Процеси і матеріали для вироблення d-молочної кислоти в дріжджах

1. Рекомбінантна дріжджова клітина виду, що в природному стані не акумулює піруват, яка містить принаймні один екзогенний Dлактатдегідрогеназний ген, інтегрований в її геном, яка відрізняється тим, що цей Dлактатдегідрогеназний ген функціонально зв'язаний з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями. 2 (19) 1 3 80976 4 10. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 1, яка відрізняє ться тим, що н уклеотидна послідовність кодує D-лактатдегідрогеназний білок із видів Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum і Lactobacillus pentosus. 11. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 10, яка відрізняє ться тим, що промотор є із виду дріжджів із роду Kluyveromyces або Saccharomyces. 12. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 11, яка відрізняє ться тим, що промотор є із виду Kluyveromyces marxianus. 13. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 11, яка відрізняє ться тим, що промотор є із виду Saccharomyces cerevisiae. 14. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 1, яка відрізняє ться тим, що вона виявляє знижену PDC-активність. 15. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 8, яка відрізняє ться тим, що D-LDH-ген інтегрований в локусі делетованого PDC-гена. 16. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини за п. 1 в умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений зазначеною клітиною. 17. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини за п. 8 в умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений зазначеною клітиною. 18. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини за п. 9 в умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений зазначеною клітиною. 19. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини за п. 14 в умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений зазначеною клітиною. 20. Процес за будь-яким з пп. 16, 17, 18 або 19, який, крім того, включає у себе стадію перетворення принаймні частини молочної кислоти на лактид. 21. Процес за п. 20, який відрізняється тим, що він включає у себе, крім того, стадію полімеризації лактиду з утворенням полілактидного полімеру або співполімеру. 22. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняє ться тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 1 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною. 23. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняє ться тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 8 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною. 24. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняє ться тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 9 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною. 25. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняє ться тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 14 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною. 26. Процес за будь-яким з пп. 22, 23, 24, 25, який, крім того, включає у себе стадію перетворення принаймні частини молочної кислоти на лактид. 27. Процес за п. 26, який відрізняється тим, що він включає у себе, крім того, стадію полімеризації лактиду з утворенням полілактидного полімеру або співполімеру. Дана заявка заявляє пріоритет попередньої заявки на [патент США сер. №60/384,333, поданої 30 травня 2002р.]. Даний винахід був створений за підтримки уряду США згідно з Контрактом № DE-FC-3600G010598 від Департаменту енергетики. Уряд США має в даному винаході певну частину прав. Молочна кислота являє собою органічну молекулу, яка може бути одержана шляхом хімічного синтезу або за допомогою процесів ферментації в мікроорганізмах (шляхом біосинтезу). Процеси біосинтезу мають цілий ряд переваг над хімічним синтезом у тому, що стосується вироблення органічних продуктів; це, зокрема, більш висока економічна ефективність процесу, його швидкість, ізомерна чистота і нижча вартість. D-(або R-)молочна кислота