Спосіб корекції показників імунної системи у летально опромінених старих мишей лінії сва/са

Спосіб корекції показників імунної системи у летально опромінених старих мишей лінії СВА/Са, що включає трансплантацію гемопоетичних стовбурових клітин фетальної печінки мишей, який відрізняється тим, що через 3 години після летального опромінення мишей віком 20 місяців, їм вводять несортовані гемопоетичні стовбурові клітини з клітинами мікрооточення, отримані з печінки плодів мишей 13 дня внутрішньоутробного розвитку. (19) (21) u200911649 (22) 16.11.2009 (24) 12.04.2010 (46) 12.04.2010, Бюл.№ 7, 2010 р. (72) КИРИК ВІТАЛІЙ МИХАЙЛОВИЧ, БУТЕНКО ГЕННАДІЙ МИХАЙЛОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ", ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕНЕТИЧНОЇ ТА РЕГЕНЕРАТИВНОЇ МЕДИЦИНИ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ" 3 нтації несортованих гемопоетичних стовбурових клітин фетальної печінки мишей, що дозволить регенерувати імунну систему, скоригувати її функції та зберегти життя експериментальним тваринам. До даного рішення автори прийшли, досліджуючи кількісні та якісні показники імунної відповіді у лабораторних мишей лінії СВА різного віку після летального опромінення з наступною трансплантацією гемопоетичних клітин. Доведено, що дані несортовані клітини в присутності клітин мікрооточення здатні відновлювати показники імунної системи у старих летально опромінених мишей, у яких знижені регенераторні властивості імунної системи. Гемопоетичні стовбурові клітини фетальної печінки виступають в якості попередників диференційованих клітин імунної системи, а клітини мікрооточення забезпечують їх приживлення та функціонування. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі, що включає трансплантацію клітин фетальної печінки, трансплантують несортовані гемопоетичні стовбурові клітини з клітинами мікрооточення фетальної печінки мишей 13 дня внутрішньоутробного розвитку, які вводяться старим летально опроміненим мишам. Спосіб здійснюють наступним чином. Мишей-реципієнтів віком 20 місяців опромінюють за 3год. до трансплантації за допомогою рентгенологічного апарата РУМ-17 в дозі 9,0Гр, з потужністю дози 0,8Гр/хв. Вагітні самки мишей з терміном гестації 13 діб підлягають евтаназії методом цервікальної дислокації під ефірним наркозом. Термін гестації визначається від моменту виявлення копулятивної пробки у самок, відсаджених із самцями для спарювання. В стерильних умовах після обробки операційного поля 70% розчином етанолу виконують розріз черевної порожнини та препарування рогів матки. Матку відсікають в районі шийки і маткових труб та переносять в стерильну чашку Петрі з 0,9% розчином NaCl при температурі +4°С. Після первинного відмивання від крові, проводиться розсікання стінки матки та виділення плодів разом з плодовими оболонками. Плоди звільняють від плодових оболонок і плаценти в чашці Петрі, що містить 3мл поживного середовища RPMI-1640 та переносять в чисту чашку з 1мл середовища. Фетальну печінку препарують у плодів мікропінцетами, подрібнюють в середовищі RPMI-1640 шляхом пропускання через голки зменшуваного діаметру до отримання однорідної суспензії. Фракцію мононуклеарних клітин, що містить ГСК та клітини мікрооточення, виділяють шляхом центрифугування протягом 15хв. при 1500об./хв. на градієнті щільності Ficol-Paque (питома густина 1,077г/см3), відмивають в поживному середовищі, пропускають через клітинний фільтр з розміром пор 70мкм, визначають відсоток життєздатних клітин і доводять до необхідної концентрації. Вміст гемопоетичних стовбурових клітин визначають методом проточної цитометрії з використанням моноклональних антитіл до поверхневих антигенів Sca-1, c-kit, CD150, flt3 та панелі антигенів Lin. Відсоток життєздатних клітин визначають 49022 4 методом проточної цитометрії за рівнем проникнення в клітини з пошкодженою мембраною 7аміноактиноміцину. Трансплантацію несортованих гемопоетичних клітин з клітинами мікрооточення (8млн. ядровмісних клітин фетальної печінки на мишу в 100мкл поживного середовища RPMI-1640) проводять в хвостову вену. Протягом перших 10 діб після опромінення тварини отримують кип'ячену підкислену воду (1 ммоль/л НСl, рН=2,5) з вмістом окситетрацикліну в концентрації 100мг/л. Оцінку показників імунологічної реактивності у опромінених реципієнтів клітин проводять через 3 та 12 тижнів після трансплантації. Приклад Досліди проведені на 35 старих самках мишей лінії СВА/Са віком 20 місяців, які утримувались в розпліднику ДУ "Інститут геронтології АМН України" в стандартних умовах віварію на основі племінних ядер, отриманих з колекції Лабораторії експериментальних біологічних моделей РАМН. Тварин-реципієнтів опромінювали в летальній дозі 9,0Гр, з потужністю дози 0,8Гр/хв. за 3 години до трансплантації. Гемопоетичні стовбурові клітини з клітинами мікрооточення виділяли з печінки плодів 13 дня гестації за описаною методикою та вводили в хвостову вену. Частка життєздатних клітин відразу після виділення становила від 93,1% до 95,0%. В контрольній групі без трансплантації клітин фетальної печінки усі летально опромінені тварини загинули протягом 3-8 діб після опромінення. Результати експерименту оцінювали через 3 та 12 тижнів після опромінення та трансплантації клітин серед мишей, які вижили, та порівнювали з нормальними інтактними тваринами такого ж віку. Через 3 тижні після опромінення з наступною трансплантацією фетальних гемопоетичних стовбурових клітин виявлено перерозподіл субпопуляцій Т-лімфоцитів в кістковому мозку, тимусі, селезінці. Спільною рисою було зростання числа CD3позитивних клітин в порівнянні з інтактними тваринами та посилення міграційних процесів в тимусі, що особливо важливо, враховуючи роль тимуса у фізіологічному старінні організму. В тимусі виявлено стимуляцію проліферації і дозрівання клітин, більш виражену щодо ранніх дозріваючих тимоцитів. Зокрема, виявлено зростання числа ранніх попередників тимоцитів (triple negative і double negative тимоцитів) та диференційованих single positive CD4+ і CD8+ клітин при зниженні числа недиференційованих double positive тимоцитів (р