Ензим, здатний до деградування рамногалактуронану ii та його похідних, способи одержання цього ензиму і рамногалактуронану ii

Предметом винаходу є ензим, здатний деградувати рамногалактуронан II (РГ-ІІ) та його похідні, а також спосіб одержання цього ензиму. Крім того, його предметом є спосіб одержання РГ-ІІ. Він також стосується застосування цього ензиму. Рамногалактуронан ІІ є одним з універсальних і дуже складних елементів клітинної оболонки рослин (O'Neil et al., Methods in Plant Biochemistry (1990) 2:415-439), Він належить до пектинних полісахаридів і розташовується головним чином на рівні середньої ламели і первинної оболонки. Його будова надзвичайно складна (фіг.1), оскільки він складається з 12 різних моносахаридів з ступенем полімерізації (сп) близьким до 30. Ця складність збільшується завдяки присутності в його складі рідкісних цукрів, котрі містять апіозу або 3-С-(гідроксиметил)-D-гліцеро-тетрозу, KDO або 2-цето-3-деокси-D-манооктулозну кислоту; DHA або 3-деокси-D-ліксо-2-гептулозну кислоту, 2-O-метил-ксилозу і, нарешті, оцтову кислоту або 3-С-карбокси-5-деокси-L-ксилозу. Цей останній моносахарид є для РГ-ІІ специфічним маркером, моносахариди, що більш часто зустрічаються в оболонкових полісахаридах: рамноза, фукоза, арабіноза, галактоза, а також галактуронова та глукуронова кислоти також присутні в складі РГ-ІІ, але найчастіше з аномеріями та численними і специфічними типами зв'язків, котрі ще більш посилюють специфічність і складність будови молекули. Ультраструктуральна організація РГ-ІІ (фіг.1) це більше підвищує цю складність (Puvanesarajah et al., Carbohydr. Res.(1991) 218:211-222). Гомологічний ланцюг, що складається з від 7 до 14 залишків галактуронової кислоти, поєднаних в a-(1®4), має в це досі не визначених позиціях 4 різних гілки: два дисахариди і два складніших окта- або нонасахаридних ланцюга. Спостерігаються структуральні відмінності в довжині гомогалактуронового ланцюга і в кінцевій частині гілки В, котрі, як здається, зобов’язані своїм існуванням ензиматичним впливам, використаним для їх одержання, з іншого боку, на залижу АБ була помічена присутність досі не визначених замісників. Крім того, молекула РГ-ІІ містить від 2 до 3 метальних груп, котрі перетворюють в складні ефіри карбоксильні групи галактуронових кислот і дві ацетильні групи, розташовані на залишках R3 (ацерична кислота) і В4 (2-метил-фукоза). Таким чином, будова РГ-ІІ є в загальних рисах визначеною, хоч природа окремих замісників лишається досі не ідентифікованою. В клітинній оболонці рослин РГ-ІІ асоційований з нативними пектинами, але точний тип зв'язку між протопектином і РГ-ІІ є на цей час невідомим. Так само і його роль в оболонці рослин є мало відомою. Тим часом його присутність відома в усьому рослинному світі (Albersheim et al., Biochem. Soc. Transactions (1994) 22:374-378); від птеридофітів до сперматофітів, від гімноспермів до ангіоспермів. від однодольних до дводольних (фіг.2), причому в варти х уваги кількостях, в середній ламелі оболонок. Відомо також, що його будова збережена в тих різних рослинах, в котрих вона вивчалась (Albersheira et al. Biochem. soc. Transactions (1994) 22:374-378). Останні роботи показали, що він може діяти як сигнальний полісахарид і викликати у рослини специфічні відповіді (еліцитрична активність) (Aldington et Fry, J. Exp. Botany (1994) 45:287-293). Тим часом, його велика кількість, його одночасна присутність в багатьох місцях і складність його будови наводять на думку про те, що він відіграє фундаментальну роль в поєднанні клітинних оболонок рослин і таким чином в клітинній організації рослинних тканин. РГ-ІІ виділено з клітинних оболонок під впливом ензимів пектолітичної дії (пектин-естераза, ендо- або ексо-полігалактуроназа), котрі деградують гладкі ланцюги нативних пектинів і вивільнюють РГ-ІІ в недеградованій формі (Darwin et al,, Plant Physiol. (1978) 62:418-422), як показано на фіг.1. Відмінності в довжинах гомогалактуронового ланцюга засвідчують наявність ензиматичних деградацій, котрі уможливили його вивільнення з нативних пектинів (Whitcombe et al., Carbhydr, Res (1995) 271:15-29). Складність і оригінальність будови РГ-ІІ роблять його особливо резистентним щодо деградування ензимами, присутніми в рослинних екстрактах, так само як і комерційними ензимними препаратами, як грибкового так і бактеріального походження. Дійсно, в комерційних ензиматичних деградувальних препаратах, що мають найбільшу кількість різних активностей, не можна засвідчити ніякої деградувальної активності щодо рослинних оболонок. Єдині з помічених деградацій мають відношення до залишав арабінофуранози, рамнопіранози або галактопіранози, розташованих на невідновному кінці бокових ланцюгів. Екзо-ензими, що дозволять вивільнення таких залишків, дійсно часто присутні в ензиматичних препаратах; що безсумнівно пояснює відмічені різних авторами відмінності різних препаратів РГ-ІІ. Під час видушування або розмелювання фруктів і овочів вивільнюються пектолітичні активності, котрі забезпечують деградацію гомогалактуронових ланцюгів нативних пектинів. Ці активності посилюються при додаванні комерційних пектолітичних ензимів і, у випадку вин і ферментованих продуктів, - ферментаційною флорою. РГ-ІІ ви вільнюється в непорушній формі і часом в значній кількості в фр уктови х та овочевих соках і нектарах та їх похідних, особливо в винах. В винах РГ-ІІ є одним з найосновніших полісахаридів (Doco et Briliouet, Carbohydr. Res. (1993) 243:333343), і його концентрація може досягнути 100мг/л. Він приймає участь в численних небажаних явищах, таких як кольматаж фільтрувальних мембран (Belleville et al., Enol. Vitic. Sci, (l99l) 46:100-107), утворення нестійких комплексів з іншими колоїдальними макромолекулами і індукція явищ осадоутворення. його елімінація обов'язково проходить з застосуванням ензимів, призначених для його деградування. Ha сьогоднішній день описані численні способи одержання РГ-ІІ з вина: ензиматичним гідролізом з допомогою грибкової ендополігалактуронази клітинних оболонок, виділених з культур суспендованих рослинних клітин (Darvill et al., Plant Physiol. (1978) 62:418-422), з комерційного ензиматичного препарата пектінол АС, одержаного з Aspergillus niger (Stevenson et al.,Carbohydr. Bes. (l988) 179:269-288); РГ-ІІ присутній в ньому в слабкій концентрпції і його очищення пов'язане з численними етапами елімінації білків і барвної речовини, з вина (Doco et Brillouet, Carbohydr. Res. (1993) 243:333-343), описана очистка потребує 4 послідовних етапи хроматографії стеричнии вилученням і іонним обміном. Слід відмітити, що рамногалактуронан І або РГ-І, хоч і дуже близький за назвою, є складником оболонок рослинних клітин, що повністю відрізняється від РГ-ІІ як з точки зору будови (його будова базується на чергуванні