Пневмоімпульсний сепаратор зерна

Імунні/запальні реакції опосередковуються складною послідовністю взаємодій. Відомо, що однією з важливих систем при здійсненні таких взаємодій є пара CD40/gp39, що належить до систем типу «ліганд-рецептор». Взаємодія CD40/gp39 опосередковує численні важливі сигнальні реакції між активованими Т-клітинами й іншими ефекторними клітинами імунної системи, що приводить до посилення імунного/запального відгуку. Відгуки на сигнальні реакції за допомогою CD40 включають допомогу Т-клітин В-клітинам у процесі гуморального імунного відгуку, індукцію цитокінів моноцитами й експресію молекул адгезії на ендотеліальних клітинах.

CD40 належить до поверхневих клітинних рецепторів типу І і є членом родини рецепторів фактора некрозу пухлин (TNFR). Незважаючи на те, що спочатку CD40 був ідентифікований як В-клітинний антиген, сьогодні вважається, що він експресується всіма антиген-презентативними клітинами (АПК), включаючи дендритні клітини, кератиноцити і моноцити. CD40 також експресується такими типами клітин, які спроможні функціонувати як АПК у визначених умовах, наприклад судинними ендотеліальними клітинами або клітинами, залученими до прямої взаємодії з Т-клітинами, або попередниками Т-клітин, такими як епітеліальні клітини тимусу. Нещодавно було також повідомлено, що CD40 може експресуватися фібробластами, еозинофілами й активованими Т-клітинами. Показана можливість експресії CD40 також клітинами злоякісних пухлин. Підтвердження цьому спочатку було отримано шляхом ідентифікації визначених клітинних ліній, що походять від карциноми і меланоми, які були позитивними за CD40 [Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. (1986) 83; 4494-98; Schriever et al., J. Exp. Med (1989) 169:2043-58; Caux et al., J. Exp. Med. (1994) 180:1263-72; Alderson et al., J. Exp. Med. (1993) 178:669-74; Young et al., Int. J. Cancer (1989) 43:786-94; Paulie et al., Cancer Immunol. Immunother. (1985) 20:23-28; Denfeld et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:2329-34; Gaspari et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:1371-77; Peguet-Navarro et al. J. Immunol (1997) 158:144-52; Hollenbaugh et al., J. Exp. Med. (1995) 182:33-40; Galy and Spits. J. Immunol (1992) 149:775-82].

Gp39 відомий також як CD40L, TRAP, T-BAM і. нещодавно на Робочій нараді з лейкоцитарних антигенів одержав офіційну познаку CD 154. У дослідженнях in vitro gp39 виявляється на Т-клітинах приблизно через 2-4 години після активації Т-клітин і досягає пікових значень через 6-8 годин. Потім рівень білка швидко падає і стає таким, що не визначається, через 24 годин після стимуляції. Експресія gp39 виявляється також на еозинофілах і гладких клітинах. [Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6550-54; Hollenbaugh et al., EMBO J. (1992) 11:4313-21; Spriggs et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1543-50; Graf et al. Eur. J. Immunol (1992) 22:3191-94; Covey et al., Моl. Immunol. (1994) 31:471-84; Castle et al., J. Immunol. (1993) 151:1777-88; Roy et al., J. Immunol. (1993) 151:2497-2510; Gauchat et al., Nature (1993) 365:340-43; Gauchat et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25:863-65; Koshy et al., J. Clin. Invest. (1996) 98:826-37; Desai-Mehta et al., J. Clin. Invest (1996) 97:2063-73].

CD40 є можливим сигнальним рецептором, що забезпечує механізм, за допомогою якого активовані Т-клітини регулюють широкий спектр імунних і запальних реакцій. Експерименти in vitro і in vivo із рекомбінантними формами ліганду gp39 і моноклональними антитілами (мАТ) проти CD40 показали, що сигнал, який передається за допомогою згаданого рецептора, призводить до клітинного відгуку в усіх відомих CD40+-клітинах, і що такий результат не тільки варіює залежно від типу клітин, але також моделюється за рахунок конкурентних сигнальних процесів, обумовлених іншими рецепторами. У В-клітинах, наприклад, сигнальні процеси за участі CD40, що тісно взаємодіють із сигнальними процесами на основі рецепторів IL-4, приводять до проліферації В-клітин і продукування антитіл ізотипу Ig E, у той час як сигнальні процеси за участі CD40 разом з сигналами від рецепторів IL-10, приводять до проліферації В-клітин і з продукування антитіл ізотипу Ig G [Gordon et al., Eur. J. Immunol. (1987) 17:1535-38; Rousset et al., J. Exp. Med. (1991) 173:705-710; Jabara et al., J. Exp. Med. (1990) 172:1861-64; Gascan et al., J. Immunol. (1991) 147:8-13]. Gp39, щo опосередковує сигнальні процеси за участі CD40, може грати певну роль у клітинному імунітеті за рахунок індукування CD80 і CD86, важливих молекул Т-клітин, що співстимулюють, які зв'язують CD28 і CTLA4 [Goldstein et al., Моl. Immunol. (1996) 33:541-52].

Система «CD40/gp39 рецептор/ліганд» є однією з численних систем, залучених до продуктивної взаємодії між активованими Т-клітинами й іншими клітинами імунної системи. Проте, численні дані дозволяють припустити, що така взаємодія є унікальною і відіграє центральну роль у регуляції гуморального імунного відгуку в людини. Зокрема показано, що дефекти структури gp39 і недостатність його експресії є причиною імунодефіциту в людини, відомого як X-зв'язаний гіперсиндром ІgМ (Х-НІМ). Зазначений імунодефіцит характеризується нездатністю індивідуумів продукувати антитіла будь-якого іншого ізотипу, ніж ізотипу ІgМ, що свідчить про необхідність продуктивної взаємодії між gp39 і CD40 для забезпечення ефективного гуморального імунного відгуку [Alien et al., Science (1993) 259:990-93; Aruffo et al., Cell (1993) 72:291-300; Di Santo et al., Nature (1993) 361:541-43; Fuleihan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90(6) :2170-73; Korthauer et al., Nature (1993) 361:539-541; Notarangelo et al., Immunodef. Rev. (1992) 3:101-22]. Подібно цьому нещодавно отримані дані свідчать про те, що Х-незв'язаний НІМ-синдром людини обумовлений дефектами СD40-молекули. Використовуючи технологію генного нокауту, були отримані миші, що втратили CD40 або gp39. Ці миші мають фенотип, який виявляє ті самі ознаки, що і фенотип при НІМ-синдромі, дозволяючи припустити, що такі миші є підхожою моделлю для тестування in vivo ефектів уведення мАТ проти CD40 або gp39, що блокують взаємодію між CD40 і gp39 [Kawabe et al., Immunity (1994)1:167-78; Xu et al., Immunity (1994) 1:423-431; Renshaw et al., J. Exp. Med. (1994) 180:1889-1900; Castigli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:12135-39].

Ефекти in vivo інгібування взаємодії CD40/gp39 інтенсивно вивчались на нормальних мишах і моделях захворювання на тваринах за використання моноклональних антитіл хом'ячка проти миші (MR1). Імуносупресорна спроможність антитіл відбивала їхню властивість цілком інгібувати гуморальний імунний відгук на залежні від Т-клітин антигени [Foy et al., J. Exp. Med. (1993) 178:1567-75]. На моделях мишей було показано, що деякі захворювання імунної системи, включаючи ті, що опосередковуються клітинними імунними реакціями, інгібуються при використанні зазначених антитіл. Моделі на тваринах показали, що до захворювань, які інгібуються антитілами проти gp39, належать індукований колагеном артрит, експериментальний алергічний енцефаломіеліт, люпозний нефрит, відторгнення трансплантату і реакція «трансплантат проти хазяїна» [Durie et al., Science (1993) 261:1328-30; Berry et al., неопубл.; Gerritse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 93:2499-504; Mohan et al., J. Immunol. (1995) 154:1470-1480; Larsen et al. Transplantation (1996) 61:4-9; Hancock et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:13967-72; Parker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:9560-64; Durie et al., J. CIin. Invest. (1994) 94:1333-38; Wallace et al., неопубл.]. Роль CD40/gp39 в ампліфікації клітинного імунного відгуку може бути безпосередньою, через стимуляцію субпопуляції активованих Т-клітин, що спроможні експресувати CD40, або опосередкованою, через індукцію цитокінів й експресію важливих співстимулюючих поверхневих клітинних молекул, у тому числі CD80 і CD86, що зв'язують Т-клітинні рецептори CD28 і CTLA-4. Протизапальні ефекти інгібітора показані при вивченні експериментальних моделей індукованого киснем ушкодження легенів на мишах. Дію на запалення in vivo можна уявити, виходячи з результатів in vitro, що показують стимуляцію CD40 на судинних ендотеліальних клітинах і моноцитах, що приводить до експресії молекул клітинної адгезії, оксиду азоту (NO), матриксних металопротеіназ і запальних цитокінів [Kiener et al., J. Immunol. (1995) 155:4917-25; Malik et al., J. Immunol. (1995) 156:3952-60; Hollenbaugh et al., J. Exp. Med. (1995) 182:33-40].

Проведені на мавпах дослідження при використанні моноклональних антитіл проти gp39 людини показали, що біологічні сполуки, що інгібують взаємодію між CD40 і gp39 in vivo, є ефективними імуносупресорними агентами в приматів. Показано, що мАТ проти gp39 ефективно інгібують антитільний відгук на залежні від Т-клітин антигени і запобігають відторгненню алотрансплантатів. Ці результати аналогічні результатам, отриманим на гризунах.

Узяті разом, вищеописані дослідження показали, що агенти, що руйнують взаємодію між CD40 і gp39, можуть бути можливими імуносупресорними і протизапальними сполуками. Таким чином, існує необхідність у розробці ефективного методу блокування взаємодії CD40 і gp39 для забезпечення імуносупрессивного або протизапального ефекту. Мета даного винаходу полягає в одержанні антитіл, що блокують взаємодію між gp39 і CD40.

Інший об'єкт винаходу стосується химерного антитіла, що ефективно блокує взаємодію між gp39 і CD40.

Ще один об'єкт винаходу стосується гуманізованого антитіла, що ефективно блокує взаємодію між gp39 і CD40.

Винахід також стосується способу модулювання імунного відгуку шляхом використання антитіл, химерних антитіл або гуманізованих антитіл, отриманих відповідно до винаходу. Спосіб може бути корисний для лікування багатьох аутоімунних захворювань, а також при трансплантації шкіри або інших органів.

Даний винахід стосується нових антитіл і, зокрема, химерних моноклональних антитіл проти CD40 людини (мАТ), що блокують взаємодію між gp39 і CD40. В одному з варіантів здійснення винаходу найкращі химерні мАТ проти CD40 людини позначені як «chi220». Сhі220 являють собою химерні антитіла, що містять варіабельні ділянки антитіла миші і постійні ділянки капа і гамма-1 антитіл людини. Сhi220, як і відповідні «батьківські» антитіла, зв'язують CD40 і, у результаті, ефективно блокують гуморальні імунні відгуки на залежні від Т-клітин антигени дозо-залежним чином.

Винахід також стосується гуманізованих антитіл проти CD40, що блокують взаємодію між gp39 і CD40. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу гуманізовані антитіла позначені як «F4»; в іншому випадку вони мають позначення «L3.17». Кращі гуманізовані антитіла відповідно до даного винаходу містять варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів антитіл людини з «щепленими» на них CDR антитіл миші.

Антитіла проти CD40 відповідно до даного винаходу, переважно химерні і гуманізовані антитіла, є ефективними для модулювання гуморального імунного відгуку на залежні від Т-клітин антигени, індукованих колагеном артритів і відторгнення трансплантату. Заявлені антитіла проти CD40, кращими з яких є розкриті тут химерні і гуманізовані антитіла, також є корисними завдяки своїм протизапальним властивостям (що є подібними до властивостей антитіл проти gp39).

Антитіла відповідно до даного винаходу, особливо химерні антитіла сhі220 проти CD40, гуманізовані антитіла F4 і L3.17 проти CD40 мають широке терапевтичне застосування і, зокрема, можуть використовуватися для лікування аутоімунних і запальних захворювань, а також для запобігання відторгнення трансплантатів. Оскільки експресія CD40 показана для злоякісних клітин різноманітних гістологічних типів, потенційна можливість застосування антитіл проти CD40 в онкології, особливо отриманих відповідно до даного винаходу химерних і гуманізованих антитіл, видається очевидною.

У даному описі використовуються такі абревіатури, відомі фахівцям у даній галузі досліджень: АПК (клітина, що презентує антиген); CDR (ділянка, що визначає комплементарність, від англ. complementarity-determining region); CHO (клітини яєчника китайського хом'ячка); ІКА (індукований колагеном артрит); Сmax (максимальна сироваткова концентрація); COS (клітинна лінія фібробластів африканської зеленої мартишки); АРЛВЗ (антиревматичні ліки, що впливають на захворювання); ELISA (імуносорбентний аналіз із пов'язаним ферментом); КТТ (кінцева точка титрування); ОЕ (одиниця ендотоксину); Fab (фрагмент, що антигензв'язує); ФІТЦ (фторізотіоцианат); Нu (гуманізований); hi 06-2 (гуманізоване моноклональне антитіло проти gp39); НАМА (антитіла людини проти імуноглобулінів миші); ГМФ (геоцианін молюска фісурелі); в/м (внутрішньом'язово); мАТ (моноклональне антитіло); МТХ (метотрексат); ОВА (овальбумін); PBS (фосфатний буферний розчин); PCR (полімеразна ланцюгова реакція); РЕ (фікоерітерін), sc (підшкірний), SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламидному гелі при наявності додецилсульфату натрію); SEC (хроматографія з виключенням за розміром); ЕО (еритроцити вівці); РРП (резервуарний реактор із перемішуванням); TNF (фактор некрозу пухлин); VL (варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла); VH (варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла).

Нуклеїнова кислота, що кодує кращий легкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (химерного антитіла 2.220), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером

АТСС _____. Нуклеїнова кислота, що кодує кращий важкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (2.220), - депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС _____.

Нуклеїнова кислота, що кодує кращий легкий ланцюг гуманізованого антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (гуманізованого антитіла F4), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС _____. Нуклеїнова кислота, що кодує додатковий кращий легкий ланцюг гуманізованого антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (гуманізованого антитіла L3.17), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС ____. Нуклеїнова кислота, що кодує кращий важкий ланцюг гуманізованого антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (антитіл F4 і L3.17), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС _____.

Депозити, про які йде мова у даному описі, підтримуються відповідно до Будапештської угоди про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Депонування здійснене, головним чином, для зручності роботи фахівців у даній галузі досліджень і не є обов'язковим. Послідовності нуклеотидів, що містяться в депонованому матеріалі, так само, як і амінокислотні послідовності, ідо ними кодуються, наведені тут у якості посилань для контролю тих чи інших конфліктних ситуацій, пов'язаних з описом і розкриттям зазначених послідовностей.

