/СD138+) злегка зменшувалося і станоантитіла проти синдекану/СD138 і антитіла проти вило 3,3% і 3,4% у селезінці PBS-оброблених і В7.2 і FITC-кон'югованого антитіла проти IgM і анHuIgG-оброблених мишей, відповідно, тоді як у титіла проти CD45R/B220. Всі mAbs закуповували hBAFF-R-Ig-оброблених мишей воно становило у фірми Pharmingen (San Diego, СА). Коротко, Fc2,4%. рецептори блокували 10мкг/мл Fc Block У МЛВ спостерігалося зниження числа В220+(Pharmingen) протягом 15 хвилин на льоду, а потім В-клітин, яке становило 14,1% у hBAFF-R-Igдодавали РЕ- і ФІТС-кон'юговані моноклональні оброблених мишей, тоді як у PBS-оброблених і антитіла (mAb) і інкубували на льоду протягом 20HuIgG-оброблених мишей воно становило 26,7% і 30 хвилин. Клітини промивали 1 x і суспендували у 35,8%, відповідно. Дані систематизовані у таблиці 0,5% параформальдегіді. Дані клітинної флуорес8А. ценції визначали на проточному цитометрі 29 75049 30 Таблиця 8А Популяція B-клітин у hBAFF-R-Ig-, PBS- і HuIgG-оброблених мишей1 Кров 1 PBS HulgG HBAFF-R-Ig Селезінка PBS HulgG HBAFF-R-Ig MLN PBS HulgG HBAFF-R-Ig high B220 IgM low 2 23,4±5,7 21,5±4,5 9,9±1,8 B220high IgMlow 27,8±1,6 30,5±2 10,6±0,2 B220+ 26,7 35,8±3,3 14,1±5,9 Синдекан 3 5,7+1,5 4,8+0,9 3,9+0,6 B220low IgM+ 11,9+1,6 11,8+1,0 8,4+0,2 low B7./B220 4 3,1±0,5 4,5±1,0 l,9±0,5 Синдекан 3,3+0,8 3,4+0,7 2,4±0,2 1 Мишей обробляли як описано у розділі "Матеріали і методи", і дані приведені як процент + стандартне відхилення Знижений процент В7.2+-В-клітин з числа клітин крові і плазми у крові і селезінці hBAFF-R-Igоброблених мишей після імунізації SRBC дає підставу передбачити, що має місце інгібування активації і/або дозрівання B-клітин, і потенційно підвищена елімінація активованих В-клітин. Дуже невеликий процент антигенспецифічних B-клітин повинен бути активований і вони повинні реагувати на будь-який антиген, у цьому випадку на SRBC. Оскільки hBAFF-R-Ig-обробка приводить до такого різкого зниження проценту B-клітин у всіх тканинах, що оцінюються, -50%, то очевидно, що активність hBAFF-R-Ig також направлена на зрілі B-клітини, що покояться. Тому передбачається, що злитий білок BAFFR може бути використаний як терапевтичний лікарський засіб для лікування В-клітинноопосередкованих захворювань. Вказаними захворюваннями є аутоімунні захворювання, такі як системний червоний вовчак, важка міастенія, аутоімунна гемолітична анемія, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, синдром антифосфоліпідних антитіл, хвороба Шага, хвороба Грейвса, гранулематоз Вегенера, вузликовий поліартериїт і швидко прогресуючий гломерулонефрит. Даний терапевтичний агент також використовується для лікування розладів, пов'язаних з клітинами плазми, таких як множинна мієлома, макроглобулінемія Вальденстрема, хвороба важких ланцюгів, первинний або імуноцитоасоційований амілоїдоз і моноклональна гаммапатія невстановленої етіології (МГНЕ). Онкологічними мішенями є Вклітинні карциноми, лейкоз і лімфоми. Приклад 9: Блокування BAFF-індукованої проліферації B-клітин in vitro з використанням розчинного BAFF-R У цьому прикладі авторами винаходу було показано, що розчинний гібридний білок BAFFR:MgGl здатний блокувати BAFF-індуковану проліферацію B-клітин у мишачих спленоцитах. Спленоцити мишей Balb/C (5 105клітин/мл) виділяли і культивували у 