Спосіб одержання гідролізату рибонуклеїнової кислоти

1 Спосіб одержання гідролізату рибонуклеїнової кислоти, що включає гідроліз розчину рибонуклеїнової кислоти рибонуклеазою, обробку гідролізату спиртом, фільтрацію суміші під тиском через мембрани, обробку фільтрату спиртом, висушування осаду, який відрізняється тим, що на стадії обробки фільтрату спиртом здійснюють додавання хлористого натрію до кінцевої концентрації 0,02-5 % 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як рибонуклеїнову кислоту використовують рибонуклеїнову кислоту мікробіологічного походження і/або рибонуклеїнову кислоту з тканин тварин, і/або рибонуклеїнову кислоту з тканин рослин 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як рибонуклеазу використовують рибонуклеазу мікробіологічного походження і/або рибонуклеазу з тканин тварин, і/або рибонуклеазу з тканин рослин 4 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що гідроліз розчину рибонуклеїнової кислоти здійснюють при ступінчастому внесенні рибонуклеази, причому мінімальне число внесень дорівнює 2 5 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що етап гідролізу розчином рибонуклеїнової кислоти провадять при рН від 3,5 до 9,0 і температурі від 5 до 90°С 6 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що обробку гідролізату спиртом проводять, додаючи спирт в КІЛЬКОСТІ 0,01-100 об'єму % 7 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що фільтрацію суміші під тиском через мембрани здійснюють при температурі від 0 до 60°С при тиску від 0,05 до 0,5 МПа 8 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що етап обробки фільтрату спиртом проводять, додаючи до фільтрату 2-25 об'ємів спирту 9 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що як спирт використовують етиловий і/або метиловий спирт 10 Спосіб за п 2, який відрізняється тим, що як рибонуклеазу використовують екстракт, що володіє рибонуклеазною активністю 00 Винахід відноситься до галузі біохімії і може бути використаний у медицині, мікробіологи, ХІМІЧНІЙ, харчовій і парфумерній промисловості, сільському господарстві, а саме для виготовлення лікарських засобів, харчових добавок, різноманітних продуктів парфумери, поживних середовищ, для отримання окремих нуклеотидів, для біохімічних досліджень Відомий спосіб готування суміші нуклеотидів (Вестник Акад Мед Наук СССР, 1971, Медицина, N7, С 63 - 69) гідролізом рибонуклеїнової кислоти панкреатичною рибонуклеазою і діалізом отриманого гідролізату з наступним виділенням і концентруванням кінцевого продукту Цей метод має суттєві недоліки -тривалість процедури діалізу, низький вихід продукту і недостатній ступінь очистки Найбільш близьким до заявляемого є спосіб одержання рибонуклеотидів, що полягає в тому, що рибонуклеотиди отримують шляхом гідролізу розчину дріжджової рибонуклеїнової кислоти панкреатичною рибонуклеазою, фільтрацією на мембранах, за рахунок чого досягається отримання продукту високого ступеню чистоти, осадженням етанолом і сушінням (Ас СРСР № 1575359 А1, 15 05 1991) Метод має недоліки, серед яких - невисокий вихід кінцевого продукту (51%) і тривалий час сепарації через неповне осадження продукту етанолом Завданням винаходу є збільшення виходу кінцевого продукту - гідролізату рибонуклеїнової кислоти і спрощення процесу декантування надосадочної рідини при осадженні кінцевого продукту спиртом і/або скороченням строку сепарації Вирішення поставленого завдання досягається за рахунок того, що спосіб отримання гідролізату рибонуклеїнової кислоти включає гідроліз розчину рибонуклеїнової кислоти рибонуклеазою, Ю Ю 59582 обробку гідролізату спиртом, фільтрацією суміші під тиском через мембрани, обробку фільтрату спиртом, висушування осаду, причому на стадії обробки фільтрату спиртом здійснюють додавання хлористого натрію до кінцевої концентрації 0,02 5%, а також за рахунок оптимізацм умов процесу гідролізу рибонуклеїнової кислоти рибонуклеазою і за рахунок ступінчастого внесення рибонуклеази Для гідролізу рибонуклеїнової