Всі посилання, наведені вище і далі в даному описі, використовуються виключно з метою кращого розуміння сутності винаходу.

На Фіг.1 показане інгібування зв'язування sgp39 із клітинами Raji під дією мАТ проти CD40 людини.

На Фіг.2 наведена схема досліджень, здійснених на приматах. Дні лікування відзначені ромбами. Імунізація ЕО і ГМФ відзначена прямокутниками і трикутниками відповідно. Тварини, оброблені 2.36, не вивчалися після Фази І, а тварини, оброблені 1.106, не вивчалися після Фази II.

На Фіг.3 показаний антитільний відгук на ЕО у приматів. На Фіг.3A наведені результати аналізу при використанні антитіл ІgМ проти ЕО. На Фіг.3B представлені результати аналізу при використанні антитіл IgG проти ЕО.

На Фіг.4A показана послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга сhi220 (SEQ ID NO:1), а на Фіг.4B - послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга сhі220 (SEQ ID NO:2). На Фіг.4A і 4B підкреслені вбудовані сигнальні послідовності антитіла людини з найбільш близьким ступенем гомології, що використовувалися в якості матриці для гуманізування.

На Фіг.5 представлені результати досліджень in vitro, що стосуються тестування химерних і гуманізованих антитіл, отриманих відповідно до винаходу. На Фіг.5A показана зв'язувальна активність chi220 і h220v3 із hCD40 - mG2b в ELISA. На Фіг.5B показане інгібування опосередкованого sgp39 співстимулювання В-клітин мАТ проти CD40 людини.

На Фіг.6 показаний антитільний відгук ІgМ на ЕО. На Фіг.6А представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили 10, 40 або 100мг/кг chi220. На Фіг.6В представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили 0,1 або 1мг/кг chi220.

На Фіг.7 показаний антитільний відгук IgG на ЕО. На Фіг.7А представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили 10, 40 або 100мг/кг chi220. На Фіг.7В представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили 0,1 або 1мг/кг chi220.

На Фіг.8 показаний антитільний на ОВА у приматів. На Фіг.8А представлені результати аналізу при використанні ІgМ проти ОВА. На Фіг.8А представлені результати аналізу при використанні IgG проти ОВА.

На Фіг.9 показаний антитільний відгук на ГМФ у приматів. На Фіг.9А представлені результати аналізу при використанні ІgМ проти ГМФ. На Фіг.9В представлені результати аналізу IgG проти ГМФ.

На Фіг.10 показана порівняльна спроможність антитіл 7E1-G1 і 7E1-G2b придушувати антитільний відгук IgG на ЕО.

На Фіг.11 показане дозо-залежне інгібування антитільного відгуку на ЕО за допомогою 7E1-G2b.

На Фіг.12 показані карти вектора експресії для ділянки важкого ланцюга і ділянки легкого ланцюга химерного антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу.

На Фіг.13 показана послідовність нуклеїнової кислоти вектора експресії, спроможного експресувати важкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до заявленого винаходу. Стартовий кодон ATG (нуклеотиди 1000-1002), що кодує початкову амінокислоту метіонін (Met) вбудованої сигнальної послідовності антитіла людини, виділений жирним шрифтом. Нуклеотиди 1057-1422 (SEQ ID NO:5) підкреслені. Вони утворюють кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, отриманого згідно з даним винаходом.

На Фіг.14 показана послідовність нуклеїнової кислоти вектора експресії, спроможного експресувати легкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до винаходу. Стартовий кодон ATG (нуклеотиди 1005-1007), що кодує початковий метіонін (Met) вбудованої сигнальної послідовності антитіла людини, виділений жирним шрифтом. Нуклеотиди 1065-1388 (SEQ ID NO:6) підкреслені. Вони утворюють кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу.

На Фіг.15 показані упорядковані варіабельні ділянки антитіла миші проти CD40 і матричні послідовності антитіла людини. Амінокислотні послідовності варіабельних ділянок легких і важких ланцюгів антитіл миші проти CD40 використовувалися для ідентифікації гомологічних послідовностей зародкової лінії людини. Нумерація залишків амінокислот і визначення CDR (підкреслені) засновані на роботах [Kabat, E.A., et al., (1991), Seguences of proteins of immunological interest (5th Ed). Washington DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A., et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]. Розходження в послідовностях відзначені вертикальними лініями, а положення амінокислот на каркасних ділянках, охарактеризовані в комбінаторній експресійній бібліотеці, відзначені зірочками.

На Фіг.16 представлені результати титрування гуманізованих варіантів анти-CD40 з імобілізованим антигеном. Схарактеризовані експресовані в бактеріях Fab-фрагменти химерних анти-СО40 і відібрані варіанти з кожної бібліотеки. Химерні (зафарбовані кружки), Нu І - 19С11 (незафарбовані кружки), Нu II - CW 43 (незафарбовані квадрати), Hu III -2В8 (зафарбовані трикутники) і недоречні фрагменти Fab (зафарбовані квадрати) були отримані з периплазматичного простору бактерій (культура об'ємом 15мл), причому серійні розведення зазначеної культури були інкубовані з антигеном CD40-lg, імобілізованим на планшетах для мікротитрування. Зв'язування з антитілами вимірювали так, як описано нижче.

На Фіг.17 показана кореляція афінності антитіл і інгібування зв'язування розчинного gp39 із CD40-lg. Ліганд для рецептора CD40, gp39, був імобілізований на планшетах для мікротитрування. Відповідно до цього, різноманітні кількості очищених химерних (зафарбовані кружки), Нu II - CW43 (незафарбовані квадрати), Hu III - 2В8 (зафарбовані трикутники), Нu ІІ/ІІІ - 2В12 (незафарбовані кружки) і Fab-фрагментів (зафарбовані квадрати), що не стосуються справи, спільно інкубували з 2мкг/мл CD40-lg, імобілізованим на планшеті для мікротитрування. Зв'язування CD40-lg із gp39 кількісно визначали так, як описано нижче.

На Фіг.18 показане кількісне визначення залишків каркасних ділянок активних антитіл миші. Варіабельні ділянки найактивніших анти-СD40 варіантів з оптимізованої бібліотеки каркасних ділянок Hu І (А) і оптимізованої бібліотеки каркасних ділянок HCDR3 Hu II (В) були секвеновані для визначення амінокислот на положеннях бібліотеки каркасних ділянок. Кожний унікальний варіант був описаний на підставі загальної кількості залишків у 8 положеннях каркасної ділянки антитіла миші. 34 клони з бібліотеки Hu І і 14 клонів із бібліотеки Hu II були секвеновані, що дало можливість ідентифікувати 24 і 10 унікальних варіантів відповідно. Жирними лініями відзначений розподіл послідовностей, очікуваний від еквівалентного числа вибірково відібраних варіантів.

Даний винахід стосується химерних і гуманізованих антитіл із CD40 людини з імуносупресорними властивостями. Такі антитіла проти CD40 людини мають очевидні терапевтичні сфери використання. Винахід стосується також близькоспоріднених мАТ проти CD40 миші (близькоспоріднених антитіл до мАТ проти CD40 людини), що є корисними для вивчення можливостей анти-СР40 терапії за допомогою мАТ на численних моделях мишей (модулювання імунних і запальних захворювань). Одержання антитіл проти CD40 ускладнюється тою обставиною, що CD40 є ефективною сигнальною молекулою. Антитіла, що зв'язуються з даним антигеном, можуть бути ідентифіковані на підставі їхньої спроможності стимулювати сигнальні властивості CD40 так само, як і їхньої спроможності блокувати взаємодію CD40/gp39.

Заявлені мАТ проти CD40 людини, що блокують взаємодію CD40/gp39, відбирали з ектензивної панелі мАТ проти CD40. Антитіла, позначені як 2.220, були гуманізовані і химеризовані. «Химерні» антитіла містять легкий ланцюг і важкий ланцюг. Легкий ланцюг включає варіабельну ділянку і постійну ділянку. Важкий ланцюг також включає варіабельну ділянку і постійну ділянку. Химерні антитіла містять варіабельні ділянки від одного виду і постійні ділянки від іншого виду (наприклад, варіабельні ділянки миші сполучені з постійними ділянками людини). (Див., наприклад, патенти США 4816397 і 4816567). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюга (VL) і кожна варіабельна ділянка важкого ланцюга (VH) містить три каркасні ділянки (framework), що перериваються трьома гіперваріабельними ділянками, які називаються "ділянки, що визначають комплементарність" або CDR. "Гуманізовані" антитіла - це такі антитіла, у яких каркасні ділянки антитіл людини скомбіновані з CDR донорних Іg миші або пацюка (див., наприклад, патент США 5530101). В об'єм даного винаходу входять гуманізовані антитіла, що містять CDR, які походять з варіабельних ділянок антитіл миші.

Найбільш прямий підхід щодо одержання гуманізованих антитіл полягає в «пересадці» CDR донорних мАТ на каркасні ділянки антитіла людини [Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525 (1986)]. Проте, визначені амінокислотні залишки каркасних ділянок підтримують структуру CDR, і «щеплення» CDR миші, що антиген-зв'язують, до каркасних ділянок антитіл людини може зменшити зв'язувальну спроможність отриманих гуманізованих мАТ [Foote, J., et al., J. Моl. ВіоІ. 224:487-499 (1992)]. Оцінка можливого внеску специфічних залишків каркасних ділянок в афінність антитіл має дві проблеми. По-перше, для визначених мАТ важко прогнозувати, які саме залишки каркасних ділянок грають критичну роль у підтримці афінності і специфічності антитіл. По-друге, для положень каркасних ділянок, що є різними у «батьківських» мАТ і матричних ділянок антитіл людини, важко прогнозувати, чи обумовить амінокислота, яка походить з батьківського антитіла миші або матричної ділянки антитіла людини, більш високу активність мАТ. Відповідно до цього, методи гуманізування антитіл, що засновані виключно на прогнозуванні структури, не завжди є успішними.

Нині добре відома загальна стратегія інженерії антитіл, яка успішно долає труднощі щодо підтримки зв'язувальної активності антитіл після гуманізування [Rosok, Μ. J., et al., Т. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)]. Потенційна важливість амінокислотних залишків каркасних ділянок, які різняться в батьківських мАТ і матричних ділянок антитіл людини, характеризується на певній стадії шляхом синтезу й експресії комбінаторної бібліотеки антитіл, яка містить усі можливі комбінації батьківських і донорних амінокислотних залишків на каркасних ділянках, що цікавлять дослідника. Варіанти, які виказують оптимальну структуру каркасних ділянок, ідентифікуються шляхом скринінгу і, відповідно до цього, оптимальна структура (або структури) каркасної ділянки (або ділянок) визначаються шляхом секвенування ДНК. Зазвичай, секвенування численних активних клонів виявляє критичні положення амінокислотних залишків на каркасних ділянках, що потребують експресії. І навпаки, експресія амінокислоти людини або миші в бібліотеці каркасних ділянок з еквівалентною частотою в активних клонах узгоджується з меншою функціональною важливістю визначеного положення амінокислотного залишку в каркасній ділянці. Таким чином, гуманізоване антитіло, що зберігає зв'язувальну активність батьківського мАТ, без суттєвих труднощів можна ідентифікувати на підставі його функціональної зв'язувальної спроможності.

Способи гуманізування антитіл і забезпечення «дозрівання» афінності часто здійснюються як відокремлені стадії одного процесу [Rosok (1996), (supra); Yelton, D. E. et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Wu, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042 (1998); Baca, M. et al., 1J BioL Chem. 272:10678-10684 (1997); Marks, J. D. et al., J. BioI. Chem. 267:16007-16010 (1992)]. За допомогою модифікованої стратегії, описаної нижче, були отримані численні версії гуманізованих антитіл 2.220 миші, що володіють афінністю, еквівалентною або кращою, ніж афінність химерних Fab-фрагментів.

Заявлені в даному винаході химерні антитіла проти CD40 позначені як «сhі220». Близькоспоріднені їм мАТ проти CD40 миші позначені як «7Е1». Гуманізовані антитіла проти CD40, отримані відповідно до даного винаходу, позначені тут як «F4» і «L3.17».

Були отримані два різних ізотипних варіанти 7Е1. Ці варіанти можуть застосовуватися для визначення ролі Fc-ділянки молекули у терапії, що базується на використанні мАТ проти CD40, у доклінічних модельних випробуваннях стосовно імунних і запальних захворювань. Даним винаходом також пропонуються: одержання мАТ проти CD40 миші; критерії відбору мАТ, що мають властивості, близькі до властивостей сhі220; одержання ізотипових варіантів мАТ і їхня активність in vivo у випробуваннях на моделях мишей стосовно імунологічних захворювань. Експерименти з сhі220 і відповідними «батьківськими» мАТ 2.220 миші на мавпах, як і експерименти з 7Е1 на мишах, показали, що зазначені мАТ проти CD40 є сильними імуносупресорними агентами (які докладніше розглядаються нижче). Всі нижчеописані експериментальні дослідження були здійснені за стандартною методикою, добре відомою фахівцям у даній галузі.

У цілому, заявлені антитіла спроможні придушувати гуморальний імунний відгук у мавп. Аналогічним чином, два ізотипових варіанти близькоспоріднених мАТ проти CD40 миші і, зокрема, антитіл 7Е1 виказують імуносупресорну активність у численних доклінічних випробуваннях з модельних захворювань людини. Усі отримані дані показують, що chi220, F4 і L3.17 корисні у клінічному лікуванні аутоімунних захворювань і при трансплантації.

Нижче наведені приклади лише ілюструють даний винахід і в жодній мірі не обмежують його об'єму, що визначається формулою винаходу.

Приклад 1

Відбір антитіл миші проти CD40 людини

А. Виділення антитіл і характеризація in vitro

Панель моноклональних антитіл проти CD40 людини була отримана за допомогою стандартної гібридомної технології із застосуванням злитого білка CD40 людини в якості імуногена. Антитіла були піддані скринінгу на зв'язування з CD40 за допомогою клітинної лінії CD40+ і злитих білків. Дослідження зв'язування gp39 із CD40 і функціональні експерименти стимуляції за допомогою CD4G використовувалися для характеризації клонованих антитіл. Відібрані антитіла потім характеризували на перехресну реактивність з клітинами приматів для визначення їхньої придатності з метою проведення модельних доклінічних випробувань на приматах.

1. Імунізація і злиття

Для одержання гібридом, які продукують мАТ проти CD40 людини, використовувалися два злиття. Імунізацію для одержання імунних лімфоцитів здійснювали на 6-8 тижневих самках мишей BALB/c з використанням у якості імуногена рекомбінантно злитого білка, що містив позаклітинний домен CD40 людини, сполучений із шарнірною ділянкою, доменами СН2 і СН3 антитіла миші lgG2b (hCD40-mG2b).

Для злиття 40-1 мишу спочатку піддавали імунізації підшкірним шляхом в 3-4 ділянки емульсією (загальний об'єм 200мкл), що містила 30мкг hCD40-mG2b у повному ад'юванті Фрейнда. Аналогічним чином тварину на 21-й день бустирували hCD40-mG2b у неповному ад'юванті Фрейнда, а потім піддавали остаточній імунізації перед злиттям на 37-й день шляхом внутрішньовенної ін'єкції 30мкг hCD40-mG2b y PBS. Імунізацію для злиття 40-2 здійснювали аналогічним чином, за винятком того, що ад'ювант Фрейнда був замінений на ад'ювант Ribi (R-730). Бустерну імунізацію проводили на 21-й і 42-й дні з остаточною ін'єкцією перед злиттям на 58-й день.

За 3 дні після останніх бустерних ін'єкцій відбирали лейкоцити із селезінки і лімфатичних вузлів і зливали їх у співвідношенні 3:1 із мієломною клітинною лінією миші Х63-Аg8.653 за стандартною методикою [Kearney et al., J. Immunol. 123:1548-50 (1979); Lane, J. Immunol. 81:223-28 (1985)]. Клітинні суспензії від кожного злиття висівали в десять 96-лункових планшетів для культур тканин із густиною близько 170000 клітин (у розрахунку на клітини до злиття) на лунку.

2. Скринінг і клонування

Для ідентифікації мАТ із специфічністю до нативного CD40 людини використовувалися два підходи. Супернатанти клітинних культур із усіх лунок були спочатку піддані скринінгу за їхньою спроможністю зв'язуватися з позитивними по CD40, трансформованими вірусом Епштейна-Бара В-клітинами лінії 1А2-2С за методом ELISA. Потім кожний супернатант тестували в ELISA на реакційну спроможність з очищеним рекомбінантно злитим білком, що містив позаклітинний домен CD40 людини, злитий з шарнірною ділянкою, доменами СН2 і СН3 антитіла lgG1 людини, hCD40-lg, і аналогічним чином сконструйованим нерелевантним злитим білком Іg людини, Leu8-hlg [Hollenbaugh, et al., EMBO J. 11:4313-4321 (1992)]. Реакційна спроможність стосовно першого, але не другого злитого білка, разом із даними щодо зв'язування клітин підтвердили наявність антитіл, специфічних до нативного CD40, приблизно в 200 лунках.

Ключовою функціональною особливістю для потрібних мАТ проти CD40 є їхня спроможність цілком блокувати взаємодію CD40 із своїм лігандом gp39. Таким чином, наступною стадією відбору антитіл явилося дослідження супернатантів із усіх лунок із специфічними до CD40 антитілами на їхню спроможність інгібувати зв'язування розчинного рекомбінантно злитого білка, що містив CD8 миші і gp39 людини, sgp39, з імобілізованим hCD40-lg за методом ELISA. Супернатанти, які цілком інгібували дану взаємодію, були потім піддані титруванню таким самим чином для визначення того, які лунки містили найбільші кількості антитіл, що інгібують. По результатах цих досліджень були відібрані 10 лунок із найбільш яскраво вираженою інгібіторною активністю для подальшого клонування.

Клонування гібридом, що продукують потрібні антитіла, здійснювали в два етапи. Клітини з кожної лунки спочатку «мініклонували» з густиною засівання 10клітин/лунку, після чого специфічні до CD40 «мініклони» з найвищим титром активності клонували за звичайним методом обмежувальних розведень.

3. Подальша характеризація антитіл

Для характеризації антитіл використовувалися шість експериментів: з інгібування зв'язування sgp39 із В-клітинами людини; інгібування проліферації В-клітин, індукованою sgp39 і анти-lgM; інгібування синтезу in vitro антитіл В-клітинами, індукованого Т-клітинами; безпосередня співстимуляція В-клітин анти-ІgМ; співстимуляция В-клітин анти-lgM у присутності антитіла з перехресним зв'язуванням легкого капа-ланцюга і співстимуляція В-клітин анти-lgM при наявності інших мАТ проти CD40, G28-5. Відомо, що антитіла G28-5 мають сильну спільну стимуляторну активність і не повністю блокують взаємодію CD40/gp39. З метою порівняння вони включені в багато експериментів, що тут описані.

Результати тестів були використані для відбору чотирьох мАТ - 1.66(lgG2b), 2.36 (lgG2a), 2.174 (lgG1) і 2.220 (lgG2a) - і для Їхньої характеризації. В одному з експериментів клітини з В-клітинної лінії людини Raji інкубували з 2 або 20мкг/мл різноманітних мАТ проти CD40, після чого здійснювалася друга інкубація з нерозведеним супернатантом клітин COS, що містили злитий білок mCD8-gp39 (sgp39). Зв'язування sgp39 визначали подальшим інкубуванням клітин із міченими ФІТЦ мАТ проти mCD8 і аналізом клітин на проточному цитофлуориметрі. Відсоток інгібування обчислювали шляхом ділення величини флуоресценції зразків, інкубованих з антитілами, на величину флуоресценції зразків без антитіл при першому інкубуванні (Фіг.1).

Як показано на Фіг.1, кожне з чотирьох мАТ було здатне цілком інгібувати зв'язування злитого білка sgp39 із В-клітинною лінією людини, що експресує високі рівні CD40, хоч у випадку 2.174 була потрібна порівняно висока концентрація антитіл для повного блокування. Подібні дані були отримані при використанні В-клітин мигдалин людини. Ці дані були рівнобіжними в двох функціональних експериментах. По-перше, було показано, що кожне мАТ здатне цілком блокувати опосередковану sgp39 співстимуляцію В-клітин мигдалин людини. По-друге, кожне мАТ суттєво інгібувало утворення IgG і ІgМ у дослідженнях in vitro залежних від Т-клітин утворення антитіл В-клітинами.

Три з чотирьох антитіл показали обмежену спроможність до співстимуляції проліферації В-клітин при наявності анти-lgM. МАТ 2.220 було більш стабільним у своїй спроможності індукувати слабку співстимуляторну активність: При додаванні антитіл до легкого капа-ланцюга, що використовувались для перехресного зв'язування мАТ проти CD40, мАТ 2.36 виявляли значну співстимуляторну активність, у той час як активність трьох інших антитіл не виявлялася. Було показано, що співстимуляторна спроможність G28-5 диференційовано модулюється, коли зазначені антитіла об'єднуються з кожним із чотирьох нових мАТ проти CD40. Антитіла мАТ 1.66 і особливо 2.174 посилювали співстимуляцію під впливом G28-5, у той час як 2.220 і 2.36 придушували її.

Після відбору, заснованого на використанні in vitro систем клітин людини, чотири мАТ проти CD40 піддавали подальшим випробуванням в дослідженнях in vivo на приматах, а не на людині. Основними процедурами аналізу були оцінка за відносною ефективністю зв'язування антитіл із В-клітинами приматів і придушення in vitro залежного від Т-клітин синтезу антитіл В-клітинами. Було виявлено, що всі чотири мАТ перехресно реагують із В-клітинами макаки циномолгус (Масаса fascicularis). мАТ 2.36 і 2.220 зв'язуються з зазначеними клітинами більш ефективно, ніж 2.174 і 1.66. Слабкіша зв'язувальна спроможність мАТ 2.174 і 1.66 не була зумовлена їхнім ізотипом, оскільки інші антитіла збіжного ізотипу виявляли рівні зв'язування, порівнянні з такими у антитіл 2.36 і 2.220 (наприклад, G28-5 і 2.118). Зазначені результати суперечать результатам, отриманим за використання В-клітин людини, коли кожне з чотирьох антитіл мало порівняну зв'язувальну активність. Спроможність чотирьох мАТ придушувати антитільний синтез В-клітинами мавп була паралельною їхній зв'язувальній спроможності.

Б. Характеризація in vivo

Були проведені два експерименти на приматах, не подібних до людей, за використання мАТ миші проти CD40 людини для вивчення їхніх імуносупресорних властивостей і відбору відповідних антитіл для подальших досліджень. По-перше, проводили порівняння кліренсу in vivo і гострої токсичності чотирьох відібраних раніше мАТ проти CD40. Результати досліджень дозволили відібрати два антитіла - 2.36 і 2.220, які далі тестували в другому експерименті для того, щоб визначити ефективність інгібування антитільного відгуку на Т-залежні антигени і гостру токсичність.

Вивчення мАТ 2.36 і 2. 220 на приматах

На підставі попередніх експериментів була зроблена оцінка мАТ 2.36 і 2.220 на їхню спроможність придушувати Т-залежний антитільний відгук після внутрішньовенного введення їх мавпам циномолгус. Зазначене дослідження розділили на три фази (Фіг.2). Під час Фази І мавп циномолгус, розподілених на чотири групи, кожна з яких складалася з одного або двох самців і двох самок, імунізували внутрішньовенно в 1-й день еритроцитами вівці (ЕО) і потім обробляли 20мг/кг мАТ 2.36, 2.220, 1.106 (позитивний контроль: lgG1 миші проти gp39 людини) або L6 (негативний контроль: lgG2A миші проти пухлинного антигена людини) у дні 1, 3 і 5. Визначали також титри ІgМ і IgG стосовно імуногена ЕО, сироваткові рівні випробуваних і контрольних антитіл, наявність антитіл проти випробуваних і контрольних антитіл, рівні сироваткових імуноглобулінів, кількість лейкоцитів периферичної крові і частоту спостереження різноманітних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові. На Фазі II після здійснення відповідних експериментів Фази І тварин імунізували ЕО і другим антигеном, гемоцианіном молюска фіссуреллі (ГМФ) для виявлення індукції імунологічної толерантності й оборотності імуносупресії, що спостерігається. На Фазі III відібраних тварин повторно імунізували для виявлення того, чи спроможний спочатку супресований антитільний відгук на ЕО відновлятися після додаткового введення ЕО і для оцінки другого антитільного відгуку на ГМФ.

Експеримент здійснювали для того, щоб показати, що мАТ 2.220 у суттєвій мірі придушують первинний антитільний відгук на ЕО (Фіг.3). Мавпам уводили 20мг/кг мАТ 1.106, L6, 2.36 або 2.220 на Фазі І у дні 1, 3 і 5. Мавп імунізували ЕО в день 1 Фаз І, II і III. На Фіг.3А представлені результати досліджень зразків сироватки на присутність ІgМ проти ЕО; на Фіг.3В представлені результати досліджень зразків сироватки на присутність IgG до ЕО. Дані виражені в геометричних значеннях титру антитіл проти ЕО для кожної групи (n=3 або 4).

Пікові значення інгібування первинного відгуку складають 85% для ІgМ і 98% для IgG відповідно. Наступне звільнення мАТ 2.220 із сироватки пов'язане зі зниженням їхніх рівнів, що виявляються; пікові значення інгібування повторного відгуку складають ще 79% і 56% для ІgМ і IgG, відповідно, в порівнянні з негативним контрольним відгуком на Фазі І. Це суперечить позитивному контрольному результату з мАТ 1.106, згідно з яким забезпечується сильний вторинний антитільний відгук на ЕО. Третинний відгук на ЕО не інгібується, засвідчуючи те, що мАТ 2.220 індукує пролонговану імуносупресію, а не імунологічну толерантність. В усіх тварин, імунізованих ГМФ, виявлявся первинний і вторинний відгук на ГМФ, дозволяючи припустити, що імуносупресія є оборотною. Тварини, оброблені мАТ 2.36, не були включені у Фазу II, оскільки на Фазі II досліджень не виявилося жодного суттєвого інгібіторного ефекту.

Головний пік концентрації сироватки, що виявлявся відразу ж після введення останньої дози, становив 744 і 405мкг/мл для мАТ 2.220 і 2.36 відповідно. У той час як мАТ 2.36, що звільнюються із сироватки, забезпечують на 15-й день зниження рівнів, що визначаються, мАТ 2.220 не звільняються аж до 29-го дня. Як мАТ 2.36, так і мАТ 2. 220 є імуногенними.

Не було виявлено жодних клінічних ускладнень, пов'язаних з уведенням препаратів, у тому числі змін ваги тіла або споживання їжі, а також гематологічних змін або змін рівнів Іg у піддослідних тварин. Була зареєстрована лише одна зміна, яка полягала у тимчасовому зменшенні на 70% і 43% кількості периферичних В-клітин під впливом мАТ 2.36 і 2.220 відповідно. Відновлення кількості В-клітин до нормальних рівнів, відбувається в межах 2-3 тижнів після введення препаратів.

У цілому мАТ 2.220 значно придушують антитільний відгук на ЕО, а мАТ 2.36 - ні. Незважаючи на те, що мАТ 2.220 індукують пролонговану антигенспецифічну імуносупресію, остання є оборотною. На підставі зазначених спостережень антитіла мАТ 2.220 були відібрані для подальших досліджень.

Приклад 2

Одержання химерних антитіл сМ220

Для надання імуногенності мишачим мАТ 2.220 проти CD40 людини були отримані їхні· рекомбінантні форми, у яких варіабельні ділянки були злиті з постійними ділянками антитіл людини. Такі антитіла перевіряли на ефективність in vitro. Для одержання химерних антитіл використовувалися два підходи. Власне химерні антитіла містили незмінені варіабельні ділянки антитіл миші, а в гуманізованих антитілах гіперваріабельні ділянки антитіл миші (CDR) були прищеплені до послідовностей каркасних ділянок антитіл людини в межах варіабельних ділянок. Химерні антитіла зберігали антигензв'язувальні властивості «батьківських» антитіл, але могли мати велику імовірність імуногенності. Гуманізовані антитіла імуногенними були з меншою імовірністю, проте, мутації, що генерувались в процесі гуманізування, могли впливати на антигензв'язувальну активність.

А. Конструювання і характеризація in vitro химерних і гуманізованих антитіл

Варіабельні ділянки легких і важких ланцюгів (VL і VH) mAT 2.220 проти CD40 одержували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR). кДНК отримували на основі РНК, виділеної з гібридоми, що експресує мАТ 2.220, при використанні lgG1-специфічного або Ск-специфічного антисмислового праймера з утворенням VH і VL відповідно. До одноланцюгових кДНК додавали полі-G хвіст. Після цього варіабельні ділянки ампліфікували за допомогою PCR, при використанні смислового олігонуклеотидного праймера, що містив полі-С послідовність, комплементарну полі-G хвосту, і гніздового набору антисмислових праймерів. Отриманий PCR-продукт далі вбудовували у бактеріальний вектор за допомогою сайтів рестрикції, введених у праймери. Після цього за допомогою дідеоксинуклеотидного методу секвенували численні клони. Однаковим шляхом було проведено два незалежних експерименти, починаючи зі стадії одержання РНК і послідовностей.

Для конструювання химерних антитіл варіабельні ділянки ампліфікували за допомогою PCR при використанні праймерів, що інтродукують послідовність, яка кодує сигнальну послідовність антитіл людини, найбільш близьку до послідовності 2.220, як показано на Фіг.4. Підкреслені ділянки варіабельних послідовностей легкого ланцюга (Фіг.4A) і важкого ланцюга (Фіг. 4B) означають вбудовані сигнальні послідовності антитіла людини з найбільшою гомологією із послідовностями антитіла миші 2.220. Продукти PCR потім вбудовували у вектор, що містив послідовності, які кодували постійні ділянки капа-ланцюга антитіла людини або g1-ланцюга антитіла людини, з одержанням повного легкого або важкого ланцюга відповідно. Вектори містили також підхожі гени стійкості до ліків для одержання й ампліфікації стабільних ліній, що експресують білок. Білок для початкової характеризації одержували шляхом транзиторної експресії в клітинах COS і подальшого очищення за допомогою білка А.

