Композиції для комплексу респіраторних захворювань собак

Реферат: Винахід належить до композицій, що містять вірус собачого грипу (CIV), депонований у АТСС під номером РТА-7694 та собачий респіраторний коронавірус (CRCoV), депонований у АТСС під номером РТА-11444. Додатково ці композиції можуть містити Bordetella bronchiseptica, пертактин р68, вірус собачого парагрипу (CPIV) та собачий аденовірус серотипу 2 (CAV-2). Композиції є ефективними для лікування або запобігання распіраторним захворюванням собак, в тому числі інфекційної респіраторної хвороби собак. UA 110504 C2 (12) UA 110504 C2 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Заявлений винахід має відношення до імунології, зокрема до імуногенетики та вакцинних композицій. Він стосується вакцинних композицій для застосування проти респіраторних хвороб собак, включно з комплексом інфекційних респіраторних захворювань собак (CIRDC), а також способів вакцинації, лікування або запобігання респіраторних інфекцій у собак. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Інфекційна респіраторна хвороба собак (CIRDC) є дуже заразним захворюванням, що звичайно трапляється у собак, розміщених у скупчених умовах, як-то притулки для тварин або тренувальні вольєри. Хоча багато собак страждають тільки на легкий кашель та одужують через невеликий проміжок часу, у деяких випадках виникає розвиток важкої бронхопневмонії. Вважається, що патогенез CIRDC є багатофакторним та до нього залучені різні віруси та бактерії. Інфекційні агенти, що, як відомо, є збудниками CIRDC охоплюють респіраторний коронавірус собак (CRCoV) (Erles et al., Virology, 310(2):216-223, 2003), вірус собачого грипу (CIV) (Crawford et al., Science, 310(5747):482-485, 2005), вірус собачого парагрипу (CPIV) (Binn et al., Exp. Biol. Med., 126:140-145, 1967), собачий аденовірус серотипу 2 (CAV-2) (Ditchfield et al., Can. Vet. J., 3:238-247, 1962), мікоплазму Mycoplasma cynos (Chalker et al., Microbiology, 150:3491-3497, 2004) та бактерію Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., Lab. Anim. Sci., 29:48-52, 1977). CRCoV викликає дуже заразну респіраторну інфекцію, що розповсюджується шляхом безпосереднього контакту між собаками, через респіраторні виділення, які знаходяться у аерозольному стані та шляхом контакту з зараженим оточенням або людиною. Деякі собаки мають легку форму хвороби з симптомами, що являють собою кашель, чхання та виділення з носа. Деякі собаки мають безсимптомну інфекцію без клінічних ознак, однак вони розповсюджують вірус, що може заразити інших собак. У деяких собак, інфікованих CRCoV розвивається пневмонія, особливо якщо вони були також інфіковані іншими респіраторними патогенами. Що стосується CIV, то починаючи з 1956 року головним респіраторним патогеном у коней вважається вірус грипу коней. Симптоми хвороби, яку викликає цей вірус можуть бути тяжкими та часто супроводжуються вторинними бактеріальними інфекціями. Визначено два підтипи вірусу грипу коней, як-то підтип-1 (subtype-1), прототипом якого є штам A/Equine/Prague/1/56 (H7N7) та підтип-2 (subtype-2), прототипом якого є штам A/Equine/Miami/1/63 (H3N8). На даний час, домінуючим вірусним підтипом є підтип-2, штам H3N8. Цей штам вірусу грипу коней може заражати також собак з відсотком смертельних випадків, що іноді досягає 36 %. Одним з пояснень такого явища є те, що міжвидова передача повного кінського вірусу грипу або його частини собакам призводить до появи нового специфічного собачого вірусу грипу, пов'язаного з гострим респіраторним захворюванням (Crawford et al., 2005). Захворювання, викликане вірусом CPIV уражає верхні респіраторні шляхи. Захворювання, викликане самим тільки вірусом CPIV може бути слабким або безсимптомним, з ознаками, що стають більш тяжкими у разі виникнення конкурентної інфекції з іншими респіраторними патогенами. Вірус CAV-2 викликає респіраторне захворювання, яке у деяких випадках може бути пневмонією та бронхопневмонією. Згідно з повідомленнями, бактерія B. bronchiseptica є головним етіологічним агентом респіраторного захворювання, що має назву " вольєрний кашель " або трахеобронхіт. Воно робить собак вразливими до впливу інших респіраторних агентів та часто існує одночасно з ними. Звичайно, вольєрний кашель є хворобливим станом верхніх респіраторних шляхів та характеризується виділеннями з носу та кашлем. На цей період існує кілька вакцин, прийнятних для лікування трахеобронхіту, викликаного Bordetella bronchiseptica, в тому числі Nobivac®, TM Bronchi-Shield®, Bronchicine® CAe, Vanguard® B, Univac 2, Recombitek® KC2, Naramune -2 та TM Kennel-Jec 2. Однак, більшість існуючих комерційних вакцин потребують обтяжливого інтраназального введення, а також додавання допоміжних речовин, що можуть привести до шкідливих побічних проявів, як-то печія та дратівливість (Viera Scheibner et al., Nexus Dec 2000 (Vol 8, No1)). Були досліджені також субодиничні вакцини, як-то вакцини, що передбачають застосування білка p68 Bordetella bronchiseptica (пертактин), але вони досі ще не включені до складу жодної промислової собачої вакцини, можливо, через недостатню імуногенність, побічні реакції, та / або стійкість препарату. Патологія CIRDC вказує на те, що він бере участь у пошкодженні легенів та, у деяких випадках, у бронхопневмонії, але він відрізняється від вольєрного кашлю (первинний етіологічний агент: B. bronchiseptica), що головним чином стосується змінень у верхніх респіраторних шляхах. Вольєрний кашель є більш м'яким синдромом, ніж CIRDC та не має 1 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 широкого спектру патології, зазначеного для CIRDC. Також CIRDC відрізняється підвищеною тяжкістю та смертністю. Зараження CIRDC рідко приводить до смертельного результату, але воно затримує процес розміщення собак у притулки у рятувальних центрах, порушує плани навчальних кінологічних центрів та призводить до значних витрат на лікування та проблеми благодійності. На даний час існують вакцини проти деяких інфекційних агентів, пов'язаних з CIRDC, однак, незважаючи на їх застосування, CIRDC все ще залишається домінувати у світі, ймовірно через відсутність ефективної вакцини проти всіх інфекційних агентів, залучених до CIRDC. Відповідно, залишається потреба у імуногенній композиції, яку можна буде безпечно вводити собакам та яка забезпечить довготривалий імунозахист проти агентів, що викликають CIRDC без шкідливих побічних проявів або негативної дії з іншими антигенами у комбінаційній вакцині. Заявлений винахід задовольняє цим та іншим, пов'язаним з цим потребам. Головним чином, заявлений винахід стосується імуногенних композицій, які надають антигени, здатні до лікування або запобігання CIRDC. У одному втіленні, імуногенна композиція містить вірус грипу собак (CIV) та респіраторний коронавірус собак (CRCoV). У іншому втіленні, імуногенна композиція додатково містить Bordetella bronchiseptica. У іншому втіленні, імуногенна композиція додатково містить виділений пертактиновий антиген. У іншому втіленні, імуногенна композиція містить пертактиновий антиген p68. У іншому втіленні, пертактиновий антиген є рекомбінантним білком. У ще іншому втіленні, пертактиновий антиген є присутнім у кількості біля 1-30 мкг. У іншому втіленні, вказаний пертактиновий антиген отримують шляхом розчинення пертактинових тілець включення у сечовині з вибірковим очищенням шляхом колоночної хроматографії. Вказані пертактинові антигени є розчинними та переважним чином позбавленими агрегатів. У іншому втіленні, Bordetella bronchiseptica є бактерином або бактеріальним екстрактом. У одному втіленні, імуногенна композиція містить CIV, CRCoV, Bordetella bronchiseptica та один або обидва антигени, вибрані з вірусу парагрипу собак (CPIV) та собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2). У іншому втіленні, вказана імуногенна композиція додатково містить пертактиновий антиген p68. У іншому втіленні, Bordetella bronchiseptica є бактерином або бактеріальним екстрактом. Інше втілення передбачає імуногенну композицію, що містить CIV, CRCoV, компонент Bordetella bronchiseptica, який містить Bordetella bronchiseptica та виділений пертактиновий антиген та один або обидва антигени, вибрані з вірусу парагрипу собак (CPIV) та собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2). У додатковому втіленні, імуногенна композиція містить обидва віруси CPIV та CAV-2. У іншому втіленні, імуногенна композиція будь-якого з вищезгаданих втілень додатково містить виділений антиген Bsp22. У іншому втіленні, імуногенна композиція будь-якого з вищезгаданих втілень не посилена ад'ювантом. У іншому втіленні, імуногенна композиція будь-якого з вищезгаданих втілень містить ад'ювант. У іншому втіленні, імуногенна композиція будь-якого з вищезгаданих втілень не містить не респіраторний антиген. У ще одному втіленні, імуногенна композиція будь-якого з вищезгаданих втілень викликає у собаки імунну відповідь на собачий респіраторний патоген. У іншому втіленні, вказаний собачий респіраторний патоген є принаймні одним з CIV, CRCoV, CPIV, CAV-2, Bordetella bronchiseptica та Mycoplasma cynos. Інше втілення заявленого винаходу передбачає застосування імуногенної композиції будьякого з вищезгаданих втілень для лікування або запобігання у собаки інфекції, спричиненої собачим респіраторним патогеном. У іншому втіленні, вказаний собачий респіраторний патоген є принаймні одним з CIV, CRCoV, CPIV, CAV-2, Bordetella bronchiseptica та M. cynos. У іншому втіленні, вказана композиція запобігає виникненню вказаної інфекції на період, що дорівнює біля 6 місяців або більше. У іншому втіленні, вказана композиція запобігає виникненню вказаної інфекції на період, що дорівнює біля одного року. У іншому втіленні, заявлений винахід передбачає застосування імуногенної композиції будь-якого з вищезгаданих втілень у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання у собаки інфекції, спричиненої собачим респіраторним патогеном. Інше втілення заявленого винаходу передбачає імуногенну композицію будь-якого з вищезгаданих втілень, де вказана композиція лікує або запобігає у собаки інфекційну респіраторну хворобу собак (CIRDC). Інше втілення заявленого винаходу передбачає спосіб лікування або запобігання CIRDC у собаки, що містить введення вказаному собаці імуногенної композиції будь-якого з вищезазначених втілень. У іншому втіленні, вказана композиція 2 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 запобігає виникненню CIRDC на період, що дорівнює біля 6 місяців або більше. У іншому втіленні, вказана композиція запобігає виникненню CIRDC на період, що дорівнює біля одного року. Інше втілення передбачає застосування імуногенної композиції будь-якого з вищезгаданих втілень у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання CIRDC у собаки. Стислий опис малюнків. Фіг. 1. Гуморальна імунна відповідь проти CRCoV, що нейтралізує сироватку. Вимірювання нейтралізуючої сироватку гуморальної імунної відповіді проти респіраторного коронавірусу собак (CRCoV) при вакцинуванні собак сольовим розчином або композиціями з гідроксидом алюмінію або препаратом Emulsigen® у якості ад'ювантів. Фіг. 2. Назальне виділення вірусу після інфікування. Вимірювання виділення CRCoV з носових ходів при вакцинуванні собак сольовим розчином або композиціями з гідроксидом алюмінію або препаратом Emulsigen® у якості ад'ювантів з наступним інфікуванням тварин вірусом CRCoV. Фіг. 3. Відсоток вірус – позитивних тварин (вірус CRCoV у тканинах) на четверту добу після інфікування. Визначення кількості вірус – позитивних собак (вірус CRCoV у тканинах органів дихання) при вакцинуванні їх сольовим розчином або композиціями з гідроксидом алюмінію або препаратом Emulsigen® у якості ад'ювантів з наступним інфікуванням тварин вірусом CRCoV. У даній заявці застосовані нижченаведені визначення, що замінюють будь-які суперечливі визначення у складі кожної окремої роботи, включеної сюди шляхом посилання. Невизначені слова мають значення, що зазвичай застосовують фахівці у цій галузі. Крім того, якщо іншого не передбачено в контексті, то терміни, застосовані у однині також повинні охоплювати множину та навпаки. Вираз "біля" або "приблизно" при застосуванні у зв'язку з вимірною числовою змінною має відношення до зазначеного значення змінної та до всіх значень змінних, що знаходяться в межах експериментальної похибки вказаного значення (наприклад, у межах 95 % довірчого інтервалу для середнього значення) або у межах 10 відсотків вказаного значення, в залежності від того, що більше. Якщо вираз "біля" застосовують по відношенню до інтервалів часу у тижнях, то "біля 3 тижнів" охоплює 17-25 днів та "біля 2-4 тижнів" охоплює 10-40 днів. "Ад'ювант", як тут застосовано, має відношення до будь-якої речовини, яка може бути неспецифічним стимулятором імунної відповіді. Додатковий опис ад'ювантів див. нижче. Термін " тварина", як тут застосовано, охоплює будь - яку тварину, сприйнятливу до інфекційного респіраторного захворювання собак, в тому числі приручених та диких ссавців. "Антитіло", як тут застосовано, є будь - яким поліпептидом, що містить сайт зв'язування антигену незалежно від джерела походження, способу отримання або інших характеристик. Цей термін має відношення до імуноглобулінової молекули або його фрагменту, що специфічно зв'язується з антигеном в результаті імунної відповіді на цей антиген. Імуноглобуліни є сироватковими білками, що складаються з "легкого" та "важкого" поліпептидних ланцюгів, що мають "сталі" та "змінні" ділянки та діляться на класи (наприклад, IgA, IgD, IgE, IgG, та IgM) в залежності від складу сталої ділянки. Під антитілом, яке є "специфічним" для вказаного антигену мається на увазі, що змінні ділянки антитіла впізнають та зв'язують виключно специфічний антиген. Цей термін охоплює, але без обмеження: поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, моноспецифічні та поліспецифічні антитіла, гуманізовані антитіла, тетрамерні та тетравалентні антитіла, мультиспецифічні антитіла, одноланцюгові антитіла, домен- специфічні антитіла, однодоменні антитіла, антитіла з видаленим доменом, злиті (гібридні) білки, злиті білки ScFc, одноланцюгові антитіла, химерні антитіла, синтетичні антитіла, рекомбінантні антитіла, гібридні, мутовані та CDR-щеплені антитіла. Антитіла можуть бути інтактними імуноглобулінами, що походять з природних або з рекомбінантних джерел або можуть являти собою імунореактивні частки інтактних імуноглобулінів. "Антитіло" може бути перетворено на антиген - зв'язуючий білок, що охоплює, але без обмеження фрагменти антитіла, які, в свою чергу, охоплюють, але без обмеження: фрагменти Fab, F(ab')2, Fab', Fv, одноланцюговий фрагмент Fv (ScFv), фрагмент Fd, фрагмент dAb, діатіла, пептид CDR3, обмежений пептид FR3-CDR3-FR4, нанотіла, бівалентні нанотіла, імунофармацевтичні засоби на основі модульного білка малого розміру (SMIP), мінітіла та будь – які з вищезазначених фрагментів та їх отримані хімічним або генетичним чином модифіковані копії, а також інші фрагменти антитіл, що зберігають антиген - зв'язувальну функцію. Звичайно подібні фрагменти будуть містити антиген - зв'язуючий домен. Як буде зрозуміло фахівцям, будь - яка з таких молекул може бути штучно створена (наприклад, за допомогою ембріональних клітинних ліній) зі зниженням своєї імуногенності, підвищенням спорідненості, зміненням специфічності або для іншої мети. 3 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Антиген" або "імуноген", як тут застосовано, має відношення до молекули, що містить один або декілька епітопів (лінійних, конформаційних або лінійних та конформаційних), що при дії на суб'єкт будуть викликати специфічну для цього антигену імунну відповідь. Епітоп є специфічною ділянкою антигену, що зв'язується з Т- клітинним рецептором або зі специфічним антитілом та звичайно містить біля 3-20 амінокислотних залишків. Термін "антиген" має відношення до субодиничних антигенів – антигенів, які є самостійними та відокремленими від цілого організму, з яким вони є природно пов'язаними, а також до вбитих, ослаблених або інактивованих бактерій, вірусів, грибів, паразитів або інших мікробів. Термін "антиген" також має відношення до антитіл, як-то до анті - ідіотипічних антитіл або їх фрагментів та до синтетичних пептидних мімотопів, що можуть імітувати антиген або антигенну детермінанту (епітоп). Також термін "антиген" має відношення до олігонуклеотиду або полінуклеотиду, що експресує антиген або антигенну детермінанту in vivo, як-то у застосуваннях ДНК – імунізації. "Антигенність", як тут застосовано, має відношення до здатності білка або поліпептиду бути імуноспецифічно зв'язаним антитілом, що виникає проти вказаного білка або поліпептиду. Термін "Bordetella bronchiseptica" або "B. bronchiseptica" має відношення до: живої послабленої бактерії Bordetella bronchiseptica, екстракту вбитих цілих клітин (бактерин) Bordetella bronchiseptica або до клітинного бактеріального екстракту Bordetella bronchiseptica. Під "буфером" мається на увазі хімічна система, що запобігає зміненню у концентрації іншої хімічної речовини. У якості буферів діють протонні донорні та акцепторні системи, що запобігають виникненню помітних змін концентрації іонів водню (pH). Іншим прикладом буфера є розчин, що містить суміш слабкої кислоти та його солі (сполучену основу) або слабку основу та її сіль (сполучену кислоту). "Собака", як тут застосовано, охоплює тварин, яких звичайно називають собаками та інших членів родини Canidae. Термін "клітинна лінія" або "клітина – хазяїн", як тут застосовано, має відношення до прокаріотичних або еукаріотичних клітин, прийнятних для реплікації або до зберігання вірусу. Термін "культура", як тут застосовано, означає популяцію клітин або мікроорганізмів, що зростають при відсутності інших видів або типів. "Доза" має відношення до вакцини або імуногенної композиції, яку отримує суб'єкт. "Перша доза" або "підсилена початкова доза" має відношення до дози такої композиції, яку отримує суб'єкт у нульову добу. "Друга доза" або "третя доза" або "щорічна доза" має відношення до кількості такої композиції, яку вводять після першої дози, що може бути, але не обов'язково є такою ж саме вакциною або імуногенною композицією, як і перша доза. "Епітоп" є специфічною ділянкою антигену, що зв'язується з Т- клітинним рецептором або зі специфічним антитілом та звичайно складається з приблизно 3-20 амінокислотних залишків. "Наповнювач", як тут застосовано, має відношення до нереактивного компонента - носія вакцини або імуногенної композиції, який не є антигеном. "Фрагмент" має відношення до усіченої частини білка або гена. "Функціональний фрагмент" та "біологічно активний фрагмент" має відношення до фрагменту, що зберігає біологічні властивості повнорозмірного білка або гена. "Тотожність" або "відсоток тотожності" має відношення до відсотка нуклеотидів або амінокислотних залишків кандидатної послідовності, які є ідентичними або подібними до залишків послідовності (послідовностей), яку порівнюють після вирівнювання послідовностей та введення пробілів, якщо це потрібно, для досягнення максимальної відсоткової тотожності послідовності, враховуючи будь - які консервативні заміщення як частину тотожності послідовності. "Гомологи" або "гомологи видів" містять гени, знайдені у двох або більше різних видів, що мають суттєву полінуклеотидну тотожність послідовності та однакові або подібні біологічні функції та/або властивості. Переважним чином, полінуклеотидні послідовності, що представлені видовими гомологами будуть гібридизуватися у