Спосіб визначення стандарту каламутності

Спосіб виготовлення стандарту каламутності, що включає розведення розчину барію хлориду дипдрату сірчаною кислотою, який відрізняється тим, що етапи розведення виконують під фотометричним контролем рівня оптичної густини розчину та доводять її до Д/540 нм 0,150 -155 Винахід відноситься до мікробіологи, зокрема, до способів виготовлення стандартів каламутності, які застосовуються при приготуванні суспензії мікроорганізмів Може бути використаний у лабораторіях медичного, фармакологічного та ветеринарного профілю, які проводять дослідження чутливості мікроорганізмів до хіміотерапевтичних препаратів та ІНШІ види досліджень з використанням суспензії з визначеною концентрацією мікроорганізмів ВІДОМІ способи виготовлення суспензії мікроорганізмів для постановки методу дифузії в агар з використанням паперових дисків Згідно наказу МОЗ СРСР №250 від 13 03 75 року ("Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам"), як стандарт для виготовлення суспензії мікроорганізмів визначеної концентрації використовують стандарт каламутності № 10, що виробляється ГІСК (Державним науково-дослідним інститутом стандартизації і контролю медичних і біологічних препаратів, Росія) За одиницю каламутності умовно приймають каламутність завісі живих тифозних бактерій з концентрацією 100 млн мікробних тіл в 1 мл Еталон №10 (10 одиниць каламутності) відповідає 1 млрд , мікробних тіл в 1мл За методичними вказівками( "По определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков"), МЗСРСР № 2675-83, від 10 031983, суспензію мікробів рекомендовано виготовляти із 18-24 годинної мікробної культури, що вирощена на щільному середовищі шляхом розведення до каламутності, що відповідає стандарту ГІСК на 10 ОД або 5 ОД Потім одержану завісь мікроорганізмів додатково розводять в 10 разів ІЗОТОНІЧНИМ розчином хлориду натрію Недоліками даних способів виготовлення суспензії мікроорганізмів є необхідність додаткового и розведення, що значно збільшує час на постановку метода, можливість помилок в разі застосування для роботи пробірок із скла іншої якості Крім того, дані стандарти каламутності є висококоштовними і виготовляються за кордоном Найбільш близьким до пропонуємого винаходу є спосіб виготовлення розчину стандартної каламутності, згідно якого стандарт каламутності виготовляється шляхом доведення 0,6мл 1% (10г/л) розчину хлориду барію дипдрату (ВаСЬ1 2НгО ) до об'єму ЮОмл 1% розчином (10мл/л) сірчаної кислоти (H2SO4) Цей розчин розливають у пробірки, аналогічні тим, що використовуються для зразків культур бактерій ("Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии", Vandepitte J , Engbae К К , Rot P, Heuck С С , ВОЗ, Женева, 1994) Основними недоліками прототипу є те, що каламутність стандарту не визначається за допомогою об'єктивних критеріїв, а тільки візуально, точність виготовлення розчинів залежить від кваліфікації персоналу та якості вимірювального посуду, що використовується Густина суспензії бактерій, виготовленої за даним стандартом, не виражається КІЛЬКІСНО В зв'язку з вищевикладеним, в основу пропонуємого винаходу покладено задачу - підвищення якості стандарту каламутності Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується у відомому способі виготовлення стандарту каламутності, що включає розведення роз (О ю 54261 чину хлориду барію дипдрату сірчаною кислотою Згідно З винаходом, етапи розведення виконують під фотометричним контролем рівня оптичної густини розчину та доводять її до Д/ 540нм 0,1500,155 Стандарт виготовляється таким чином 1 етап Виготовляють розчин № 1 наважку ВаСЬ 2Н2О масою 1г розчиняють у 99,9мл дистильованої води Розчин №2 Розчиняють H2SO4 у дистильованій воді до одержання питомої ваги розчину 1,005 2 етап 0,6мл розчину ВаСЬ 2Н2О (розчин №1) в мірній колбі МІСТКІСТЮ ЮОмл доводять до мітки розчином H2SO4 (розчин №2) Отриманий таким чином розчин використовують в якості стандарту каламутності 3 етап Контролюють точність виготовлення стандарту каламутності на фотометрі фотоелектричному КФК-3 при довжині хвилі 540нм, з використанням кювети з робочою довжиною 10мм і контрольного розчину №2 Доводять оптичну густину стандарту каламутності до Д/540нм 0,150 -0,155 шляхом додавання в разі необхідності розчинів №1 або №2 Спосіб , що пропонується, ілюструється дослідженням таких якостей стандарту Протокол № 1 Виготовляють стандарт каламутності з Д/540нм 0,150-0,155 (коефіцієнт пропускання, х=70,0-80,0 Вирощують 24-годинну культуру штаму Eschenchia coll АТСС 25923 на м'ясопептонному агарі Виготовляють суспензію культури Е соїі в ізотонічному розчині натрію хлориду (NaCI), яка візуально відповідає стандарту каламутності Визначають КІЛЬКІСТЬ бактерій, що містить суспензія, методом послідовних розведень і наступним засівом на щільне середовище, підраховуючи КІЛЬКІСТЬ колонієутворюючих одиниць (КУО) після 24-годинноі інкубації при 37°С ЩІЛЬНІСТЬ суспензії дорівнює 1,03±0,13-109КУО/мл(п=12) Вирощують 24-годинну культуру штаму St aureus АТСС 25923 на м'ясо-пептонному агарі Виготовляють суспензію культури St aureus в ізотонічному розчині NaCI , яка візуально відповідає стандарту каламутності Визначають КІЛЬКІСТЬ бактерій , що містить суспензія, методом послідовних розведень і наступним засівом на щільне середовище, підраховуючи КІЛЬКІСТЬ КУО після 24годинної інкубації при 37°С ЩІЛЬНІСТЬ суспензії дорівнює 2,14±0,14-109КУО/мл(п=15) Протокол №2 Виготовляють стандарт каламутності з Д/540нм 0,215-0,220 (т=60,0-70,0) Вирощують 24годинну культуру штаму Eschenchia coll АТСС 25922 на м'ясо-пептонному агарі Виготовляють суспензію культури Е соїі в ізотонічному розчині NaCI, яка візуально відповідає стандарту каламутності Визначають КІЛЬКІСТЬ бактерій , що містить суспензія, методом послідовних розведень і наступним засівом на щільне середовище, підраховуючи КІЛЬКІСТЬ КУО після 24-годинноі інкубації при ЩІЛЬНІСТЬ 37°С суспензії дорівнює 1,16±0,08-10іиКУО/мл(п=12) Вирощують 24-годинну культуру штаму Staphylococcus aureus АТСС 25923 на м'ясопептонному агарі Виготовляють суспензію культу ри St aureus в ізотонічному розчині NaCI , яка візуально відповідає стандарту каламутності Визначають КІЛЬКІСТЬ бактерій , що містить суспензія, методом послідовних розведень і наступним засівом на щільне середовище, підраховуючи КІЛЬКІСТЬ КУО після 24-годинноі інкубації при 37°С ЩІЛЬНІСТЬ суспензії дорівнює 10 3,07±0,46-10 КУО/мл(п=11) Протокол №3 Виготовляють стандарт каламутності з Д/540нм 0,090-0,095 (т=80,0-90,0) Вирощують 24годинну культуру штаму Eschenchia coll АТСС 25922 на м'ясо-пептонному агарі Виготовляють суспензію культури Е соїі в ізотонічному розчині NaCI, яка візуально відповідає стандарту каламутності Визначають КІЛЬКІСТЬ бактерій , що містить суспензія, методом послідовних розведень і наступним засівом на щільне середовище, підраховуючи КІЛЬКІСТЬ КУО після 24-годинноі інкубації при 37°С ЩІЛЬНІСТЬ суспензії дорівнює 1,66+0,06-109КУО/мл(п=12) Вирощують 24-годинну культуру штаму Staphylococcus aureus АТСС 25923 на м'ясопептонному агарі Виготовляють суспензію культури St aureus в ізотонічному розчині NaCI , яка візуально відповідає стандарту каламутності Визначають КІЛЬКІСТЬ бактерій , що містить суспензія, методом послідовних розведень і наступним засівом на щільне середовище, підраховуючи КІЛЬКІСТЬ КУО після 24-годинноі інкубації при 37°С ЩІЛЬНІСТЬ суспензії дорівнює 1,28±0,03-109КУО/мл(п=9) Ефективність стандарту ілюструється наступними прикладами Приклад №1 При визначенні чутливості штаму Eschenchia coll АТСС 25922 до антибіотиків методом дифузії в агар з використанням паперових