У якості прикладу, лінії клітин, що продукують химерні антитіла, одержували шляхом співтрансфекції клітин СНО DG44 окремими векторами експресії важкого і легкого ланцюгів химерного антитіла за допомогою висококопійного кількісного методу електропорації (див. Патент США №4956288), що забезпечував співінтеграцію. Важкі і легкі ланцюги chi220 були клоновані у вектори експресії pD17 і pD16 відповідно. Обидва ці вектори походили з плазміди pcDNA3 InVitrogen і містили такі конструктивні елементи (Фіг.12): (1) ген стійкості до неоміцину з pcDNA3 заміщений на ген дигідрофолатредуктази миші (DNFR) під контролем позбавленого енхансера промотора SV40 (цей ген також позначений як «ослаблений» ген DHFR; слід звернути увагу на те, що «ослабленим» фактично є тільки промотор, а самий фермент - ні; позбавлений енхансера промотор усе ще містить ориджин реплікації SV40 і, таким чином, відповідні вектори можуть бути використані для транзиторної трансфекції клітин COS); (2) потрібний ген експресується з промотора CMV, а сигнал поліаденілювання походить від гена бичачого гормону росту; (3) касета експресії потрібного гена фланкірувалась послідовностями термінації транскрипції (тобто послідовність 5' примикає до промотора, а послідовність 3' - до полі-Α сайта); (4) вектори містять два окремих полілінкерних сайта рестрикції, один у напрямку 3' до промотора для клонування потрібного гена й один у напрямку 5’ до промотора для лінеаризації вектора до трансфекції; (5) ген стійкості до ампіциліну й ориджин СоІЕ1 для розмноження плазміди в Ε. Coli.

Гени важких і легких ланцюгів використовувалися для одержання геномних конструктів із такими модифікаціями: (1) послідовності, що кодують, для сигнального пептиду важкого ланцюга, варіабельної ділянки і домену СН1 були безперервними (тобто не містили інтронів); (2) послідовності, що кодують, для сигнального пептиду легкого ланцюга і варіабельної ділянки були також безперервними.

Об'ємом даного винаходу також охоплюються відомі фахівцям інші вектори експресії, що спроможні експресувати заявлені химерні антитіла. Послідовність нуклеїнової кислоти, використана в експресійному векторі, спроможному визначати синтез важкого ланцюга заявленого химерного антитіла, показана на Фіг.13; послідовність нуклеїнової кислоти, використана в експресійному векторі, спроможному визначати синтез легкого ланцюга заявленого химерного антитіла, показана на Фіг.14.

Повна амінокислотна послідовність важкого і легкого ланцюгів химерного антитіла (сhі220), включаючи варіабельні і постійні ділянки, наведена нижче (жирним шрифтом виділені амінокислоти варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів).

Послідовність важкого ланцюга (SEQ ID NO:3)

Послідовність легкого ланцюга (SEQ ID NO:4)

Отримано кілька гуманізованих форм 220. Спосіб їх отримання включає у себе ідентифікацію послідовностей клітин зародкової лінії людини і миші, що мають максимальну гомологію з доменами VH і VL. Домени зародкових клітин миші використовувалися для ідентифікації сприятливих місць локалізації соматичних мутацій, що генерують у процесі афінного дозрівання. Далі послідовності клітин людини використовувалися в якості матриці, і ділянками послідовності, для котрих відомо або очікується, що вони є важливими для зв'язувальної специфічності, заміщувались відповідні ділянки в послідовностях VH і VL антитіл людини. Структуру таких послідовностей моделювали, використовуючи в якості матриці білок з найбільш близькою гомологією, для якого відома кристалічна структура. Плазміди, що кодують гуманізовані форми антитіл, одержували за методом PCR-спрямовуваного мутагенезу і використовували для генерації антитіл шляхом транзиторної експресії в клітинах COS. Дослідження in vitro здійснювали з химерними і гуманізованими антитілами, отриманими відповідно до даного винаходу; результати цих досліджень представлені на Фіг.5. На Фіг.5A показані результати тестування зв'язувальної спроможності сhі220 і h220v3 з hCD40-mG2b за методом ELISA. Лунки планшетів lmmulon-2 покривали hCD40-mG2by концентрації 10нг/мл у PBS протягом 2 годин. Лунки блокували реагентом Specimen Diluent (Genetic Systems), і далі в них добавляли антитіла у визначених концентраціях. Через 1 годину інкубування лунки відмивали, і наявність антитіл виявляли за допомогою кон'югованих із пероксидазою антитіл кози до IgG людини. H220v3 являє собою гуманізовану форму мАТ 2.220. Отримані результати є середніми для двох лунок, а короткі лінії відповідають стандартному відхиленню.

На Фіг.5В представлені результати тестування гальмівного впливу мАТ проти CD40 людини на опосередковувану sgp39 співстимуляцію В-клітин людини. В-клітини мигдалин людини (50000кл/лунку), що перебувають у стані спокою, інкубували зі злитим білком sgp39, 20мкг/мл антитілами кролика проти ІgМ людини, адсорбованими на імунобусах, і визначеними концентраціями мАТ проти CD40 або контрольного препарату в 96-лункових планшетах. Через 72 години після «закладання» культур усі лунки пульсово мітили 1мкКі/лунку [зН]-тимідином, і далі клітини культивували протягом ще 18 годин. Після цього клітини збирали, і на сцинціляційному лічильнику міряли включення [зН]-тимідину.

По результатах досліджень in vitro (Фіг.5А і. 5В, на яких показане ефективне зв'язування CD40 химерними і гуманізованими антитілами і інгібування В-клітинної стимуляції) для подальших експериментів були відібрані химерні антитіла.

Приклад 3

Ефективність chi220

А. Химерні мАТ 2.220: вивчення однодозової ефективності на приматах, не подібних до людей

Сhі220 оцінювали в експериментах на мавпах циномолгус на їхню спроможність придушувати первинний і вторинний гуморальні імунні відгуки на залежні від Т-клітин антигени. В одному з експериментів групу з чотирьох мавп імунізували ЕО, а потім здійснювали другу імунізацію овальбуміном (ОВА) безпосередньо перед введенням однократних внутрішньовенних болюсних доз chi220, що складали 10, 40 або 100мг/кг, або стерильного фосфатного буферного розчину (PBS) у якості контрольного препарату. При всіх трьох зазначених рівнях спостерігали значне придушення первинного гуморального імунного відгуку на ЕО, що є свідченням ефективної дії сhі220 у приматів. Дозо-залежне транзиторне зменшення числа В-клітин периферичної крові спостерігалося у всіх оброблених chi220 мавп; час відновлення числа В-клітин також залежав від дози. При двох найвищих дозах спостерігалося транзиторне помірне зменшення абсолютного числа Т-клітин периферичної крові. Також відзначалося транзиторне мінімальне зменшення рівнів сироваткових ІgМ без будь-яких пов'язаних із уведенням препаратів змін сироваткових рівнів IgG або ІgА.

Для оцінки індукції імунологічної толерантності й оборотності імуносупресорної активності проводили імунізацію всіх мавп овальбуміном (ОВА), ЕО і неоантигеном, ГМФ на 149-й день, коли сироваткові рівні сhi220 у групі тварин, що одержували їх у дозі 100мг/кг, були нижче рівнів, оцінюваних як імуносупресорні (приблизно 10мкг/мл), а число В-клітин периферичної крові відновилося до вихідних рівнів. Антитільний відгук на ЕО при найнижчій дозі, у цілому, був порівнянний із первинним антитільним відгуком на ЕО у контрольних мавп. Проте, антитільний відгук на ЕО був ще частково або суттєво придушений у мавп, оброблених двома найбільшими дозами антитіла.

Для подальшого вивчення дозо-залежної імуносупресії і зниження числа В-клітин було проведене друге дослідження, у якому додаткових мавп (по чотири в групі) імунізували ЕО, а потім уводили їм однократні дози сhі220, що складали 0,1 або 1,0мг/кг, або PBS. При обох дозах спостерігалася субоптимальна імуносупресія антитільного відгуку на ЕО. Помірне зменшення кількості В-клітин периферичної крові, з усією очевидністю, виявлялося у мавп, що одержували 1,0мг/кг chi 220 на 8-й день, і відновлялося на 29-й день. При дозі 0,1мг/кг спостерігалося зменшення середнього числа і відсоткового вмісту В-клітин периферичної крові, але ці значення не виходили за межі звичайних показників відсоткового вмісту В-клітин. Взагалі норми абсолютного числа В-клітин периферичної крові не були встановлені. У мавп, що одержували 1мг/кг сhі220, виявлялося транзиторне мінімальне зменшення числа Т-лімфоцитів периферичної крові і помірне зменшення Т-клітинної проліферації ex vivo. І нарешті, не було даних на користь активації комплемента або пов'язаних із уведенням препаратів змін сироваткових рівнів IL-6 або TNFL. Т-клітинна активація ex vivo, активація комплемента і рівні сироваткових цитокінів не виявлялися в мавп, що одержували 10, 40 або 100мг/кг chi220.

В обох експериментах сироваткові зразки досліджувались після введення chi220 на циркулюючі рівні випробуваних сполук і утворення антитіл проти цих сполук. Фармакокінетичний аналіз показав, що основна пікова концентрація chi220 у сироватці (Сmax) не збільшується пропорційно уведеній дозі, а період півжиття chi220 збільшується в міру зростання дози. Було знайдено, що Сhі220 є імуногенними при введенні в дозах 0,1, 1 і 10мг/кг. Виявилось, що при циркулюючій концентрації, більшій за 10мкг/мл, сhі220 спроможні придушувати спрямований до них антитільний відгук.

1. Протокол експерименту

На початковій стадії описаних вище досліджень мавпи циномолгус були розподілені по чотирьох групах, в кожну з яких входили по дві самки і по два самці. Всіх мавп імунізували за 28 днів до введення сhі220 або контрольної ін'єкції ОВА (5мг/кг внутрішньом'язово і 10мг/кг підшкірно). У 1-й день усіх мавп імунізували ЕО (1,7мл/кг; 10% суспензія підшкірно), після чого проводили другу імунізацію ОВА (5мг/кг внутрішньом'язово і 10мг/кг підшкірно) безпосередньо перед введенням однократної внутрішньовенної болюсної дози сhі220, що складала 10, 40 або 100мг/кг, або стерильного PBS у якості контрольного препарату. На 149-й день після того, як сироваткові рівні сhі220 упали нижче рівнів, оцінюваних як можливі імуносупресорні (приблизно 10мкг/мл), а кількість В-клітин периферичної крові відновилася до перед-дозових рівнів у всіх групах, мавп імунізували ОВА, ЕО і ГМФ (10мг/тварину внутрішньом'язово). Мета імунізації ГМФ полягала в тому, щоб показати, що мавпи спроможні генерувати імунний відгук на неоантиген після введення сhі220.

Для того, щоб продемонструвати кращий дозовий відгук відповідно до імуносупресії і зменшення числа В-клітин периферичної крові, додаткових мавп (дві самиці і два самці) у другому досліді імунізували ЕО і потім однократною дозою сhі220 у кількості 0,1мг/кг або 1,0мг/кг, або PBS у якості контрольного препарату на 1-й день. В обох експериментах у визначені періоди часу безперервно спостерігали за гематологічними параметрами і субпопуляціями лімфоцитів периферичної крові. Хімічні параметри сироватки крові оцінювали в мавп, що одержували 10, 40 або 100мг/кг сhі220, але не оцінювали при дозах 0,1 і 1мг/кг, оскільки при більш високих дозах жодних ефектів, пов'язаних із уведенням препаратів, не спостерігалося. Крім того, визначали сироваткові рівні IgM, IgG, IgA і сhі220. Виявляли також специфічний. ІgМ- і lgG-антитільний відгук на імуногени. ЕО й ОВА у відповідних зразках сироватки, отриманих безпосередньо перед уведенням імуногена і за тиждень після цього. Специфічний ІgМ- і lgG-антитільний відгук на випробувані антитіла в мавп, що одержували сhі220, визначали до введення антитіл на 1-й день і за тиждень після цього. Для порівняння антитільного відгуку між групами використовували геометричні значення титрів. Крім того, визначали загальну гемолітичну активність комплемента (СН50) і рівень C4d-фрагмента, а також рівні TNF-a і IL-6 у мавп, що одержували 0,1 або 1мг/кг сhі220, у визначених періодах часу після введення сhі220. Проводили ex vivo дослідження активації Т-клітин периферичної крові після стимуляції конканаваліном А у мавп, що одержували 0,1 і 1мг/кг сhі220, на 17-й і 31 -й дні для виявлення впливу сhі220 на реакцію Т-клітин на мітоген. І нарешті, усіх мавп обстежували щодня на виявлення клінічних симптомів токсичності, визначення щотижневої ваги тіла і щоденного споживання їжі.

Мавп імунізували ЕО до введення їм контрольного препарату або 10, 40 чи 100мг/кг chi220 (Фіг.6А), або 0,1 чи 1мг/кг сhі220 (Фіг.6В) на 1-й день. Зразки сироватки аналізували на lgM-антитіла проти ЕО за методом ELISA. Одержані дані виражали через геометричні значення кінцевої точки титрування (КТТ) для антитіл проти ЕО для кожної групи [n=2 (100мг/кг, 15-й день) або 4], коли КТТ була еквівалентною оберненому найбільшому розведенню сироватки з поглинанням, більшим ніж у 2 рази середнього рівня фону.

2. Результати

А. Антитільний відгук на ЕО

При введенні chi220 мавпам у дозах 10, 40 або 100мг/кг ефективність цих антитіл виявила себе у значному придушенні первинного антитільного відгуку на ЕО. У піковий (8-й) день контрольного первинного lgM-антитільного відгуку на ЕО первинний lgM-антитільний відгук на ЕО придушувався приблизно на 92-94% порівняно з контрольним препаратом у мавп, що одержали 10, 40 і 100мг/кг сhі220 (Фіг.6А). Групове значення lgM-антитільного відгуку на ЕО не ставало позитивним аж до 85-го дня при дозах 10, 40 або 100мг/кг. На піковий (15-й) день контрольного первинного lgG-антитільного відгуку на ЕО первинний lgG-відгук на ЕО придушувався на 98%, 99% і 85% у мавп, що одержували 10, 40 і 100мг/кг сhі220 відповідно в порівнянні з контрольним зразком (Фіг.7А). Більш високі вихідні (до введення доз) антитільні титри щодо ЕO у групі, яка одержала 100мг/кг chi220, можуть бути підраховані при явній утраті дозозалежної імуносупресії. Більш того, у мавп, що отримали 10 або 100мг/кг chi220, первинний lgG-антитільний відгук на ЕО не виявлявся до 85-го дня досліджень. Проте, дві мавпи, які одержали 40мг/кг chi220, виявляли затриманий первинний IgG- антитільний відгук на ЕО (за амплітудою порівнянний із контрольним відгуком), який ставав позитивним на 36-й день і досягав піка на 51 -й день досліду.