являє собою структурний блок, з якого складаються при їх виготовленні біологічно активні матеріали, включаючи гербіциди і фармацевтичні вироби. Поряд з цим, нові процеси, що знижують вартість D-молочної кислоти, дозволяють поширювати її використання на інші сфери ринку хімічної продукції, включаючи, наприклад, пластмаси. Dмолочну кислоту можна перетворювати на Dлактид, циклічний конденсат D-молочної кислоти, який має широкий діапазон різновидів потенціального застосування, включаючи виготовлення плівок, волокон та інших полімерних виробів. D-лактид може полімеризуватися в полі(D-лактид) (D-PLA), полімер, який має властивості, подібні властивостям полі(L-лактиду) (L-PLA), що використовується в різноманітних прикладних сферах полімерів. Висококристалічний 5 80976 PLA, який сьогодні виробляється фірмою Cargill Dow, як правило, містить L-стереоізомер. Ця високо-L-ізомерна смола знаходить найбільш загальне застосування на ринку PLA-волокон завдяки її здатності збільшувати міцність волокна щодо розриву, протистояти усадці і підвищува ти його робочу температуру до рівня вище температури переходу із високо еластичного стану в склоподібний стан при прикладанні до нього високих напруг. Аналогічних властивостей очікують також від полімерів, що подібним чином є високо-D-ізомерними. Крім того, високо-Dізомерний полімер може бути змішаний з високоD-зомерним полімером з утворенням стереокомплексу, що має значно вищу температуру плавлення (приблизно, до 230°С). Така висока температура плавлення дозволяє використовува ти PLA там, де потребується більш висока термостійкість матеріалу. Однією з можливих сфер застосування таких матеріалів є предмети одягу, де підвищені температури плавлення потребуються для виготовлення тканин, стійких щодо прасувальної обробки. D-молочна кислота використовується також як проміжний продукт у хімічній промисловості для виготовлення гербіцидів і фармацевтичних виробів. Наприклад, D-молочна кислота є проміжним продуктом у процесах виготовлення феноксипропіонових і арилоксифеноксипропіонових гербіцидів. Відомі процеси біосинтезу у виробництві молочної кислоти мають певні обмеження. Наприклад, природні організми, що є виробниками молочної кислоти, такі, як Lactobacilli, можуть продукувати великі кількості L-молочноі кислоти в умовах ферментації. Проте, для ефективного продукування ці організми потребують складного ферментаційного середовища. Складність ферментаційного середовища підвищує вартість сировинних матеріалів, а також утруднює і робить більш витратним процес відділяння молочної кислоти від цього середовища. Крім того, процеси ферментації, в яких використовуються ці організми, часто наражаються на інфікування іншими видами, що не продукують молочну кислоту. До сьогоднішнього дня не існувало економічного способу селективного позбавлення таких небажаних штамів. При використанні зазначених вище організмів величина рН ферментаційного бульйону потрібно підтримувати в певних межах, оскільки середовище з низькою рН як в самих бактеріях, так і в бульйоні може інгібувати проліферацію бактерій або викликати загибель клітин. Таке регулювання здійснюється шляхом додавання нейтралізаторів, наприклад, карбонату кальцію у ферментаційний бульйон з утворенням лактату кальцію. Для відновлення молочної кислоти цей лактат кальцію потрібно піддавати обробці сильною, наприклад, сірчаною кислотою, що з ним реагує, утворюючи молочну кислоту і сульфат кальцію. Отже нездатність цих організмів функціонувати за низьких рН спричиняє додаткові витрати на сировинні матеріали і на відходи небажаних побічних продуктів (сульфату кальцію). 6 В японській заявці №2002-136293А фірми Кокаї виведені генетично модифіковані дріжджі, котрі, як стверджується авторами, продукують Dмолочну кислоту. Ця дріжджова клітина-хазяїн є спеціального типу, що "акумулює" піруват, тобто виробляє значні кількості піруватинту, який більше не піддається метаболізму. Таким чином, із вищевикладеного ясно, що існує потреба у процесах біосинтезу для вироблення D-молочної кислоти за допомогою організму, який: 1) дозволяв би одержувати молочну кислоту з прийнятними виходом корисного продукту і продуктивністю, 2) потребував би лише спрощеного ферментаційного середовища і 3) дозволяв би використовувати ферментаційне середовище з низькою рН і/або високою температурою, що давало би змогу уникати забруднення, створюваного штамами небажаних мікроорганізмів. Згідно з одним із аспектів даного винаходу пропонується рекомбінантна дріжджова клітина виду, що у природному стані не акумулює пірувату і містить, принаймні, однин екзогенний Dлактатдегідрогеназний ген, інтегрований в її геном, де D-лакгатдегідрогеназний ген є функціонально зв'язаним з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями. Винаходом також пропонуються рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що кодують Dлактатдегідрогеназний ген, функціонально зв'язаний з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями. Рекомбінантні нуклеїнові кислоти за даним винаходом дозволяють експресувати Dлактатдегідрогеназний ген у рекомбінантній дріжджовій клітині. Згідно з іншим аспектом даного винаходу пропонується процес вироблення D-молочної кислоти, який включає у себе ферментацію клітини за даним винаходом в умовах, що дозволяють здійснювати біосинтез D-молочної кислоти. Трансформовані дріжджові клітини є здатними продукувати D-молочну кислоту з ви ходом корисного продукту, прийнятним для умов промислового виробництва. Ці клітини добре витримують наявність D-молочної кислоти і можуть продовжувати її ефективне продукування, коли ферментаційний бульйон містить значну концентрацію D-молочної кислоти. Це явище с цілком несподіваним, оскільки як L-молочна кислота, так і D-молочна кислота є схильними до інгібування росту і виживаності деяких мікроорганізмів, див. [Lett. Appl. Microbiol. 2002;35(3): 176-80; Susceptibility of Escherichia coli 0157 and non-0157 isolates to lactate. McWilliam Leitch EC, Stewart CS. Appl. Environ. Microbiol. 2002 Sep; 68(9):4676-8]. У деяких випадках еукаріотичні і бактеріальні клітини на D-молочну кислоту реагують інакше, ніж на L-молочну кислоту [Uribarri J., Oh MS, Carroll HJ, Medicine (Baltimore) 1998 Mar; 77(2):73-82, "D-lactic acidosis: a review of clinical presentation, biochemical features, and pathophysiologic mechanisms;" порівн. Leitch et al, supra]. 7 80976 Переваги й особливості даного винаходу з більшою ясністю й очевидністю випливають із поданих нижче докладного опису винаходу і прикладів його практичного здійснення. Фіг.1. Плазмідна карта pNC2, що містить PGKпромотор і GAL10-термінатор, обидва із виду S. cerevisiae. Фіг.2. Плазмідна карта pNC4, що містить PDC1-промотор і GAL10-термінатор, обидва із виду S. cerevisiae. Фіг.3а. Карта фрагмента Notl рестрикції 1.235т.п.н. (тисяча пар нуклеотидів) послідовності, виведеної із PCR-ампліфікованої хромосомної DNA клітин S. cerevisiae, що містить PGKпромотор і GAL10-термінатор (S. cerevisiae) і сайт множинного клонування між промотором і термінатором. Фіг.3b. Карта фрагмента Notl рестрикції 1.235т.п.н. (тисяча пар нуклеотидів) послідовності, виведеної із PCR-ампліфікованої хромосомної DNA клітин S. cerevisiae, що містить PDC1промотор і GAL10-термінатор (S. cerevisiae) і сайт множинного клонування між промотором і термінатором. Фіг.4. Плазмідна карта pVR24, що містить LLDH виду В. megaterium, функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.5. Плазмідна карта pVR22, що містить маркер стійкості до G418, функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.6. Плазмідна карта pNC7, що містить LDHген із виду в. megateriumj функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.7А-В. А) Плазмідна карта pSO21, що містить PDC1 із клітин K. marxianus; і В) плазмідна карта pSO27, що містить 3,3kb (т.п.