Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку synchytrium endobioticum (schilb) perc. якісним аналізом патогенозалежних білків

Реферат: Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку включає зараження паростків картоплі літніми зооспорами збудника хвороби і їх аналіз. При цьому з контрастних за стійкістю сортів картоплі виділяють білки на 7, 14, 21 та 28 дні після зараження патогеном, проводять їх ізоелектрофокусування у поліакриламідному гелі і виявляють патогенозалежні білки в інтервалі рН 4,8-5,6, за якими визначають стійкість до хвороби. UA 105467 U (12) UA 105467 U UA 105467 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [2]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. [2, 3]. Польовий спосіб визначення стійкості картоплі до раку базується на безпосередньому зараженні зразків картоплі зимовими зооспорами збудника раку у природних польових умовах. Лабораторний спосіб базується на зараженні паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів (найближчий аналог) [4]. Спосіб, що представлений у найближчому аналогу, полягає в тому, що він включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів за 11-13 °C. Після 21 дня проводиться облік реакції рослин на дію зооспор з ракових наростів картоплі. У сприйнятливих сортів картоплі спостерігається деформація паростків картоплі та поява ракових наростів, а у стійких - поява поодиноких copyсів та некротичне відмирання тканини паростків картоплі. Згадані аналоги мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане з затратою часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення стійкості картоплі до раку шляхом якісного аналізу патогенозалежних білків на 7, 14, 21 та 28 дні після зараження сортів картоплі збудником хвороби. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі шляхом якісного аналізу патогенозалежних білків ізоелектрофокусуванням у полі акриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0 з контрастних за стійкістю до раку сортів картоплі на 7-й день після зараження патогеном у зразків картоплі виявляються патогенозалежні білки в інтервалі рН 4,2-5,8 і, таким чином, відібрати стійкі до раку сорти картоплі. 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити стійкість картоплі до раку за значно коротший термін часу - 7 днів (за найближчим аналогом - впродовж 28 днів). 2. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом виявлення патогенозалежних білків вдається відбірати стійкі до раку сорти картоплі. Приклади здійснення способів Приклад 1. Зразки бульб сортів картоплі, контрастних за стійкістю до раку - Поліська рожева та Божедар, коли паростки сягають 1-2 мм, заражають літніми зооспорми зі свіжих ракових наростів впродовж 24 годин за 11-13 °C. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплюють паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливають дистильовану воду, кладуть шматочки свіжого ракового наросту 2 розміром 0,5 см . Зразки залишають у клімокамері з підвищеною вологістю і температурою 1113 °C. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімають з бульб і залишають зразки картоплі температури 17-18 °C впродовж 27 діб, після чого відзначають реакцію паростків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізують під бінокулярною лупою і визначають ступінь ураження збудником раку: 1 - некротизована тканина паростка, поодинокі соруси (до 5 штук); 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5); 3 - щільні соруси без деформації паростка; 4 - щільні соруси з деформацією паростка, 5 - раковий наріст [4]. В аналізованих таким чином сортів картоплі Поліська рожева та Божедар (таблиця) ступінь ураження паростків картоплі збудником раку склала: 7-й день після зараження патогеном: 1 - Божедар; 2 - Поліська рожева; 3-0 зразків; 4-0 зразків; 5-0 зразків. 14-й день після зараження патогеном: 1 - Божедар; 2 - Поліська рожева; 1 UA 105467 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3 - Поліська рожева; 4 - Поліська рожева; 5-0 зразків. 21 день після зараження патогеном: 1 - Божедар; 2-0 зразків; 3 - Поліська рожева; 4 - Поліська рожева; 5 - Поліська рожева. 