кислоти заявленим способом використовують рибонуклеїнову кислоту мікробіологічного походження і/або рибонуклеїнову кислоту з тканин тварин і/або рибонуклеїнову кислоту з тканин рослин, при цьому в якості рибонуклеази використовують або екстракт, що володіє рибонуклеазною активністю, або очищену рибонуклеазу мікробіологічного походження і/або рибонуклеазу з тканин тварин і/або рибонуклеазу з тканин рослин Гідроліз розчину рибонуклеїнової кислоти здійснюють при ступінчастому внесенні рибонуклеази, причому мінімальне число внесень дорівнює 2, що дозволяє провести гідроліз більш повно При цьому етап гідролізу розчину рибонуклеїнової кислоти рибонуклеазою проводять при рН від 3,5 до 9,0 і температурі від 5 до 90°С, однак більш інтенсивний гідроліз проходить при рН від 4,5 до 8,0 і при температурі вищій від 45°С Правильний підбір умов гідролізу дозволяє змінювати час повного гідролізу Обробку гідролізату спиртом роблять, додаючи спирт у КІЛЬКОСТІ ВІД 0,01 до 100% об'єму, що дозволяє видалити білкові домішки, причому в залежності від КІЛЬКОСТІ додаваемого спирту видаляють різні білки Фільтрацію суміші під тиском через мембрани здійснюють при температурі від 5 до 35°С і тиску від 0,05 до 0,5Мпа Більш низька температура дозволяє зберегти білкові гідролізати в якості харчових домішок Зміною тиску регулюють швидкість фільтрації Етап обробки фільтрату спиртом роблять, додаючи до фільтрату від 2 до 25 об'ємів спирту Причому, чим більше хлористого натрію може містити кінцевий продукт (наприклад, при використанні гідролізату у якості харчових домішок), тим меншу КІЛЬКІСТЬ спирту додають до гідролізату для осадження кінцевого продукту І навпаки, якщо потрібно одержати гідролізат з незначним вмістом хлористого натрію, для більш повного осадження додають більшу КІЛЬКІСТЬ спирту, причому осадження метиловим спиртом проходить більш повно, однак при використанні гідролізату у медичних цілях переважно використовують етиловий спирт Суть Спосіб припускає проведення гідролізу розчину рибонуклеїнової кислоти рибонуклеазою в оптимізованих умовах, обробку гідролізату спиртом, фільтрацію суміші під тиском через мембрани, обробку фільтрату спиртом при кінцевій концентрації хлористого натрію від 0,02 до 5% і висушування осаду, причому у якості спирту використовують етиловий і/або метиловий спирт Технічним результатом запропонованого (передбачуваного) винаходу є спрощення технологічного процесу, зменшення часу, необхідного для виготовлення кінцевого продукту і збільшення виходу кінцевого продукту на 15% Приклад 70г дріжджової РНК розчиняють в 400мл дистильованої води і доводять рН розчину до 7,5 0,25н NaOH Додають 250мг панкреатичної РНКази і пдролізують впродовж 3 годин при температурі 57°С Потім ДО розчину додають ще 250мг РНК-ази і продовжують гідроліз при температурі 57°С впродовж 6 годин Потім гідролізат охолоджують до 4°С, додають 250мл етанолу, відфільтровують осад і фільтрат піддають ультрафільтрації До фільтрату додають 4,8л етанолу і NaCI до кінцевої концентрації 0,6% Надосадову рідину декантують, а осад висушують Вихід кінцевого продукту 46,2г (див Табл ) Таблиця Порівняльні показники технологічного процесу одержання рибонуклеотидів способом А с СРСР № 1575359 А1 і одержання гідролізату рибонуклеїнової кислоти заявляємим способом Номер и основні показники технологічного процесу 1 2 3 4 Вага рибонуклеїнової кислоти, г Об'єм води для розчинення, мл рН розчину Вага рибонуклеази, мг 1-е додавання 2-е додавання 5 Час інкубації, год 6 Температура інкубації, °С 7 Об'єм спирту для осадження кінцевого продукту, л 8 Концентрація хлористого натрію у фільтраті при осадженні кінцевого продукту, % 9 Вага кінцевого продукту, г Одержання рибонуклеотиОдержання гідролізату рибонуклеїнової дів способом А с № кислоти заявляємим способом 1575359 А1 70 430 5,1 70 400 7,5 140 250 250 5 65 9 57 5 4,8 0 0,6 35,7 46,2 59582 Комп'ютерна верстка А Крулевський Підписано до друку 06 10 2003 Тираж 39 при м Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна