Hатрійhа сіль флуореhілідеhгідразиду, яка виявляє протимікробhу дію

Винахід належить до розділу органічної хімії, до нової хімічної сполуки, а саме до натрійної солі N-(9флуоренІліден)-N’-ізонікотиногідразиду формули 1, яка виявляє протимікробну, зокрема, протитуберкульозну і антихламідійну дію щодо мікобактерій туберкульозу штаму H37Rv і хламідій штаму L2 (венерична лімфогранульома). Туберкульоз останнім часом набрав масштабів небезпечного лиха. 20 тисяч громадян України щорічно хворіють на туберкульоз і приблизно 5 тисяч осіб умирає [Фещенко Ю. Двобій з туберкульозом //Медична газета України. - 1996 лютий, - №5(97). – С.7; Фещенко Ю.І. Актуальні питання фтизіатрії та пульмонології в Україні //Український пульмоно-логічний журнал. - 1993. - №1. - С 8-10]. Відомі протитуберкульозні препарати, які ефективні у фтизіатричній практиці, належать до похідних гідразиду Ізонікотинової кислоти (ГІНК або Ізоніазид, фтивазид, салюзид, салюзид розчинний та метазид) і вже півстоліття широко використовуються для лікування різних форм туберкульозу легень та Інших органів. Найефективнішим є Ізоніазид [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1986. - Ч. 2. - С 221-226; С 246-247; С. 273-281; Маслова Л.І., Хоменко А.Г., Парновский В.Л., Калмикова Г.Н. Лекарственные препараты для лечения туберкулеза. - Информационное письмо для врачей-фтизиатров и провизоров. Львов, 1987. - 45 с]. Недоліком ізоніазиду та його похідних, за даними вітчизняних і зарубіжних авторів, є небажані побічні реакції (токсичні, алергічні і змішаного типу) у хворих [Маслова Л.І., Хоменко А.Г, Парновский В.Л., Калмикова Г.Н. Лекарственные препараты для лечения туберкулеза. - Информационное письмо для врачей-фтизиатров и провизоров. - Львов, 1987. - 45 с; Фирсова H.A. Побочное действие туберкулостатических препаратов. Минск, 1971.; Шмелев Н.А., Степанян Е.С. Побочное действие противотуберкулезных препаратов. - М., 1977.; Скакун Н.П., Шманько В. В. К вопросу о гепатотоксичности изониазида. - Проблемы туберкулеза, 1985. - №4 С. 51-54.; Munch Е., Eichelbaum М., Weng J. et al. - Klin. Nschr. - 1982. - Bd. 60. - S. 513-519]. У хіміотерапії туберкульозу має місце лікарська стійкість бактерій, зокрема, збільшення ізоніазидостійкихформ, особливо у вперше виявлених хворих [Приймак A.A., Должанский В.М., Сагалович В.Я., Ельмурзаева A.A. Тенденции в развитии лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза // Проблемы туберкулеза. - 1985. - №8. – C. 49-52]. Урогенітальні хламідіози - це група хвороб (синдромів), які викликані патогенним облігатним мікроорганізмом Chlamydia trachomatis. Вони дуже поширені і передаються статевим шляхом. За даними ВООЗ (1992) хламідійними інфекціями у світі уражено 50 млн. людей. При цьому найвищий показник розповсюдження інфекції реєструється у молодих людей віком 15-29 років. [Пирогова В.І. Проблема генітальних сексуально-трансмісивних інфекцій в акушерстві та гінекології // Автореферат дис.... докт, мед. наук. - Київ, 1995. - 42 с]. Відомі такі препарати для лікування хламідіозу: тетрациклін, окситетрациклін, еритроміцин або сульфаніламідні препарати. Недоліком цих препаратів є їх низька ефективність і велика частота побічних реакцій на організм [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1986. - Часть 1,2]. У зв'язку з викладеним вище, дуже актуальною є проблема пошуку препаратів специфічної протитуберкульозної та антихламідійної