помірно жорстких умовах, як описано тут у прикладі та мають однакові або подібні біологічні функції та/або властивості. У іншому аспекті, полінуклеотиди являють собою види гомологів, що мають більш, ніж біля 60 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 70 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 80 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 90 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 95 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 96 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 97 % тотожності послідовності, більш, ніж біля 98 % тотожності послідовності або більш, ніж біля 99 % тотожності послідовності. "Ідентичність" або "відсоток ідентичності" має відношення до відсотка нуклеотидів або амінокислот у кандидатній послідовності, які є ідентичними залишкам у порівняльній послідовності після вирівнювання обох послідовностей та введення пробілів, якщо це потрібно, 4 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для досягнення максимальної відсоткової тотожності послідовності, врaховуючи будь - які консервативні заміщення як частину тотожності послідовності. "Імунна відповідь" у суб'єкта, як тут застосовано, має відношення до розвитку гуморальної імунної відповіді, клітинної імунної відповіді або гуморальної та клітинної імунної відповіді на антиген. "Гуморальна імунна відповідь" має відношення до такої відповіді, що принаймні частково опосередкована антитілом. "Клітинна імунна відповідь" є відповіддю, опосередкованою T- лімфоцитами або іншими білими клітинами крові або цими клітинами разом та полягає у продукуванні цитокінів, хемокінів та подібних молекул активованими Tклітинами, білими клітинами крові або цими клітинами разом. Імунні відповіді можна визначити з застосуванням відомих у цій галузі стандартних способів імуноаналізу та аналізу нейтралізації. "Імуногенність", як тут застосовано, має відношення до здатності білка або поліпептиду викликати імунну відповідь, специфічно спрямовану проти антигену. " Імуногенна композиція " є препаратом, що містить імуноген, в тому числі, наприклад, білок, пептид, цілі клітини, інактивований, субодиничний або ослаблений вірус або полісахарид або їх комбінацію, який вводять для стимулювання гуморальних та клітинних імунних систем реципієнта до одного або декількох наявних у імуногенній композиції антигенів. " Імунізація " є процесом введення імуногенної композиції та стимулювання у хазяїна імунної або імуногенної відповіді на антиген. Бажаними хазяями є ссавці, як-то собаки. Переважним чином, імуногенна композиція є вакциною. "Імунологічно захисна кількість", як тут застосовано, є кількістю антигену, що буде ефективною для викликання імуногенної відповіді у реципієнта, яка є адекватною для запобігання або полегшення ознак або симптомів захворювання, в тому числі несприятливих наслідків для здоров'я або їх ускладнень. Викликаними можуть бути або гуморальна або клітинно - опосередкована імунність або обидві з них. Імуногенна відповідь тварини на композицію може бути обчислена, наприклад, небезпосереднім чином шляхом вимірювання титрів антитіл, застосуванням аналізів проліферації лімфоцитів або безпосередньо шляхом моніторингу ознак та симптомів після інфікування штамом дикого типу. Захисна імунність, надана композицією або вакциною може бути обчислена шляхом вимірювання, наприклад, скорочення виділення організмів інфікування, зменшення клінічних ознак як-то смертності, захворюваності, температури, загального фізичного стану, здоров'я та продуктивності суб'єкта. Імунна відповідь може охоплювати, без обмеження, викликання клітинної та/або гуморальної імунності. Терапевтично ефективна кількість композиції або вакцини може змінюватися у залежності від певного застосованого організму або стану тварини, що підлягає лікуванню або вакцинації та може бути визначена ветеринаром. "Інтраназальне" введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то вакцини або іншій композиції у тіло суб'єкта через ніс та полягає у транспортуванні речовини переважно крізь слизову оболонку носа. "Виділений", як тут застосовано, означає вилучений зі свого природного оточення або окремо або у складі гетерологічної клітини - хазяїна або хромосоми або вектора (наприклад, плазміди, фага тощо). "Виділені бактерії," "виділені анаеробні бактерії," "виділений бактеріальний штам," "виділений вірус", "виділений вірусний штам" тощо мають відношення до композицій, у яких бактерія або вірус є істотно вільною від інших мікроорганізмів, наприклад, у культурі, як-то при вилученні зі свого природного оточення. Термін "виділений" при застосуванні для опису будь - якої окремо визначеної речовини, як-то полінуклеотиду або поліпептиду, означає речовину, яка є вилученою зі свого природного клітинного оточення, де її (наприклад, нуклеїнову кислоту або поліпептид) звичайно можна знайти. Отже, як тут застосовано тільки у якості прикладу, рекомбінантна клітинна лінія, сконструйована з полінуклеотидом відповідно за винаходом буде застосовувати "виділену" нуклеїнову кислоту. Альтернативно, якщо заявлено про певний білок або специфічний імуногенний фрагмент або його застосовують у якості вакцини або іншої композиції, його також слід розглядати, як виділений, тому що його було ідентифіковано, відокремлено та у деякої мірі очищено у порівнянні зі умовами його природного існування. Якщо продукування білка або його специфічного імуногенного фрагменту відбувається у рекомбінантній бактерії або завдяки еукаріотичному вектору експресії, що продукує антиген, то вважається, що він існує у якості виділеного білка або нуклеїнової кислоти. Наприклад, вважається, що сконструйована з полінуклеотидом рекомбінантна клітинна лінія застосовує "виділену" нуклеїнову кислоту. "Лікарський засіб" має відношення до будь-якого агента, корисного у запобіганні, лікуванні або покращенні медичного стану або у запобіганні певного психологічного стану або явища. "Моноклональне антитіло", як тут застосовано, має відношення до антитіл, отриманих від одиничної лінії клітин гібридоми, всі з яких спрямовані до одного епітопу певного антигену. 5 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Антиген, що взаємодіє з моноклональним антитілом може бути наданий у вигляді виділеного білка патогену або цілого патогену. "Гібридома" є клональною клітинною лінією, що складається з гібридних клітин, отриманих шляхом злиття клітин міеломи та специфічних клітин, що виробляють антитіла. Головним чином, моноклональні антитіла є мишачого походження, однак вони також мають відношення до клональних популяцій антитіл, отриманих до певного епітопу у складі антигену за допомогою фаг-дисплейної технології або способу, еквівалентному фагдисплейної технології або до гібридів клітин не-мишачого походження. "Оральне" або "пероральне" введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то вакцини або іншої композиції у тіло суб'єкта через рот та полягає у ковтанні або у транспортуванні речовини через слизову оболонку порожнини рота (наприклад, шляхом сублінгвального або букального (щічного) всмоктування) або у застосуванні обох цих шляхів. Внутрішньотрахеальне введення також вважається оральним або пероральним введенням. "Ороназальне" введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то композиції або вакцини у тіло суб'єкта через рот та ніс, як це відбувається, наприклад, шляхом введення у ніс однієї або декількох крапель. Ороназальне введення охоплює транспортні процеси, пов'язані з оральним та інтраназальним введенням. "Парентеральне введення", як тут застосовано, має відношення до введення речовини, якто композиції або вакцини у тіло суб'єкта шляхом, що виключає застосування травного тракту. Парентеральне введення охоплює підшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоартеріальне та внутрішньовенне введення. Для цілей даного опису, парентеральне введення виключає шляхи введення, що перш за все охоплюють транспортування речовини через слизову оболонку у порожнини рота, носа, трахеї та легені. Термін "патоген" або "патогенний мікроорганізм", як тут застосовано, має відношення до мікроорганізму, наприклад, вірусу CPIV, CAV-2, CRCoV, CIV або бактерії Bordetella bronchiseptica, що здатен викликати або спонукати виникнення захворювання, слабкість або ненормальний стан своїх тварин - хазяїв. "Пертактин", як тут застосовано, є білком зовнішньої мембрани Bordetella. Переважним чином, пертактин походить з B. bronchiseptica та ще переважніше він є білком "p68" та кодується геном prnA. Пертактин може бути виділений у нативній формі з Bordetella bronchiseptica або його можна отримати рекомбінантним шляхом. Послідовності та приклади пертактину надані у патенті США U.S. Patent No. 7,736,658, зміст якого включений сюди шляхом посилання. Застосований тут пертактиновий антиген охоплює ліпідовані форми білка. "Фармацевтично прийнятний" має відношення до речовин, які, в рамках медичної точки зору, є придатними для застосування в контакті з тканинами пацієнтів без пов'язаних з ними надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції тощо, прийнятних з розумним ставленням користі до ризику та ефективних для їх призначеного застосування. " Поліклональне антитіло ", як тут застосовано, має відношення до змішаної популяції антитіл, отриманої проти окремого патогену або антигену. Головним чином, популяція містить багато груп антитіл, де кожна група є спрямованою до окремого епітопу патогену або антигену. Для отримання поліклональних антитіл, цілий патоген або виділений антиген вводять хазяїну шляхом інокуляції або інфікуванням, що спонукає хазяїна виробляти антитіла проти цього патогену або антигену. Термін "полінуклеотид", як тут застосовано, має відношення до органічної полімерної молекули, що складається з ковалентно пов'язаних в ланцюг нуклеотидних мономерів. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) та РНК (рибонуклеїнова кислота) є прикладами полінуклеотидів з різною біологічною функцією. Термін "поліпептид", як тут застосовано, має відношення до органічної полімерної молекули, що складається з двох або більше амінокислот, пов'язаних в ланцюг. " Запобігання інфекції ", як тут застосовано, означає запобігання або інгібування реплікації бактерії або вірусу, що викликає визначене захворювання для інгібування передачі бактерії або вірусу, запобігання укорінення бактерії або вірусу у тілі хазяїна або для зменшення симптомів захворювання, викликаного інфекцією. Лікування вважається терапевтичним, якщо є зниження бактеріального або вірусного навантаження. "Захист", "захисний", "захисна імунність" тощо, як тут застосовано, має відношення до вакцини або іншої композиції та означає, що ця вакцина або композиція запобігає або зменшує симптоми захворювання, викликані організмом, антиген (антигени) якого були застосовані у отриманій вакцині або композиції. Терміни "захист" та "захисний" тощо також означають, що вакцина або композиція може бути застосована для "лікування" захворювання або одного або більше симптомів захворювання, що вже існує у суб'єкті. 6 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Респіраторне" введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то композиції або вакцини у тіло суб'єкта шляхом інгаляції розпиленої (атомізованої) речовини. При такому введенні, основний механізм транспорту полягає у поглинанні розпиленої речовини через слизову оболонку трахей, бронхів та легень, отже відрізняється від інтраназального або перорального введення. Терміни "специфічне зв'язування", "специфічно зв'язується" тощо стосуються визначення двох або більше молекул, що утворюють комплекс, який піддається вимірюванню у фізіологічних або аналітичних умовах та є селективним. Вважають, що антитіло або інший інгібітор "специфічно зв'язується" з білком, якщо, при відповідно підібраних умовах таке зв'язування істотно не пригнічується, тоді як в той же час має місце інгібування неспецифічного зв'язування. Специфічне зв'язування відрізняється високою спорідненістю та є селективним для сполуки або білка. Неспецифічне зв'язування завжди має низьку спорідненість. Зв'язування -7 антитіл IgG, наприклад, звичайно характеризується спорідненістю принаймні біля 10 M або -8 -9 вище, як-то принаймні біля 10 M або вище, або принаймні біля 10 M або вище або принаймні -10 -11 -12 біля 10 або вище або принаймні біля 10 M або вище, або принаймні біля 10 M або вище. Цей термін також можна застосувати, наприклад, коли антиген-зв'язуючий домен є специфічним для певного епітопу, що не переноситься у складі численних антигенів. У такому разі, антитіло, що несе антиген - зв'язувальний домен звичайно не буде зв'язувати інші антигени. "Специфічний імуногенний фрагмент", як тут застосовано, має відношення до частини послідовності, що розпізнається антитілом або специфічними для цієї послідовності T клітинами. "Суб'єкт", як тут застосовано, має відношення до будь-якої тварини, що має імунну систему, що охоплює ссавців, як-то собак. "Істотно ідентичний", як тут застосовано, має відношення до ступеня ідентичності послідовності, що дорівнює принаймні біля90 %, принаймні біля 95 %, принаймні біля 96 %, принаймні біля 97 %, принаймні біля 98 % або принаймні біля 99 %. "Субодинична вакцина" та "субодинична композиція", як тут застосовано, має відношення до типу вакцини або композиції, що охоплює один або декілька антигенів, але не обов'язково всі антигени у вакцині або композиції, що походять від антигенів з інтересуючого патогену, як-то вірус, бактерія, паразит або гриб або гомологічні цим антигенам. Така композиція або вакцина є істотно вільною від інтактних клітин патогену або патогенних частин чи лізатів таких клітин або частин. Отже, субодинична вакцина або субодинична композиція може бути отримана з принаймні частково очищених або істотно очищених від патогену імуногенних поліпептидів або їх аналогів. Способи отримання антигену або антигенів у субодиничній вакцині або субодиничній композиції полягають у застосуванні стандартних технологій очищення та виробництва продукту рекомбінантним шляхом або шляхом хімічного синтезу. Отже. "субодинична вакцина" або "субодинична композиція" має відношення до вакцини або композиції, що складається з визначеного антигенного компонента або компонентів вірусу, бактерії або іншого імуногену. "TCID50" (ЦПД 50) має відношення до "інвективної дози для культури тканин" та визначається, як розведення вірусу, потрібне для інфікування 50 % вибраної партії інокульованих клітинних культур. Для обчислення TCID50 можуть бути застосовані різні способи, в тому числі спосіб Спірмена-Карбера, застосований у даному описі. Опис цього способу див. у B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996). " Терапевтичний агент ", як тут застосовано, має відношення до будь-якої молекули, сполуки, вірусу або лікарського засобу, переважно до ослабленого або вбитого вірусу або субодиниці або сполуки, що допомагає у лікуванні вірусної, бактеріальної, паразитарної або грибкової інфекції, захворювання або викликаного цим стану. "Терапевтично ефективна кількість", як тут застосовано, має відношення до кількості антигену або вакцини або композиції, що буде викликати імунну відповідь у суб'єкта (де суб'єктом є, наприклад, собака), що отримав антиген або вакцину або композицію, яка буде адекватною для запобігання або послаблення ознак або симптомів захворювання, в тому числі негативних дій на здоров'я або їх ускладнень, викликання інфекції з патогеном, як-то вірус, бактерія, паразит або грибок. Може бути викликана гуморальна або клітиннно-опосередкована імунність або гуморальна та клітинно - опосередкована імунність разом. Імуногенна відповідь тварини на композицію може бути обчислена, наприклад, небезпосереднім чином шляхом вимірювання титрів антитіл, аналізом проліферації лімфоцитів або безпосередньо шляхом моніторингу ознак та симптомів після інфікування штамом дикого типу. Захисна імунність, надана композицією або вакциною може бути обчислена шляхом вимірювання, наприклад, зменшення розповсюдження інфікування організмів, зменшення клінічних ознак як-то 7 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 смертність, захворюваності, температури та загального фізичного стану, здоров'я та продуктивності суб'єкту. Терапевтично ефективна кількість вакцини або композиції може змінюватися в залежності від окремого застосованого імуногену або стану суб'єкта та може бути визначена фахівцем у цей галузі. "Лікувати" або "лікування", як тут застосовано, має відношення до реверсії, полегшення, пригнічення розвитку або попередження розладу, стану або захворювання, до якого цей термін застосовано або до запобігання виникнення одного або декількох симптомів такого розладу, стану або захворювання. "Лікування", як тут застосовано, має відношення до акту "лікування", як безпосередньо визначено вище. "Вакцина" або "вакцинна композиція," як тут застосовано, має відношення до імуногенної композиції, вибраної з вірусу або бактерії, яка є або живою модифікованою, ослабленою або вбитою або до субодиничної вакцини, або до будь-якої комбінації вищезазначеного. Введення вакцини суб'єкту веде до появи імунної відповіді. Вакцину можна ввести безпосередньо суб'єкту за допомогою будь - якого відомого шляху введення, в тому числі парентерально, перорально тощо. Під цим терміном слід розуміти композицію, що запобігає або зменшує інфекцію або що запобігає або зменшує одну чи більше її ознак або симптомів. Звичайно захисних дій вакцинної композиції проти патогену досягають шляхом викликання у суб'єкті імунної відповіді. Взагалі кажучи, зникнення або зниження випадків зараження, полегшення ознак або симптомів або прискорене усунення мікроорганізму з інфікованого суб'єкту свідчить про наявність захисних дій композиції вакцини. Вакцинні композиції заявленого винаходу забезпечують захисний ефект проти інфекцій, викликаних патогенами респіраторного захворювання собак. "Ветеринарно прийнятний", як тут застосовано, має відношення до речовин, які, в рамках медичної точки зору, є придатними для застосування в контакті з тканинами суб'єктів ветеринарії без пов'язаних з ними надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції тощо, прийнятних з розумним ставленням користі до ризику та ефективних для їх призначеного застосування. "Ветеринарно прийнятний носій ", як тут застосовано, має відношення до транспортного середовища, що не впливає на ефективність біологічної активності активного інгредієнта та не є токсичним для ветеринарного суб'єкта, якому його вводять. Заявлений винахід стосується імуногенних композицій та вакцин, що містять один або декілька вірусів та бактерій. Заявлений винахід стосується імуногенних композицій та вакцин, що містять один або декілька вірусів та бактерій або субодиниць, прийнятних для введення собакам для лікування проти CIRDC. Описаний тут респіраторний коронавірус собак (CRCoV) можна охарактеризувати, як коронавірус, присутній у респіраторних шляхах собаки з інфекційним респіраторним захворюванням. Філогенетично CRCoV є найбільш близько спорідненим до коронавірусу корів (BCoV), штаму OC43 коронавірусу людини (HCoV) та вірусу гемаглютинуючого енцефаломієліту (HEV). Кишковий собачий коронавірус (CCoV) має лише віддалену спорідненість з CRCoV. Характерним прикладом прийнятного для застосування у заявленому винаході вірусу CRCoV є його штам, визначений, як штам 4182 CRCoV (Erles et al., Virus Res., 124:78-87, 2007). Антигени вірусу грипу, що охоплюються цим винаходом можуть належати до будь – якого визначеного