На 149-й день після того, як сироваткові рівні сhі220 упали нижче прогнозованих імуносупресорних рівнів (приблизно 10мкг/мл), а рівні В-клітин периферичної крові відновилася до перед-дозових рівнів у всіх групах, мавп імунізували еритроцитами ЕО другий раз. Як і очікувалося, контрольні мавпи виявили сильний вторинний IgG- антитільний відгук на ЕО. У мавп, які одержали 10мг/кг сhі220, виявлявся первинний ІgМ- і lgG-антитільний відгук на ЕО, який у цілому був порівнянний із первинним антитільним відгуком у контрольних мавп. Проте, антитільний відгук на ЕО був усе ще частково придушений при дозі 40мг/кг і суттєво придушений при дозі 100мг/кг. Незважаючи на те, що в двох мавп, що отримали сhі220 у дозі 40мг/кг, у котрих попередньо визначався слабкий первинний антитільний відгук на ЕО, розвивався вторинний антитільний ІgМ- і IgG-відгук на ЕО. Антитільний відгук на ЕО у двох інших мавп тієї ж групи й інших мавп, котрі одержали 100мг/кг сhі220, був придушений приблизно на 90% порівняно із середнім первинним відгуком на ЕО у контрольних мавп.

Субоптимальна імуносупресія антитільного відгуку на ЕО спостерігалася після введення сhі220 у дозах 0,1 або 1,0мг/кг (Фіг.6В і 7В). У той час як у всіх мавп, що одержували сhі220, розвивався позитивний ІgМ-відгук на ЕО, загальний пік ІgМ-відгуку був придушений приблизно на 56% у мавп, що одержували сhі220 у дозі 1мг/кг, у порівнянні із середнім піковим значенням контрольного відгуку. Ніякого придушення ІgМ-відгуку не спостерігалося в мавп, що одержували 0,1мг/кг сhі220. Значення ІgМ-відгуку на ЕО досягало піка на 15-й день у контрольних мавп і на 8-й день у мавп, що одержували 0,1 і 1,0мг/кг сhі220. Більш того, середній піковий lgG-відгук на ЕО був придушений на 56% і 42% у мавп, що одержали 0,1 і 1,0мг/кг сhі220 відповідно. IgG-відгук на ЕО досягав пікового значення на 15-й день у контрольних мавп і мавп, оброблених 1мг/кг сhі220, і на 18-й день у мавп, що одержували 0,1мг/кг сhі220.

Б. Антитільний відгук на ОВА

Мавп імунізували внутрішньовенно дозами 10, 40 або 100мг/кг chi220 у 1-й день. Крім того, усіх мавп імунізували овальбуміном (ОВА) у дні 28,1 і 149. Зразки сироватки аналізували на вміст ІgМ (Фіг.8A) або IgG (Фіг.8B) проти ОВА. Отримані дані виражені в геометричних значеннях кінцевої точки титру (КТТ) анти-ОВА для кожної групи [n=2 (100мг/кг, 15-й день) або 4], коли КТТ були еквівалентні оберненому найбільшому розведенню сироватки при поглинанні, що більш, ніж у два рази, перевищувало середній рівень фону.

Специфічне утворення ІgМ- і lgG-антитіл проти ОВА контролювали щотижня під час спостереження за мавпами, які одержували 10, 40 або 100мг/кг сhі220. Первинний і вторинний антитільний відгуки на ОВА змінювались у широких межах і, у цілому, були слабкими у всіх мавп (Фіг.8). Мавпи, що одержували chi220 у 1-й день, мали більш високі титри антитіл до ОВА порівняно з мавпами контрольної групи.

На 149-й день мавпам вводили третинну імунізацію ОВА. Всі мавпи виявили позитивний lgG-антитільний відгук на ОВА протягом 7 днів після введення. Контрольні мавпи і мавпи, яким вводилось 10мг/кг сhі220, мали титри антитіл, характерні для третинного антитільного відгуку, у той час як мавпи, яким вводили 40 або 100мг/кг сhі220, мали титри антитіл більш характерні для вторинного антитільного відгуку.

В. Антитільний відгук на ГМФ

Мавпам внутрішньовенно вводили сhі220 у дозах 10, 40 або 100мг/кг у 1-й день. Крім того, усіх мавп імунізували ГМФ на 149 день. Зразки сироватки аналізували на вміст ІgМ (Фіг.9A) та IgG (Фіг.9B) антитіл проти ГМФ. Отримані дані представлені як геометричні значення кінцевої точки титру (КТТ) антитіл проти ГМФ для кожної групи [n=2 (100мг/кг на 15-й день) або 4], причому значення КТТ є еквівалентними оберненому найбільшому розведенню сироватки при поглинанні, що перевищує більш ніж у 2 рази фонове значення.

На 149-й день після того, як сироваткові рівні сhі220 упали нижче величин, оцінюваних як можливі імуносупресорні (приблизно 10мкг/мл), а рівні В-клітин периферичної крові відновились до перед-дозових рівнів у всіх групах, мавп імунізували ГМФ (внутрішньом'язово 10мг/тварину).

Всі мавпи виявляли позитивні антитільні відгуки на ІgМ і IgG, засвідчуючи те, що спроможність реагувати на новий антиген не порушується (Фіг.9).

Г. Сироваткові рівні випробуваних антитіл і антитіл проти випробуваних Іg

Зразки сироватки досліджували після введення chi220, щоб визначити циркулюючі рівні випробуваних антитіл і виявити можливість формації антитіла проти цих антитіл. Середній пік сироваткової концентрації (Cmax) chi220 спостерігався через 3 хвилини після введення доз 10 і 40мг/кг і через 6 годин після введення дози 100мг/кг. Величини Cmax для сhі220 складали 329, 2429 і 2343мкг/мл у мавп, яким уводили 10, 40 і 100мг/кг сhі220 відповідно. Проте, спостерігалися суттєві індивідуальні варіації величин Cmax у окремих мавп у групах, що одержували 40 і 100мг/кг сhі220. Згідно з проведеними оцінками, середнє значення періоду півжиття сhі220 складало 114, 173 і 315 годин у мавп, що одержували 10, 40 і 100мг/кг chi220 відповідно.

Середні величини Cmax, що спостерігались за три хвилини після введення chi220, складали 1.77 і 33 для доз 0,1 і 1мкг/кг відповідно. У межах кожної дози жодних суттєвих розбіжностей між сироватковими рівнями chi220 не спостерігалося. Середні значення AUCjnf складали 15,5 і 847мкг.ч/мл для доз 0,1 і 1,0мг/кг відповідно. В цілому проведені експерименти дозволяють припустити, що період півжиття сhі220 збільшується в міру зростання дози введених антитіл. Більш того, очевидно, що Cmax сhі220 збільшується диспропорційно збільшенню дози.

Незважаючи на те, що антитільний відгук ІgМ на випробувані антитіла був мінімальним або не спостерігався в мавп, що одержували 10, 40 і 100мг/кг сhі220, суттєвий lgG-антитільний відгук на випробувані антитіла був виявлений у тварин, яким уводили 10мг/кг сhі220. Такий відгук виявлялася на 29 день-після введення chi220, приблизно через тиждень після того, як середнє значення сироваткової концентрації сhі220 падало нижче 10мкг/мл, і досягав пікових значень на 36-й і 43-й дні при геометричному значенні титру 12,627. Поява lgG-антитіл проти випробуваних мАТ у мавп, що одержали 10мг/кг сhі220, збігалося з першим проявом збільшення числа В-клітин після зниження їхньої кількості. До останнього дня дослідів (149) мавпи, які одержали 40 і 100мг/кг, усе ще не виявляли позитивного антитільного відгуку на сhі220, незважаючи на те, що середні сироваткові рівні chi220 у групах були нижче 10мкг/мл аж до 57-го дня (40мг/кг) або до 92 дня (100мг/кг).

Chi220 були імуногенними при введенні в дозах 0,1 або 1мг/кг. У трьох із чотирьох мавп, що одержували сhі220 у дозах 0,1 або 1мг/кг, спостерігався слабкий позитивний lgM-антитільний відгук на випробувані антитіла на 15-й день досліджень. У трьох із чотирьох мавп, що одержували сhi220 у дозі 1мг/кг, спостерігався значний lgG-антитільний відгук на випробувані антитіла на 22-й день, досягаючи середнього пікового геометричного значення кінцевої точки титру 16,618. Крім того, середнє геометричне значення lgG-антитільного відгуку на випробувані антитіла не було позитивним у мавп, що одержували 0,1мг/кг сhі220, і тільки в однієї мавпи, яка одержала 0,1мг/кг сhі220, спостерігався слабкий позитивний lgG-антитільний відгук на випробувані антитіла, який досяг пікового значення КТТ 2430 на 22-й день. У цілому, наведені дані дозволяють припустити, що сhі220 спроможні імуносупресувати імунний відгук проти них самих при сироваткових рівнях, що перевищують приблизно 10мкг/мол.

Приклад 4

Одержання гуманізованих антитіл F4 і L3.17 проти CD40

На сьогоднішній день відомі різноманітні способи гуманізування мАТ. З'ясовано, що можна використовувати структурні підходи, але вони є складними через те, що велике число амінокислотних залишків каркасних ділянок, потенційно залучених у зв'язувальну активність, зменшує шанси на успішне одержання заданих антитіл. Скоріше не модельне прогнозування оптимальної структури каркасних ділянок, а одержання бібліотеки генів антитіл, як показано нижче, дозволяє ідентифікувати активні конформації каркасних ділянок, базуючись на скринінгу численних комбінацій. Мутагенез у комплексі з методами селекції забезпечує аналіз багатьох варіантів і імітує процес «дозрівання» антитіл in vivo, див. огляд [Marks, J.D., et al., J. Biol. Chem. 267:16007-16010 (1992)]. Заснований на заміні кодонів мутагенез дозволяє конструювати бібліотеки, що характеризують внесок специфічних залишків у зв'язувальну спроможність і, таким чином, є більш ефективним, ніж підхід, заснований на вибірковому мутагенезі. Наприклад, PCR, що пов'язана з можливістю виникнення помилок, не може бути використана для синтезу комбінаторних бібліотек каркасних ділянок, описаних нижче. Більш того, вибірковий мутагенез приводить до створення більшого числа, різноманітних бібліотек і, на жаль, велика частина мутацій не збільшує зв'язувальної активності мАТ. Відповідно до цього, для ідентифікації активних варіантів скринінгу повинна бути піддана більша кількість клонів.

Відомо про використання стратегії, що зветься "спрямованою селекцією", для виділення мАТ людини з фагової бібліотеки в дві стадії за використання мАТ гризунів у якості матриці [Jespers, L.S., et al., Bio/Technology 12:899-903 (1994)]. Нещодавно був описаний варіант методу спрямованої селекції при використанні фагової бібліотеки, згідно з яким химерний Fd-фрагмент використовувався для відбору L-ланцюга з бібліотеки, що містила L-ланцюги людини з щепленими CDR3 миші [Rader, С, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915 (1998)]. Відповідно до цього, найактивніший L-ланцюг використовувався для відбору Η-ланцюга з бібліотеки Η-ланцюгів людини, що містили HCDR3 миші. Антитіла, виділені за допомогою згаданих методів, були, по суті, антитілами людини [Jespers, L.S., et al., Bio/Technology 12:899-903 (1994)] або здебільшого антитілами-людини [Rader, С, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915 (1998)], проте велика розмаїтість антитіл на кожній стадії викликала необхідність використання методів збагачувальної хроматографії.

Для одержання гуманізованих антитіл F4 і L3.17 проти CD40 відповідно до даного винаходу були використані такі матеріали і методи.

1. Конструювання химерних антитіл проти CD40

На основі послідовності мАТ 2.220 миші проти CD40 були синтезовані і очищені перекривані олігонуклеотиди, що кодують VH і VL (69-75 нуклеотидів у довжину). Варіабельні домени Η і L були синтезовані окремо шляхом об'єднання 25пкМ кожного з перекриваних олігонуклеотидів із ДНК-полімеразою Pfu (Stratagene) у 50мкл суміші для PCR-реакції, проведеної у 5 циклів: денатурації при 94°С протягом 20с, відпалювання при 50°С протягом 30с, підвищення температури до 72°С протягом 1хв. і витримування суміші при 72°С протягом 30с. Температуру відпалювання збільшували послідовно до 55°С протягом 25 циклів. За цією ж самою схемою для подальшої ампліфікації 1мкл злитого продукту в 100мкл суміші для PCR використовували обернений праймер і біотинільований спрямовуючий праймер. Продукти PCR очищали в агарозному гелі шляхом електрофорезу, електроелюювали і фосфорилювали полінуклеотидкіназою Т4 (Boehringer Mannheim) і потім інкубували з покритими стрептавідином магнітними бусами (Boehringer Mannheim) у 5мМ Тріс-СІ, рН 7,5, 0,5мМ ЕДТА, 1М NaCI і 0,05% Твіну 20 протягом 15хв. при 25°С. Буси відмивали, а не підданий біотинілюванню мінус-ланцюг ДНК елюювали інкубуванням із 0,15М NaOH при 25°С протягом 10хв. Химерний Fab-фрагмент проти CD40 синтезували за допомогою модифікованого вектора М131X104 [Kristensson, К., et al., Vaccines 95, pp.39-43, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1995)], позначеного як M131X104CS, отриманого гібридизаційним мутагенезом [Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 ; Kunkel, T. A. Proc. NatІ. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)] при використанні VH і VL олігонуклеотидів у 3-кратному молярному надлишку уридинільованої векторної матриці. Вектор М131Х104 був модифікований шляхом заміщення цистеїнових залишків на кінці капа і g1 постійних ділянок на серин. Реакційну суміш шляхом електропорації уводили у клітини DH10B і титрували за допомогою системи XL-1 Blue.

2. Конструювання комбінаторних бібліотек каркасних ділянок і каркасних ділянок із CDR3

Комбінаторну бібліотеку каркасних ділянок (Нu І) синтезували за тим самим методом, що використовувався для одержання химерних антитіл проти CD40 із визначеними модифікаціями. Були синтезовані перекривані олігонуклеотиди, що кодують каркасні ділянки Η і L варіабельних доменів матричних антитіл людини і CDR мишачих антитіл проти CD40, визначених Е.А. Кабатом [Kabat, Ε. Α., et al., Послідовності білків, що становлять собою інтерес з боку імунології (5th Ed.), Washington DC: Unted States Department of Health and Human Services (1991); Kabat, Ε.Α., et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]. Також були синтезовані вироджені олігонуклеотиди, що кодують амінокислоти як людини, так і миші в семи положеннях VH і одному положенні VК каркасних ділянок (Фіг.15, залишки відзначені зірочками).