дії. Технічне завдання полягає у пошуку протимікробних засобів, зокрема, протитуберкульозної та антихламідійної дії серед похідних флуореніліденгідразидів. Поставлену задачу вирішують таким чином, що одержують натрійну сіль N-(9-флуореніліден)-N’ізонікотиногідразиду, яка виявляє протитуберкульозну та антихламідійну дію і характеризується низькою токсичністю. Сполука формули 1 у літературі не описана. Спосіб синтезу речовини формули 1 полягає у взаємодії еквімолекулярних кількостей N-(9флуоренілІден)-N-Ізонікотиногідразиду й металічного натрію у диметилформаміді. Приклад. 2.99 г (0,01 моль) N-(9-флуоренІліден)-N'- ізонікотиногідразиду розчиняють у 50,0 мл диметилформаміду при нагріванні, додають 0,23 г тонко порізаного натрію металічного і кип'ятять протягом 2 год. Потім до гарячого розчину додають при перемішуванні 100,0 мл толуолу і продовжують нагрівати ще 30 хв. Охолоджують до кімнатної температури. Викристалізований осад відфільтровують, промивають толуолом та ефіром, висушують. Одержують 3,1 г (96,6%) натрійної солі N-(9-флуоренілІден)-N’- Ізонікотиногідразиду у вигляді оранжевих кристалів, т.пл. >300°С. Знайдено, %: С 71,27; Н 3,79; N 13,26; Na 7,42; Вирахувано, %: С 71,02; Н 3,76; N 13,08; Na 7,16; C19H12N3ONa M. м 321,3173 УФ спектри в етанолі, l макс, нм: 260 (lg e 4,69), 340-345 (lg e 4,21) Найближчим структурним аналогом заявленої речовини є N-(9-флуореніліден)-N’-Ізонікотиногідразид формули 2, метод одержання якого описаний у патенті Великобританії №722679 від 26.01.55 p., але який не вивчений з точки зору утилітарних властивостей. Протитуберкульозна дія заявленої натрійної солі N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразиду вивчена щодо Мус. tuberculosis hominis H37Rv при проведенні експерименту з зависсю культури Мус. tuberculosis hominis H37Rv методом дворазових серійних розведень на густому поживному середовищі ЛевенштейнаЄнсена. Густина мікробної суспензії дорівнювала 50 млн. кл./мл. Встановлено мінімальну інгібуючу концентрацію досліджуваної нової речовини щодо штаму Мус. tuberculosis hominis H37Rv, який чутливий до протитуберкульозних препаратів. Вона становить 0 078 мкг/мл. За еталон порівняння взято найактивніший туберкулостатик ізоніазид. Порівняльні дані туберкулостатичної активності досліджуваних речовин подані в табл. 1. Результати досліджень, подані в табл. 1, свідчать про те, що нова речовина - натрійна сіль N-(9флуореніліден)-N'- Ізонікотиногідразиду - у двічі перевищує активність відомого протитуберкульозного засобу Ізоніазиду в дослідах на густому поживному середовищі Левенштейна-Єнсена. Протихламідійна активність заявленої речовини вивчена при експериментальній хламідійній інфекції (штам L2, венерична лімфогранульома) в дослідах на курячих ембріонах, які розвиваються. Зараження проводили у жовточний мішок 7-денних курячих ембріонів в дозі 10 ЛД50/емб, викликавши при цьому загибель 80% контрольних ембріонів. Досліджувану речовину вводили одночасно Із збудником в об'ємі 0,5 мл/емб. На кожну експериментальну умову використовували не менше 20 ембріонів. Термін спостереження за ембріонами становив 12 днів. Для порівняння ефективності дії використовували відомий сульфаніламідний препарат етазол-натрій, яким лікують хламідіози. Активність досліджуваної речовини оцінювали за ступенем захисту, який визначають за різницею у виживанні між дослідною і контрольною групами, а також середньою тривалістю життя