Спосіб одержання ізольованих гепатоцитів

Спосіб одержання ізольованих гепатоцитів, який включає перфузію печінки сахарозним розчином, що містить 1мМ ЕДТА і трипсин, з наступною дезагрегацією й відокремленням цільового продукту, який відрізняється тим, що перфузію здійснюють із швидкістю 45-50 мл/хв. і у два етапи, причому на першому етапі використовують са харозний розчин, який містить тільки ЕДТА, а на другому ЕДТА і 0,02-0,03% трипсину. (19) (21) 2000052521 (22) 04.05.2000 (24) 15.05.2001 (33) UA (46) 15.05.2001, Бюл. № 4, 2001 р. (72) Бондаренко Валерій Антонович, Коптьолов Віталій Олександрович, Кудокоцева Олена Валентинівна, Лєжанін Сергій Миколайович, Середа Тетяна Петрівна (73) Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України 37910 трипсин 0,25 г/л вода бідистильована до 1 л рН 8,0 Після перфузії печінку продавлювали крізь нейлон на холоді в сахарозно-сольовому середовищі такого складу: сахароза 86 г/л КCI 0,4 г/л KH2PO4 0,06 г/л MgSO4 ·7H2O 0,04 г/л CaCl2 0,14 г/л HEPES 2,4 г/л альбумін 10 г/л вода бідистильована до 1 л рН 7,4 Після фільтрації відокремлювали життєздатні гепатоцити від пошкоджених шляхом центрифугування протягом 3 хв. при 1000 об/хв і наступного триразового центрифугування протягом 1 хв. Після відділення клітини промивали сахарозносольовим середовищем. Структурно-функціональне збереження клітин оцінювали за прикріпленням клітин у культурі [3], за прокрашуванням трипановим синім і накопиченням клітинами флуоресцеїну [4]. В табл. 1 надані результати дослідження гепатоцитів, одержаних запропонованим і відомим способами. З табл. 1 видно, що спосіб, який пропонується, дозволяє одержати гепатоцити з більш високим рівнем структурно-функціонального збереження, про що свідчить збільшення кількості клітин, здатних накопичувати флуоресцеїн. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що перфузію проводили з різними швидкостями. Результати представлені в табл. 2. Як видно з табл. 2, зменшення або збільшення швидкості перфузії призводить до різкого зниження показників структурно-функціонального збереження гепатоцитів. Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що змінювали умови проведення перфузії: 1) в один етап сахарозним розчином, що містить 0,3 г/л ЕДТА; 2) в один етап розчином, що містить 0,3 г/л ЕДТА і 0,25 г/л трипсину; 3) в два етапи розчином, що містить 0,3 г/л ЕДТА; 4) в два етапи розчином, що містить 0,3 г/л ЕДТА і 0,25 г/л трипсину; 5) відповідно до винаходу в два етапи: на першому розчином, який містить 0,3 г/л ЕДТА, на другому - 0,3 г/л ЕДТА і 0,25 г/л трипсину. Результати представлені в табл. 3. З табл. 3 видно, що проведення перфузії в 1 етап або 2 етапи, але одним і тим же розчином призводить до зниження структурно-функціонального збереження клітин. Приклад 4. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1 за винятком того, що в розчині, який використовується на другому етапі перфузії, змінювали вміст трипсину. Результати представлені в табл.4. З табл. 4 видно, що оптимальна концентрація трипсину у перфузійному розчині 0,02-0,03%. При концентрації нижче заявлюваної знижується вихід і структурно-функціональне збереження клітин, а при більш високій - втрачається здатність клітин прикріплюватися до колагенової підкладки. Джерела інформації 1. СССР, А.с. № 1310426, C12N5/00, 1987. 2. Україна, Пат. № 14519, C12N5/00, 1987. 3. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Фреони. –М.: Мир, 1989. - С. 76. 4. СССР, А.с. № 1067442, G01N33/48, 1984. Таблиця 1 Структурно-функціональне збереження гепатоцитів п=9 Показники відомий 501±90 93±8 Кількість клітин печінки, млн. Прокрашування трипановим синім, % Прикріплення клітин у культурі після 2 годин інкубації при 37°С, % Кількість клітин, що накопичують флуоресцеїн, % Спосіб одержання за винаходом 498±95 95±4 98±2 97±3 72±3 98±2 Таблиця 2 Структурно-функціональне збереження гепатоцитів залежно від швидкості перфузії п=8 Показники Кількість клітин, млн. Прокрашування трипановим синім, % Прикріплення клітин у культурі після 2 годин інкубації при 37°, % Кількість клітин, що накопичують флуоресцеїн, % Швидкість перфузії, мл/хв 45-50 516±30 15-20 443±50 80-90 301±25 65±10 95±3 11±8 57±6 98±2 5±2 49±6 97±2 3±1 2 37910 Таблиця 3 Структурно-функціональне збереження гепатоцитів залежно від умов перфузії п=5-7 Показники Кількість клітин печінки, млн. Прикрашування трипановим синім, % Прикріплення клітин у культурі після 2 годин інкубації при 37°С, % Кількість клітин, що накопичують флуоресцеїн, % Умови перфузії 3 4 407±67 539±55 1 411±80 2 503±30 5 498±95 38±9 81±5 43±19 78±11 95±4 31±8 11±3 37±11 9±8 97±3 30±9 56±12 35±11 43±21 98±2 Таблиця 4 Структурно-функціональне збереження гепатоцитів залежно від концентрації трипсину в перфузійному розчині п=7 Показники Кількість клітин печінки, млн. Прокрашування трипановим синім, % Прикріплення клітин у культурі після 2 годин інкубації при 37ºС, % Кількість клітин, що накопичують флуоресцеїн, % 0,01 299±50 Концентрація трипсину, % 0,02-0,03 511±30 0,05 507±25 45±10 95±3 85±8 39±6 98±2 0 34±6 97±2 83±11 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3