Бібліотеки каркасних ділянок із HCDR3 (Нu II) і HCDR3/LCDR3 (Нu III) були синтезовані за тим самим методом, що і комбінаторні бібліотеки каркасних ділянок, із визначеними модифікаціями. CDR-залишками, відібраними для мутагенезу, були такі: Ser95-Tyr102 у HCDR3 і Gln89-Thr97 у LCDR3 (Фіг.15, підкреслені). Для забезпечення мутації визначеного залишку CDR були спроектовані олігонуклеотиди, що кодують HCDR3 і LCDR3, а їхній синтез здійснювали шляхом уведення NN(G/T) у кожному положенні так, як описано в [Glaser, S.Μ., et al., J. Immunol. 149:3903-3913 (1992)]. Перекривані олігонуклеотиди, що кодують бібліотеку каркасних ділянок, і CDR миші не з бібліотеки, об'єднували з 25пкМ олігонуклеотидів, що кодують мутантну ділянку HCDR3, або з 25пкМ кожного з олігонуклеотидів, що кодують мутовані ділянки HCDR3 і LCDR3.

3. Скринінг фагових експресійних бібліотек

Бібліотеки Нu II і Нu III спочатку піддавали скринінгу за модифікованим способом збору бляшок, який має назву «захоплення бляшок» [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 256:169-177 (1998)]. При цьому нітроцелюлозні фільтри (82-мм) покривали антитілами кози проти капа-ланцюгів антитіла людини, блокували 1%-м БСА і наносили на чашки з агаром, що містили бактеріальний газон, інфікований фагами. Спочатку фаги наносили в концентрації 105фагів/100мм чашку. Після захоплення експресованого фагами варіанта Fab проти CD40, фільтри інкубували 3 години при 25°С із 5нг/мл CD40-lg у PBS, що містив 1% БСА. Фільтри відмивали чотири рази розчином PBS, який містив 0,1% Твіну 20, і далі інкубували з антитілами кози проти lgG2b миші, кон'югованими з лужною фосфатазою (Soutern Biotechnology), 3000-кратно розбавленим, у PBS, що містить 1% БСА, протягом 1 години при 25°С. Після цього фільтри відмивали 4 рази розчином PBS, що містив 0,1% Твіну 20, і піддавали обробці так, як описано вище [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 256:169-177 (1998)]. Для виділення окремих клонів позитивні бляшки, відібрані при першому скринінгу, збирали і переносили при меншій густині (<103фагів/100мм чашку) і потім піддавали скринінгу за тим самим методом.

Комбінаторну бібліотеку Нu І спочатку піддавали скринінгу за методом ELISA, який забезпечує швидку оцінку відносних афінностей варіантів антитіл [Watkins, J.D.( et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)]. Крім того, метод ELISA використовували для характеризації клонів, ідентифікованих за методом захоплення. Планшети для мікротитрування покривали 5мкг/мл антитіл кози проти капа-ланцюгів антитіла людини (Soutern Biotechnology) і блокували 3%-ним розчином БСА в PBS. Потім 50мкл Fab із культурного супернатанту Е. Соlі або клітинного лізату інкубували в чашках протягом 1 години при 25°С. Далі чашки відмивали три рази PBS, який містив 0,1% Твіну 20, і 0,1мкг/мл CD40-lg у PBS, що містив 1% БСА, протягом 2 годин при 25°С. Після цього чашки відмивали три рази розчином PBS, який містив 0,1% Твіну 20 і добавляли кон'югат антитіл кози проти lgG2b миші з лужною фосфатазою, 3000-кратно розведеним розчином PBS, що містив 1% БСА, протягом 1 години при 25°С. Чашки відмивали три рази розчином PBS, який містив 0,1% Твіну 20, і обробляли відомим шляхом [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)].

4. Секвенування ДНК

Ізолювали одноланцюгову ДНК і секвенували гени варіабельних ділянок Η- і L-ланцюгів заявлених гуманізованих антитіл за допомогою методу флуоресцентної дідеоксинуклеотидної термінації (Perkin-Elmer, Foster City, CA).

Нижче наведені нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:7) і амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:8) варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла F4:

Нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:9) і амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:10) варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованих антитіл F4 і L3.17 мають такий вигляд:

Нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:11) і амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:12) варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла L3.17 мають такий вигляд:

5. Експрагія й очищення Fah

Деякі Fab були клоновані у векторі експресії під контролем регульованого арабінозою BAD-промотора. Крім того, послідовність із 6 гістидинових залишків була злита з карбокси-кінцевою ділянкою Η-ланцюга для забезпечення очищення на смолі, що утворює нікель-хелатні комплекси. Очищені Fab були схарактеризовані так, як описано нижче [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)].

6. Характеризація Fab

Планшети Immulon II для мікротитрування покривали 0,1мкг/мл CD40-lg у PBS протягом 16 годин при 4°С і блокували 3% розчином БСА в PBS. Потім планшети відмивали три рази в PBS, що містив 0,1% Твіну 20, і звільнювані з периплазматичного простору Fab розбавляли послідовними триразовими розведеннями в PBS, що містив 1% БСА. Далі планшети інкубували з Fab протягом 2 годин при 25°С. Потім планшети відмивали чотири рази PBS, що містив 0,1% Твіну 20, і виявляли зв'язувальну спроможність антитіл інкубуванням їх з антитілами кози проти капа-ланцюгів антитіл людини, кон'югованими з лужною фосфатазою, 2000-кратно розведеними PBS, що містили 1% БСА, протягом 1 години при 25°С. Далі планшети чотири рази відмивали PBS, що містив 0,1% Твіну 20, і результати враховували колориметричним шляхом [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)].

Для тестування варіантів на інгібування зв'язування ліганду планшети Immulon II покривали 2мкг/мл антитілами проти CD8 миші для захоплення злитого білка sgp39, що експресує домен CD8. Планшети 1 раз відмили PBS, який містив 0,05% Твіну 20 і блокували 3% розчином БСА в PBS. Потім планшети один раз відмили PBS, що містив 0,05% Твіну 20, і інкубували з культурним середовищем клітин, яке містило насичені рівні sgp39, протягом 2 годин при 25°С. Білок sgp39, що не зв'язався, відсмоктали, а планшети відмили два рази PBS, що містив 0,05% Твіну 20. Потім 25мкл очищеного варіанта Fab, послідовно трикратно розведеного PBS, добавили в лунки і до них внесли 25мкл Іg проти CD40 людини з концентрацією 4мкг/мл у PBS. Далі планшети інкубували 2 години при 25°С і тричі відмили PBS, що містив 0,05% Твіну 20. Зв'язування CD40-lg виявили через 1 годину інкубації при 25°С із (Раb')2-фрагментами антитіл кози проти Fcg IgG людини, кон'югованими з пероксидазою хріну (Jackson), 10000-кратно розведеною PBS. Далі планшети відмили 4 рази PBS, що містив 0,05% Твіну 20, і зв'язування визначали за кількісним колориметричним методом шляхом інкубування з 1мг/мл о-фенілендіаміндигідрохлориду і 0,003% пероксиду водню в 50мМ оцтової кислоти, 100мМ Nа2НРО4, рН 5. Реакцію зупинили доданням H2SO4 до кінцевої концентрації 0,36Μ і визначили поглинання на хвилі 490нм.

7, Аналіз за методом ВІАсоге

Кінетичні константи взаємодії між CD40 і варіантами антитіл проти CD40 визначали за методом поверхневого плазмонного резонансу (ВІАсоге). Злитий білок CD40-lg імобілізували з (1-етил-3-[3-диметиламінопропил]-карбодіімідом гідрохлоридом) і активованим N-гідроксисукцинімідом сенсорним чипом СМ5 шляхом уведення 8мкл 10мкг/мл CD40-lg у 10мМ ацетаті натрію, рН 4. CD40-lg імобілізували за низької густини (приблизно 150 RU) для запобігання повторного зв'язування Fab під час дисоціації. Для одержання констант швидкості асоціації(kon) швидкість зв'язування Fab у шести концентраціях 25-600нМ у PBS визначали при швидкості потоку 20мкл/хв. Константи швидкості дисоціації (koff) розраховували як середні значення шести вимірювань, отримані під час аналізу фази дисоціації. Сенсограми аналізували за допомогою програми ВІА 3.0. Kd обчисляли за формулою kd=koff/kon. Залишкові Fab-фрагменти видаляли шляхом пролонгованої дисоціації після кожного вимірювання.

Результати кінетичного аналізу гуманізованих антитіл F4 і L3.17 у порівнянні з химерними Fab представлені в Таблиці 1:

Таблиця 1

КЛОН ID #

Kon

Koff

Kd

Примітка

Химерний Fab

8.43Е+5

2.65Е-3

3.14нМ

Отриманий при розщеплюванні папаїном химерного Іg 2.220

F4

2.00Е+6

4.77Е-4

0.24нМ

Гуманізований

L3.17

3.17Е+6

3.28Е-4

0.10нМ

Гуманізований

8. Результати гуманізування

Як описано вище, послідовності каркасних ділянок варіабельної області мАТ миші проти CD40 використовувалися для ідентифікації, найбільшою мірою, гомологічних послідовностей зародкової лінії людини. Залишки каркасних ділянок Η-ланцюга були на 74% ідентичні послідовностям VH7(7-4.1) і JH4 зародкової лінії людини, у той час як L-ланцюг був на 75% ідентичним відповідним послідовностям VKIII (L6) і JK4 зародкової лінії людини. Вирівняні варіабельні послідовності Н- і L-ланцюгів показані на Фіг.15. Залишки CDR, визначені Кабатом. [Kabat, E.A., et al., Секвенування послідовностей білків, що становлять імунологічний інтерес (5th Ed.), Washington DC: United States Department of Health and Human Services (1991); Kabat, E.A., et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1997)] підкреслені і виключені з аналізу на гомологію. Залишки каркасних ділянок, що різняться у мАТ миші і матричних антитіл людини, оцінювалися індивідуально.

По результатах структурного аналізу й аналізу послідовностей ділянки CDR антитіл за винятком HCDR3 виявляли обмежене число основних конформацій ланцюга, які звуться канонічними структурами [Chothia, С. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, C. et al., Nature 342:877-883 (1989)]. Більш того, були ідентифіковані певні залишки, критичні для виявлення основних конформацій петель CDR [Chothia, С. et al., J. МоI. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, C. et al., Nature 342:877-883 (1989)]. Були також ідентифіковані канонічні залишки каркасної ділянки анти-СD40 миші, і було показано, що амінокислоти у всіх критичних канонічних позиціях каркасних ділянок Н- і L-ланцюга матриць людини ідентичні відповідним амінокислотним залишкам антитіл миші.

Експоновані на поверхні амінокислотні залишки антитіл миші, які зазвичай в антитілах людини не виявляються, швидше за все дають певний внесок в імуногенність гуманізованих мАТ [Padlan, E.A. МоІ. ІmmunоІ. 28:489-498 (1991)]. Таким чином, були проаналізовані залишки каркасних ділянок, що відрізняються в анти-СD40 миші і матричних антитілах людини, і на основі експонування в розчині було завбачене місце їхнього знаходження - тобто усередині або на поверхні антитіл [Padlan, E.A. МоI. Immunol. 28:489-498) (1991)]. Не очікувалося, що експоновані в розчин залишки каркасних ділянок, дистальні відносно CDR, дають істотний внесок у зв'язування антигена, і тому за винятком двох залишків Н-ланцюга, усі були замінені на відповідні амінокислоти людини для зниження можливої імуногенності. Для залишків 28 і 46 Η-ланцюга було завбачено, що вони є експонованими в розчин. Проте Н28 локалізований у межах HCDR1-ділянки, як визначено в праці [Chothia et al.] (див. вище) і, можливо, взаємодіє з антигеном. Крім того, лізин Н46 у мАТ миші до деякої міри є нетиповим і істотно відрізняється від глутамінової кислоти в матричному антитілі людини. Таким чином, залишки Н28 і Н46 в антитілах миші і людини були експресовані в комбінаторній бібліотеці (Фіг.15, відзначені зірочками).

Решту різноманітних залишків каркасних ділянок для котрих завбачено, що вони здебільшого «утоплені» в антитіло, оцінюють за такими показниками: (1) близькості до CDR; (2) спроможності контактувати з протилежним доменом VК-VH-простору; (3) ступенем доречності різноманітних амінокислот; і (4) прогнозованим ступенем важливості в модулюванні CDR-активності, як визначено в праці [Studnicka, G.M., et aІ., Protein Eng. 7:805-814 (1994)]. Велика частина розходжень занурених амінокислотних залишків каркасних ділянок L-ланцюга відносилась до споріднених амінокислот у положеннях, для яких вважалось малоймовірним їхнє безпосереднє залучення до конформації CDR. Проте, L49 локалізований у безпосередній близькості від LCDR2 і такий, що потенційно контактує з VH-доменом, не зв'язаний із залишком людського походження і може бути залучений у детермінацію конформації LCDR2. З цих причин амінокислоти мишачого і людського походження в положенні L49 експресуються в комбінаторній бібліотеці каркасних ділянок (Фіг.15, відзначені зірочками).

Аналіз послідовності Η-ланцюга миші і матричних послідовностей людського походження був більш складним. Залишок Н9 був проліном у мАТ миші, у той час як матриця людського походження містила неспоріднений залишок серину. Положення Н9 також може грати певну роль у модулюванні конформації CDR і, таким чином, воно було відібране в якості сайта комбінаторної бібліотеки (Фіг.15, відзначені зірочками). Решта занурених залишків каркасної ділянки, що різнилися в анти-СР40 миші і матриці Η-ланцюга, знаходилася в положеннях 38, 39, 48 і 91 каркасної ділянки. мАТ миші проти CD40 містили глутамін і глутамінову кислоту в положеннях Н38 і Н39 відповідно, у той час як матриця людського походження містила аргінін і глутамін. Залишок Н38 знаходився поблизу від HCDR1, зміна глутамін®аргінін не є консервативною, а експресія глутаміну в цьому сайті в мАТ миші до деякої міри незвичайна. Аналогічним чином, зміна глутамінова кислота®глутамін є неконсервативним розходженням для занурених амінокислот, Н39 є потенційним контактним залишком VК, а глутамінова кислота до деякої міри є нетиповою для мАТ миші. Залишок Н48 знаходиться в безпосередній близькості від HCDR2 і Н91 і завбачено, що це положення є сайтом високого ризику [Studnicka, G.M., et al., Protein Eng. 7:805-814 (1994); Harris, L, et al., Prot. Sci. 4:306-310 (1995)], що потенційно контактує з VК-домєном. Таким чином, амінокислотні залишки як антитіл миші, так і людини експресувались у положеннях Н38, 39, 48 і 91 (Фіг.15, відзначені зірочками).

У цілому, бібліотека каркасних ділянок складалася з CDR миші, щеплених на матриці людського походження. Крім того, один залишок каркасної ділянки L-ланцюга і 7 залишків каркасної ділянки Η-ланцюга розглядалися як потенційно важливі для підтримки активності мАТ. Всі зазначені сайти були схарактеризовані шляхом синтезу комбінаторної бібліотеки, що експресувала усі можливі комбінації амінокислот людини і миші, знайдених на цих залишках. Загальний діапазон розмаїтості бібліотеки, позначеної як Нu І, складався з 28 або 256 варіантів (Таблиця 2, нижче).

