Спосіб реєстрації генотипів сорго

Спосіб реєстрації генотипів сорго, що включає аналіз ідентифікаційних ознак сорту, який відрізняється тим, що опис ідентифікаційних ознак здійснюється у вигляді формули, що відображає певний алельний склад мікросателітних локусів генотипу сорго, які досліджували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. (19) (21) u200907295 (22) 13.07.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) СИВОЛАП ЮРІЙ МИХАЙЛОВИЧ, КОЖУХОВА НАТАЛІЯ ЕДУАРДІВНА, ШЕВЧУК ГАННА ЮРІЇВНА (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР В РОСЛИННИЦТВІ УААН 3 48475 при 55°С. Додати рівний об'єм (0,6мл) суміши хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Отриману суміш центрифугувати 5хв при 14000об./хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в новий епендорф. До водної фази додати 0,5 об'єму (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадити ДНК центрифугуванням при 14000об./хв протягом 4хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Надосадну рідину злити, осад промити двічі 1мл 70% етанола - центрифугувати при 14000об./хв протягом 2хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", надосадну рідину злити. Підсушити осад при кімнатній температурі 15-20хв і розчинити в 100мкл ТЕ-буферу (10 mM Трис-НСІ рН 7,4; 1 mM Na3EDTA рН 8,0). 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5 мкл-епендорфах з 4 використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНКтехнологія", Росія). Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл містить: 50 mM KC1, 20 тМ Тріс-НСІ рН 8,4 (25 °С), 2 mM MgCl2, 0,01 % Твін-20, 0,2 тМ кожного dNTP, по 0,2 ткМ прямого і зворотнього праймерів, 20 нг ДНК і 1 одиницю ДНК-полімерази Taq. Поверх реакційного розчину нашаровувати 20 мкл мінеральної олії. Температурний режим ампліфікації такий: денатурація - 96 °С, 2 хв; ЗО циклів: 94 °С 1 хв; 55 °С ЗО сек; 72 °С 1 хв, фінальна елонгація - 72 °С, 2 хв. Аналізувати 15 мікросателітних локусів, розташованих на десятьох різних хромосомах. В таблиці наведено номенклатуру SSR-локусів та послідовність фланкуючих праймерів даних SSRлокусів. Таблиця Мікросателітні локуси сорго та послідовності фланкуючих праймерів SSR-локус (код) Sbl-1 (A) Sb4-15(B) Sb4-22 (С) Sb4-32 (D) Sb4-34 (E) Sb4-121 (F) Sb6-36 (G) Sb6-57 (H) Sb6-84 (I) Sb6-325 (J) Sb6-342 (K) Xtxp18(L) Xtxp 250 (M) Xtxp 400 (N) Xtxp 406 (O) Послідовність праймерів (5'-3') прямого зворотнього F: tсc gtt tga caa gcg ctt ata R: aaa cat cat acg agс tсa atg F: gсt gсt aag ccg tgc tga R: tta ttt ggg tga agt aga ggt gaa ca F: gtg ccg ctt tgc tсg ca R: tgc tat gtt gtt tgc ttc ctt сtc F: сtc ggc ggt tag cac agt cac R: gсc cat aga cag аса gca aag cc F: gca taa tga сgg cgt gсt с R: ctt cca agt gaa aga aac cat ca F: gaa aaa tct ccg tсa atс cca aaa taa R: cgc tga аса acg aaa gga ata agt g F: aac agс at aat gсc аса с R: tag ctt ggt aga gaa ctt get ttc F: аса ggg ctt tag gga aat eg R: cca tсa ccg tсg gca tct F: cgc tct egg gat gaa tga R: taa сgg acс act aac aaa tga tt F: gсc aag aga aac аса aac aa R: age aat gta ttt agg caa cac a F: tgc ttg tga gag tgc etc cct R: gtg aac ctg ctg ctt tga teg atg F: act gtc tag aac aac ctg eg R: ttg сtc tag сta ggc att tc F: gca cat cct eta aaa eta ctt agt R: gaa cag gac gat gtg ata gat F: eta gag acс gac gcg tgt ata gt R: gca tct ate ttc act ccg att ct F: ggc ctg aat сtc agt gtt aag R: agt tgc ctg ctt cga cac tt 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації проводити в горізонтальному "підводному" 2% і 3% агарозних гелях розміром 20,0х15,0х0,5см в приладі фірми "Hoefer Scientific Instruments" (США) в 1хТВЕ-буфері (89 mM Трис, 89тМ борна кислота, 2 mM EDTA) при 100В 4 год. за кімнатної температури. ДНК візуалізувати фарбуванням бромистим етидієм концентрацією 1мкг/мл. Гелеві пластини фотографувати з використанням світлофільтру ОС-12 в ультрафіолетовому світлі (300нм) на плівку "Мікрат - 300". Відеозображення електрофоретичних профілів ампліфікованої ДНК та оцінки довжини продуктів ампліфікації одержувати за допомогою системи документації і аналізу гелів "Image Master VDS" ("Amersham Pharmacia Biotech", OKB) згідно з інструкцією користувача обладнання. 4. Запис ідентифікаційної формули. За результатами аналізу мікросателітних локусів записати для аналізуємого генотипу характерний для нього набір алелів у вигляді формули, де латинськими літерами позначити коди досліджених локусів, а у нижніх індексах числами - розміри алелів відповідних локусам (в парах нуклеотидів). У випадку гомозиготного стану локусу вказувати довжину одного алеля. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Здійснювали ДНК-типування лінії Одеська 2111 за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів дев'яти мікросателітних локусів. Лінія Одеська 2111 є гомозиготною за всьома дослідженими локусами. Записали ДНКспектр у вигляді формули: А201 В191 С296 D186 Е134 F415 G444 Н376 І169. Приклад 2. Здійснювали ДНК-типування національного стандарту сорту Одеський 302 за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів девляти мікросателітних локусів. Записали ДНК-спектр у вигляді формули: А195 B185 C290 D177 Е128 F406 G459 Н370 І160 5 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 48475 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601