96-ямковому планшеті у 100мкл RPMI (Life Technologies), у яку були до дані 10% фетальна теляча сироватка (JRH), 2мМ глутамін, 100одиниць/мл пеніциліну і 100мг/мл стрептоміцину (Life Technologies). Потім додавали різні кількості BAFF людини, 10мкг/мл людського BAFF-R:hIgGl або людського Ig, а також 10мкг/мл антимишачого поверхневого важкого ланцюга (Jackson Immuno Research). Після витримання у культурі протягом 48год. при 37°С клітини піддавали імпульсному міченню 3 1мкКі/ямку [метил- Н]-тимідину (Dupont NEN) протягом 24 годин і збирали з використанням колектора клітин Torutec (Orange, CT). Радіоактивність вимірювали на рідкому сцинтиляційному лічильнику Betaplate (Pharmacia Biotech). На Фіг.8 показані результати аналізу проліферації спленоцитів. На цій Фігурі показане число імпульсів у хвилину (імп./хв.), включених у клітини спленоцитів мишей, у залежності від кількості доданого реагенту BAFF. Рівень анти- -антитіло або злитого білка, або контрольного hlgG підтримувався постійним при 10мкг/мл. Заштриховані квадрати означають рівень проліферації, індукований лише BAFF. Заштриховані кружки означають проліферацію клітин з використанням BAFF і анти- -антитіла. Крива з незаштрихованими трикутниками означає інгібування, що спостерігається при додаванні BAFF-R:hIgGlBAFF з анти- антитілом + BAFF-R:higGI. Незаштрихований ромб означає інгібування, що спостерігається з використанням контрольного Ig людини. Додавання BAFF разом з анти- -антитілом приводить до проліферації спленоцитів мишей in vitro. Рівень 3Н-тимідину, включеного у ці клітини, значно перевищує рівень, одержаний при додаванні до спленоцитів або тільки BAFF, або тільки анти- -антитіла. Обробка спленоцитів тільки BAFF приводить лише до включення 3Н-тимідину у дуже високих концентраціях. Додавання тільки анти-μ-антитіла не приводить до проліферації. При додаванні до спленоцитів 10мкг/мл контрольного людського Ig з кількостями BAFF, що збільшуються, і 10мкг/мл анти- -антитіла відбувається помірне зниження рівня проліферації. У 31 75049 32 протилежність цьому, у даному аналізі при ввечення MFI у даному експерименті становило 7. денні 10мкг/мл людського гібридного білка BAFFТаким чином, BAFF-R:hIgGl є дуже ефективним R:higGI при тих же умовах, рівень проліферації для блокування зв'язування BAFF з клітинами знижувався до рівня, що спостерігається у разі Raji. обробки лише одним BAFF. Це вказує на те, що Приклад 11: BAFF-R-IgG сприяє ослабленню гібридний білок BAFF-R:higGI володіє здатністю аутоімунних розладів типу червоного вовчака у до інгібування проліферації спленоцитів, індукотрансгенних мишей У цьому прикладі описана дія BAFF-R, наваних BAFF і анти- -антитілом. правлена на зниження пулу периферичних BПриклад 10: Блокування зв'язування BAFF з клітин і інгібування розвитку спленомегалії і нефRaji-клітинами з використанням BAFF-R:higGI риту. У цьому прикладі описане попереднє інкубуУ даному експерименті використали п'ятимівання BAFF зі злитим білком BAFF-R:hIgGl, що сячних трансгенних (Tg) BAFF-мишей (C57BL/6) і приводить до зниження зв'язування BAFF з Bпоноси відповідного віку. BAFF-Tg-миші виявляли клітинною лінією лімфоми Raji. лімфатичні розлади і їх аутоімунний фенотип був У цьому FACS-аналізі 200нг/мл FLAGаналогічний такому при системному червоному міченого людського BAFF заздалегідь