Спосіб виготовлення тест-системи для серологічної експрес-діагностики туберкульозу

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме фтизіатрії та пульмонології, стосується діагностики туберкульозу та ди ференціальної діагностики неспецифічних захворювань органів дихання (НЗОД). За останні роки в Україні визначається зростання захворюваності населення на туберкульоз (з 32 на 100 тис. населення в 1991 році до 35 на 100 тис. населення в 1992 році) [Фещенко Ю.І., 1993]. Проте проблема ефективної і своєчасної діагностики цього захворювання залишається невирішеною. Сучасна діагностика туберкульозу грунтується на комплексі клініко-рентгеноло-гічних, Інструментальних та бактеріологічних обстежень пацієнтів, що пов'язано з втратою коштів, часу та травматизацією хворих [Фреур П., 1992, National Institute of Health, 1988, Rieder H.L, 1989). За останні роки збільшилась кіслькість захворювань, викликаних атиповими штамами мікобактерій, появою поєднаних перебігів туберкульозу Із СНІДом, НЗОД, раком легень та Ін., що також утруднює верифікацію діагнозу (Глургиева О.Х., 1992, Harries A.D., 1990). Отже, пошук І впровадження нових методів діагностики туберкульозу, а також розробка на їх основі діагностичних тест-систем є актуальним і необхідним. Як прототип обраний спосіб одержання туберкульозного діагностикуму, що включає культивування мікобактерій туберкульозу, виділення і очистку фосфатидного антигену з мікробної маси ацетоном і метанолом, випарювання до появи осаду, обробку хлороформом з послідуючою сенсібілізацією ним сорбенту (еритроцитів барана) з розрахунку 0,4-1,0 мг антигену на 1 мл 10% суспензії еритроцитів [Авт.св. СССР № 1069788]. Але відомий спосіб не дозволяє отримати діагностикум, що відповідає сучасним вимогам: висока чутливість та специфічність, максимальна ефективність та інформативність, а також експресність та простота виконання. В основі винаходу лежить завдання розробити діагностичну тест-систему для визначення активного туберкульозу легень на основі реакції аглютинації латексу (РАЛ), що характеризується всіма више вказаними параметрами. Поставлене завдання досягається шляхом сенсибілізації карбоксильованих полістирольних частинок латекса антигенними детермінантами мікобактерій туберкульозу. Діагностична цінність створеноїтест-системи, її чутливість та специфічність значно вище від інших методів, що застосовуються у фтизіопульмонологічних установах. Згадана тест-система та спосіб її одержання в літературі не описані. Спочатку одержують антигенні детермінанти з мікобактерій туберкульозу: - протеїнові антигени (туберкуліни): а) туберкулін В, виділений з концентрованих фільтратів мікобактерій Mycobacterium tuberculosis Dt/St та M.bovis Vallee; б) туберкулін BCG - з фільтратів M.bovis BCG; - фосфатидний антиген Із суміші мікробної маси штамів Dt/St і Vallee; - полісахаридний антиген із суміші мікробної' маси штамів Dt/St і Valtee. Приклад. Джерелом одержання препаратів туберкуліну служать концентровані фільтрати різних штамів туберкульозних мікобактерій. Культивування мікобактерій проводять 8 тижнів на середовищі Павловського, потім стерилізують в автоклаві, змішують поштамно з матрасів в бутель. Вміст бутлів фільтрують через фільтрувальні пластини, потім проводять ультрацентрифугування через мембрани оцтово-кислого коллодія, при цьому концентрують приблизно в 10 разів. З цього "згущеного" концентрованого фільтрату одержують туберкулін. До фільтрату додають ТХО (три хлороцтова кислота) до 6% кінцевої концентрації. Надосад-кову рідину зливають, осад центрифугують і промивають 3-4 рази 10%-ною ТХО, центрифугують після кожного промивання. Розчин ТХО беруть в кількості приблизно рівній по відношенню до опресованого центрифугуванням осаду. Осад 2 рази промивають 96% етиловим спиртом для видалення ТХО, потім 5 разів обробляють ефіром, після чого поміщають в ексикатор на СаСІ2 на 3-4 доби для повного видалення ефіру і вологи. Одержання фосфатидного антигену: Для цього на 50 г мікробних клітин, висушених ацетоном, додають 0,5 л метанолу І струшують при 37°С на протязі 5 год., після чого мікробні клітини відділяють центрифугуванням, операцію заливки метанолом повторюють. Метанольні екстракти першого і другого вилучення об'єднують і поміщають у вакуум-сушильну ша фу, в якій проводять випарювання метанольного екстракту до появи осаду фосфатидного антигена. Випарювання краще проводити при розрідженні 0,8-0,6 кгс/см 2 і температурі 48-52°С. Випарювання до 1/3 вихідного об'єму метанольного екстракту доста тньо для випадення осаду фосфатидного антигена без співосадження домішок. Утворений осад фосфатидного антигену відділяють центрифугуванням і розчиняютьв хлороформі. До цього розчину додають два об'єми ацетону для осадження фосфатидного антигену і висушують у вакуумексикаторі. Одержання полісахаридного антигену: До наважки сухи х мікробних клітин (1 г) додають рівну по вазі кількість дистильованої води. Біомасу розтирають зі спиртовим розчином b-нафтолу. Кількість b-нафтолу має складати 1/2 частину (по вазі) на одну вагову частину сухи х мікробних клітин. В процесі розтирання в фарфоровій ступці спирт вивітрюється, b-нафтол випадає в осад. Для запобігання цього процесу до суміші мікробної маси і /3-нафтолу додають спирт І продовжують розтирання до одержання гомоненної' маси. Потім