рамнози і галактуронової кислоти), так і його деградування ензимами. Рамногалактуроназна (Schols et al., Carbohydr. Res. (1990) 206:105-115) або протопектиназна (Sakamoto et Sakai, Carbohydr. Res. (1994) 259:77-91) активності вже були описані раніше. З наведеного веде аналізу стану техніки витікає, що спеціалістам невідомий жоден ензим або ензиматичний препарат, що мав би достатню активність для деградування РГ-ІІ. Однак присутність цього полісахариду є джерелом небажаних явищ, таких як кольматаж фільтрувальних мембран, утворення з інший колоїдальними макромолекулами нестабільних комплексів і індукція явищ осадоутворення. Зважаючи на важливість пов'язаної з цими явищами економічної діяльності, описану проблему потрібно було вирішити. Заявник показав можливість виділити з мікроорганізмів ензиматичні активності, відповідальні за деградацію РГ-ІІ і його похідних. З іншого боку, він розробив новий спосіб одержання РГ-ІІ, котрий дозволяє одержувати його в великих кількостях з різних рослинних джерел. Предметом цього винаходу є ензим, відмітний тим, що він деградує РГ-ІІ і його похідні. В цьому винаході під РГ-ІІ розуміється будь-який полісахарид, що мас будову, показану на фіг.1, будь-то в формі мономера або димера, і будь-яка молекула, утворена в результаті його часткової деградації, що має принаймні один ланцюговий фрагмент А, в, С або D, характерний як з точки зору складу, так і послідовності. В подальшому будь-яке посилання на РГ-ІІ може також стосуватись будь-якої похідної цієї молекули. Вигідний чином, такий ензим виявляє активність типу ендо-гідролазної. Такий ензим може зокрема вишити ендо-b-L-рамнопіраносил-(1®3')-D-апіофураносил-гідролазну і/або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносил-гідролазну активності. Ці активності можуть бути зідентифіковані по їх спроможності вивільнювати ланцюг А, як це видно з фіг.1. Такий ензим може бути продукованим мікроорганізмом, зокрема грибом з роду Реnісіllium. Такі мікроорганізми, що виявляють активність деградування РГ-ІІ і його похідних, являють собою інший предмет цього винаходу. Ними зокрема можуть бути наступні штами Penicillium, депоновані 19 травня 1995 року в Національній колекції культур мікроорганізмів Інституту Пастера (СNCM): штам Penicillium simplicissimum, депонований в CNCM під №1-1577 (IPV1), штам Penicillium daleae, депонований в CNCM під №1-1578 (LAV2). Ці два штами грибів мають характерний вигляд нитчатих, поділених перегородками, грибів, що швидко утворюють синьо-зелені спори (починаючи з 6-го дня культури). P. daleae є малопоширений гриб, котрий завжди виділяють з лісових ґрунтів і котрий є відомим завдяки своїй спроможності деградувати крохмаль і пектинові полісахариди. Цей вид описано в "Compedium of soil Fungi, H.К. Domsch, W. Gams et Т.Н. Anderson (1980) academic Press, London, c.560". P. simplicissimum є більш поширеним і його часто виділяють з овочів в стані розкладання. Цей вид описано в "Compedium of soil Fungi, H.К. Domsch, W. Gams et Т.Н. Anderson (1980) Academic Press, London, cc.597-598". Винахід також стосується ензиматичних препаратів, що містять ензим-деградант РГ-ІІ і його похідні, такі як описано вище. Таким чином, такі ензими можуть бути приготовленими у вигляді препаратів, що містять інші ензими, котрі виявляють інші активності. Збагачення таких препаратів активностями, що дозволяють деградувати РГ-ІІ, створює цілковито нові можливості для всіх застосувань, що потребують часткової або повної деградації клітинних оболонок і полісахаридів рослин. Ензими, що дозволяють специфічну деградацію РГ-ІІ та його похідних, можуть бути застосованими для деградування або модифікації РГ-ІІ або його похідних і зокрема в таких застосуваннях: видалення РГ-ІІ з соків фруктів, овочів та їх похідних для покращання фільтрувальної спроможності, спрощення виготовлення соків і ароматичних концентратів, сприяння явищам просвітлення і забезпечення стабільної якості виготовлених продуктів, очищення мембран для мікро- і ультрафільтрації, вживаних для просвітлення фруктових та овочеви х соків і їх похідних, одержання препаратів типу мацерази, тобто таких, що дозволяють дисоціацію оітинних тканин молодих овочів разом з мінімальним деградуванням нативних структур (виготовлення фруктових нектарів, пюре, желе і фр уктових та овочеви х концентратів), одержання препаратів типу зріджувальних, тобто таких, що мають забезпечити повний гідроліз полісахаридів клітинних оболонок рослин (виготовлення з фруктів та овочів соків і ароматичних основ, а також ферментованих напоїв і пива), виробництво пектинів і кормів для тварин з рослинних залишків (бурякова пульпа, тверді залижи після видушування фруктів...), виробництво целюлози з рослин; ензиматичний гідроліз інших складових полісахаридів дійсно дозволяє поліпшити вихід продукції (текстильна промисловість, виробництво паперу). Комерційні ензиматичні препарати, що дозволяють деградувати клітинні оболонки рослин, в залежності від типу бажаного застосування повинні мати найточніші і найліпше визначені типи біологічних дій. Специфічне внесення ензимів з властивістю деградувати РГ-ІІ, що мають точні і добре визначені типи дії, сприяє кращому використанню технологічного потенціалу грибкових ензимів. Ензими і ензиматичні препарати, що відповідають нижчеописаному винаходу, можуть бути найбажаним чином одержані в спосіб, що складається з наступних етапів: введення в культур у мікроорганізмів, що мають активність деградування РГ-ІІ або його дохідних, в культуральному середовищі, пристосованому до продукування цих ензимів, рекуперацію ензиму або ензиматичного препарату з поверхневої плівки культури або з поверхневої плівки розколу мікроорганізмів. Бажано, щоб цей спосіб включав наступні етапи: введення в культуру мікроорганізмів, що мають активність деградування РГ-ІІ, в культуральному середовищі, що містить РГ-ІІ, і пристосованому до цих мікроорганізмів, рекуперацію мікроорганізмів, розмелювання мікроорганізмів, видалення нерозчинної речовини, зокрема фільтрацією або центрифугуванням розмелених мікроорганізмів, і рекуперацію поверхневої плівки, що містить ензим або ензиматичний препарат. За сприятливих умов ензими можна також одержати безпосередньо з поверхневої плівки культури, без розмелювання мікроорганізмів, підбираючи умови або игами в такий спосіб, щоб ензими вивільнювались в середовище. З найбільшою користю цей спосіб запроваджується з використанням штамів Penicillium, депонованих, в CNCM під №№1-1577 та 1-1578. Такі ензими можуть бути також одержані генною інженерією після клонажу гену або генів, відповідальних за їх синтез, або будь-якими інший технічними прийомами» доступними для спеціаліста, зокрема синтезом з окремих амінокислот, після Ідентифікації їх послідовності. Даний винахід стосується, крім того, способу одержання