штаму вірусу грипу будь - яких птахів або ссавців, в тому числі, але без обмеження, до вірусу грипу що має підтип гемаглютинину H3 та підтип нейрамінідази N8 або підтип H3N8, частіше позначений, як вірус H3N8. Грип може бути пташиним захворюванням або бути грипом ссавців, в тому числі, але без обмеження, свинячим, кінським або собачим. У одному втіленні застосовано антиген собачого грипу, у одному втіленні застосовано антиген кінського грипу. У одному втіленні застосовано штам, що має підтипні глікобілки, позначені, як H3 або N8. У одному втіленні застосовано штам, що має обидва підтипних глікобілка H3 та N8. Антигени грипу, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути отримані від собак, коней, свиней, а також від свійських та диких птахів. Тварини, вибрані для відбору зразків повинні проявляти гострі та / або підгострі клінічні синдроми, включаючи важкі респіраторні симптоми та лихоманку. Тварини також можуть проявляти ознаки анорексії та летаргії. Способи виділення вірусу добре відомі фахівцям у цей галузі та охоплюють, серед іншого: інокуляцію клітинних культур клітин ссавців та птахів, інокуляцію ембріонів зразками назального чи глоткового слизу, отриманими з клінічних препаратів, відбір мазків з носових ходів або горла або відбір тканинних зразків, як-то селезінці, легенів, мигдалин, печінки та рідини промивання (лаважу) легенів. Цитопатичну дію вірусу можна спостерігати у культурі клітин. Алантоїсну рідину або клітинні лізати також можна перевірити на їх здатність до аглютинації еритроцитів людини, курки, індика чи морської свинки, яка є можливим свідоцтвом наявності вірусу грипу. 8 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Характерним прикладом штаму вірусу грипу, прийнятного для застосування у заявленому винаході є штам, визначений, як A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12, що зберігається, як PTA-7694 у Американській колекції типових культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 з 29 червня 2006р відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Характерним штамом CIV антигену є штам вірусу CIV промислової вакцини Vanguard® CIV (Pfizer, Inc). Цей винахід також охоплює вакцини, що містять штам, визначений, як штам кінського вірусу грипу A/Equine/2/Miami/1/63. Цей штам також зберігається у ATCC під інвентарним номером VR 317 відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Додаткові приклади вірусів грипу для застосування у заявленому винаході охоплюють A/canine/Iowa/13628/2005, A/Equine/Kentucky/1998, A/Equine/Kentucky/15/ 2002, A/Equine/Ohio/1/2003, A/Equine/Kentucky/1/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003, A/Equine/Wisconsin/2003, A/Equine/NewYork/1999 та A/Equine/Newmarket/A2/1993. Інші бажані штами та/або ізоляти вірусу CIV охоплюють описані у патенті США U.S. Patent Nos. 7,959,929 (особливо штами та гемаглютинінові послідовності, що були визначені, як Jacksonville/2005, Miami/2005, FL/242/03 та Florida/43/04), 7,384,642, 7,572,620 та 7,468,187, склад яких, у тому числі всіх послідовностей, особливо гемаглютинінових послідовностей та штамів включений сюди в якості посилання, начебто б вони були викладені тут повністю. Додатково, прийнятним для застосування у заявленому винаході штамом CIV є ізолят Colorado CIV, описаний у Barrell et al., J. Vet. Intern. Med., 24 (6), 1524-1527 (2010), що має інвентарний номер ADW41784. Вірус парагрипу собак (CPIV), що має відношення до заявленого винаходу можна охарактеризувати як один з вірусів, який є, як відомо, збудником, пов'язаним з вольєрним кашлем. Характерним штамом антигену CPIV є штам ослабленого вірусу CPI у промисловій вакцині Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Іншим характерним штамом антигену CPIV є штам ослабленого вірусу CPI, що має назву "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Собачий аденовірус другого типу (CAV-2), що має відношення до заявленого винаходу можна охарактеризувати як один з вірусів, який є, як відомо, збудником, пов'язаним з вольєрним кашлем. Характерним штамом антигену CAV-2 є штам ослабленого вірусу CAV-2 у промисловій вакцині Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Характерним штамом антигену CAV-2 є також штам ослабленого вірусу CAV-2, відомий, як штам "Манхеттен" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Mycoplasma cynos (M. cynos), що має відношення до заявленого винаходу, описана у Chalker et al., Microbiology, 150:3491-3497, 2004 та є єдиним видом мікоплазми, який звичайно пов'язують з респіраторним захворюванням. Імуногенні композиції проти M. cynos описано у патенті США US 2007/0098739, який є включеним сюди шляхом посилання. Компонент Bordetella bronchiseptica, що має відношення до заявленого винаходу можна охарактеризувати як бактеріальний агент, який, як відомо, є збудником, пов'язаним з вольєрним кашлем. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути одним або декількома з наступного: живими ослабленими Bordetella bronchiseptica, бактерином Bordetella bronchiseptica або бактеріальним екстрактом. Крім того, композиція також переважно включає виділений субодиничний антиген Bordetella bronchiseptica. У одному втіленні, Bordetella bronchiseptica отримують у вигляді гомогенату, отриманого з цілих клітин під дією ультразвуку та очищеного шляхом колоночної хроматографії, як передбачено у заявці Patent Application No. FR2571618, що була подана 12 жовтня 1984 р. Іншим характерним прикладом Bordetella bronchiseptica є бактеріальний екстракт Bronchicine™ CAe (Pfizer), отриманий з антигенного матеріалу, екстрагованого з клітин Bordetella bronchiseptica. Іншим прикладом Bordetella bronchiseptica є штам B-C2 живих ослаблених бактерій Bordetella bronchiseptica, присутній у вакцині Nobivac® та/або штам живих ослаблених TM бактерій Bordetella bronchiseptica з вакцин Intra-Trac®, Bronchi-Shield®, Naramune , TM Recombitek®, Univac, та/або Kennel-Jec . Крім того, у комбінації з компонентом Bordetella bronchiseptica переважно також представлені (тобто доповнюють його) субодиниці. Характерним прикладом субодиниці є виділений пертактиновий антиген, переважно антиген p68 Bordetella bronchiseptica, особливо рекомбінантний антиген p68 Bordetella bronchiseptica, що впізнається p68- специфічним моноклональним антитілом Bord 2-7 (що описано у патенті США US 7,736,658, який включений сюди шляхом посилання) та, у одному бажаному втіленні, має амінокислотну послідовність, яка наведена у патенті США US 7,736,658 або має тотожність до неї. 9 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пертактиновий антиген рекомбінантного білка p68 переважно отримують у розчинній формі зі збереженням та відновленням протягом процесингу його структури, подібної до нативної. Відповідно, одним аспектом винаходу передбачено рекомбінантний білок p68, який є істотно вільним (менш, ніж на біля 80 %, 90 %, 95 % або навіть 99 %) від агрегатів. У іншому втіленні, рекомбінантний білок p68 розчинюють у сечовині, у переважно біля 0.1 M, 0.5 M, 1 M, 2 M, 3 M, або 6 M розчині сечовини. Після цього, антиген p68 може бути очищено, наприклад, шляхом колоночної хроматографії. Один такий процес солюбілізації описаний у Surinder et al., J. Bioscience and Bioengineering, v. 99(4), pgs 303-310 (2005). Застосовані тут пертактинові антигени також охоплюють ліпідовані форми. Приклади отримання ліпідованих білків наведені у науковій статті від Erdile et al., Infection and Immunity, (1993) v.61(1), p. 81-90, включеній сюди шляхом посилання. Описані тут способи можуть бути застосовані для отримання посттрансляційно модифікованих пертактинових білків, що містять приєднану ліпідну функціональну групу. Крім того, у іншому втіленні, імуногенна композиція містить Bordetella bronchiseptica та виділений антиген Bsp22. У іншому втіленні, імуногенна композиція містить Bordetella bronchiseptica, виділений пертактиновий антиген та виділений антиген Bsp22. Антиген Bsp22 можна отримати, як наведено у Medhekar et al., Molecular Microbiology (2009) 71(2), 492–504. Переважним чином, виділений антиген Bsp22 є присутнім разом з (тобто на додачу до) екстрактом Bordetella bronchiseptica та виділеним пертактиновим антигеном, специфічним рекомбінантним білком p68. "Bsp22" також охоплює ліпідовані форми антигену. Приклади отримання ліпідованих білків наведені у Erdile et al., Infection and Immunity, (1993) v.61(1), p. 81-90, включеній сюди шляхом посилання. Описані тут способи можна застосувати для отримання посттрансляційно модифікованих білків Bsp22, що містять приєднану ліпідну функціональну групу. Віруси, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути розмножені у клітинах, клітинних лініях та у клітинах - хазяях. Вказані клітини, клітинні лінії або клітини - хазяї можуть бути наприклад, але без обмеження, клітинами ссавців та іншими клітинами, в тому числі клітинами комах та рослин. Клітини, клітинні лінії та клітини – хазяї, у яких можна розмножувати віруси, що охоплюються заявленим винаходом є добре відомі та доступні фахівцям у цій галузі. У іншому втіленні, описані тут імуногенні композиції не містять не- респіраторних антигенів. Отже, одне втілення винаходу передбачає композицію, як описано тут, за умовою, що вона не містить не- респіраторний антиген. Не- респіраторні антигени не викликають у суб'єкта респіраторного захворювання. Необмежені приклади таких не- респіраторних антигенів охоплюють вірус сказу, собачий парвовірус, собачий кишковий коронавірус, види Leptospira та Borrelia burgdorferi. Бактерії, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути культивовані та розмножені з застосуванням різних відомих пересічним фахівцям культуральних середовищ, в тому числі, середовищ для культивування у вигляді бульйону (рідке) та на основі