дисків для засіву газону використовують суспензії бактерій, виготовлені двома способами з 18-24 годинної культури суспензія, що відповідає стандарту каламутності ГІСК на 5 ОД, розведена у 10 разів ІЗОТОНІЧНИМ розчином натрію хлориду (за методичними вказівками по «Определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков», (1983 г)), суспензія, що відповідає стандарту каламутності, виготовленому за пропонуємим способом На поверхню твердого середовища для визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків АГВ в чашці Петрі наносять 0,1 мл суспензії культури бактерій, виготовлених за одним з вище наданих способів, та рівномірно розподіляють нанесену суспензію по всій поверхні середовища мікробіологічним шпателем Після підсихання газону на його поверхні стерильним пінцетом на відстані 2см один від одного та від краю чашки розкладують паперові диски, імпрегновані антибіотиками, виготовлені НДЦФ, м Санкт-Петербург, Росія Використовують диски з ампіциліном, карбеніциліном, цефазоліном, цефотаксимом, СІЗОМІЦИном, гентаміцином та еритроміцином Засіяні чашки шкубують у термостаті 18-20 годин при 37°С Оцінку результатів проводять у проходящему СВІТЛІ на темній матовій поверхні шляхом виміру діаметру зон затримки росту бактерій з урахуванням 54261 діаметру дисків з використанням вимірювальної ЛІНІЙКИ Результати вимірів відображені утабл 1 Таблиця 1 Діаметри зон затримки росту штаму Escherichia coll АТСС 25922 (мм) Антибіотик АМПІЦИЛІН Карбеніцилін Цефазолін Цефотаксим СІЗОМІЦИН Рентам і цин Еритроміцин Стандарт, що пропонується 15,5 ±0,3 25,0 ±0,5 26,2 ±0,9 33,1 ±1,0 22,0 ±0,4 22,1 ±0,4 9,1 ±0,4 п 24 24 24 18 24 27 27 Стандарт ГІСК 15,8 ±0,4 25,3 ±0,4 25,7 ±0,7 32,3 ±0,7 21,2 ±0,3 22,5 ±0,4 8,6 ±0,4 п 21 24 24 18 24 27 27 Таблиця 2 Діаметри зон затримки росту штаму Staphylococcus aureus АТСС 25923 (мм) Антибіотик АМПІЦИЛІН Карбеніцилін Цефазолін Цефотаксим СІЗОМІЦИН Рентам І цин Еритроміцин Стандарт, що пропонується 33,3 ±0,4 36,1 ±1,1 31,0 ±1,3 32,2 ±1,1 30,8 ±1,4 26,7 ±0,6 29,6 ±0,5 Приклад № 2 При визначенні чутливості штамів Staphylococcus aureus АТСС 25923 до антибіотиків методом дифузії в агар з використанням паперових дисків для засіву газону використовують суспензії бактерій, виготовлені двома способами з 18-24 годинної культури суспензія, що відповідає стандарту каламутності ГІСК на 5 ОД, розведена у 10 разів ІЗОТОНІЧНИМ розчином натрію хлориду (за методичними вказівками по «Определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков», (1983 г)), суспензія, що відповідає стандарту каламутності, виготовленого за пропонуємим способом На поверхню твердого середовища для визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків АГВ в чашці Петрі наносять 0,1 мл суспензії культури бактерій, виготовлених за одним з вище на п 18 21 21 21 21 21 21 Стандарт ГІСК 33,6 ±0,4 35,9 ±0,8 29,9 ±1,2 31,7 ± 1,3 30,8 ±1,3 26,5 ±0,9 30,0 ±0,5 п 18 21 21 21 21 21 21 даних способів, та рівномірно розподіляють нанесену суспензію по всій поверхні середовища мікробіологічним шпателем Після підсихання газону на його поверхні стерильним пінцетом на відстані 2см один від одного та від краю чашки розкладують паперові диски, імпрегновані антибіотиками, виготовлені НДЦФ, м Санкт-Петербург, Росія Використовують диски з ампіциліном, карбеніциліном, цефазоліном, цефотаксимом, СІЗОМІЦИном, гентаміцином та еритроміцином Засіяні чашки шкубують у термостаті 18-20 годин при 37°С Оцінку результатів проводять у проходящему СВІТЛІ на темній матовій поверхні шляхом виміру діаметру зон затримки росту бактерій з урахуванням діаметру дисків з використанням вимірювальної ЛІНІЙКИ Результати вимірів відображені утабл 2 Таким чином, створено вітчизняний стандарт високої якості ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71