РГ-ІІ і його метаболітів або похідних з екстракту рослинного походження, відмітного тим, що він включає етап хроматографії зазначеного екстракту. Йдеться само собою, що цей спосіб стосується не лише одержання РГ-ІІ, але й ти х продуктів деградації цієї молекули, котрі могли утворитись при застосуванні цього способу і звуться метаболітами, також ж і всіх похідних РГ-ІІ. Для даного винаходу під "екстрактом рослинного походження" розуміють будь-який препарат, що містить зокрема розчинені полісахариди рослинного походження. Ці полісахариди можуть пройти в ньому етап концентрації, або ультрафільтрацією, або осаджуванням, наприклад етанолом, метанолом або будь-яким іншим підходящим розчинником. Цей спосіб може складатися принаймні з одного етапу хроматографії обміном аніонами при низькокислотному або нейтральному рН, бажано вищому за 4. Така адсорбційна хроматографія може проводитись на колоні DEAE або QEAE. Цей спосіб може також складатися принаймні з одного етапу хроматографії адсорбцією РГ-ІІ на носієві, що утримує РГ-ІІ. Така адсорбційна хроматографія може проводитись на активованому вугіллі, на колоні з полістирен-дівінілбензенової смоли, або на будь-якому іншому пристосованому носієві. Перед і/або після етапу хроматографії можна додати етап сепарації полісахаридів, або частковим осадженням, або ультрафільтрацією, або хроматографією стеричним вилученням. Для проведення часткового осадження найзручніше застосовува ти етанол або метанол. Для проведення хроматографії стеричним вилученням зручно користуватись "сефакріловою" колоною або будь-яким іншим пристосованим носієм. Винахід стосується, крім того, препаратів, котрі можна одержати одним з цих способів: з одного боку, препаратів, котрі містять в значній кількості (тобто щонайменше 95%) мономерів РГ-ІІ, і з іншого боку, препаратів, котрі містять принаймні 80%, бажано більше ніш 95% димерів РГ-ІІ. Після кожної хроматографії визначається, за їх складом, які з фракцій містять РГ-ІІ. Ця операція може бути виконаною спеціалістом. Ці способи дозволяють з легкістю в значних кількостях (порядку кілограма) одержати препарати рамногалактуронану II з усі х продуктів рослинного походження, таких як соки з фруктів, овочів та їх похідних, зокрема вин, в тому числі концентрованих, вінас і виноградного сусла, за винятком тих продуктів, що походять з злакових, причому на рівні десятка грамів. РГ-ІІ найбільш вигідно одержувати з первинних оболонок рослин, але його можна також виділити з усякого продукту, одержаного з рослин, при розчиненні оболонок, або при застосуванні традиційних способів переробки (видушування, ферментація...), або при обробці за допомогою зріджувальних ензимів. Іншим предметом цього винаходу є спосіб відбору мікроорганізмів, зокрема грибів, зважаючи на їх здатність до деградування РГ-ІІ, відмітний тим, що зазначеним мікроорганізмам дають можливість зростати в пристосованому середовищі, що містить РГ-ІІ. Він також стосується культурального середовища для мікроорганізмів, відмітного тим, що воно містить РГІІ. Способи, що становлять предмет цього винаходу, зокрема способи приготування та виділення ензимів, а також спосіб приготування РГ-ІІ можуть бути застосованими спеціалістом лише на базі цього опису і загальних знань. Проте, він може скористатися наступним підручником: Methods in Microbiology, томи з 1 по 6, J.R. Morris et D.W. Ribbons (1969-1972), Academic Press, London, New York. Винахід проілюстровано, але при цьому не обмежено наступними прикладами. Фігури, на які робляться посилання в цьому описі і його прикладах, є такими. Фіг.1 зображає в схематичний спосіб структуру рамногалактуронану її, разом з його чотирма бічними ланцюгами від А до D. На цій фігурі R1 репрезентує водень або a-L-рамнопіраноз, a R2 і R3 - водень або інший замісник; Фіг.2 ілюструє місце РГ-ІІ в рослинному світі; Фіг.3 з ілюструє розподіл на фракції полісахаридів, кислих і нейтральних цукрів одного з вин на колоні DEAE (Macroprep); Фіг.4А і 4В зображають одержані з допомогою високочутливої хроматографії стеричним вилученням профілі двох фракцій РГ-ІІ, виділених з червоного вина; Фіг. 5 показує одержаний високочутливою хромотаграфією стеричнии вилученням на колоні Superdex-75 HR профіль двох фракцій РГ-ІІ, очищених з концентрату вина; а: фракція III, димер РГ-ІІ (молекулярна маса 9500 Da, елюція після 18,5хв.); b: фракція II, мономер РГ-ІІ (молекулярна маса 4750Da, елюція після 20,5хв.); Фіг.6 є схемою очищення РГ-ІІ на пілотній установці; Фіг.7 служить для порівняння профілів, визначених високочутливою хроматографією стеричним вилученням на колоні Superdex-75 HR, повних полісахаридів червоного вина (а) з фракцією, не затриманою на смолі Relite®DIAIGN®(b), і затриманою і потім елюйованою 20%-ним етанолом (с); Фіг.8 ілюструє деградування РГ-ІІ розчинним клітинним екстрактом Реnicillium simplicissimum (1-1577); Спектри а, b і с стосуються відповідно нативного РГ-ІІ та РГ-ІІ після 24 і 48 годин деградування; Фіг.9 ілюструє деградування РГ-ІІ розчинним оітиннии екстрактом штаму P.daleae LaV2 (1-1578) (а нативний РГ-ІІ; b - після 96 годин; с - після 168 годин; d - після 190 годин); Фіг.10 ілюструє деградування РГ-ІІ культурою Реnicillium simplicissimum (1-1577), слідом за яким проводиться хроматографія CES-HP. Криві від а до f репрезентують відповідно спектр нативного РГ-ІІ і спектри РГ-ІІ після 96, 132, 168, 192 і 400 годин зростання гриба. Фіг.11 ілюструє деградування РГ-ІІ культурою P.daleae (1-1578) різної тривалості, контрольоване хроматографією CES-HP, (а - нативний РГ-ІІ, b - 72 години, с - 120 годин, й - 240 годин, є - 264 години, f - ЗЗб годин, g - 384 годин). Фіг.12 показує стр уктур у фіг.1 в спрощеному вигляді. Місця потенційних розрізів ензиму відповідно до цього винаходу показані стрілками 1 і 2. Фіг.13 показує структур у залишкової фракції РГ-ІІ після його деградування за допомогою Реnicillium simplicissimum і Реnicillium daleae. Фіг.14 ілюструє деградування димерного РГ-ІІ культурою P. daleae (1-1578). Спектри від а до с репрезентують відповідно спектр нативного димерного РГ-ІІ і спектри РГ-ІІ після 168 і 300 годин деградування. Фіг.15 ілюструє деградрання РГ-ІІ, очищеного повним розчинним клітинним екстрактом P. simplicissimum (1-1577), контрольоване хроматографією CES-HP. Спектри від а до й стосуються відповідно нативного РГ-ІІ і РГ-ІІ після 72, 120 і 148 годин інкубації. Фіг.16 слугує для порівняння полісахаридних профілів, визначених за допомогою CES-HP, червоного вина (спектр а) і того ж вина після 48 годин інкубації в присутності ензиматичного екстракту IPV1 (спектр b). Фіг.17 призначена для порівняння за допомогою CES-HP полісахаридних профілів червоного вина до (спектр а) і після 48 годин інкубації в присутності лише Pectinex® Ultra (спектр b), або разом з ензиматичним