Таблиця 2

Загальні дані про фагові бібліотеки експресії антитіл проти CD40

Бібліотека

Положення

Розмір*

Піддано скринінгу**

Hu I

Каркасна ділянка

256

2,4x103

Hu ll

Каркасна ділянка, HCDR3

1,1x105

2,0x106

Нu III

Каркасна ділянка, HCDR3, LCDR3

3,1x107

5,5x105

*Число унікальних клонів на підставі ДНК-послідовності. Для кодування всіх 20 амінокислот у кожному положенні CDR використовувалися тридцять два кодони.

**Бібліотеку Нu І піддавали скринінгу за методом ELISA, використовуючи антитіла, експресовані у дрібномасштабних бактеріальних культурах [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)]. Бібліотеки Нu II і Нu III були висіяні на газони з XL-1 блакитним агаром при концентрації 105 бляшок на 100мм чашку і далі піддані скринінгу за методом захоплення [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 256:169-177 (1998)].

Бібліотеку Hu І експресували в дрібномасштабних (<1мл) бактеріальних культурах, однакові кількості Fab, що звільнюються з периплазматичного простору, поміщали в планшети для мікротитрування, і зв'язувальну активність антитіл порівнювали безпосередньо за методом ELISA [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)]. Незважаючи на те, що були ідентифіковані варіанти, що зв'язують антиген-мішень з афінністю, яка є порівнянною або перевищує активність химерного Fab, більшість скринованих клонів Hu І були менш активними, ніж химерний Fab проти CD40. Приблизно 6% випадково відібраних варіантів Hu І виказували зв'язувальну активність, порівнянну з химерним Fab (дані не наведені). Ідентифікація численних варіантів Hu І з активністю, порівнянною з активністю химерного Fab CD40, погоджувалася з інтепретацією даних про те, що більшість критичних залишків каркасної ділянки включена в комбінаторну бібліотеку.

Активні клони були схарактеризовані далі титруванням на імобілізованому антигені, що забезпечує ідентифікацію численних варіантів зі збільшеною афінністю. Наприклад, клон 19С11 зв'язував CD40-рецептор із більш високою афінністю, ніж химерний Fab, як це підтверджується зсувом профілю титрування (Фіг.16, незафарбовані кружки в порівнянні з зафарбованими). ДНК-секвенування 34 найактивніших клонів дозволило ідентифікувати 24 унікальні комбінації каркасних ділянок, кожна з яких містила 2-6 залишків каркасних ділянок антитіл миші (дані не наведені).

LCDR3 і HCDR3 контактують з антигеном безпосередньо, реагуючи з іншими CDR, і часто значним чином впливають на афінність і специфічність антитіл [Wilson, ΙΑ et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 3:113-118 (1993); Paldan, E.A. МоІ. Immunol. 31:169-217 (1994)]. Крім того, конформація LCDR3 і HCDR3 частково була визначена за допомогою залишків каркасної ділянки. Для ідентифікації найактивнішого антитіла був використаний мутагенез кодонів [Glaser, S.M. et al., J. Immunol. 149:3903-3913 (1992)] з метою синтезу олігонуклеотидів, що вводять мутації в кожне положення в HCDR3, одну за один раз, приводячи до експресії всіх 20 амінокислот у кожному залишку CDR. Кожний олігонуклеотид, кодує не більш ніж одну зміну амінокислоти. Пул олігонуклеотидів, що кодують бібліотеку HCDR3, змішували з перекриваними олігонуклеотидами, що кодують комбінаторну бібліотеку караксних ділянок і інші CDR, для одержання бібліотеки «каркасна ділянка/НСРРЗ». Розмаїтість зазначеної бібліотеки, позначеної як Нu II, оцінювалася величиною 1,1x105 (Таблиця 2, див. вище). Бібліотека LCDR3 була синтезована аналогічним чином. Олігонуклеотиди, що кодують LCDR3, HCDR3 і комбінаторну бібліотеку каркасних ділянок використовували для одержання бібліотеки «каркасні ділянки/HCDR3/LCDR3», позначеної як Hu III. Велика кількість комбінацій «каркасна ділянка/СРР3» у бібліотеці оцінювалося величиною 3,1х107 (Таблиця 2, див. вище).

Комбіновані мутації в LCDR3 і/або HCDR3 у бібліотеці каркасних ділянок збільшили число потенційних варіантів гуманізованих анти-СD40 від 256 до більш, ніж 107. З метою більш ефективного скринінгу таких бібліотек був використаний модифікований метод відбору бляшок, відомий як «захоплення бляшок» [Watkins, J.D., et al., Anal. Biochem. 256:169-177 (1998)]. Полягав він у тому, що інфіковані фагом бактерії поміщали на твердий агар, і на агар послідовно нашаровували нітроцелюлозні фільтри, покриті Fab-специфічним реагентом. Після захоплення практично близьких кількостей експресованих фагами Fab фільтри обробляли 5нг/мл злитого білка CD40-lg. Оскільки на фільтри був нанесений антиген у концентраціях, значно нижчих за Kd Fab, виявлялися лише ті варіанти, що виказували підвищену афінність. Численні клони з більш високою афінністю ідентифікували по результатах скринінгу більш ніж 106 варіантів бібліотеки Нu II і більш ніж 105 варіантів бібліотеки Hu III за допомогою 82мм фільтрів, що містили близько 105 варіантів на фільтр (Таблиця 2).

Через високу густину фагів на фільтрах позитивні бляшки відбирали, пересівали на чашки з більш низькою густиною і знову піддавали їх скринінгу. Далі варіанти, які продукували найбільш інтенсивний колориметричний сигнал у методі «захоплення бляшок» схарактеризували за допомогою ELISA. Як і очікувалося, більшість клонів, ідентифікованих скринінгом захоплення бляшок, зв'язували CD40 краще, ніж химерний Fab. Титрування варіантів на імобілізованому CD40-lg дозволило ідентифікувати численні клони з більшою афінністю, ніж химерний і гуманізований Fab (Фіг.16, порівняння незафарбованих квадратів, зафарбованих трикутників і кружків).

Мутації «каркасні ділянки/CDR», що забезпечували посилену афінність, ідентифікували секвенуванням ДНК. Унікальні послідовності варіабельних ділянок ідентифікували в 10 із 13 Нu II варіантів і в 3 із 4 Нu III варіантів. Варіанти Нu II і Нu III, що містили 1-5 залишків мишачого походження в каркасних областях і 0-2 СDR3-мутації, підсумовані в Таблиці 3 нижче.

Таблиця 3

Одночасна оптимізація каркасних ділянок і залишків CDR дозволяє на ідентифікацію варіантів із більш високою афінністю

Бібліотека

Клон

Залишки в каркасних ділянках AT миші*

Мутації CDR

Химерний

(43)

0

Нu 1

19С11

(2)Н28,48

0

Нu II

CW43

(3)Н9,28,91

HCDR3, 101А®R

2В12

(5)Н9,28,38,46,48

HCDR3, 101А®К

Нu III

2В12

(5)9,28,38,46,48

HCDR3, 101А®К

2В8

(1)Н28

HCDR3, 101А®К

LCDR3, 96R®Υ

*Число залишків на каркасних ділянках AT миші, що відрізняються від найбільш гомологічної послідовності зародкової лінії людини, визначене по числу CDR згідно з [Kabat et al.] (див. вище). Число залишків у каркасних ділянках AT миші, що відрізняються від матриць AT людини, укладено в скобки. Всі розходження в каркасних ділянках між мАТ миші і гуманізованими версіями AT локалізовані на Η-ланцюгу (Н) у позначених положеннях відповідно до нумераційної системи Кабата [Kabat et al.] (див. вище).

Афінність експресованих у бактеріях химерних Fab і відібраних варіантів із кожної бібліотеки була схарактеризована більш докладно за методом поверхневого плазмонного резонансу для визначення швидкостей асоціації і дисоціації очищених Fab з імобілізованим CD40-lg. Химерні анти-СР40 мали константу дисоціації kd=3,14нМ і, узгоджуючись з результатами скринінгу, багато варіантів виявляли більш високу афінність. Два з кращих клонів - F4 і L3.17 - мали Kd=0,24нМ і 0,10нМ відповідно (Таблиця 1). Підвищення афінності варіантів анти-СР40 виказували переважно більш повільну швидкість дисоціації, у той час як величини швидкості асоціації були схожими в усіх варіантів (розкид від 0,9 до 3,2х106М-1S-1).

І нарешті, варіанти з підвищеною афінністю тестували на їхню спроможність блокувати зв'язування ліганду gp39 із рецептором CD40. Всі варіанти гальмували зв'язування розчинного злитого білка CD40-lg з імобілізованим антигеном gp39 дозо-залежним чином, що корелювало з афінністю Fab (Фіг.17). Наприклад, найсильніший інгібітор зв'язування ліганду зі злитим білком CD40-lg являв собою варіант 2В8, який також був варіантом із найбільш високою афінністю проти CD40 (Фіг.17). Варіант 2В8 виказував приблизно у 17 разів вищу афінність із CD40, ніж химерні Fab, і гальмував зв'язування ліганду приблизно у 7 разів ефективніше.

Приклад 5

Модельна система на мишах

Автори також одержали і тестували in vivo моноклональні антитіла пацюка проти CD40 миші, позначені як 7E1-G2b, і їхні попередники 7E1-G1. Одержання таких антитіл було пов'язане з необхідністю вивчення анти-СР40-терапії аутоімунних, запальних і трансплантаційних захворювань на модельних системах мишей. У першу чергу завдання полягало в тому, щоб створити конкурентні антитіла проти антитіл миші, які б імітували 2.220 і блокували зв'язування gp39/CD40 за слабкої співстимулюючої активності, і протестувати такі антитіла in vivo на експериментальних моделях захворювань.

А. Одержання і характеристика мАТ 7E1-G1 і 7E1-G2b проти CD40 миші

1. Імунізація, злиття i характеристика

Для імунізації 8-тижневих самок пацюків Lewis через подушечки лап використовували рекомбінантно злитий білок миші CD40-lg, що складався з позаклітинної ділянки CD40 миші, злитої з шарнірною ділянкою, СН2- і СН3-доменів антитіла lgG2a миші (mCD40-mlg). Через три дні після останньої імунізації лейкоцити з дренованих лімфатичних вузлів зливали з клітинами мієломи Х63-Аg8.653 миші для одержання гетерогібридом пацюк/миша. Лунки, що містили антитіла, специфічні до нативного CD40 миші, ідентифікували на реактивність із початковим імуногеном mCD40-mlg в ELISA і на реактивність із позитивною по CD40 В-клітинною лімфомною лінією WEHI-231, АТСС CRL-1702. Потім супернатанти тестували на їхню спроможність інгібувати зв'язування mCD40-mlg із розчинним, рекомбінантно злитим білком mCD8-gp39 миші, mgp39, еквівалентом sgp39 мишачого походження. Приблизно 12 із усіх лунок із найбільш сильною інгібіторною активністю клонували за методом обмежувальних розведень.

Після клонування проводили дослідження функціональності на культурних супернатантах й очищених антитілах для більш точної оцінки спроможності мАТ проти CD40 інгібувати взаємодію gp39 миші і CD40 і визначення їхніх стимуляторних властивостей. Інгібіторні властивості визначали за спроможністю AT інгібувати зв'язування mgp39 із WEHI-231 за допомогою відомих стандартних методик. Стимуляторні властивості визначали шляхом індукції густої гомотипової адгезії клітин WEHI-231 і проліферації В-клітин селезінки при наявності антитіл і анти-lgM за відомими методами. Таким чином, були ідентифіковані три мАТ (5А3, 7E1-G1 і 8Е1), що із найбільшою імовірністю були антитілами 2.220 проти CD40 людини з очікуваним рівнем співстимуляторної активності і спроможністю блокувати gp39/CD40.

2. Селекція 7Е1 як основного мАТ проти CD40 миші

Експерименти in vivo на мишах мали на меті визначити те, які з мАТ проти CD40, що блокують і володіють співстимуляторною активністю, найбільш ефективно придушують специфічний антитільний відгук на Т-залежні антигени. У зв'язку з цим вивчали супресію lgG-антитільного відгуку на ЕО у мишей під впливом мАТ проти CD40 миші. Групи з п'ятьох мишей BALB/c були імунізовані 1x108 ЕО й одночасно оброблені інтраперитонеально 1мг мАТ 5АЗ, 7E1-G1 або 8Е1 проти CD40 миші. У якості контрольних зразків брали групи аналогічним чином імунізованих мишей, оброблених MR1 (антитіла хом'ячка проти gp39 миші, позитивний контрольний зразок 250мкг), 6Е9 (антитіла пацюка проти gp39, негативний контрольний зразок, 1мг) або PBS. У мишей визначали титри Іg до ЕО в ELISA на 7, 14, 21 і 35-й дні. Результати показали, що коли тварині вводять одну дозу антитіл при одночасному введенні антигена ЕО, мАТ 7E1-G1 виказує більш ефективне придушення lg-відгуку на ЕО порівняно з мАТ 5А3 або 8Е1. Таким

52

чином, зазначене мАТ було відібране як найбільш перспективне моноклональне антитіло проти CD40 для вивчення на мишах.

3. Варіант мАТ 7E1-G1 із переключеним ізотипом

7E1-G1 не виказує ефекторних функціональних властивостей, порівнянних із властивостями химерного мАТ 2.220 проти CD40 миші (наприклад, IgG пацюка не є ефективними у якості lgG1 людини в реакції зв'язування комплемента і взаємодії з Fc-рецептором), і профіль специфічної антитільної супресії in vivo для 7Е1 не такий показовий, як для мАТ 2.220 в дослідженнях на приматах. Таким чином, антитіло зі специфічністю 7Е1, але ізотипу AT пацюка більш близького до lgG1 людини, буде мати ефекторні функції, більш схожі з такими в lgG1 людини. З цією метою за методом субселекції був отриманий природний варіант 7Е1 із переключеним ізотипом, тобто переключеня здійснювали в напрямку lgG1 -» lgG2b [Hale et al., J. Immunol. Methods 103(l):59-67 (1987)]. Коротко, мАТ проти CD40 ізотипу lgG2b було ідентифіковане за методом ELISA серед супернатантів 96-лункових планшетів, у які висівали 1000кл/лунку початкової гібридоми 7Е1. Клітини поміщали у планшети з густиною 200 і далі 20 клітин у розрахунку на лунку, і кожного разу відбирали лунки, позитивні за утворенням lgG2b. Далі клітини з відібраних лунок 2 рази тестували за методом обмежувальних розведень і виділяли клони 7Е1, що продукували lgG2b переключеного ізотипу 7Е1 -G2b.