агару (тверде; напівтверде). Деякі бактерії також можуть бути культивовані та розмножені у клітинах ссавців або у інших клітинах. Віруси та бактерії, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути ослаблені або інактивовані перед застосуванням у імуногенній композиції або вакцині. Способи ослаблення та інактивації добре відомі фахівцям у цей галузі. Способи ослаблення охоплюють, але без обмеження, серійний пасаж у клітинній культурі відповідної клітинної лінії (віруси та деякі бактерії), серійний пасаж у бульйонній культурі (бактерії), ультрафіолетове опромінення (віруси та бактерії) та хімічний мутагенез (віруси та бактерії). Способи вірусної або бактеріальної інактивації охоплюють, але без обмеження, обробку формаліном, бетапропіолактоном (BPL), бінарним етиленіміном (BEI) або інші відомі фахівцям способи. Інактивацію формаліном можна здійснити шляхом змішування суспензії, що містить мікроорганізм з 37 % формальдегідом до кінцевої 0.5 % концентрації формальдегіду. Суміш мікроорганізм - формальдегід перемішують шляхом постійного збовтування протягом приблизно 24 год. при кімнатній температурі, після чого інактивовану суміш мікроорганізму перевіряють на залишкові живі організми шляхом аналізу зростання у прийнятній клітинній лінії або у бульйонному середовищі. Для деяких антигенів, інактивацію за допомогою BEI можна здійснити шляхом перемішування суспензії, що містить мікроорганізм заявленого винаходу з 0.1M BEI (2-бромоетиламін у 0.175Н NaOH) до кінцевої 1 мМ концентрації BEI. Для інших антигенів кінцева концентрація BEI дорівнює 2 мM. Відповідні для застосування концентрації відомі фахівцям у цій галузі. Суміш вірусу з BEI суміш перемішують шляхом постійного збовтування протягом приблизно 48 год. при кімнатній температурі, після чого додають 1.0 M тіосульфат натрію до 10 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінцевої концентрації 0.1 мM. Перемішування триває ще додаткові дві години, після чого суміш, що містить інактивований мікроорганізм перевіряють на залишковий живий вірус шляхом аналізу зростання у відповідній клітинній лінії або бульйонному середовищі. Імуногенні композиції та вакцини, що належать до заявленого винаходу можуть містити один або декілька ветеринарно прийнятних носіїв. " Ветеринарно прийнятний носій ", як тут застосовано, охоплює будь - які та всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, ад'юванти, стабілізуючі агенти, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, агенти затримки адсорбції тощо. Розчинники можуть охоплювати воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Серед інших ізотонічних агентів, відомих фахівцям, до цих речовин також належать хлорид натрію, декстроза, маніт, сорбіт та лактоза. Серед інших стабілізаторів, відомих фахівцям, до цих речовин також належить альбумін. Серед інших консервантів, відомих досвідченим фахівцям, до цих речовин також належить мертіолат. Ад'ювант може перетворюватися в ході обміну речовин, це стосується ад'ювантів, що складаються з компонентів, здатних перетворюватися в ході обміну речовин інтересуючих видів, як-то ад'ювантів на основі рослинних олій. Такий здатний до перетворення під час метаболізму ад'ювант може бути олією, що має подібні властивості. Здатними до перетворення під час метаболізму речовинами є олії та жири, що звичайно зустрічаються у рослинах та тваринах та звичайно складаються головним чином з суміші тригліцеридів, також відомих, як тригліцериди або нейтральні жири. Ці неполярні, нерозчинні у воді речовини є складними триефірами жирних кислот гліцерину. Три-ацил-гліцеріни розрізняються в залежності від їх особливих властивостей та від розташування притаманних їм трьох залишків жирних кислот або бічних ланцюгів. Ад'ювант може також бути нездатним до перетворення під час метаболізму, як-то ад'юванти, що складаються з компонентів, що не перетворюються під час метаболізму організмом тваринного суб'єкту, якому вводять вказану емульсію. Не здатні до метаболізації прийнятні для застосування у композиції заявленого винаходу олії охоплюють алкани, алкени, алкіни та їх відповідні кислоти та спирти, їх прості та складні ефіри та суміші. Переважним чином, окремі олійні сполуки є легкими вуглеводневими сполуками, тобто такі компоненти мають 6-30 карбонових атомів. Подібні олії можна отримати синтетично або отримати з нафтопродуктів шляхом очищення. Бажані для застосування у описаних тут композиціях олії, що не перетворюються в ході метаболізму, наприклад, охоплюють мінеральні оливи, рідкий парафін та циклопарафіни. Термін " мінеральна олива " має відношення до нездатної до перетворення під час метаболізму ад'ювантної олії, яка є сумішшю рідких вуглеводів, отриманих з петролатума (парафіну, що одержують із залишкової сировини) шляхом дистиляції. Цей термін є синонімічним до термінів " зріджений парафін ", " рідкий петролатум " та " біла мінеральна олива ", а також призначений охоплювати поняття " легка мінеральна олива ", тобто олива, яка аналогічним чином була отримана з петролатума шляхом дистиляції, але має трохи меншу густину, ніж біла мінеральна олива. Miнеральну оливу можна отримати з різних комерційних джерел, наприклад, J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). Легка мінеральна олива є у продажу під торгівельною маркою DRAKEOL®. Ад'юванти охоплюють, але без обмеження, ад'ювантну систему Emulsigen® (MVP Laboratories; Ralston, NE), ад'ювантну систему RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), галун, гель гідроксиду алюмінію, емульсії типу "олія у воді" та "вода у олії", як-то, наприклад, повний та неповний ад'юванти Фрейнда, блок-співполімер (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, ® CA), ад'ювант AMPHIGEN , сапонін, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GPI0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL) або інші сапонінові фракції, монофосфорил-ліпід A, ліпід-аміновий ад'ювант Авридин, термолабільний ентеротоксин з E. coli (рекомбінантний або іншого походження), холерний токсин, мурамілдипептид, блок-співполімер / поверхнево-активну речовину (SP-oil) Сквален/Плюронік, сульфо - ліпо - бета - циклодекстрин (SL-CD), ліпосоми, що містять імуномодулятор (наприклад, CpG або полі I:C), мурамілдипептид (MDP), ад'ювант ІSCOMATRIX® (Quil A / фосфатидилхолін), CpG / DEAE-декстран / мінеральна олива (TXO), CpG, тритерпеноїди (наприклад, Quil А або інший очищений або частково очищений сапоніновий препарат), стероли (наприклад, холестерин), імуномодуляторні агенти (наприклад, диметил діоктадеціл бромід амонію - DDA), полімери (наприклад, поліакрилова кислота, як-то CARBOPOL®) та Th2 - стимулятори (наприклад, гліколіпіди, як-то Bay R1005®) та їх комбінації, а також багато інших відомих фахівцям ад'ювантів. Необмежені приклади різних прийнятних для застосування комбінацій охоплюють комбінацію тритерпеноїду зі стеролом (наприклад, Quil A/ холестерин, також відому, як QAC), комбінацію тритерпеноїду зі стеролом, імуномодуляторним агентом та полімером (наприклад, 11 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Quil A / холестерин / DDA /CARBOPOL®, також відому, як QCDC) та комбінацію тритерпеноїду зі стеролом, імуномодуляторним агентом, полімером та Th2 - стимулятором (наприклад, Quil A / холестерин /DDA / CARBOPOL® та Bay R1005®, також відому, як QCDCR). Кількості та концентрації ад'ювантів та домішок, корисних у контексті заявленого винаходу можуть бути легко визначені досвідченим фахівцем. У одному втіленні, заявлений винахід розглядає імуногенні композиції та вакцини, що містять біля 20-2000 мкг ад'юванту. У іншому втіленні, ад'ювант включено у кількості біля 100-1500 мкг або біля 250-1000 мкг або біля 350-750 мкг. У іншому втіленні, ад'ювант включено у кількості біля 500 мкг / 2 мл дози імуногенної композиції або вакцини. Імуногенні композиції та вакцини також можуть містити антибіотики, що охоплюють, але без обмеження, антибіотики, що належать до аміноглікозидів, карбапенемів, цефалоспоринів, глікопептидів, макролідів, пеніцилінів, поліпептидів, хінолонів, сульфаніламідів та тетрациклінів. У одному втіленні, заявлений винахід розглядає імуногенні композиції та вакцини, що містять біля 1-60 мкг/мл антибіотика. У іншому втіленні, імуногенні композиції та вакцини містять біля 555 мкг/мл антибіотика або біля 10-50 мкг/мл антибіотика або біля 15-45 мкг/мл антибіотика або біля 20-40 мкг/мл антибіотика або біля 25-35 мкг/мл антибіотика. У іншому втіленні, імуногенні композиції та вакцини містять менш, ніж біля 30 мкг/мл антибіотика. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть містити одну або декілька полінуклеотидних молекул, що кодують вірус або бактерію або вірусний або бактеріальний білок. Також у імуногенній композиції або вакцині можуть бути застосовані молекули ДНК або РНК. Молекули ДНК або РНК можуть бути введені у відсутності інших агентів або їх можна ввести разом з агентом, що сприяє клітинному поглинанню (наприклад, з ліпосомами або катіонними ліпідами). Загальна концентрація полінуклеотиду у імуногенній композиції або вакцині буде звичайно знаходитися у межах біля 0.1-5.0 мг/мл. У іншому втіленні, загальна концентрація полінуклеотиду у імуногенній композиції або вакцині буде звичайно знаходитися у межах біля 1 мкг/мл - 4.0 мг/мл або біля 10 мкг/мл та біля 3.0 мг/мл або біля 100 мкг/мл та біля 2.0 мг/мл. Вакцини та процедури вакцинації, де застосовані нуклеїнові кислоти (ДНК або мРНК) добре описані у науковій літературі, наприклад, у патентах США U. S. Pat. No. 5,703,055, U.S. Pat. No. 5,580,859 та U.S. Pat. No. 5,589,466, всі з яких є включеними сюди шляхом посилання. На додачу до описаних вище вірусів або бактерій, імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть також містити інші додаткові антигени. Антигени можуть існувати у вигляді інактивованого цілого або часткового препарату мікроорганізму або у вигляді антигенних молекул, отриманих за допомогою способів генетичної інженерії або хімічного синтезу. Інші прийнятні для застосування відповідно до заявленого винаходу антигени охоплюють, але без обмеження, антигени, що походять від патогенних вірусів, як-то вірус собачої чуми, вірус герпесу собак, вірус собачого грипу, вірус сказу, патогенних бактерій, як-то Bordetella bronchiseptica, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Borrelia spp., Streptococcus spp., в тому числі Streptococcus equi subspecies zooepidemicus, Ehrlichia spp., Mycoplasma spp., в тому числі Mycoplasma cynos та Microsporum canis. Антигени також можуть бути отримані від патогенних грибів, як-то Candida, від протозоа, як-то Cryptosporidium parvum, Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp., Leishmania spp. або від гельмінтів, як-то Taenia, Cuterebra, Echinococcus, та Paragonimus spp. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути введені тваринам для викликання ефективної імунної відповіді проти CIRDC. Відповідно, заявлений винахід передбачає способи стимулювання ефективної імунної відповіді шляхом введення тварині терапевтично ефективної кількості описаної тут імуногенної композиції або вакцини. Описані тут імуногенні композиції та вакцини можуть бути введені тваринам для вакцинації тваринного суб'єкту проти CIRDC. Імуногенні композиції та вакцини можуть бути введені тваринам для запобігання або лікування CIRDC у тварин. Відповідно, тут описані способи вакцинації тварин проти CIRDC та запобігання або лікування CIRDC, що полягають у введенні тваринам терапевтично ефективної кількості описаної тут імуногенної композиції або вакцини. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути отримані у різних формах у залежності від шляху введення. Наприклад, імуногенні композиції та вакцини можуть бути отримані у вигляді стерильних водних розчинів або дисперсних систем, прийнятних для ін'єкційного застосування або у ліофілізованому стані з застосуванням способів сублімаційного сушіння. Ліофілізовані імуногенні композиції та вакцини звичайно зберігають при 12 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біля 4 °C та потім вони можуть бути відновлені у стабілізуючому розчині, наприклад, у сольовому розчині або HEPES, з ад'ювантом або без нього. Імуногенні композиції та вакцини також можна отримати у формі суспензій або емульсій. Імуногенні композиції та вакцини заявленого винаходу містять терапевтично ефективну кількість одного або декількох вищеописаних мікроорганізмів. Очищені віруси та/або бактерії можна застосувати безпосередньо у імуногенній композиції або вакцині або можуть бути додатково ослаблені або інактивовані. Звичайно, імуногенна композиція або вакцина містить 2 12 3 11 біля 1×10 -1×10 вірусних або бактеріальних частинок або біля 1×10 -1×10 частинок або біля 4 10 5 9 6 8 1×10 -1×10 частинок або біля 1×10 -1×10 частинок або біля 1×10 -1×10 частинок. Точна кількість мікроорганізмів у імуногенній композиції або вакцині, що буде ефективною для надання захисного ефекту може бути визначена досвідченим фахівцем. Пертактиновий антиген є присутнім у кількості біля 1-30 мкг та, більш особливо, у кількості біля 5-20 мкг, ще переважніше у кількості біля 7 мкг - 15 мкг та навіть більш особливо у кількості біля 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг або 20 мкг. Імуногенні композиції та вакцини звичайно містять ветеринарно прийнятний носій об'ємом біля 0.5-5 мл. У іншому втіленні, об'єм носія дорівнює біля 1-4 мл або біля 2-3 мл. У іншому втіленні, об'єм носія дорівнює біля 1 мл або біля 2 мл або біля 5 мл. Ветеринарно прийнятні носії, прийнятні для застосування у імуногенній композиції та вакцині може бути будь – яким з вищеописаних. Фахівець у цій галузі може легко визначити, чи потребує вказаний вірус або бактерія ослаблення або інактивації перед введенням. У іншому втіленні заявленого винаходу, вірус або бактерія може бути введена тварині безпосередньо без додаткового ослаблення. Кількість терапевтично ефективного мікроорганізму може відрізнятися в залежності від окремого застосованого мікроорганізму, стану тварини та/або ступеню інфекції та може бути визначена досвідченим фахівцем. У відповідності зі способами заявленого винаходу, тваринам може бути введена одинична доза або, альтернативно, можуть мати місце дві або більше інокуляції з інтервалами біля 2-10 тижнів. Також може бути потрібним застосування режимів бустингу та режим дозування може бути відрегульований для забезпечення оптимальної імунізації. Фахівець у цій галузі зможе легко визначити оптимальний режим введення. Імуногенні композиції та вакцини можуть бути введені безпосередньо у кровотік, у м'яз, внутрішній орган або під шкіру. Прийняті засоби для парентерального введення охоплюють внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньом'язове та підшкірне введення. Прийнятні пристрої для парентерального введення охоплюють голки (в тому числі, мікроголки) ін'єктори та безолкові ін'єктори. Препарати для парентерального введення звичайно є водними розчинами, що можуть містити наповнювачі, як-то солі, вуглеводи, білки та буферні агенти (переважно з pH біля 3-9 або біля 4-8 або біля 5-7.5 або біля 6-7.5 або біля 7-7.5), але, у деяких випадках, вони можуть бути більш зручніше отримані у вигляді стерильного безводного розчину або у сухому стані для застосування у поєднанні з прийнятним засобом доставки, як-то зі стерильною, апірогенною водою або сольовим розчином. Отримання препаратів для парентерального введення у стерильних умовах, наприклад, шляхом ліофілізації, може бути легко здійснено за допомогою добре відомих фахівцям стандартних фармацевтичних технічних прийомів. Розчинність матеріалів, застосованих для отримання розчинів для парентерального введення можна збільшити шляхом застосування відомих досвідченому фахівцю відповідних способів отримання, як-то шляхом включення агентів, що збільшують розчинність, в тому числі буферів, солей, поверхнево-активних речовин, ліпосом, циклодекстринів тощо. Композиції для парентерального введення можуть бути отримані для негайного або модифікованого вивільнення. Препарати з модифікованим вивільненням охоплюють препарати з затриманим, сталим, імпульсним, контрольованим, цільовим та програмованим вивільненням. Отже, імуногенні композиції та вакцини можуть бути отримані у твердому, напівтвердому або тиксотропному рідкому стані для введення у вигляді імплантованого депо для забезпечення модифікованого вивільнення імуногенних композицій та вакцин. Інші засоби введення імуногенної композиції або вакцини охоплюють доставку за допомогою мікроголки або шляхом безголкової (наприклад, Powderject™, Bioject™ тощо) ін'єкції. У випадках застосування підшкірної або внутрім'язової ін'єкції бажаним є ізотонічний препарат. Головним чином, ізотонічні домішки можуть охоплювати хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт та лактозу. В окремих випадках застосовують ізотонічні розчини, як-то забуферений фосфатом фізіологічний розчин. Додатково, препарати можуть містити 13 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стабілізатори, як-то желатин та альбумін. У деяких втіленнях до препарату також додають судинозвужувальний засіб. Фармацевтичні препарати відповідно до заявленого винаходу звичайно надають в стерильному та апірогенному стані. Однак, фахівцям добре відомо, що препарати фармацевтично прийнятних носіїв є фармацевтичними носіями, затвердженими постановами, прийнятими Департаментом сільського господарства США або еквівалентним урядовим агентством в інших країнах, як-то як Канада чи Мексика, або у будь-який з європейських країн для будь-якої вакцини для собак, поліпептидних (антигенних) субодиничних імуногенних композиції та вакцин, рекомбінантних вірусних векторних вакцин та ДНК - вакцин. Отже, фармацевтично прийнятний носій для промислового виробництва імуногенних композиції або вакцин є носієм, який вже є затвердженим або буде затверджений відповідною державною установою у Сполучених Штатах Америки або у іншій державі. Також імуногенні композиції та вакцини можуть бути додатково змішані з фармацевтично прийнятним ад'ювантом. У деяких препаратах імуногенних композицій та вакцин, імуногенні композиції або вакцини поєднують з іншими собачими імуногенними композиціями або вакцинами для отримання полівалентного продукту, що може захистити собаку проти широкого спектру захворювань, викликаних іншими собачими патогенами. Описані тут імуногенні композиції можуть запобігти зараженню собаки собачим респіраторним патогеном або CIRDC на період, що дорівнює біля трьох місяців або більше. Композиції можуть запобігти зараженню вказаного собаки вказаним собачим респіраторним патогеном або CIRDC на період, що дорівнює біля шести місяців або більше. Композиції можуть запобігти зараженню вказаного собаки вказаним собачим респіраторним патогеном або CIRDC на період, що дорівнює біля одного року. Природу та ступінь викликаних у тварин імунних відповідей можна оцінити за допомогою багатьох способів. Наприклад, можна зібрати сироватку з інокульованих тварин та дослідити її на присутність або відсутність антитіл, специфічних до імуногенів. Виявлення відповіді цитотоксичних T- лімфоцитів (CTL) у лімфоїдних тканинах, що свідчить про індукцію клітинної імунної відповіді, можна отримати шляхом аналізів, наприклад, проліферації T - клітин. Відповідні способи добре описані у науковій літературі. Оскільки може бути бажаним введення імуногенної композиції або вакцини у комбінації з додатковими композиціями або сполуками, наприклад, для лікування певного захворювання або стану, це знаходиться в межах