екстрактом штаму IPVI (спектр с). Фіг.18 призначена для порівняння за допомогою CES-HP полісахаридних профілів яблучного соку, одержаного повним зріджуванням фруктів за допомогою ензиматичного препарату Rapidase®Lic після 48 годин інкубації за умов відсутності (спектр а) або присутності (спектр b) ензиматичного екстракту штаму IPV1 . Фіг.19A і 19В ілюстр ують деградування тканини буряка (фіг.19A) ензиматичним екстрактом штаму IPV1 у порівнянні з свідком (фіг.19В). Фіг.19С, 20А і 20С репрезентують відповідно дегадування ензиматичними екстрактами штаму IPV1 тканин моркви, яблука та картоплі в порівнянні з відповідними свідками (фіг.19D, 20В та 20D). Приклад 1: Очистка рамногалактуронану ІІ з вина аніонообмінною хроматографією і хроматографією молекулярним відсіюванням РГ-ІІ присутній в недеградованій формі особливо в фр уктових та овочеви х соках і їх похідних, зокрема ферментованих. РГ-ІІ може бути очищеним до гомогенного стану з усіх продуктів рослинного походження при виконанні таких очисних етапів: 1. Одержання макромолекул в один етап, або осаджуванням 80% етанолом, або ультрафільтруванням; 2. Підготовча хроматографія аніонним обміном при кислому рН; 3. Хроматографія молекулярним відсіюванням (цим останнім етапом, котрий дозволяє вийти на більш високий рівень очистки, можна знехтувати, якщо хочуть вийти на ступінь очистки препарату РГ-ІІ порядку 80%). 1 - Зразок вина і одержання колоїдів: Вино, призначене для використання, було одержане з стиглого винограду Каріньян чорний (Carignan noir), зібраного у вересні 1991 року на експериментальній ділянці Пеш-Руж/Нарбон (Pech-Rouge/Narbonne). 600 літрів було сконцентровано на ультрафільтрувальній мембрані Carbo Sep М5 (Tech Sep, Франція) з пороговим отвором 10000, Всі колоїди концентрованого вина (сумарний об'єм 28л) були після цього осаджені додаванням 4 об'ємів етанолу, підкисленого 60мМ HCl, послідовно промиті 80 і 90% етанолом, перенесені в воду і діалізовані з допомогою буферного розчину з 40мМ цитрату натрію при рH 4,6. Суха вага всі х колоїдів (визначена після знесолювання і ліофіїізації аліквотної фракції) становила 296г, або близько 0,5г на літр вина. 2 - Аніонообмінна хроматографія Розчин колоїдів з рН 4,6 фракціонували хроматографією обміном аніонів десятьма послідовними пропусканнями через колону 5х80см DEAE-Macroprep (BioRad, США), налаштовану на 20мл/хв в 40мМ буферному розчині з цитрату натрію при рН 4,6. Нейтральні і слабозаряджені полісахариди елюювались в ін'єкційному буферному розчині (фракція І). Фракції, що містили РГ-ІІ, спочатку елюювались пропусканням концентрату в 50мМ цитратному буферному розчині (фракція ІІ), потім додаванням 50 (фракція ІІІ) і 150мМ (фракція IV) NaCl до елююйочого буферного розчину (фіг.3). Ці три фракції складали відповідно 7,9, 6,6 і 4,1% загальної кількості колоїдів в перерахунку на суху вагу. 3 - Очистка РГ-ІІ до гомогенного стану хроматографією стеричним вилученням РГ-ІІ, присутній в фракціях II і ІІІ, проходив очистк у до гомогенного стану хроматографією стеричнмм вилученням на колоні 5х75см Sephacryl. S- 400 HR, налаштованій на 7мл/хв, в буферному розчині з 50мМ ацетату натрію при pH 5, що містив 50мм NaCl, Фракції, що містили РГ-ІІ, були зрештою діалізовані водою перед ліофілізацією. Два одержані зразки РГ-ІІ мали в високоефективній хроматографії стеричним вилученням (CES-HP, аналіз на двох послідовних колонах Shodex OHPak KB-803 і KB-805, елюант LlNO3 0,1М при 1мл/хв, рефрактометричні детектори) виключно гомогенний профіль і становили відповідно 4,4 1 4,6% всіх колоїдів зразка вина. Повна кількість РГ-ІІ в використаному зразку вина перевищувала 50мг/л, оскільки сюди слід додати РГ-ІІ, щo містилась в фракції IV, котр у до гомогенного стану не очищували. 4 - Склад фракцій РГ-ІІ. очищеного з вина Дві очищені фракції РГ-ІІ репрезентують, обидві, характерний склад РГ-ІІ (таблиця 1). Вони помітно не відрізняються з точки зору аналізу їх складу. Фракції II і III, одержані на DEAE-Macroprep, аналізувались на колоні Superdex-75HR (1х30см, вилучення на 14хв.), носія для молекулярного відсіювання. Цей аналіз (фіг.5) виявляє, що фракція II в основному містить мономери РГ-ІІ (елюція за 20,5хв, молекулярна вага 4750 Da), в той час як фракція ІІІ містить більш як 95% дилерів РГ-ІІ (елюція за 18,5хв, .молекулярна вага 9500 Da). Препарат з РГ-ІІ фракції II пізніше застосовувався для роботи по відбору і індукції ензиматичних активностей специфічних типів деградування. Приклад 2: Одержання РГ-ІІ адсорбційною хроматографією з рідких залишків перегонки алкогольної продукції (ВІНАС) Користувались вінасами, одержаними в результаті вакуумної дистиляції і концентрації 300гл червоного вина (суміші вин з різних сортів винограду). Вінаси, одержані дистиляцією, концентрувались вакуумним випаровуванням на установці з падаючою хвилею. Бітартратні солі вилучались з цього концентрату після декантації, потім вінаси концентрувались знову на тій самій установці, загалом вино концентрувалось 30 разів, і всі колоїди, одержані з 1000 літрів концентрованої вінаси осаджувались додаванням 4 об'ємів 90% етанолу. Осад зливали в 300 літрів води, щоб одержати розчин вінаси для застосування як джерела для одержання РГІІ. Адсорбційна хроматографія Процес хроматографічної сепарації забезпечується CLHP на колонах Shodex (див. Приклад 1) або на колоні Superdex-HR 75 (Pharmacia; дебіт 0,6мл/хв), приєднаної до системи рефрактометричного виявлення (детекції). а) на активованому вугіллі Активоване вугілля має сильну адсорбційну спроможність по відношенню до численних видів молекул. В даному винаході активоване вугілля було використане, зважаючи на його спроможність відділяти РГ-ІІ від пектинових полісахаридів різних класів, дійсно всі полісахариди адсорбуються на активованому вугіллі, але РГ-ІІ десорбується при концентраціях в алкоголі нижчих за 40%. Було випробувано два типи вугілля. Порошкове активоване вугілля Один літр розбавленого вп'ятеро розчину вінаси тримали протягом 30 хвилин в контакті з 100г порошкового активованого вугілля (Norit®SA*). Після цього розчин фільтрували на фриті для вилучення часток вугілля. Затримане фільтром вугілля вводили в суспензію в 1 літрі 40% етанолу, одержану суміш ретельно перемішували протягом 30 хвилин і після цього фільтрували в вакуумі. Елюйований РГ-ІІ аналізувався після цього CLHP. Аналіз складу цієї фракції (табл. 2) вказує та чистоту РГ-ІІ, близьку 50%. Екструдоване активоване вугілля Цей тип вугілля потребує для адсорбції РГ-ІІ з розчину вінаси набагато більшої тривалості контактування (48 годин), але має перевагу у вигляді спрощення етапів фільтрування. З іншого боку, маса необхідного вугілля є вдвічі більшою за масу порошкового вугілля. Один літр розбавленого вп'ятеро розчину вінаси тримали протягом 48 хвилин в контакті з 200г екструдованого активованого вугілля (Norit®RO-08 Supra). Після вилучення неадсорбованої фракції фракцію, що містила РГ-ІІ, десорбували розчиненням в 40% етанолі протягом 24 годин, одержаний РГ-ІІ мав ту ж саму ступінь чистоти, що і у випадку застосування порошкового вугілля. (b) на смолі з суміші полістирен-дівінілбензен (Resine Relite ® DIAION® SP411) Смола Relite® DIAION® SP411 є синтетичною неполярною смолою, складеною з співполімерів полістирендівінілбензену. вона утримує РГ-ІІ краще ніш інші полісахариди, присутні в рослинних екстрактах. Останні розділяються таким чином на дві фракції адсорбційною хроматографією на смолі Relite® DIAION® SP411: фракція, щo не затримується і що містить різні полісахариди РГ-ІІ, і фракція, щo затримується і що містить РГІІ. Очистка РГ-ІІ на пілотній установці Схема очистки РГ-ІІ з вінаси на пілотній установці показана на фіг.6. 