цю масу поміщають в термостат при 37°С на 24 год, при цьому ступку щільно закривають для запобігання висихання клітин. Антиген екстрагують дистильованою водою при температурі 50°С, яку додають з розрахунку 3% кінцевої концентрації b-нафтолу. С уміш знову поміщають в термостат при 37°С на 48 год, потім центрифугують при 3000 об/хв 30 хв, надосадкову рідину (екстракт) збирають, осад мікробних клітин знову заливають дистильованою водою при 50°С і проводять другу екстракцію. Надосадкові рідини першої і другої екстракцій з'єднують і додають три об'єми етанолу при рН 4,5. Осад полісахариду відділяють центрифугуванням, потім три рази промивають 96% етанолом (кожного разу центрифугуючи в тому ж режимі) і три рази ефіром, далі сушать в термостаті прм 37°С до повного видалення ефіру і вологи. Далі проводять сенсибілізацію латексів отриманими антигенними детермінантами, В якості носіїв використовують карбокси-льовані латекси виробництва НДІ систетичного каучуку Ім.Лєбєдєва (м.СанктПетербург). Приклад, Готують 3% суспензію латекса на гліциновому буфері рН 8,1 (0,75% розчин гліцерину в 1 % розчині NaCI), безпосередньо перед додаванням розчину антигена. Розчин антигенів готують на тому ж буфері з розрахунку того, що в готовому препараті концентрація протеїнових і полісаха-ридних антигенів мас складати 500 мкг/мл, а фосфатидного 250 мкг/мл. Причому фосфа-тидний антиген - тяжкорозчинний і його треба розчинятия на магнітній мішалці з підогрівом до 56°С. Далі з'єднують розчини латекса і відповідного антигену у співвідношенні 1:1 і проводять сорбцію на магнітній мішалці при температурі 38°С на протязі 2 год. Після сенсибілізації сорбовані відповідними антигенними детермінантами зразки латексів осаджують на центрифузі при 3000 об/хв при температурі (6 ± 2)°С на протязі 10 хв. Надосадкову рідину обережно зливають і до осадку додають 5-ти кратний об'єм гліцинового буферу рН 8,1 з додаванням 0,9 г NaN31 1 г БСА (бичий сироватковий альбумін) на 1 л буферної суміші (склад вказано вище), струшують на протязі 15 хв і осаджують на центрифузі в тому ж режимі на протязі 20 хв. Процедуру відмивки повторюють ще раз, осад сорбованих латексів ресуспендують до вихідного об'єму. У відповідності з методикою приготовано по три серії кожного з антигенних туберкульозних латексних препаратів (ЛП). Проведено лабораторне вивчення їх активності з гіперімунними кролячими сироватками до двох штамів мікобактерій Dt/St τ Vallee (табл.1). Специфічність отриманих латексних препаратів перевіряли в РАЛ з гіперімунними кролячими сироватками до шігел Зонне, Флекснер 1-5, 6, сальмонел (основних гр уп) до рецепторів 2; 4; 61t· 62; 9; 12: 3,10, а також до ієрсіній псевдотуберкульозу, кишкового ієрсініозу сероварів 03 і 09 в розведеннях від 1:4 до 1:32. Було показано, що ні з однією з перерахованих сироваток зі всіма серіями туберкульозних латексних препаратів не було відзначено перехресних реакцій в жодному розведенні. Для визначення діагностичної цінності розробленої тест-системи, аналізували в РАЛ сироватки хворих як з різними формами туберкульозу (175 чол.), так і неспецифічними захворюваннями органів дихання (80 чол.) та у практично здорових осіб (50 чол,). Встановлені діагнози були підтверджені результатими клінікорентгенологічних та бактеріологічних досліджень. Для порівняння ефективності створеної діагностичної тестсистеми використовували комерційний ΡΗΓΑ-набір з фосфатидним антигеном виробництва Санкт-Петербугського НДІ вакцин і сироваток (табл.2). Результати РАЛ фіксували по останньому розведенню сироватки (від 1:4 до 1:2048), в якому ще спостерігалась аглютинація, а середні титри у відповідних групах виводились, як середнє арифметичне від суми титрів сироваток до відповідних антигенів. Із наведених даних видно, що у хворих на активний туберкульоз високі титри відповідних антитіл при використанні ЛП з туберкуліном В: Вони коливались від 1:1028 до 1:32. Це відзначено у 97,5% хворих. В цей же час при НЗОД 10% хворих цей показник дорівнював 1:2 І не відрізнявся суттєво від результатів обстеження здорових осіб. Треба відмітити, що дещо ви щі ніж середні титри в РАЛ з полісахаридним та фосфатидним антигенами відзначались у хворих з фіброзно-кавернозним туберкульозом, у яких процес був застарілим, довготривалим, запущеним, що вказує на те, що антитіла до цих антигенів з'являються на пізніх стадіях захворювання, а це теж має неабияке діагностичне значення. Таким чином, можна зробити висновок про високу інформативність запропонованої тест-системи для діагностики туберкульозу та диференціальної діагностик НЗОД. Доведено також значні переваги опрацьованої діагностичної тест-системи над РНГАнабором. Таким чином, запропонована тест-система, створена на основі чотирьох антигенів мікобактерій (туберкулінів В І БЦЖ, полісахаридного і фосфатидного) характеризується високою чутливістю та специфічністю, Виготовлення нової тест-системи не потребує великих затрат, економічно вигідне в умовах повної відсутності вітчизняних діагностичних наборів та необхідності затрат значних валютних кошті в для закупівлі за кордоном. Методика постановки РАЛ відповідає всім вимогам експресності та не потребує спеціальних приладів. Нова тест-система може бути запропонована для використання в практичній медицині для експрес-діагностики туберкульозу.