обсягу даного винаходу, куди імуногенні композиції або вакцини можуть бути легко включені або можуть знаходитися у вигляді набору, прийнятного для введення або спільного введення композицій. Отже, набори, що охоплюються заявленим винаходом можуть містити одну або декілька окремих фармацевтичних композиції, де принаймні одна з них є імуногенною композицією або вакциною відповідно до заявленого винаходу та засоби для окремого зберігання вказаних композицій, як-то контейнер, розділена пляшка або розділений пакет з фольги. Прикладом такого набору є шприц та голка тощо. Набір заявленого винаходу є особливо прийнятним для введення різних форм дозування, наприклад, для перорального або парентерального введення окремих композицій з різними інтервалами дозування або для порівняльного титрування окремих композицій між собою. Для сприяння введенню композиції, що охоплюється заявленим винаходом, набір звичайно містить керівництво по введенню. Інший набір, що охоплюється заявленим винаходом може містити один або декілька агентів, корисних для визначення інфікованих тварин. Набір може містити агенти для аналізу зразка на наявність цілих мікроорганізмів, поліпептидів, епітопів або полінуклеотидних послідовностей. Наявність вірусу, бактерії, поліпептидів або полінуклеотидних послідовностей може бути визначена за допомогою антитіл, ПЛР, гібридизації та інших способів визначення, відомих фахівцям. Інший набір, що охоплюються заявленим винаходом може передбачати реагенти для визначення антитіл проти певних епітопів. Такі реагенти є корисними для аналізу зразка на присутність антитіл та добре відомі та доступні фахівцям в даній галузі. Наявність антитіл може бути визначена за допомогою стандартних способів визначення, що також відомі фахівцям в даній галузі. У певних втіленнях, набори можуть містити ще набір надрукованих інструкцій або етикетку, яка вказує на те, що набір є корисним для визначення інфікованих тварин. Антитіла можуть бути моноклональними, поліклональними або рекомбінантними. Антитіла можуть бути отримані проти імуногену або його частини. У якості імуногену, наприклад, може бути виділено та застосовано синтетичний пептид або пептид, отриманий рекомбінантним шляхом за допомогою технологій клонування на основі амінокислотної послідовності імуногену або продукту природного гену та/або його частин. Імуногени можна застосувати для 14 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 продукування антитіл за допомогою добре відомої фахівцям стандартної технології отримання антитіл. Фрагменти антитіл, що охоплюють Fab, F(ab') 2, та Fv також можна отримати з антитіл за допомогою відомих фахівцям способів. При виробництві антитіл, за допомогою стандартних відомих в цій галузі імунологічних способів можна здійснити перевірку на бажане антитіло. Найбільш бажаними прийнятними типами імуноаналізу є добре відомі фахівцям способи ІФА та Вестерн - блот аналізу, у яких можна застосовувати як поліклональні, так і моноклональні антитіла. Антитіло може бути зв'язано з твердим підтримуючим субстратом, кон'юговане з функціональною групою, яку можна визначити або бути водночас зв'язаним та кон'югованим, як це добре відомо у цій галузі. Прикріплення антитіл до твердого підтримуючого субстрату також добре відомо у цій галузі. Прийнятні для застосування у заявленому винаході функціональні групи, що піддаються визначенню охоплюють, але без обмеження, флуоресцентний, металічний, ферментативний та радіоактивний маркери, як-то біотин, золото, феритин, лужну фосфатазу, бета - галактозидазу, 14 пероксидазу, уреазу, флуоресцеїн, родамін, тритій, C, та йодування. Заявлений винахід ілюстровано нижче наступними прикладами, що не мають обмежувального характеру. Приклади. Приклад 1. Аналіз вакцин, що містять вірус CRCoV. У дослідженнях приймали участь шістдесят 8 – 9 тижневих собак – гончаків з добрим загальним станом здоров'я. Після прибуття та на -2 або -1 день досліджень всі тварини пройшли перевірку фізичного стану. Загальний стан здоров'я тварин перевіряли щоденно раз на день, починаючи з дня прибуття тварин (-8 день досліджень) до 39 дня досліджень. Тимпанальні температури збирали, починаючи з -1 дня досліджень перед вакцинацією. Зразки крові (приблизно 5 мл) для серологічного аналізу збирали у пробірки для відокремлення сироватки (SST tubes) у 0 та 21 дні досліджень перед кожною вакцинацією. Вакцинний штам CRCoV отримали зі штаму CRCoV.669, що зберігається у ATCC під назвою PTA-11444 відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Вакцинний штам CIV отримали зі штаму, що зберігається у ATCC під назвою PTA-7694. Ізоляти CPIV та CAV-2 отримали з вірусних посівів, застосованих для отримання вакцин вакцинної лінії Vanguard® (Pfizer). Антигени отримали при найвищих пасажах вірусу (Master Seed Virus+5). Вакцинні композиції містили ад'ювант, що мав у своєму складі Quil А (20 мкг), холестерин (20 мкг), диметил діоактодецил амонію бромід (DDA; 10 мкг) та Carbopol® (поліакрилову кислоту; 0.05 % у обсяговому співвідношенні). Антиген CRCoV був отриманий у кількості 1.3 відносних антигенних одиниць (RAU) на дозу. Експериментальні вакцини були перевірені на стерильність. У якості матеріалу для інфікування дослідники застосували гетерологічний ізолят CRCoV (штам "Max"; пасаж 1). Вихідний матеріал вірусного штаму розмножили та відтитрували у 7.1 клітинах HRT18G та його титр сягав 10 ЦПД50 / мл. Цей матеріал інфікування перевірили з підтвердженням задовільності на стерильність та відсутність мікоплазми або собачих/кошачих чужорідних агентів. Одну тварину вакцинували на 21 день досліджень; всіх позосталих тварин вакцинували на 22 день досліджень. Вакцинацію тварин відповідною вакциною або плацебо проводили підшкірно згідно з планом досліджень, наведеним у Таблиці 1. Першу вакцинацію тваринам робили у ділянку правого плеча (0 день досліджень) та другу вакцинацію - у ділянку лівого плеча (22 день досліджень). 15 UA 110504 C2 Таблиця 1 План досліджень. 1 Група Т01 Т02 Т03 Т04 Т05 Т06 IVP плацебо, підсилене ад'ювантом QuilA/холестерин /DDA/Carbopol плацебо, підсилене ад'ювантом (QC/DC) CRCoV/CIV/CPIV/CAV2 (QC/DC) CRCoV/CIV/CPIV/CAV2 (QC/DC) моновалентна RTU CRCoV (QC/DC; емульгована) моновалентна RTU CRCoV (QC/DC; емульгована) N Вакцинація дні шлях дослідвведення жень 2 Інфікування день досліддоза жень 10 Розтин день досліджень 46 10 56 6 10 0 та 22 підшкірно 42 10 ЦПД50 46 10 56 10 46 10 56 1 Дослідницький ветеринарний продукт (IVP) вводили підшкірно (SC). Для інфікування застосували дозу ізоляту CRCoV Max (пасаж 1), яку вводили інтраназально. RTU – готова для застосування рідка вакцина 2 5 10 15 20 25 30 Після першої вакцинації тварин щоденно спостерігали (з першого по восьмий день досліджень) на наявність ін'єкційних набряків після вакцинації. Після другої вакцинації, на 29 день досліджень, тварин також щоденно спостерігали на наявність ін'єкційних набряків після вакцинації. Для тварин, що мали набряк у місці ін'єкції / біль, крім днів, зазначених вище, спостереження проводили ще двічі на тиждень до зникнення набряку/болю. Тимпанальні температури вимірювали щоденно протягом одного тижня після кожної вакцинації. Зразки крові (приблизно 8 мл) для серологічного аналізу збирали у пробірки для відокремлення сироватки (SST tubes) на 42 день досліджень перед інфікуванням. Тимпанальні температури вимірювали на 40, 41 та 42 день досліджень перед інфікуванням. Також, на 42 день досліджень перед інфікуванням, з кожного собаки зібрали два типи ротоглоткових мазків (VTM (вірусне транспортне середовище) для отримання вірусу та Amies для отримання бактерій). Для визначення вихідних значень, на 40, 41 та 42 день досліджень перед інфікуванням тварин раз на день спостерігали на наявність клінічних ознак респіраторного захворювання. На 42 день досліджень, всіх тварин інтраназально (IN) інфікували вірусом CRCoV з 6 цільовою дозою інфікування у 10 / мл / собаку. Перед інфікуванням всім тваринам дали заспокійливі ліки у вигляді внутрішньовенної ін'єкції препарату Domitor®. Після цієї процедури, кожній тварині ввели по 1.0 мл вірусу для інфікування шляхом повільного введення приблизно по 0.5 мл у кожну ніздрю за допомогою шприца без голки. Після цього введення, седативний стан у тварин був скасований шляхом внутрім'язової ін'єкції препарату Antisedan®. Вимірювання тимпанальних температур, клінічні спостереження та збирання ротоглоткових мазків проводили щоденно після інфікування з 42 по 56 день досліджень. Зразки крові (приблизно 5 мл) для серологічного аналізу збирали на 46 та 56 день досліджень (перед розтином). Під час розтину, легені (повністю) та трахею асептично відокремили, перенесли на стерильну серветку, долі легенів загальним чином дослідили на наявність легеневих уражень (ущільнень) та був обчислений відсоток ущільнень у кожній долі легенів. Один набір легенів мав неприйнятну кровотечу та не був досліджений. Трахею розрізали, порожнину трахеї дослідили на наявність очевидної патології та будь - які знахідки були занотовані. Після перевірки легенів, праву хвостову легеневу долю промили приблизно 30.0 мл середовища для наступного бактеріологічного аналізу та отримання вірусу. З трахеї та носової порожнини вилучили пару зразків тканини, де один зразок застосували для отримання вірусу, а 16 UA 110504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 другий - для гістопатологічних досліджень. Праві головні легеневі долі розділили на три зразка, де один був призначений для бактеріологічної перевірки. Кров для серологічних досліджень збирали у заздалегідь визначені дні дослідження. В результаті IFA – тестування (застосування непрямого флуоресцентного аналізу антитіл) було підтверджено, що перед нульовим днем досліджень всі тварини були негативними до антитіл (титр ІФА