250 літрів розбавленого вп'ятеро розчину вінаси (2,5 обємів колони) швидко знебарвлювались на активованому вугіллі Norit® RO-08 Supra і подавались на 90-літрову колону з Relite® DIAION® SP4I1 з дебітом 40л/год (тривалість контакту для адсорбції РГ-2 на цьому хроматографічному носієві - 2 години). Колона промивалась 100 літрами води. Не утримана фракція складалась таким чином з об'ємів входу і промивки. Елюція РГ-ІІ досягалось пропусканням 100 літрів 20% етанолу з подальшою промивкою колони 200 літрами води. Одержаний в такий спосіб РГ-ІІ (1кг на всю заготовку вінаси) мав чистоту близьку до 60% (табл. 2). РГ-ІІ було осаджено додаванням етанолу (кінцева концентрація - 40% етанолу). Одержаний осад містить РГ-ІІ, чистий на 90%. Приклад 3: Одержання РГ-ІІ адсорбційною хроматографією з вин Вино (червоне вино з винограду Merlot 94, біле вино Chardonnay 94) знеалкоголізовували і концентрували 2 рази під вакуумом на ротаційному випаровувачі. Фракції 15мл вводять на 50мл Relite® DIAION® SP411 з продуктивністю 25мл/год. Потім колона промивалась 50мл води. Потім РГ-ІІ було елюйовано з допомогою 50мл 20% етанолу, і колона промивалась 100мл води. Кількісний аналіз CLHP (фіг.7) показав, що РГ-ІІ адсорбується на смолі, оскільки він відсутній в фракції, не утриманій смолою, і щo його вилучено елюцією 20% етанолом. Стрінь чистоти розчину РГ-ІІ була близькою до 50% для червоного вина (табл. 2) і 36% для білого вина. Приклад 4: Одержання РГ-ІІ з виноградного сусла Amberlite® XAD 2 є співполімерною неполярною смолою полістирен-дівінілбензену. 100мл білого виноградного сусла, одержаного роздрібненням ягід винограду Grenache вводили в колону з 100мл смоли XAD 2, зрівноваженої в воді. РГ-ІІ елюювали 60% метанолом при ступені очистки близько 40%. Результати аналізу елюату наведені в табл.2. Приклад 5: Одержання РГ-ІІ з фруктови х та овочеви х соків Розчинні екстракти одержувались з 0,6кг яблук, томатів і моркви, очищених від шкірки і нарізаних кубиками в 200мл аскорбінової кислоти (остаточна концентрація 3мМ). Застосовані фр уктові і овочеві соки були одержані ензиматичним зріджуванням сукупною дією комерційних зріджувальних ензиматичних препаратів (Pectinex ® Ultra SPL; Novo Ferment et Rapidase® Liq; Gist-Brocades) протягом 24 годин при 45°С. Реакція зріджування була зупинена денатурізацією ензимів під впливом високої температури. Тверді осади вилучались центрифугуванням, а поверхнева плівка застосовувалась як джерело РГ-ІІ. Очистка РГ-ІІ з фр уктів та овочів після ензиматичного зріджування Фруктові та овочеві соки, одержані ензиматичним зріджуванням, фільтрувались на паперовому фільтрі, перед пропусканням з дебітом 25мл/год через колону (2,5х30см), зрівноважену водою і заповнену Relite® DIAION® SP411. Колона промивалась 50мл вода перед елюцією РГ-ІІ 50мл 20% етанолу, услід за чим колона промивалась 100мл води. Одержані в цей спосіб препарати РГ-ІІ мали показник чистоти, видай за 80%. Результати їх аналізу наведені в табл.2. Приклад 6: відбір мікроорганізмів-деградантів РГ-ІІ в мономерній формі РГ-ІІ є універсальний компонентом клітинних оболонок рослин, і його деградування в біосфері забезпечується мікроорганізмами природних екосистем: ґрунтів, компостів, грязей очисних станцій і т.п. З природних зразків було виділено два штами грибів, що належать до двох видів Penicillium, котрі вживають РГ-ІІ як єдине джерело вуглецю і енергії. 1 - Кутьтуральне середовище Культуральне середовище, котре використовувалось для відбору мікроорганізмів, що використовують РГІІ, як джерело вуглецю і енергії, було створене, як показано в табл.3. Йдеться про мінеральне культуральне середовище, до якого додавався розчин мономерного РГ-ІІ з остаточной концентрацією від 2 до 10мг/мл. Культури, що містили гриби, були звільнені від інфекційних бактерій додаванням до середовищ трьох антибіотиків: пеніциліну G, стрептоміцину і тетрацикліну. 2 - відбір мікроорганізмів, котрі вживають РГ-ІІ як джерело вуглецю та енергії Зразки було взято з різних природних систем (сільськогосподарських та лісових ґрунтів, торфів, компостів, грязей очисних станцій, зогниваючих фр уктів ...) і введено в культур у на мінеральному культуральному середовищі, налаштованому на 10мг/мл мономерного РГ-ІІ. Кожного разу, коли було помічене зростання мікроорганізмів, культури пікірувались повторно кілька разів на тому ж середовищі. Ця процедура дозволила напочатку ізолювати кілька культур, що забезпечували своє зростання на середовищі з РГ-ІІ. Паралельно деградування РГ-ІІ в середовищі контролювалось високоефективною хроматографією стеричним вилученням, і відбирались лише такі культури, де така деградація спостерігалась паралельно з зростанням мікроорганізмів. Мікроорганізми, що забезпечували деградування РГ-ІІ, ізолювались після посіву культур в чашечках Петрі на середовище з агар-агару, котре одержувалось додаванням агарози в кількості 2% вкультуральне середовище (табл.3) і містило 2,5мг/мл ноноиерного РГ-ІІ. Після тижня інкубації при 25°С клони відбирались і інокулювались в рідке культуральне середовище для контролю їх спроможності деградувати РГ-ІІ. Відбір штанів, деградуючи х РГ-ІІ Зрештою було відібрано два штами нитчатих грибів, оскільки вони мали потрібні властивості, а саме: 1 - Швидке зростання, цілковито узгоджене із зменшенням кількості РГ-ІІ в середовищі; 2 - Кількісне зникнення РГ-ІІ спостерігалось паралельно з зсувом об'єму його елюції в HP-SEC, що вказувало на наявність ензиматичних активностей деградування ендо-гідролазного типу; 3 - Остаточний рівень деградування РГ-ІІ досягав 70% після тижня культури при 25°С. Ці дві культури, замарковані як Ε і К, застосовувались згодом для продукування ензимів, здатних деградувати РГ-ІІ, і вивчення типів ензиматичних дій. Вони культивуються без перемішування в контакті з повітрям при 25°С в рідкому культуральному середовищі, що містить 5мг/мл РГ-ІІ в присутності трьох антибіотиків: пеніциліну