Спосіб визначення метилмалонової кислоти в сечі

Спосіб визначення метилмалонової кислоти в сечі, що передбачає пропускання 1мл сечі через 3 21606 кислота, креатинін, аскорбат тощо), що перешкоджають подальшому визначенню ММА. Це досягається способом, що передбачає пропускання 1мл сечі через іонообмінну колонку з сильноосновною іонообмінною смолою DOWEX 1´4, елюацію ММА з наступним проведенням кольорової діазореакції, який відрізняється тим, що в якості елюенту використовують 2М розчин хлориду натрію (NaCl), далі очищують елюат активованим вугіллям і здійснюють спектрофотометрію фінального розчину при 620нм відносно контролю на реактиви. Спосіб здійснюється таким чином: 1мл сечі, з величиною рН попередньо доведеної до 6,5, пропускається крізь іонообмінну колонку (d=6мм), до якої було вміщено 600мг сильноосновної аніонообмінної смоли DOWEХÒ 1´4, Сl form strongly basic (SIGMA-ALDRICH) з розміром гранул 50-100mesh. Висота шару смоли повинна складати 25-30мм. Після пропускання сечі через колонку смола промивається 30мл дистильованої води. Далі сорбована на смолі ММА елююється 10мл 2М розчину NaCl. До елюату додають 375мг активованого вугілля (подрібнений фармакопейний препарат, розмір частинок менше 1мм), одержану суспензію перемішують протягом 10хв., після чого активоване вугілля відокремлюють центрифугуванням при 1500об/хв впродовж 30 хвилин. Готують діазореагент додаванням 8мл 0,5% розчину нітриту натрію (NaNO2) до 30мл 5,4мМ розчину пара-нітроаніліну (75мг пара-нітроаніліну на 100мл 0,2М HСl). Після витримування при кімнатній температурі протягом 15хв., суміш охолоджують на льоду до 2-6ºС, далі до неї додають 8мл 0,2М розчину ацетату натрію. Стандартні розчини готують розведенням наважки ММА (Meth ylmalonic acid, 99%, SIGMA) у 2М розчині NaCl до концентрації 0,5мг/мл з подальшим розведенням 2М розчином NaCl до концентрацій 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2мг/мл. 1мл елюату або стандартного розчину перемішують з 1,5мл 1М ацетатного буфера рН=4,3. Далі до суміші додають 1,5мл холодного діазореагенту, пробірку закорковують для запобігання контакту з вуглекислотою (СО2) атмосферного повітря, ретельно перемішують і поміщають до водяної бані на 30 хвилин при 37°С. Потім до суміші додають 1мл 3М розчину гідроксиду натрію (NaOH), вільного від карбонатів. Після додаткової інкубації при 37°С протягом 30 хвилин вимірюють оптичну густину розчину (ММА з діазотованим паранітроаналіном в лужному середовищі спричинює ізумрудно-зелений колір) на шкальному спектрофотометрі типу ЛОМО-26 при довжині хвилі світла 620нм в кюветі товщиною 10мм відносно контролю на реактиви (1мл дистильованої води, який обробляють за аналогічною методикою). На основі визначень оптичної густини стандартних розчинів будують калібрувальний графік, за яким визначають концентрації ММА в дослідних розчинах, враховуючи розведення в ході аналізу (з 1мл сечі утворюється 10мл елюату). Слід зауважити, що хімічні реакції, які відбуваються в ході визначення ММА, є чутливими до зовнішніх факторів, зокрема температури в приміщенні. Міжсерійні коливання можуть складати до 20% в обидві боки від певних 4 середніх значень. Саме тому обов'язково при кожній серії визначень відтворювати градуіровочну шкалу. Залежність оптичної густини (D) фінального розчину від концентрації ММА (С) добре описується рівнянням типу D= Dmax × k × C 1 + k ×C Вище вказана залежність в обернених координатах 1 æ1ö = f ç ÷ являє собою пряму лінію, що D èCø значно полегшує математичну обробку експериментальних даних. Метод дозволяє вимірювати концентрацію ММА в сечі від 3мкг/мл та вище. В тих випадках, коли кількість ММА в сечі (uММА) перевищує 300мг/л, повторно змішують елюат з ацетатним буфером і діазореактивом, проте замість 1мл беруть елюату в 10 разів менше і доводять об'єм до 1мл 2М розчином хлориду натрію (NaCl), а при розрахунку концентрації враховують розведення. Вміст креатиніну в сечі (uСrеа) визначають за реакцією з пікриновою кислотою у лужному середовищі. Далі знаходять співвідношення ММА до відповідних концентрацій креатиніну (uMMA/uCrea ratio) в кожному зразку сечі. uMMA/uCrea ratio нижче ніж 20мг/г розглядають як ознаку оптимального забезпечення організму вітаміном В12, в межах 20-25мг/г як ознаку субнормального статусу, а понад 25мг/г - як дефіцит вітаміну В12. Приклад Хвора В., 69 років перебувала на стаціонарному лікуванні в гематологічному відділенні Вінницької обласної лікарні ім. M.I. Пирогова з діагнозом: Вітамін В12 дефіцитна анемія, вкрай тяжкого ступеню. Фунікулярний мієлоз по типу сенситивної атаксії. Анемічна кардіоміопатія, НК ІІА. 20.05.2005 до початку застосування цианокобаламіну у хворої здійснено забір зразка ранкової сечі, який було заморожено. Після відтаювання і центрифугування, 1мл сечі пропущено крізь іонообмінну колонку з наступним елююванням 2М розчином НСl, оборобкою елюату активованим вугіллям, проведенням кольорової діазореакції в процесі якої отримано ізумрудно-зелений колір фінального розчину, оптична густина якого відносно контролю на реактиви склала 0,288. При відповідних перерахунках встановлено, що uММА дорівнює 254,82мг/л. В подальшому визначено, що вміст uCrea та uMMA/uCrea ratio склали 0,58г/л та 436,95мг/г. Отже, розвиток клінічних ознак фунікулярного мієлозу у хворої був підтверджений сечовою екскрецією ММА, що значно перевищувала нормальні значення, адже відомо, що саме ММА спричинює демієлінізацію нервових стовбурів з розвитком специфічних неврологічних розладів при Віздефіцитній анемії. Через 8 тижнів застосування цианокобаламіну при повторній перевірці сечової екскреції ММА, виявлено її повну нормалізацію (uММЛ, uСrеа та uММЛ/uСreа ratio склали 21,09мг/л, 1,12г/л та 18,76мг/г відповідно), а при клінічному обстеженні - поступову регресію неврологічних ознак. Таким чином, запропонована корисна модель «Спосіб визначення метилмалонової кислоти в 5 21606 сечі», що завдяки обробці елюату активованим вугіллям призводить до повної адсорбції на вугіллі заважаючи домішок з сечі (причому ММА на вугіллі практично не сорбується), які взаємодіють з діазо Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 6 реагентом в лужному середовищі, підвищує точність дослідження та дає можливість вимірювати оптичну густину фінального розчину на відносно чутливи х шкальних спектрофотометрах. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601