28-й день після зараження патогеном: 1 - Божедар; 2-0 зразків; 3 - Поліська рожева; 4 - Поліська рожева; 5 - Поліська рожева. Приклад 2. На 7-й, 14-й, 21-й та 28-й день після зараження з паростків картоплі виділяють білки шляхом розтирання на холоді у фарфоровій ступці, центрифугують впродовж 10 хвилин за 8000 об./хв. [8]. При цьому білки виділяються в супернатант (центрифугат), а суміш випадає в осад, який видаляють. Супернатант використовують для ізоелектрофокусування білків у поліакриламідному гелі (Т - 5 %, С - 3 %) з амфолітом діапазону рН 3,5-10,0. Ізоелектрофокусування проводять за напруги 600 В впродовж двох годин [9]. Білкові спектри виявляють фарбуванням за допомогою 0,5 % розчином Кумасі блакитного G 250. Для цього спочатку відмивають амфоліти сумішшю: трихлороцтова кислота: етанол:вода (10:25:65) і забарвлюють барвником в суміші: оцтова кислота:етанол:вода (10:25:65). Промивання від надлишку барвника проводять цією ж сумішшю. Розрахунок білкових компонентів проводять розробленою нами комп'ютерною програмою [1]. У результаті проведених досліджень до зараження збудником хвороби поліморфізм білків сорту картоплі Поліська рожева представлений 45 білковими компонентами (фіг. 1 Поліморфізм білків сорту картоплі Поліська рожева, отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ до зараження збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (рН 3,5-10,0)). Після зараження збудником раку сорту картоплі Поліська рожева на 7-й день виявлено 43 білкові компоненти (фіг. 2 - Поліморфізм білків сорту картоплі Поліська рожева, ураженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (7 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0)). На 14-й день після зараження - 38 білкових компонентів (фіг. 3 - Поліморфізм білків сорту картоплі Поліська рожева, ураженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (14 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0)). На 21-й та 28-й дні - 28 білкові компоненти (фіг. 4 - Поліморфізм білків сорту картоплі Поліська рожева, ураженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (21 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0), фіг. 5 - Поліморфізм білків сорту картоплі Поліська рожева, ураженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (28 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0)), які відрізняються своїми ізоелектричними точками та вмістом в них білка. Пояснюючи зникнення компонентів поліпептидів за ураження сорту картоплі Поліська рожева на 7, 14, 21 та 28 дні після зараження її збудником раку, характерні припинення синтезу білків рослини-живильника, що на ізоелектрофореграмі розташовані в інтервалі рН 5,2-8,7 і поява білків патогену в інтервалі рН 8,8-9,8. На ізоелектрофореграмах (фіг. 1-5) встановлено зменшення кількості білкових компонентів з 45 до 28. Отримані білкові спектри характерні для збудника раку картоплі. Аналізуючи поліморфізм білків до зараження збудником раку у сорту картоплі Божедар у інтервалі рН 3,5-10,0 ідентифіковано 53 білкових фракції (фіг. 6 - Поліморфізм білків сорту картоплі Божедар, не враженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc., отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0)). На 7 день після зараження патогеном у інтервалі рН 4,2-5,8 виявлено 3 додаткові білкові компоненти (фіг. 7 - Поліморфізм білків стійкого до раку сорту картоплі Божедар, зараженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (7 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0)). На 14, 21 та 28 дні спостерігається збільшення білкових фракцій у спектрі поліпептидів на 7 білкових компонентів в інтервалі рН 4,2-5,8 з низькою молекулярною масою (фіг. 8 - Поліморфізм білків сорту картоплі Божедар, зараженого збудником раку Synchytrium 2 UA 105467 U 5 10 15 20 endobioticum (Schilb.) Perc. (14 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0), фіг. 9 - Поліморфізм білків стійкого до раку сорту картоплі Божедар, зараженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (21 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0), фіг. 10 - Поліморфізм білків стійкого до раку сорту картоплі Божедар, зараженого збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. (28 день після зараження), отриманих після