G, стрептоміцину і тетрацикліну. Приклад 7: Продукування ензимів, здатних деградувати РГ-ІІ Відомо, що різні види Penicillium мають здатність продукувати і виділяти в культуральне середовище ензими, здатні до деградування полісахаридів, здатність двох ізольованих штамів продукувати ензими, спроможні деградувати РГ-ІІ, була перевірена, 1 - Пошук ензимів, відповідальних за деградування РГ-ІІ, в поверхневій плівці культури Штами P.daleae LaV2 (№ депонування в CNCM 1-1578) і P. simplicissimum IPV1 (№ депонування в CNCM 1-1577) були введені в культур у при 25°C на середовищі, що містило 2,5мг/мл мононерного РГ-ІІ. Після 96 годин культивування було відібрано 1мл культурального середовища з міцелієм в стадії зростання, стерильно профільтровано на фільтрі 0,22мкм і до нього додано 2мг/мл нативного РГ-ІІ. Середовище, що містило деградуючі ензими і РГ-ІІ, було поставлене на інкубацію при 25°C, фракції завбільшки в 25мкм відбирались після 0, 20 і 45 годин і аналізувались на CES-HP. Порівняння профілів елюції РГ-ІІ при різних тривалостях інкубації ясно засвідчують відсутність деградувальних активностей по відношенню до РГ-ІІ в культуральному середовищі. Тому, ці активності відшукувались в цитоплазмі і периплазмі грибів. 2 - Продукування ензимів, деградуючи х РГ-ІІ, в повних клітинних екстрактах грибів Зазначені штами P.daleae LaV2 і P.simplicissimum IPV1 вводились в культуру при 25°С на 4мл середовища, що містило 6мг/мл мономерного РГ-ІІ. Після 140 годин культивування міцелій вилучали центрифугуванням перед розмелюванням скляними кульками при 4°С протягом 4 хвилин в буферному розчині MES (морфоліно-етан-сульфонієвої кислоти)//КОН 50мМ з рН 6, до якого було додано 1мМ PHSF (фенілметил-сульфоніл-фториду) і 1мМ DTT (дитіотреітолу). Поверхнева клітинна плівка вилучалась центрифугуванням при 10000g x 5хв. Присутність ензимів, здатних деградувати РГ-ІІ, в розчинному клітинному екстракті перевірялась додаванням нативного РГ-ІІ в кількості 2,5мг/мл до поверхневої плівки після розмелювання і центрифугування, інкубацією при 25°С і контролюванням за допомогою CES-HP за деградуванням РГ-ІІ. Аналіз профілів після 24 і 48 годин в порівнянні з нативним РГ-ІІ (фіг.8 та 9) свідчить про сильну деградацію РГ-ІІ (50%), починаючи від 24 годин, котра продовжувалась до 48 годин і дала 40% молекулярного залишку. Ензиматичні активності, котрі забезпечують деградування РГ-ІІ, містяться таким чином в розчинному клітинному екстракті і тому можуть бути одержаними після розмелювання грибів. Два виділених штами Penicillium є таким чином продуцентами ензимів, що деградують рамногалактуронан II. Приклад 8: визначення активностей деградування РГ-ІІ Два виділених і ідентифікованих види Penicillium продукують ензими, здатні деградувати РГ-ІІ в культуральному середовищі. Спосіб дії цих ензимів було вивчено напочатку, спостерігаючи деградацію полісахариду в середовищі під час зростання грибів. Цей підхід має той недолік, що він дозволяє стежити лише за фракцією РГ-ІІ, не асимільованою грибом, однак він дозволяє скласти уяву про залучені до дії активності і їх спосіб дії. 1 - Кінетика деградування РГ-ІІ грибом Penicillium simplicissimum Штам p.simplicissimum IPV1 вводили в культуру в колбі Ерленмеєра при 25° на 10мл середовищ з концентрацією мономерного РГ-ІІ 5мг/мл. Проби об'ємом і мл вилучались через 0, 96, 132, 168 і 192 години. рН середовища доводили до 5 додаванням 20мкл НСl 1М. Ще одне вилучення було зроблене після 360 годин, культивування було остаточно припинене після 400 годин інкубації. Кожну пробу аналізували на CES-HP (фіг.10), що дозволяло стежити за деградацією під час зростання грибів. Різні вилучені фракції були знесолені на колоні (1х50см) з Bio-Gel Р-6, зрівноваженим в буферному розчині з ацетату натрію 100мМ при рН 4. Для кожної з тривалостей інкубації проводився повний структурний аналіз фракції РГ-ІІ, що проходила деградування. Цей аналіз включав: підрахунок ступеня деградації РГ-ІІ, визначення складу в нейтральних моносахаридах і уронових кислотах, визначення типів зв'язків між залишковими компонентами молекули, визначення довжини гомо-галактуронового ланцюга. Сукупність цих аналізів дозволяє визначити стан молекули РГ-ІІ кожної проби і таким чином весь час слідкувати за деградацією. Ці результати створюють уяву про спосіб ензиматичної деградації молекули з плином часу. 2 - Кінетика деградування РГ-ІІ грибом Penicillium daleae Для дослідження деградування РГ-ІІ грибом P.daleae 500мг препарату мономерного РГ-ІІ спочатку омилювали (2 годиш при 4°C в NaOH 50мМ), потім відновлювали (6 год при 4°С в присутності 2,5г NaBH4) з метою маркування відновлюючої кінцевої частини молекули. Штам P.daleae LaV2 було введено в культуру в колбі Ерленнеєра при 25°С на 6мл середовища з 5мг/мл омиленого і відновленого РГ-ІІ. Фракції об'ємами 0,6мл відбирались через 0, 72, 120, 168, 240, 264, 336 і 384 години. Кожна проба аналізувалась CES-HP (фіг.11), аби простежити за деградуванням протягом зростання грибів. Різні проби були знесолені на колоні (1х30см) з Superdex-76HR, налаштованій на 0,6мл/хв в буферному розчині з форміату амонію 30мМ з рН 5,2. Для кожного періоду інкубації проводився повний структурний аналіз фракції РГ-ІІ, що проходила деградування. Цей аналіз включав: обчислення ступеня деградації РГ-ІІ, визначення складу в нейтральних моносахаридах і уронових кислотах в формі похідних триметилсилілів після метилування. визначення типів зв'язків між залишковими компонентами молекули шляхом метшшвання, що включало розкислення уронових кислот тріетилбородейтерійним літієм, визначення довжини гомо-галактуронового ланцюга. Сукупність цих аналізів дозволяє визначати стан молекули РГ-ІІ для кожної проби і стежити таким чином за її деградацією з плином часу, ці результати засвідчують, в який спосіб відбувається ензиматична деградація молекули з плином часу. 3 - Ме ханізм деградації РГ-ІІ Аналіз складу (табл.4 і 5) і типів зв'язку для кожного з залишав, присутніх в молекулі (табл.6 і 7), дозволяє стежити за станом залишкової молекули РГ-ІІ з плином часу і дозволяє зрозуміти, що у випадках обох штамів Penicillium РГ-ІІ деградується за допомогою серії послідовно діючих ензимів. а) Перший етап деградації полягає в розриванні зв'язків між залишком тризаміщеної b-L-рамнози і залишками a-L-фукози та b-D-апіози, що призводить до втрати ланцюга А (фіг.12), котрий асимілюється грибом. Цей етап має місце протягом перших днів культури, паралельно з невеликим скороченням гомогалактщюнового ланцюга, котрий з 8-9 залишків скорочується в середньому до 7 залишків, і частково втрачає кінцеві залишки арабинофуранози (В7 і D2) і рамнопіранози (С2). б) Скидається на те, що повна елімінація залишків А2 і A5 ланцюга А, утримуваного залишком b-D-апіози, позбавляє молекулу РГ-ІІ опірності