інкубували вовчаку (Mackay et al., 1999). Цей фенотип відпоабо з людським BAFF-R:hIgGl, або з людським відав популяціям з підвищеним числом перифеLT R:hIgGl, при двократних розведеннях у межах ричних B-клітин, включаючи "перехідні" клітини 1 від 20мкг/мл до 39нг/мл, або без злитого білка, (Т1) і 2 (Т2), зрілі клітини (М), клітини маргінальпротягом 30 хвилин на льоду. Інкубування провоної зони (MZ) і клітини CDlhigh/IgMhigh-В-клітини. дили у FACS-буфері, що містить PBS без Са2+ 2+ Мишам внутрішньочеревно вводили PBS, або Mg з додаванням 10% FCS (JRH) і 0,05%400мг очищеного людського IgG (hlg) (Sandoz, ного азиду натрію. Після попереднього інкубуBasel, Switzerland)(3/rpyny) або 400мкг злитого вання суміш BAFF-злитий білок додавали до білка BAFF-R-huIgGl (hBCMA-Ig)(2/rpyny), що по5 106 Raji-клітин(ATCC)/мл. Це інкубування проходить від СНО, у дні 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, водили протягом 30 хвилин на льоду, а потім, 32, 35, а на 40-й день мишей умертвляли. клітини промивали 2мл FACS-буфера при 4°С. Відразу після умертвіння визначали вагу сеДля детекції пов'язаного BAFF до клітин додавалезінки, і після лізису еритроцитів у гіпотонічному ли 5мкг/мл антитіла М2 проти FLAG (Sigraa) і інбуфері приготовляли суспензію з одиночних клікубували протягом 30 хвилин на льоду. Одержані тин. Проточну цитометрію здійснювали з викориклітини знов промивали, як описано вище, а постанням ФІТС-кон'югованого антитіла проти тім інкубували при розведенні 1:100 з РЕCD21/CD35, РЕ-кон'югованого антитіла проти IgD кон'югованим ослиним антитілом проти мишачих і проти CD1, кон'югованого з цитохромом антитіIg (Jackson Imnuno Research) протягом 30 хвилин ла проти CD45R/B220 і кон'югованого з біотином на льоду. Після повторного промивання FACSантитіла проти IgM. Всі mAbs закуповували у фібуфером ці клітини фіксували з використанням рми Pharmingen (San Diego, CA). Коротко, Fc1% параформальдегіду і зчитували на FACS рецептори блокували 10мкг/мл Fc Block (Becton Dickinson & Co.). (Pharmingen) протягом 10 хвилин на льоду, потім На Фіг.9 показані результати аналізу на блододавали біотин-кон'юговані mАВ протягом 30 кування BAFF. На цій фігурі показані дані зчитухвилин на льоду, клітини промивали їх, а потім вання MFI (середньої інтенсивності флуоресцендодавали РЕ- і ФІТС-, цитохром-кон'юговані mAb, ції), одержані внаслідок проведення FАСS стрептавідин-АРС і 10мкг/мл Fc-BIock. Ці клітини аналізу, вказуючого на зв'язування BAFF з Rajiінкубували на льоду протягом 30 хвилин, клітини клітинами. Заштриховані квадрати відповідають промивали 1 x і суспендували у 0,5% парафорданим, одержаним при попередньому інкубуванні мальдегіді. Дані клітинної флуоресценції визнаBAFF-R:hIgGl з BAFF перед зв'язуванням з цими чали на проточному цитометрі FACSCalibur клітинами. Кружки показують криву, одержану (Becton Dickinson, San Jose, CA) і аналізували з після додавання неспецифічного злитого людсьвикористанням програмного забезпечення кого білка LT R:hIgGI до BAFF. На осі x предстаCELLQuest (Becton Dickinson). влена кількість злитого білка, доданого до 200нг/мл BAFF перед інкубуванням з клітинами. Присутність білків у мишачій сечі вимірювали Якщо злитий білок не був заздалегідь інкубоз використанням смуг реагенту Multistix 10 SG ваний з людським BAFF, то середня