ізоелектрофокусування в ПААГ (рН 3,5-10,0)). Появу додаткових білкових компонентів у стійкого сорту картоплі Божедар з 7 до 28 дня можна пояснити тим, що дані синтезовані поліпептиди є стресовими або патогенозалежними білками рослини-живильника, які виконують захисну функцію рослини при враженні її патогеном. У нашому випадку до 28-го дня після зараження сорту картоплі Божедар виявлено до 60 білкових компонентів. Нині з'ясовуються можливі механізми генної експресії патогенозалежних білків, але відомо, що надчутлива реакція є одним із головних механізмів експресії стійкості рослин проти фітопатогенів, а синтез патогенозалежних білків – супроводжуюча ознака, пов'язана з цією реакцією. Тому аналіз їх синтезу можна використовувати як маркер стійкості рослин до патогенів [3]. Процес виявлення патогенозалежних білків в інтервалі рН 4,2-5,8 шляхом ізоелектрофокусування у поліакриламідному гелі на 7-й день після зараження зразків картоплі збудником раку склав 2,5 годин, а за способом зараження зооспорами зі свіжих ракових наростів (найближчим аналогом) - 28 днів. Запропонований спосіб визначення стійкості картоплі до раку підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при зараженні патогеном сортів картоплі, отриманих з Інституту картоплярства НААН та Поліського дослідного відділення ІК НААН. Таблиця Реакція сортів картоплі на зараження збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. (2014 p.). № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Назва сорту картоплі Поліська рожева - 7-й день Поліська рожева - 14-й день Поліська рожева - 21-й день Поліська рожева - 28-й день Божедар - 7-й день Божедар - 14-й день Божедар - 21-й день Божедар - 28-й день 1 - некроз + + + + Ступінь стійкості 2- розсіяні 3 - щільні 4 - дефор- 5 - раковий соруси соруси мація наріст + + + + + + + + + + + '+" - ураження сортів; '-" - відсутність ураження сортів. 25 30 35 40 Джерела інформації: 1. Авт. свід. № 26245 від 29.10.2008 р. Комп'ютерна програма "Розрахунок ізоелектричних білкових спектрів" / П.О. Мельник, В.Є. Куц, О.С. Сологуб. 2. Вилкова Н.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам / Н.А. Вилкова, И.Д. Шапиро, Т.А. Борщева // В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М.: Колос, 1976. - С. 216-219. 3. Горбачева Л.А. Молекулярные механизмы устойчивости растений / Л.А. Горбачева, Н.Л. Дударева, Р.И. Салганик // Успехи современной биологии. - 1991. - Т. 111. Вып. 1. - С. 122-136. 4. Зеля А.Г. Методологія оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі стійкого до раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. / А.Г. Зеля, П.О. Мельник. - Чернівці, 2007 р. - 24 с. 5. Зеля А.Г. Стійкість картоплі проти збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc, методи його виявлення і диференціації. Авт. канд. дис. К.,2009, 24 с. 6. Зеля А.Г. Біохімічні методи визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. // Вісник Чернівецького національного університету, серія "Біологія". 2007. - № 343. - С. 78-90. 3 UA 105467 U 5 7. Маслов Ю.И. Статистическая обработка данных биохимических исследований // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. - С. 163-178. 8. Остерман Н.А. Исследование биологических макромолекул электрофорезом, ультрацентрифугированием. / Н.А. Остерман // М.: Наука, 1983. - 304 с. 9. Ригетти Т. Изоэлектрическое фокусирование белков. Теория, методы, применение / Т. Ригетти // М.: Мир. - 1986. - 294 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорами збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з контрастних за стійкістю сортів картоплі виділяють білки на 7, 14, 21 та 28 дні після зараження патогеном, проводять їх ізоелектрофокусування у поліакриламідному гелі і виявляють патогенозалежні білки в інтервалі рН 4,8-5,6, за якими визначають стійкість до хвороби. 4 UA 105467 U 5 UA 105467 U 6 UA 105467 U 7 UA 105467 U 8 UA 105467 U 9 UA 105467 U 10 UA 105467 U 11 UA 105467 U 12 UA 105467 U 13 UA 105467 U 14 UA 105467 U 15 UA 105467 U 16 UA 105467 U 17 UA 105467 U 18 UA 105467 U 19 UA 105467 U 20 UA 105467 U 21 UA 105467 U 22 UA 105467 U 23 UA 105467 U 24 UA 105467 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 25