ензиматичним деградуванням, оскільки в цей час спостерігається друга фаза деградації, котра характеризується: сильним скороченням гомо-галактуронового ланцюга в середньому до 4 залишків галактуронової кислоти; втратою залишку Ά1; тим, що ланцюг В, постійно зв'язаний з гомо-галактуроновим ланцюгом через b-D-апінозу, проходить модифікації, котрі стосуються його нерозкислюваного терміналу, а саме зменшення кількості термінального залишку арабінофурадози і втрата залишку a-L-рамнози (залишки В6 і В7); тим, що залишки Kdó та Dha, як здасться, знаходяться частково під впливом ензиматичного деградування. Всі деградації, помічені під час цієї другої фази, можуть бути одержані з допомогою відомих ензимів: b-Dапіосідази, b-L-арабіносідази, a-L-рамносідази, ендо- або екзс-полігалактуронази. Остаточна молекула на кінець зростання грибів кількісно відповідає ланцюгу В (залишки В1 і В5), залишкам Kdo (СІ) і Dha (D1), утримуваних олігосахарадною кислотою з середнім ступенем полімеризації 4, і репрезенту від 20 до 30% початкової молекули РГ-ІІ (фіг.13). Перший етап, котрий вводить в дію дві ензиматичні активності типу ендо- є таким чином ключовим етапом, що уможливлює деградацію молекули РГ-ІІ. Кількісне вивільнення ланцюга А дійсно робить молекулу чутливою щодо впливу ензимів з відомими типами дій, котрі часто зустрічаються в комерційних ензиматичних препаратах. Продукування ензимів з активностями типу ендо-b-L-рамнопіраносил(1®3')-D-апіофураносил-гідролазної (1) і ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносил-гідролазної грибами P.daleae LaV2 і P.simplicissimum IPV1 є таким чином вирішальним етапом, котрий дозволяє цим грибам забезпечити своє зростання за рахунок використання РГ-ІІ. Таким чином застосування цих ензимів з ендо-b-L-рамнопіраносил-(1®3')- Dапіофураносил-гідролазною або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносил-гідролазною активністю дозволяє активне ензиматичне деградування РГ-ІІ. специфічність активності (1) є сильною, оскільки ланцюг В не піддається дії його гідролітичної активності, хоч він і є пов'язаний з гомо-галактуроновим ланцюгом через рамносил-апіосідний зв'язок такого ж типу. Цю різницю в поведінці активності (1) по відношенню до ланцюгів Ά і В ноша пояснити: або різницею між замісниками рамнози: один ланцюг, зв'язаний в С3 в випадку В, один ланцюг, зв'язаний в С4 і два моносахариди, зв'язані в С2 і С3 в випадку А; або різною локалізацією цих дво х ланцюгів в середині молекули РГ-ІІ. Присутність в ензиматичному препараті однієї або іншої з цих двох активностей уможливлює вивільнення ланцюга Ά РГ-ІІ і знімає таким чином проблему неспроможності деградувати РГ-ІІ за допомогою звичайних ензимів пектинолітичних препаратів, справді, інші ензими, що уможливлюють більш інтенсивне деградування РГ-ІІ, вступають в дію після відходу ланцюга А під дією зазначених ензимів. Цей другий етап деградації дозволяє вступити в дію ензимам, щo мають активності: b-D-апіосідазну, b-L-арабіносідазну, a-L-рамносідазну, ендо-полігалактуроназну, екзо-полігалактуроназну. Приклад 9: Одержання препарати димерного РГ-ІІ і деградування за .допомогою Penicillium daleae Штам P.daleae вводили в культуру на середовищі, що містило 5мг/мл препарату РГ-ІІ, одержаного пропусканням концентрату вінаси на смолі Relite®DIAION® (приклад 2). Цей препарат містить близько 60% РГ-ІІ, котрий знаходиться, як це показує аналіз на колоні Superdex-75, в димерній формі. Спостереження за допомогою CLHP (фіг.14) за культуральним середовищем гриба показує сильну деградацію РГ-ІІ. Домішки з більш високою молекулярною масою (в основному манани, присутні в концентратах вінаси) не деградуються. Штами Penicillium, виділені на мономерному РГ-ІІ, виявляють таким чином спроможність деградувати РГ-ІІ в формі димеру. Ензими, котрі є предметом цієї заявки на винахід, є таким чином активними на молекулах двох форм. Приклад 10: Одержання ензиматичного препарату, деградуючого РГ-ІІ З культури p.simplicissimum IPV1 було одержано ензиматичний препарат з активностями деградування РГІІ ендо-b-L-рамнопіраносил-(1®3')-D-апіофураносил-гідролазного або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-Lрамнопіраносил-гідролазного типу в спосіб, описаний нижче: 120мл культурального середовища, що містило 6мг/мл очищеного РГ-ІІ, було розподілено в 8 чашках Петрі, Штам P.simplicissimum IPV1 вводився в культур у при 25°С протягом 6 діб. Міцелій (1,2г чистої ваги) було вилучено центрифугуванням перед розмелюванням, як описано вище (в прикладі з) в буферному розчині MES/KOH 50мМ з рН 6, що містив 1мМ PMSF і DTT. Ензиматичний екстракт загальною кількістю 6мл зрештою було одержано центрифугуванням і застосовано в наступних прикладах. Приклад 11: Деградування очищеного РГ-ІІ ензиматичним екстрактом P. simplicissimum IPV1 В присутності 0,02% NaN3 було поставлено на інкубацію при 25°С таку суміш: 500мкл буферного розчину ацетату натрію 50мМ, рн 4,8; 12,5мкл розчину очищеного РГ-ІІ (табл.1, частина II) з концентрацією 200кг/л; 25мкл повного ензиматичного екстракту P. simplicissimum ІPV1, одержаного як в прикладі 5. Проби об'ємом 25мкл відбирались через 0, 72, 120 і 148 годин і аналізувались на CES-HP. Присутність ензимів з активностями типу ендо-b-L-рамнопіраносил-(1®3')-D-апіофураносил-гідролазної або ендо-a-Lфукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносил-гідролазної підтверджувалась деградацією РГ-ІІ (фіг.15). До речі, профіль деградації є порівняним з одержаним при спостереженні в поверхневій плівці культури P.simplicissimum (фіг.15). Приклад 12: Деградування полісахаридів вина ензиматичним екстрактом P. simplicissimum IPV1 Повний ензиматичний екстракт, що містив ензими, деградуючі РГ-ІІ, зокрема активності типу ендо-b-Lрамнопіраносил-(1®3')-D-апіофураносил-гідролазного або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносилгідролазної випробовувався на спроможність деградувати РГ-ІІ, присутній в винах. Всі полісахариди червоного вина (сорт винограду Carignan noir) були одержані ультрафільтрацією вина (2мл) на мембрані Centricon 30 (Amicon, США). Фільтрувальний залишок (100мл) знімався 1,9мл ацетатного буферного розчину 50мМ при рН 4,8. Наступні проби було інкубовано при 25°С в присутності 0,02% NaN3. а: 200мкл фільтрувального залишку з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Н2О, 20мкл буферного розчину МES, застосовуваного при розмелюванні; b: 200мкл фільтрувального залижу з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Н2О, 20мкл повного ензиматичного екстракту P. simplicissimum IPV1, одержаного як в прикладі 9. с: 200мкл фільтрувального залижу з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Pertinex® Ultra Sp-L (Novo Ferment, Швейцарія), 20мкл буферного розчину HES, застосовуваного при розмелюванні; d: 200мкл фільтрувального