ембріонів. Статистичну достовірність одержаних результатів визначено за методом Фішера-Стьюдента. Отримані результати подані в табл, 2. Дані табл. 2 свідчать про те, що заявлена речовина має протихламідійну дію, ступінь якої залежить від дози препарату. Так, одноразове її введення разом Із збудником у дозах 5,0 та 2,5 мг/емб. забезпечує повне попередження загибелі курячих ембріонів, які розвиваються (процент захисту дорівнює 90). Введення нового препарату в дозі 1,25 мг/емб. підвищувало резистентність до хламідійної Інфекції у 20% ембріонів. При тих самих умовах досліду етазол-натрій в дозі 2,5 мг/емб. викликав 40%-ий захист курячих ембріонів, які розвиваються, більш ніж у два рази нижче від відповідного показника заявленої речовини. Введення етазол-натрію в дозі 1,25 мг/емб. і нижче не проявляло протихламідійної дії. Таким чином, одержані дані свідчать про виражену антихламідійну активність нової речовини, яка при зараженні курячих ембріонів, які розвиваються (штам L2, венерична лімфогранульома) в дозі 10 ЛД50/емб, забезпечувала 90% захисту при дозах 5,0 та 2,5 мг/емб. і 20% захисту при дозі 1,25 мг/емб., що вище від аналогічного показника для етазол-натрію, який застосовується при хламідіозах. Визначення гострої токсичності нової сполуки проводили на білих безпородних мишах при внутрішньочеревному введенні 5 концентрацій препарату, приготованих шляхом дворазового розведення. Речовину розчиняли в дистильованій воді. На кожну концентрацію використовували по 10 мишей. Загибель тварин реєстрували протягом 14 днів. Розрахунок ЛД50 проводили за методом I.A. Ашмарина, A.A. Воробйова (1962). Вивчення гострої токсичності показало, що ЛД50 при внутрішньочеревному введенні становить для нового препарату 1500 мг/кг маси тварини. Верхні параметри токсичності натрійної солі N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразиду вивчено на трьох видах лабораторних тварин, а саме: білих мишах, білих щурах, морських свинках. Речовини вводили внутрішньошлунково натще в рослинній олії. Середньосмертельна доза для білих мишей, розрахована за методом пробіт-аналізу В.Б. Прозоровського становить 9660 мг/кг. Гостру токсичність натрійної солі N-(9-флуореніліден)-N’- Ізонікотиногідразиду на білих щурах і морських свинках визначали за методом Дейхмана і Ле Бланка; ЛД50 для білих щурів дорівнює 12000 мг/кг, для морських свинок - 10600 мг/кг. Результати досліджень подані в табл. 3. Результати проведених досліджень дозволяють кваліфікувати нову речовину як малотоксичну, що належить до IV класу небезпеки за ГОСТ 12.1.007-76. Перевагою натрійної солі N-(9-флуореніліден)-N'- ізонікотиногідразиду над відомими протимікробними засобами, зокрема, протитуберкульозної (ізоніазид) і антихламідійної (етазол-натрій) дії є те, що запропонована речовина виявляє високу туберкулостатичну і антихламідійну дію при низькій токсичності. Після поглибленого токсикологічного та фармакологічного дослідження натрійну сіль N-(9-флуореніліден)N'- Ізонікотиногідразиду можна рекомендувати для клінічних досліджень у різних лікарських формах (порошок, таблетки, ін'єкційні розчини). Нова речовина як засіб специфічної протитуберкульозної та антихламідійної дії замінить препарати ряду ГІНК, антибіотики-макроліди, антибіотики тетрациклінового та цефалоспоринового ряду й сульфаніламідні препарати. Вона належить до оригінальних субстанцій, які спроможна випускати хіміко-фармацевтична промисловість України.