Живильне середовище для культивування штаму р-04 irpex lacteus fr.-продуцента сичужного ферменту

Живильне середовище для культивування штаму Р-04 Irpex lacteus Fr. - продуцента сичужного ферменту, що містить пептон, MgSO4·7H2O, 3 Поставлене завдання вирішується тим, що живильне середовище для культивування штаму Р-04 I. lacteus - продуцента сичужного ферменту, яке містить пептон, MgSO4∙7H2O, СаСl2, КН2РО4, К2НРО4, ZnSO4∙7H2O та дистильовану воду, згідно корисної моделі, додатково містить сахарозу при наступному співвідношенні компонентів, г/л: сахароза 7,4988 пептон 5,0 MgSO4∙7H2O 0,2 СаСl2 0,02 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 ZnSO4∙7H2O 0,001 вода дистильована до 1 л. Живильне середовище готують шляхом послідовного розчинення його компонентів з наступним доведенням дистильованою водою до 1 л. Молокозсідальну активність культурального фільтрату (МЗАкф) визначають за методом Каваї і Мукаї за формулою [11]: 40  100  К МЗАкф   од. / мл формула 1, t де МЗАкф - молокозсідальна активність культурального фільтрату, од./мл; К - коефіцієнт розведення культурального фільтрату (КФ); t - час, протягом якого з 100 мл молока при додаванні 1 мл КФ утворюється щільний згусток, хв.; 40 - середній час зсідання молока при виробництві сирів, хв. Приклад конкретного виконання. Приклад 1 Приготувати оптимізоване живильне середовище для культивування штаму Р-04 Irpex lacteus Fr. - продуцента сичужного ферменту. Наважки 7,4988 г сахарози, 5,0 г пептона, 0,2 г MgSO4∙7H2O, 0,02 г СаСl2, 0,6 г КН2РО4, 0,4 г К2НРО4 та 0,001 г ZnSO4∙7H2O послідовно розчиняли у 500 мл дистильованої води. Отриманий розчин складових середовища доводили до 1 л дистильованою водою. Кислотність середовища доводили до 3,5 рН, яка є оптимальною для росту продуцента Р-04, за допомогою крапель 10% НСl. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра ємністю 250 мл та стерилізували в автоклаві АГ-1 під тиском 0,8-1 атм протягом 40 хв. Через три доби контролю стерильності живильного середовища проводили інокуляцію 7-добовою агаризованою, чистою культурою штаму Р-04 I. lacteus. Для інокуляції використовували шматочки міцелію, приблизно, 1×1 см. Гриб вирощували протягом 10 діб в термостаті ТС-80М за оптимальної температури 30-32°С. Потім міцелій гриба відділяли від культуральної рідини шляхом фільтрування. Одержаний культуральний фільтрат використовували для визначення його молокозсідальної активності за формулою 1. Молокозсідальна активність культурального фільтрату дорівнювала 2590,37 од./мл. Таким чином, нове модифіковане живильне середовище, яке містить, г/л: сахарозу - 7,4988, пептон - 5,0, MgSO4∙7H2O - 0,2, СаСl2 - 0,02, КН2РО4 - 0,6, К2НРО4 - 0,4, ZnSO4∙7H2O - 0,001, дистильовану воду - 1 л, є оптимальним для куль 61605 4 тивування штаму Р-04 Irpex lacteus Fr., тому що забезпечує найвищі значення його МЗА. Високий рівень МЗА (2590,37 од./мл) вказує на те, що запропоноване живильне середовище максимально містить усі необхідні речовини для синтезу сичужного ферменту штамом Р-04 Irpex lacteus Fr. Інша кількість сахарози в живильному середовищі сприяла невеликим значенням МЗА культурального фільтрату штаму Р-04. Приклад 2 Приготувати живильне середовище для культивування штаму Р-04 Irpex lacteus Fr. - продуцента сичужного ферменту. Наважки 3,4988 г сахарози, 5,0 г пептона, 0,2 г MgSO4∙7H2O, 0,02 г СаСl2, 0,6 г КН2РО4, 0,4 г К2НРО4 та 0,001 г ZnSO4∙7H2O послідовно розчиняли у 500 мл дистильованої води. Отриманий розчин складових середовища доводили до 1 л дистильованою водою. Кислотність середовища доводили до 3,5 рН, яка є оптимальною для росту продуцента Р-04, за допомогою крапель 10% НСl. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра ємністю 250 мл та стерилізували в автоклаві АГ-1 під тиском 0,8-1 атм протягом 40 хв. Через три доби контролю стерильності живильного середовища проводили інокуляцію 7-добовою агаризованою, чистою культурою штаму Р-04 I. lacteus. Для інокуляції використовували шматочки міцелію, приблизно, 1×1 см. Гриб вирощували протягом 10 діб в термостаті ТС-80М за оптимальної температури 30-32°С. Потім міцелій гриба відділяли від культуральної рідини шляхом фільтрування. Одержаний культуральний фільтрат використовували для визначення його молокозсідальної активності за формулою 1. МЗА культурального фільтрату після культивування штаму Р-04 в даному випадку дорівнювала 2322,21 од./мл. Приклад 3 Приготувати живильне середовище для культивування штаму Р-04 Irpex lacteus Fr. - продуцента сичужного ферменту. Наважки 11,4988 г сахарози, 4,0 г пептона, 0,4 г MgSO4∙7H2O, 0,04 г СаСl2, 0,6 г КН2РО4, 0,4 г К2НРО4 та 0,001 г ZnSO4∙7H2O послідовно розчиняли у 500 мл дистильованої води. Отриманий розчин складових середовища доводили до 1 л дистильованою водою. Кислотність середовища доводили до 3,5 рН, яка є оптимальною для росту продуцента Р-04, за допомогою крапель 10% НСl. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра ємністю 250 мл та стерилізували в автоклаві АГ-1 під тиском 0,8-1 атм протягом 40 хв. Через три доби контролю стерильності живильного середовища проводили інокуляцію 7-добовою агаризованою, чистою культурою штаму Р-04 I. lacteus. Для інокуляції використовували шматочки міцелію, приблизно, 1×1 см. Гриб вирощували протягом 10 діб в термостаті ТС-80М за оптимальної температури 30-32°С. Потім міцелій гриба відділяли від культуральної рідини шляхом фільтрування. Одержаний культуральний фільтрат використовували для визначення його молокозсідальної активності за формулою 1. Більша кількість сахарози в живильному середо 5 61605 вищі сприяла утворенню невисокої МЗА культурального фільтрату штаму Р-04 і дорівнювала 1118,75 од./мл. Таким чином, приклади 2 і 3 доводять недоцільність застосування для культивування штаму Р04 Irpex lacteus Fr. сахарози в кількості, яка є нижчою або вищою оптимального значення 7,4988 г/л. Джерела інформації, використані при складанні заявки. 1. Белова Н.В. Базидиомицеты - источник биологически активных веществ / Н.В. Белова // Растительные ресурсы. - 1991. - №2. - С. 8-17. 2. Бойко М.І. Фізіолого-біохімічні особливості системи Pinus sylvestris L. - Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. і перспективи практичного використання екзометаболітів деяких дереворуйнівних грибів: автореф. дис. на здобуття д-ра біол. наук.: спец. 03.00.12 "Фізіологія рослин", спец. 03.00.21 "Мікологія" / М.I. Бойко - К., 1996. - 51 с. 3. Бойко С.М. Біологічні особливості штамів Irpex lacteus Fr. - продуцентів протеїназ молокозсідальної дії: автореф. дис. на здобуття канд. біол. наук.: спец. 03.00.21 "Мікологія" / С.М. Бойко - К., 2002. - 20 с. 4. Кузнецова І.А. Вплив високих та низьких температур на вихід протеїназ молокозсідальної дії у гриба Irpex lacteus Fr. / І.А. Кузнецова // Вісник Харківського нац. ун-ту. - 2008. - №2 (14). - С. 96-99. 6 5. Пат. 24126 Україна, МПК С12N 1/38, 9/14. Живильне середовище для росту штаму М-81 Hirshioporus laricinus - продуценту молокозсідного ферменту / Нікітіна О.А., Бойко М.І., Негруцький С.Ф.; заявитель і патентоутримувач Донецький Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 держ. ун-т. - №97073489; заявл. 02.07.98; опубл. 31.08.98, Бюл. №4. 6 6. Пат. 23877 Україна, МПК А23С 19/032, C12N 5/00. Живильне середовище для виділення та пересіву чистих культур штамів базидіального гриба Irpex lacteus Fr. / Кузнецова I.А., Клименко Г.В., Бойко М.I.; заявитель і патентоутримувач Донецький нац. ун-т. - №u200700908; заявл. 29.01.2007; опубл. 11.06.2007, Бюл. №8. 7. Кузнецова І.А. Біосинтетичні властивості гриба Irpex lacteus Fr. в залежності від якісного складу пептону в живильному середовищі / І.П. Парасій, І.А. Кузнецова // Сучасні проблеми природничих наук: III Всеукр. студ. наук, конф.: матер, конф. - Ніжин, 2008. - С. 129. 8. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов / С.М. Семенов - М.: ВО "Агропромиздат" 1, 1990. - 240 с. 9. Пат. 34088 А Україна, МКВ С12N 9/50, А23С 19/032. Штам соматичних культур макроміцету Irpex lacteus Fr. - Д-4 продуцент молокозсідального ферменту / Бойко С.М., Бойко М.І., Єфанова І.Л. №99063016; заявл. 02.06.99; опубл. 15.02.01, Бюл. №1. (прототип). 10. Максимов В.Н. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента / В.Н. Максимов, М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина // Практикум по микробиологии - М: изд-во МГУ, 1976. - С. 153-163. 11. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes 1. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes / M. Kawai, N. Mukai // Agric. Biol. Chem. 1970. - V.34, №2. - P. 159-163. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601