залишку з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Pertinex® Ultra Sp-L, 20мкл повного ензиматичного екстракту P.simplicissimum IPV1, одержаного як в прикладі 9. Через 48год. було відібрано по 25мкл від кожної проби і аналізувалось на CDS-HP. Аналіз результатів (фіг.16 та 17) засвідчив: деградування РГ-ІІ вина (характерний пік, елюйований через 18,2хв.) ензиматичний екстрактом P.simplicissimum IPV1 (фіг.16); деградування інших полісахаридів вина (манопротеїнів, арабінанів та арабіногалактанів) комерційним ензиматичним препаратом Pertinex® Ultra Sp-L, в той час, коли пік, характерний для ГР-ІІ, лишається інтактним (фіг.17); підтверджено доповнювальний ефект обох ензиматичних препаратів (фіг.17) деградацією всієї сук упності полісахаридів вина в експерименті с. Повний ензиматичний екстракт P.simplicissimum IPV1, що містить ензими ендо-b-L-рамнопіраносил-(1®3')D-апіофураносил-гідролазного або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносил-гідролазного типу, має таким чином ензиматичні активності, відсутні в комерційному ензиматичному препараті, виготовленому з Aspergillus aculeatus і богатому на целюлічні, геміцелюлазні і пектинолітичні активності, зокрема на рамногалактуроназну активність (Schols et al., 1990, Carbohydr. Res, 206, 105-115). Додавання ензимів, відповідних цьому винаходу, в сукупності з іншими пектинолітичними активностями призводить до більш потужної деградації полісахаридів вина і таким чином дозволяє покращати фільтрувальну здатність, а також запобігти колоїдному помутнінню і формуванню осадів. Приклад 13: Деградування полісахаридів яблучного соку ензиматичним екстрактом P.simplicissimum IPV1. Яблучний сік було одержано з 1кг яблук (сорту Starking): цілі яблука були порізані на скибки 1см завтовшки, до них додали 1г аскорбінової кислоти і 500мл ензиматичного препарату Rapidase® Liq (Gist Brocades, Франція) і перемішували 2год. при 50°C. Фрукти були зріджені під дією комерційного ензиматичного препарату, а сік було одержано центрифугуванням. Препарат Rapidase©Liq має високий рівень активностей пектиназного (пектин, ліаза, евдо-і екзо-полігалактуроназа, рамногалактуроназа, арабадаза, ...), геміцелюлазного (галактоназа, ксіланаза, ...) і целюлазного типів. 1,5мл освітленого яблучного соку було ультрафільтровано на нембрані Centricon 30 (Amicon, США). Фільтрувальний залишок (100мл) було відібрано 1,4мл ацетатного буферного розчину 50мМ при рН 4,8, і було поставлено на інкубацію при 25°С в присутності 0,02% NaN3 наступні проби. а: 200мкл фільтрувального залижу з повним вмістом полісахаридів яблучного соку, 50мкл Н2О; b: 200мкл фільтрувального залишку з повним вмістом полісахаридів яблучного соку, 50мкл повного ензиматичного екстракту P.simplicissimum IPV1; Через 48 год 25мкл з кожної проби відбиралось і аналізувалось на CES-HP. Аналіз результатів (фі г.18) свідчить про додавальний ефект ензимів, деградуючих РГ-ІІ, оскільки додавання ензиматичного екстракту з P.simplicissimum IPV1 сприяє подальшій деградації сукупності полісахаридів, що залишились після обробки яблук препаратом Rapidase® Liq. Зокрема, характерний пік РГ-ІІ (елюйований через 18,2хв.) зазнає сильної деградації. Крім того, деградація структур з більш високими молекулярними масами, резистентних по відношенню до дії ензимів, присутніх в Rapidase® Liq, свідчить, що ці фракції також містять фрагменти РГ-ІІ. Повний ензиматичний екстракт P.simplicissimum IPV1, в якому були засвідчені активності ендо-b-Lрамнопіраносил-(1®3')-D-апіофураносил-гідролазного або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносилгідролазного типів, містить таким чином ензиматичні активності, відсутні в комерційному ензиматичному препараті, виготовленому з Aspergillus niger, і про якого повідомляється, як про такого, що має сукупність відомих целюлолітичних, пектинолітичних (включно з рамногалактуроназною) активностей. Додатковий і додавальний ефект ензимів, відповідальних за деградування РГ-ІІ, є таким чином підтвердженим цим експериментом. Приклад 14: Мацерація фруктів та о вочів ензиматичним екстрактом Р.simplicissimum IPV1 Активність дисоціації рослинних тканин повним ензиматичний екстрактом Р.simplicissimum IPV1 була перевірена на таких фрукта х і овоча х: буряк червоний, морква, картопля сорту Bintge, яблука сорту Golden. Фрагменти 158х4х2мм кожного фрукта чи овочу вміщували в 2мл ацетатногобуферного розчину 50мМ рН 4,8 і додавали: 200мкл буферного розчину MES, застосовуваного при розмелюванні, для контролю, 200мкл повного ензиматичного екстракту Р.simplicissimum IPV1 для ензиматичних проб. Різні проби були поставлені на інкубацію при 25°С в присутності 0,02% NaN3 протягом 72год., активно перемішувались в вортексі (2х10сек.) і фотографувались. Аналіз результатів виявив: майже повну дилацерацію (розривання) тканин буряка і моркви (фіг.19), мацерувальний ефект, супроводжуваний появою суспендованих клітин картоплі і яблук (фіг.20). Повний ензиматичний екстракт Р.simplicissimum IPV1 з активностями ендо-b-L-рамнопіраносил-(1®3')-Dапіофураносил-гідролазного або ендо-a-L-фукопіраносил-(1®4)-L-рамнопіраносил-гідролазного типів, має таким чином ефект дисоціації рослинних тканин. Висновки Ензиматичні активності деградування РГ-ІІ можуть таким чином застосовуватись самі або в поєднанні з іншими ензимами в рідкій фазі або на твердих основах і дозволити: деградування РГ-ІІ з підвищеним ступенем ефективності, наприклад 70%, фруктових та овочеви х соків і їх похідних для покращання фільтрувальної спроможності, спрощення виготовлення концентрованих соків, сприянню явищ просвітлення і забезпечення хорошої стабільності готових продуктів; очищення носіїв для мікро- і ультрафільтрації, що застосовуються для фільтрування соків фруктів, о вочів та їх похідних. Ці ензиматичні активності сприяють деградації клітинних оболонок рослин, і можуть завдяки цьому застосовуватись самі або в поєднанні з іншими ензимами в усіх застосуваннях, що потребують мацерації, зріджування і повного або часткового гідролізу рослинних тканин, зокрема: в препаратах типу мацерази для виробництва фруктових нектарів, пюре, желе і концентратів фруктів, овочів та їх похідних, включно з вином, в зріджувальних препаратах для виготовлення соків і ароматичних основ з фруктів, овочів та їх похідних, включно з вином, та для виготовлення пива, для виготовлення пектинів з рослинних залишив, таких як бурякова пульпа і твердих залишків після видушування фруктів і подібної сировини, для виготовлення корму для тварин з рослинної сировини, для виготовлення целюлози з рослин для текстильної промисловості, зокрема з бавовни, та для виробництва паперу. для виготовлення з рослинних залишків олігосахарадів з властивостями викликати захисті реакції рослин, котрі можуть бути застосованими як фітосанітарні засоби.