інтенсивність для аналізів сечі [Bayer Corp., Diagnostics флуоресценції (MFI) зразка становила 80. Якщо Division]. людський LT R:hIgGl заздалегідь інкубували з Результати представлені нижче у Таблицях BAFF, навіть при 20мкг/мл, то детекція зв'язуван11А і 11В. ня BAFF з клітинами Raji не змінювалася. Однак якщо людський BAFF-R:hIgGl заздалегідь інкубували з BAFF, то MFI значно знижувалася до 2-25 навіть при 625нг/мл злитого білка. Фонове зна 33 75049 34 Таблиця 11А Анализ спленоцитів 3-місячних мишей 6 Т1 816Е23 816Е33 816Е99 Середнє 9,4 14 14 13+/2,6 816Е2 816Е4 Середнє 5,3 ZA 3,9+/-2 Всього клітин на селезінку ( 10 ) Т2 MZ Baff-Tg-мишей 18 9 30 19 24 19 24+/-6 16+/5,7 Контрольні поноси 5,8 3,1 3,7 19 4,8+/-1,5 2,4+/-1 Спленоцити 3-місячних Baff-Tg-мишей (n=3) і поносів відповідного віку (n=2) виділяли і піддавали FACS-аналізу як описано у розділі "Матеріали і методи". Клітини Т1, Т2, Μ і ΜΖ визначали за експресією нижченаведених поверхневих маркерів (hi: високий, lо: низький, int: проміжний): Зрілий 91 170 150 140+/-41 73 44 59+/-20 Tl: IgD , IgMhigh, CD2llo MZ: IgD , IgMhi, CD21 T2: IgD+, lgMhi, CD21hi M: IgD+, IgMlo, CD21int Таблиця 11В Аналіз спленоцитів 10-місячних мишей Т1 802-39 823-3-11 823-3-13 Середнє 13 7,5 3,1 7,9+/-4,9 823-3-22 802-64 823-14-13 Середнє 0,7 0,28 0,45 0,48+/-0,21 Всього клітин на селезінку ( 106) Т2 ΜΖ Baff-Tg-мишей 100 34 43 6,6 50 15 64+/-30 19+/-10 Контрольні поноси 6,5 1,4 5,4 1,3 3,4 0,16 5,1+/-1,5 0,95+/-0,65 10-місячних Baff-Tg-мишей (n=3) і поноси відповідного віку (n=3) піддавали FACS-аналізу як описано у таблиці 1. Після введення hBAFF-R-Ig Baff-Tg-мишам популяції клітин Τ1, Τ2, Μ, ΜΖ і CDlhigh/IgMhigh-Bклітин у селезінці значно знижувалися у порівнянні з популяціями PBS- і hlg-оброблених Baff-Tgмишей, і загальне число Т1, Т2, Μ, ΜΖ і CDlhigh/IgMhigh-B-клітин знижувалося до рівня, аналогічного рівню клітин у PBS-оброблених контрольних поносів, або до меншого рівня (Фіг.10а, 10b, 10с). BAFF-R-Ig-обробка Baff-Tg-мишей приводила до ослаблення Baff-опосередкованого аутоімунного захворювання, про що свідчило спостереження того факту, що BAFF-R-оброблені миші мали селезінку нормального розміру, тоді як контрольні Baff-Tg-миші виявляли спленомегалію (Фіг.11). Крім того, у BAFF-R-Ig-оброблених мишей придушувався розвиток протеїнурії як показника ниркоподібної дисфункції, тоді як у контрольних Baff-Tgмишей розвивався нефрит, як було визначено за зростаючими рівнями протеїнурії (Фіг.12). Зрілий 630 200 180 340+/-250 56 38 38 44+/-10 Мишi, трансгенні за Ваff мали значною мірою збільшене число периферичних B-клітин, і додатковий аналіз, проведений авторами даного винаходу, виявив переважне збільшення субпопуляцій Т1, Т2, MZ B-клітин у цих мишей. Перехідна стадія розвитку B-клітин (Т1 і Т2) являє собою контрольну стадію, на якій приблизно відбувається елімінація аутореактивних B-клітин. У Baff-Tg-мишей було також значно збільшене число CDlhigh/IgMhigh-Bклітин, які мають тенденцію залишатися у маргінальній зоні. Було показано, що ця остання популяція B-клітин являє собою головне джерело продукування аутоантитіл у NZB/NZW-мишей з вовчаком. BAFF-R-Tg-обробка Baff-lg-мишей приводила до зниження популяцій Т1, Т2, Μ, ΜΖ і CDlhi B-клітин до рівня, що спостерігається у контрольних поносах дикого типу, або до меншого рівня. Дія BAFF-R-Ig направлена на зниження пулу периферичних B-клітин і інгібування розвитку спленомегалії і нефриту. Тому, крім її ефективності у лікуванні системного червоного вовчака і вовчакового нефриту, дія BAFF-R-Ig також є ефективною для лікування В-клітинно-опосередкованих 35 75049 36 захворювань, які за своєю природою є аутоімунсування хвороби з розвитком важкого нефриту ними, такі як важка міастенія, аутоімунна гемолітиСамицям мишей зі схильністю до вовчака чна анемія, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпу(SWR x NZB)Fl(SNF1), що має вік 21 тиждень і що ра, синдром антифосфоліпідних антитіл, хвороба виявляє помірний нефрит (30-100мг/дл протеїнуШага, хвороба Грейвса, гранулематоз Вегенера, рії), вводили і.р. 200мкг гібридного білка людського вузликовий поліартериїт і швидко прогресуючий BAFF-R-huIgG (hBCMA-Ig), людського IgG гломерулонефрит. Даний терапевтичний агент (HuIgG)(Sandoz) або 200мкл PBS щотижня протятакож використовується для лікування розладів, гом 8 тижнів. Сечу кожної миші щотижня аналізупов'язаних з клітинами плазми, таких як множинна вали на протеїнурію з використанням Albustix мієлома, макроглобулінемія Вальденстрема, хво(Bayer Corp., Terrytown, NY). Протеїнурія понад роба важких ланцюгів, первинний або імуноцитоа10мг/мл оцінювалася як важкий нефрит. BAFF-R-Ig соційований амілоїдоз і моноклональна гаммапабув продукований у тимчасово трансфікованих тія невстановленої етіології (МГНЕ). клітинах EBNA 293. Кондиціоновані середовища Онкологічними мішенями є B-клітинні карциноми, від клітин 293, надекспресуючих hBCMA-Ig, заванлейкоз і лімфоми. тажували на колонку з білком А. Білок елюювали Приклад 12: Середній артеріальний тиск у 25мМ фосфатом, 100мМ NaCl, pH 2,8, а потім нейтрансгенних BAFF-мишей тралізували 1/20 об'єму 0,5Μ NaPO4, pH 8,6. ФракУ цьому експерименті описане вимірювання ції, відібрані виходячи з ОП280, піддавали електкров'яного тиску у трансгенних BAFF-мишей. Спорофорезу у відновлювальному і стереження, зроблені під час оцінки фенотипу невідновлювальному ДСН-ПААГ і Вестернтрансгенних BAFF-мишей, вказували на імовірблотингу для ідентифікації очищеного білка. ність гіпертонії у цих мишей. Через три тижні після обробки було встановBaff-Tg-мишей, описаних вище, анестезували лено, що важкий нефрит виявлявся у 50% мишей, кетаміном. Ліву сонну артерію оголювали за допооброблених BAFF-R-Ig, і у 75% і 87,5% мишей, могою надрізу на шиї. У цю сонну артерію вставяким вводили HulgG і PBS, відповідно (див. Фіг.15). ляли катетер для вимірювання кров'яного тиску і Ці дані показали, що розчинний рецептор BAFF, частоти серцевих скорочень. Катетер приєднували BCMA-Ig, може блокувати опосередковані Вдо датчика тиску, і кров'яний тиск вимірювали з клітинами аутоімунні захворювання, такі як вовчавикористанням системи збирання даних (Po-Neковий нефрит, що приводить до помітного ослабMah Data Acquisition system and Gould polygraph). лення прогресування даного захворювання. Виходячи з форми зубців пульсового тиску, систоПриклад 14: BAFF-R-Ig-Обробка нормальних лічного тиску, діастолічного тиску, визначали семишей, що приводить до зниження числа дендриредній тиск і частоту серцевих скорочень. При тних клітин селезінки (ДКС) і їх атипічної локалізацьому використали дві групи мишей: трансгенних ції у селезінці BAFF-мишей (n=8) і контрольних мишей дикого 7-Тижневим самицям мишей BALB/c (З/групу) типу (n=9). вводили і.р. або 20мкг або 50мкг людського BAFFНа Фіг.13 представлений середній артеріальR-IgGI (hBCMA-Ig), або 50мкг IgG людини (HulgG), ний тиск (МАР у мм рт.ст.) для двох груп. Як покаабо 100мкл PBS 1х/тиждень протягом 4 тижнів. зано, трансгенні BAFF-миші мали середній МАР Гібридний білок hBCMA-Ig очищали з супернатан102±8мм рт.ст. Контрольні миші мали середній тів культури стабільно трансфікованої клітинної МАР 92±би мм рт.ст. Таким чином, у BAFF-мишей лінії СНО. Через 8 днів після останньої ін'єкції вивиявлялося збільшення МАР на 10мм рт.ст. у поділяли селезінки і розщеплювали колагеназою рівнянні з контролем, хоча це значення не є стати(Sigma, cat.# С-5138) протягом 1год. при 37°С. стично значущим (ANOVA). Потім одержували суспензію з одиночних клітин, Більш докладний аналіз цих даних поданий на еритроцити (RBC) лізували у гіпотонічному буфері, Фіг.14. На цій фігурі представлені результати анаі клітини промивали 3х у PBS. Спленоцити приголізів, одержаних від окремих тварин. У контрольтовляли для проточного цитометричного аналізу них мишей дикого типу (BAFF-) розподіл даних шляхом фарбування клітин біотинільованим антивідповідає типовому біноміальному розподілу. У тілом проти CDllc, а потім стрептавідином-АРС, протилежність цьому, тиск у трансгенних BAFFкон'югованим з цитохромом антитілом проти CD8a мишей (BAFF+) був таким, як якби вони були подіі FITC-кон'югованим антитілом проти CD4 для оцілені на дві групи, де одна група мала тиск у діапанки ДК-популяцій. зоні 120-130мм рт.ст., а інша група мала тиск у У окремому експерименті самицям мишей діапазоні 80-90мм рт.ст. BALB/c (N=3) і.р. вводили 100мкг hBCMA-Ig Трансгенні BAFF-миші як популяція мали тен1х/тиждень протягом 4 тижнів, після чого селезінки денцію до гіпертонії у порівнянні з мишами негативмить заморожували в ОСТ з використанням 2вного контролю. Аналіз окремих рівнів артеріальметилбутану, охолодженого на СО2. Кріозрізи розного тиску показав, що трансгенні BAFF-миші різали і фіксували у ацетоні. Зрізи інкубували з розділялися на дві субпопуляції, причому одна з біотинільованим антитілом проти CDІІc, потім зі них мала високий кров'яний тиск, а інша мала нострептавідином-АР і субстратом ВСІР (Pierce) для рмальний кров'яний тиск. Відповідно до цього, візуалізації ДК, а після цього з mAb МОМА-1, а введення розчинного BAFF-R, гібридного білка або потім з ПХ-кон'югованим антитілом проти щурячих гомолога антитіла може ослабляти ефекти гіперIgG (Jackson IrnmunoResearch) і субстратом 3,3'тонії. діамінобензидину (Sigma, St.Louis MO, cat.# DПриклад 13: BAFF-R-Is-обробка мишей SMF1 з 1293) для візуалізації металофільних макрофагів, і встановленим захворюванням уповільнює прогрез біотинільованим антитілом проти CD35, потім зі 37 75049 38 стрептавідин-АР і субстратом (набір субстрату нта) у CDllc + ДК селезінки у порівнянні з HulgG- і лужної фосфатази І, Vector cat#SK-5100) для візуPBS-обробленими контролями. Це зменшення алізації фолікулярних дендритних клітин (ФДК). було очевидним для всіх CDІІc + ДК-популяцій, що Миші, оброблені in vivo або 20мкг, або 50мкг оцінюються: CD8a-CD4-, CD8a+CD4-, і CD8a-CD4+ BCMA-Ig 1х/тиждень протягом 4 тижнів, виявляли (Фіг.16, Таблиця 14А). значне зменшення (р