Клон 7E1-G2b продукував антитіла переключеного варіанта ізотипу lgG1, що підтверджується трьома різними дослідженнями. По-перше, N-кінцеве секвенування важкого ланцюга показало, що як отримані антитіла, так і антитіла-попередники ідентичні першим 35 амінокислотним залишкам. По-друге, PCR при використанні праймерів, специфічних до CDR варіабельної ділянки важкого ланцюга 7E1-G1, приводить до утворення молекул відповідного розміру на матриці кДНК, отриманої з 7E1-G1 або 7E1-G2b, а не з двох інших неспоріднених антитіл. І нарешті, оцінка зв'язувальної активності очищених антитіл двох версій з імобілізованим CD40-hlg в ELISA при використанні анти-капа індикаторного реагенту дала практично однакові криві титрування.

Б. Дослідження in vivo

1. Порівняння 7E1-G1 і 7E1-G2b на моделі антитільного відгуку in vivo

7E1-G1 порівнювали з 7E1-G2b на ефективність in vivo при використанні ЕО в якості залежного від Т-клітин антигена. Групи з 3-5 тварин імунізували внутрішньовенно ЕО й одночасно інтраперитонеально антитілами 7E1-G1 або 7Е1-G2b у дозах 1, 0,25 або 0,1мг речовини в день 0, як показано на Фіг.10. Антитіла мАТ MR1 проти gp39 миші служили позитивним контрольним реагентом на імуносупресорний ефект. Антитіла мАТ 6Е9 і PBS служили в якості недоречних мАТ і контрольних реагентів не-мАТ відповідно. Мишей оцінювали на титри антитіл проти ЕО за методом ELISA на 7, 14 і 21-й дні. Титри відповідали обчисленому розведенню сироватки, що дає OD=3 в ELISA. Як показано на Фіг.10, 7E1-G2b придушували lgG-відгук на ЕО в дозах, коли 7E1-G1 не були активні.

2. Дозовий відгук 7E1-G2b на Т-залежні антигени на моделях мишей

7E1-G2b оцінювали на залежний від Т-клітин первинний імунний відгук на моделях при використанні ЕО в якості антигена. 7E1-G2b тестували в різноманітних дозах для визначення найменшої ефективної дози. Мишей BALB/c (n=5) ін'єктували IV 1x108ЕО, а також здійснювали одну ін'єкцію 7E1-G2b у встановлених дозах, або MR1 (антитіла проти gp39 миші), або PBS вводили в той самий час у якості антигена в день 0. На Фіг.11 показаний lg-відгук на ЕО на 7, 16 і 28-й дні. Одержані значення відповідають поглинанню в ELISA при розведенні сироватки 1/50. Рисками позначене стандартне відхилення.

Як видно на Фіг.11, одна обробка 7E1-G2b у дозі 25мкг/мишу (1,25мг/кг) приводила до придушування lg-імунного відгуку на 87% на 16-й день, а в дозах 50 або 100мкг - цілком на 16-й день. На 28-й день доза 50мкг/мишу придушувала lg-відгук на 89%, а доза 100мкг/мишу - цілком. Слід звернути увагу на те, що MR1 використовувався в якості позитивного контрольного зразка імуносупресії в субоптимальній дозі 100мкг/мишу.

3. 7F1-G2b і запобігання індукованому колагеном артриту (ІКА) на модeлях мишей

Стандартна експериментальна модель ревматоїдного артриту миші, модель індукованого колагеном артриту (ІКА), використовувалася для визначення ефекту 7E1-G2D щодо запобігання артриту. Самок мишей DBA/IJ (віком 6-8 тижнів) ін'єктували 200мкг колагену типу II курчати (К II) у повному ад'юванті Фрейнда внутрішньовенно в день 0. 7E1-G2b у дозі 250мкг уводили інтраперитонеально кожні чотири дні, починаючи з 7-го. Контрольну групу обробляли PBS за тією самою дозовою схемою. Потім всіх мишей на 21-й день бустирували К II у неповному ад'юванті Фрейнда. За тваринами спостерігали щодня, реєструючи набряки лап і оцінюючи їх за шкалою 0-3, де цифра 3 відповідає максимальному набряку й еритемі. Крім того, лапи щодня вимірювали штангенциркулем. Загальні клінічні показники одержували, сумуючи дані по кожній лапі під час умертвіння тварин і ділячи їх на загальне число тварин у кожній групі. Значення відповідних величин представляли у вигляді середніх результатів по групах.

Розвиток артриту і супутнє запалення суглобів цілком інгібувалось при введенні 7E1-G2b, як показано в Таблиці 4 нижче. У мишей, яких обробляли 7Е1-G2b, цілком були відсутні симптоми захворювання протягом 90 днів.

Таблиця 4

Лікування артриту індукованого колагеном

Група

Виникнення артриту

Серед. величина

Серед. величина

Серед. розмір

День захворювання

Клінічний показник

Розмір лапи

7E1-G1

0/5

0

0

0,075

7E1-G2b

0/5

0

0

0,075

PBS-Контроль

4/4

30(27-32)

3,5(3-4)

0,114 (0,110-0,117)

Як показано вище, заявлені антитіла є сильними імуномодуляторами і можуть знайти терапевтичне застосування для лікування різноманітних захворювань.

Даний винахід стосується химерних і гуманізованих антитіл, описаних вище, із додатковими консервативними амінокислотними замінами, що практично не справляють суттєвого впливу на зв'язування CD40. Консервативні заміни, зазвичай, включають до свого числа заміщення однієї амінокислоти на іншу, яка володіє подібними властивостями, наприклад, заміщення в межах таких груп: валін, гліцин; гліцин, аланін; валін, ізолейцин, лейцин; аспарагінова кислота, глутамінова кислота; аспарагін, глутамін; серин, треонін; лізин, аргінін; і фенілаланін, тірозин.

Один з аспектів винаходу стосується одержання химерних і/або гуманізованих антитіл, як описано вище, шляхом експресії рекомбінантних сегментів ДНК, що кодують варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів Іg миші (або їхні фрагменти), сполучені із ДНК-сегментами, що кодують постійні ділянки Іg людини. Прикладом отриманої відповідно до винаходу ДНК-послідовності, що кодуює поліпептидний ланцюг, який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга або її фрагмент, може служити послідовність SEQ ID NO:1 або відповідний депонований клон АТСС. Прикладом отриманої відповідно до винаходу ДНК-послідовності, що кодує поліпептидний ланцюг, який включає у себе варіабельну ділянку важкого ланцюга або її фрагмент, може служити послідовність SEQ ID NO:2 або відповідний депонований клон АТСС.

Винахід стосується також варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів Іg, а також їхніх активних або функціональних фрагментів. Імунологічно значущі або функціональні форми білка або його фрагментів називаються тут варіабельними ділянками легкого/важкого ланцюга або їх біологічно активними частинами. В аналізованому випадку біологічно активні частини білка включають до свого числа фрагмент згаданих легкого або важкого ланцюгів, які у складі антитіла усе ще забезпечують зв'язування антитіла з CD40 людини.

Винахід також стосується послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів заявленого антитіла. Наприклад, нуклеотиди 1057-1422 (SEQ ID NO:5), показані на Фіг.13, являють собою кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу; нуклеотиди 1065-1388 (SEQ ID NO:6), показані на Фіг.14, являють собою кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу. SEQ ID NO:7 і SEQ ID NO:11 є кращими послідовностями нуклеїнової кислоти, що кодують варіабельні ділянки легких ланцюгів заявлених гуманізованих антитіл; SEQ ID NO:9 являє собою кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюіа заявленого гуманізованого антитіла. Плазміди, які містять полінуклеотиди SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 і SEQ ID NO:11, депоновані в АТСС.

Химерні і/або гуманізовані антитіла, що зв'язують CD40 людини і включають у себе поліпептиди, в сутності гомологічні або такі, що мають практично ідентичні послідовності амінокислот по відношенню до послідовностей варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів, описаних відповідно до даного винаходу, також включені в об'єм винаходу. Наприклад, об'ємом даного винаходу охоплюються також химерні антитіла, що містять ділянку легкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85%, і краще, якщо принаймні на 90%, а ще краще, якщо принаймні на 95%, і найкраще, якщо принаймні на 98% ідентична послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO:4. Точніше, об'ємом даного винаходу також охоплюються химерні антитіла, що містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85%, краще, якщо принаймні на 90%, ще краще, якщо принаймні на 95%, і найкраще, якщо принаймні на 98% є ідентичною послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:1. Крім того, в об'єм винаходу включені гуманізовані антитіла, що містять ділянку легкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85%, краще, якщо принаймні на 90%, ще краще, якщо принаймні на 95% і, найкраще, якщо принаймні на 98% є ідентичною послідовності ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:8 і/або SEQ ID NO:12.

Крім того, в об'єм даного винаходу включені химерні антитіла, що містять ділянку важкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85%, краще, якщо принаймні на 90%, ще краще, якщо принаймні на 95%, і найкраще, якщо принаймні на 98% є ідентичною послідовності ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:3. Точніше, в об'єм даного винаходу також включені химерні антитіла, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85%, краще, якщо принаймні на 90%, ще краще, якщо принаймні на 95%, і найкраще, якщо принаймні на 98% є ідентичною послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:2. Крім того, об'ємом даного винаходу охоплюються також гуманізовані антитіла, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85%, краще, якщо принаймні на 90%, ще краще, якщо принаймні на 95%, і найкраще, якщо принаймні на 98% є ідентичною варіабельній ділянці важкого ланцюга SEQ ID NO:10.

Фрагменти ДНК також містять ДНК-послідовність, яка контролює експресію, функціонально пов'язану з послідовностями, що кодують химерне або гуманітарне антитіло, що включає природні або гетерологічні промоторні ділянки. Краще, якщо послідовності, що контролюють експресію, являли собою еукаріотичні промоторні системи у векторах, спроможних трансформувати або трансфікувати еукаріотичні клітини-хазяїни, проте для прокаріотичних хазяїв можуть бути використані контролюючі послідовності. Після включення вектора в підхожу клітину-хазяїн така клітина підтримується в умовах, необхідних для забезпечення високого рівня експресії нуклеотидних послідовностей і, якщо це потрібно, у подальшому можуть здійснюватися збір і очищення варіабельної ділянки легкого ланцюга, важкого ланцюга, димеров легкого/важкого ланцюга або інтактного антитіла, зв'язувальних фрагментів або інших форм імуноглобуліну, див. [Beychok, S., «Клітини синтезу імуноглобулінів», Academic Press, N.Y. (1979)]. Одноланцюгові антитіла можуть бути отримані шляхом з'єднання послідовностей нуклеїнової кислоти, що кодують розкриті в даному описі ділянки VL і VH з ДНК, що кодує поліпептидний лінкер.

Для експресії антитіл, отриманих відповідно до даного винаходу можуть бути використані прокаріотичні хазяїни, наприклад, E. соIі, й інші мікроорганізми, наприклад, дріжджі. Крім мікроорганізмів для експресії й одержання заявлених антитіл можуть використовуватись клітинні культури тканин ссавців. Еукаріотичні клітини можуть виявитися кращими; сьогодні відомі численні лінії клітин-хазяїнів, спроможні секретувати інтактні імуноглобуліни, до яких належать, наприклад, СНО-клітинні лінії, різноманітні COS-клітинні лінії, клітини НеLа, мієломні клітинні лінії і гібридоми. Вектори експресії для зазначених клітин можуть включати послідовності, що контролюють експресію, наприклад промотори або енхансери, і необхідні для процесінгу інформаційні сайти, наприклад, сайти зв'язування рибосом, сайти сплайсінгу РНК, сайти поліаденілювання, послідовності термінації транскрипції, відомі на сьогоднішній день.

Вектори, що містять необхідні ДНК-фрагменти (наприклад, послідовності, що кодують важкі і/або легкі ланцюги, і контролюючі експресію послідовності) можуть бути перенесені в клітини-хазяїни добре відомими методами, що залежать від типу клітини-хазяїна. Наприклад, у випадку прокаріотичних клітин, зазвичай, використовують метод кальцій-хлоридної трансфекції, у той час як у випадку еукаріотичних клітин використовують кальцій-фосфатну преципітацію або електропорацію, див., наприклад, [Maniatis, et al., «Молекулярне клонування: лабораторний посібник», Cold Spring Hurbor Press (1982)].

Після експресії цілі антитіла, їхні димери, окремі легкі і важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів, заявлені відповідно до даного винаходу, можуть бути очищеніза відомими стандартними методами, наприклад, преципітації сульфатом амонію, афінної хроматографії на колонках, гель-електрофорезу і т.д. Для фармацевтичного використання кращими є практично очищені, гомогенні на 90-95% Іg, а ще кращими - Іg, гомогенні на 98-99%.

Заявлені антитіла можуть знайти застосування в терапії захворювань, опосередкованих антитілами і/або Т-клітинами. До таких захворювань належать, наприклад, хвороба «трасплантат проти хазяїна», аутоімунні захворювання, наприклад, діабет типу І, псоріаз, множинний склероз, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчий лишай і міастенія гравіс. Крім того, зазначені антитіла можуть використовуватися для попередження відторгнення трансплантату.

Отримані відповідно до винаходу антитіла і фармацевтичні композиції особливо придатні для парентерального застосування, наприклад, підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного. Фармацевтичні композиції для парентерального застосування зазвичай містять розчин антитіла в підхожому і краще, якщо водяному носії. Відомі різноманітні водяні носії, які можуть бути використані в зазначених цілях, і серед них, зокрема, вода, забуферна вода, фізіологічний розчин, гліциновий розчин і т.д. Ці розчини є стерильними і вільними від частинок. Зазначені фармацевтичні композиції можуть бути стерилізовані за допомогою відповідних добре відомих методів. Такі композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для забезпечення визначених фізіологічних умов, наприклад, сполуки для доведення рН і буферні компоненти, регулятори токсичності й інші сполуки, наприклад, ацетат натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, лактат натрію, альбумін людини і т.д.

Композиції, що містять заявлені антитіла, можуть використовуватися в профілактичних і/або терапевтичних цілях. При терапевтичному застосуванні дані композиції уводяться хворому, що вже страждає на те чи інше захворювання, у кількості, достатній для його лікування абр принаймні для зм'якшення симптомів захворювання і запобігання ускладнень. Кількість, що відповідає зазначеним умовам, визначається як «терапевтично ефективна доза», що залежить від важкості захворювання, загального стану імунної системи хворого і встановлюється фахівцем у даній ділянці досліджень.

У профілактичних цілях композиції, що містять заявлені антитіла, уводяться пацієнту, у котрого ще не розвилося визначене захворювання, для того, щоб підсилити опірність до нього (придушити імунний відгук). Кількість препарату, що при цьому вводиться хворому, визначається як «профілактично ефективна доза». У конкретному випадку ця кількість залежить від стану здоров'я хворого і ступеня виразності імунітету. До кращого профілактичного застосування належить запобігання відторгнення трансплантату, наприклад, пересадженої нирки.

Незважаючи на те, що у даному описі винахід детально розкритий на Прикладах найкращого його висвітлення, цілком зрозуміло, що це не виключає різноманітні модифікації і варіанти винаходу, які не виходять за межі викладеної нижче його формули.