н.) фрагмент PDC1-промотора (K. marxianus), що містить 5'ділянку зліва від локусу PDC1; і Фіг.8. Плазмідна карта pSO28, що містить делецію на PDC1кодуючій ділянці, що міститься в плазміді pSO21, і ген стійкості до G418, функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAM О-термінатором із клітин S. cerevisiae. Фіг.9. Плазмідна карта pSO29, що містить делецію на PDC7-кодуючій ділянці, що міститься в плазміді pSO21, і ген стійкості до зеоцину, функціонально зв'язаний з TEF1-промотором і Тсус7-термінатором із клітин S. cerevisiae (із. pTEFI/Zeo; Invitrogen). Фіг.10. Плазмідна карта pPSI, що містить ген стійкості до гігроміцину (hph) із виду Ε Coli, функціонально зв'язаний з PDC1-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cere visiae. Фіг.11а. Плазмідна карта pVR43, що містить DLDH-ген із виду L. helveticus. Фіг.11b. Плазмідна карта pVR44, що містить DLDH-ген із виду L. Helveticus із сайтами Xbal і BamHI відповідно на 5'- і 3'-кінцях цього гена. Фіг.12. Плазмідна карта pVR47, що містить DLDH-ген із виду L. helveticus із PGK-промотором і GAL 70-термінатором із виду S. cerevisiae. 8 Фіг.13. Плазмідна карта pVR48, що містить DLDH-ген із виду L. helveticus, функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAL 70термінатором із виду S. cerevisiae, і hрh-ген стійкості до гігроміцину, функціонально зв'язаний з РОС7-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.14. Плазмідна карта pCASO, що містить полігенний експресуючий кластер, уставлений між 3'- і 5'-фланкуючими ділянками локусу PDC1 (K. marxianus), що містить D-LDH-ген із виду L. helveticus, функціонально зв'язаний з PGKпромотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae, і hрh-ген стійкості до гігроміцину, функціонально зв'язаний з PDC1-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cere visiae. Фіг.15. Плазмідна карта pVR29, що містить G418-маркер стійкості, функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.16а. Плазмідна карта рВН5а, що містить 5'бічну ділянку локусу PDC1 (K. marxianus) і окремо G418-ген стійкості, функціонально зв'язаний з PDC1-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.16b. Плазмідна карта pBH5b, що містить бічні ділянки 5' і 3' локусу PDC1 (K. marxianus) і окремо - G418-ген стійкості, функціонально зв'язаний з PDC1-промотором і GAL10термінатором із виду S. cerevisiae. Фіг.16с. Плазмідна карта рВН5с, що містить локус PDC1 (K. marxianus). Фіг.17. Плазмідна карта рВН6, що містить DLDH-ген із L helveticus, розташований між 5'- і 3'фланкуючими ділянками локусу PDC1 (K. marxianus), і окремо - G418-ген стійкості, функціонально зв'язаний з PDC1-промотором і GAL10-термінатором із виду S. cere visiae. Дріжджові клітини за даним винаходом отримуються із видів, які до рекомбінації, здійснюваної у відповідності з даним описом, не акумулюють піруват. Під виразом „не акумулюють" пірувату тут мається на увазі те, що дані види не виробляють, принаймні, 10г/л піровиноградної кислоти при культивуванні відповідно до процесу, описаного у Прикладі 5 здійснення Патенту Японії 2000-78996 фірми Кокаї. У загальному випадку дріжджова клітина не акумулює пірувату, коли вона у природному стані містить активний шлях метаболізму, що перетворює піруват на різноманітні продукти метаболізму, такі, як етанол, ацетат або біомаса. Такі дріжджові клітини метаболічно перетворюють піруват настільки швидко, що мала кількість пірувату є наявною усередині клітини в будь-який момент часу, а мала кількість пірувату виділяється секрецією клітини. Кращі дріжджові клітини у природному стані мають один або більше активних піруватдекарбоксилазних (PDC) генів, що продукують піруватдекарбоксилазний білок, який перетворює піруват на етанол. Більш кращими дріжджовими клітинами є такі, що виказують ознаки Крабтри-негативного фенотипу, в якому шлях аеробного метаболізму клітин (дихання і цикл трикарбонових кислот) не інгібується 9 80976 наявністю високої концентрації глюкози. Як приклади підходящих для цього дріжджових клітин можна назвати із родів Candida, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula. Особливо кращими є клітини із родів Candida і Kluyveromyces. Ще кращими є клітини С. sonorensis, K. lactis, K. theromotolerans і K. marxianus, і найкращими є клітини С sonorensis і K. marxianus. Рекомбінантні дріжджові клітини за даним винаходом містять, принаймні, один екзогенний DLDH-ген, інтегрований в їхній геном. Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus bulgancus, Lactobacillus delbrueckii, lactobacillus plantarum і Lactobacillus pentosus є штамами, які мають підходящі D-лактатдегідрогенази, котрі для застосування згідно з даним винаходом можуть одержуватися, поряд з іншим, за допомогою рекомбінантних методів генної інженерії. Кращим D-лактатдегідрогеназним геном є Dлактатдегідрогеназа клітини L. helveticus. Ця клітина може містити множину екзогенних LDHгенів, тобто, принаймні, два таких гени, а в кращому варіанті - приблизно 2-10 таких генів, і ще краще - приблизно 2-5 таких генів. Включені шляхом інсерції LDH-гени можуть усі бути однаковими, або ж можуть складатися з двох і більше різних типів LDH-генів. Ген, промотор або термінатор вважається "екзогенним" в рамках даного винаходу, якщо (1) його немає усередині геному немодифікованої клітини і (2) він не є гомологічним генетичному матеріалу, наявному в геномі немодифікованої клітини. Ген, термінатор або промотор вважається "нативним" для даного виду дріжджів, якщо він (окрім мутацій типу "індивідуальна в індивідуальну", що не впливають на його функції) є всередині геному даного виду дріжджів. Екзогенний D-LDH-ген є функціонально зв'язаним з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями. Вираз "функціонально зв'язаний" в контексті даного винаходу означає, що промотор або термінатор, про який іде мова, після інтегрування в геном дріжджів керує, відповідно, початком і закінченням процесу транскрипції D-LDH-гена. Використовуваний тут термін "промотор" означає нетранскрибовану послідовність, яка розташована зліва (тобто 5') стартового кодона трансляції структурного гена (в загальному випадку на ділянці, приблизно, від 1 до 1000о.п., краще - від 1 до 500о.п. і ще краще - від 1 до 100о.п.), і керує початком транскрипції структурного гена. Промотор може бути нативним або екзогенним для клітини-хазяїна. Промоторами можуть бути такі послідовності, що керують експресією генів, залучених до центрального вуглецевого обміну, тобто гліколітичні промотори або промотори гена циклу трикарбонових кислот. До числа підходящих промоторів належать, наприклад, промотори із дріжджових генів фосфогліцераткінази (PGK), гліцеральдегід-3фосфа тдегідрогенази (TDH), піруватдекарбоксилази (PDC1), триозофосфатізомерази (ТРІ), енхансерного 10 фактора-1 транскрипції (TEF-1), пуринцитозинпермеази (PCPL3) й алкогольдегідрогенази (ADH), тощо. Кращими промоторами за даним винаходом є TEF-1 (S. cerevisiae), PGK (S. cerevisiae) і PDC1 (S. cerevisiae, K. Marxianus). У тих випадках практичного здійснення, де потребується інтегрувати D-LDH-ген (або гени) в локус-мішень геному дріжджової клітини, промоторна послідовність є гомологічною промоторній послідовності гена, в якому намічена ця інсерція. Таким геном-мішенню в кращому варіанті є піруватдекарбоксилазний (PDC) ген. До числа інших кращих генів-мішеней належать алкогольдегідрогеназа (ADH), оротидин-5'фосфа тдекарбоксилаза (ura3) і 3ізопропілмалатдегідрогеназа (Іеu2). Подібним чином термін "термінатор" означає нетранскрибовану послідовність, яка розташована нижче (тобто 3') до завершуючого трансляцію кодона структурного гена (в загальному випадку в межах, приблизно, від 1 до 1000п.о., частіше - від 1 до 500п.о. і особливо - в межах 1-100п.о), і керує завершенням транскрипції структурного гена. Термінатор може бути екзогенним або нативним до даного виду дріжджів. Підходящими екзогенними термінаторами можуть бути термінатори GAL10 і CYC-1 із S. cerevisae або інших видів дріжджів. Як і для промоторів, у деяких варіантах здійснення винаходу дана термінаторна послідовність є гомологічною термінаторній послідовності гена-мішені. Ген, промотор, термінатор або інший геномний матеріал вважається "гомологічним" іншому геномному матеріалу, якщо він є ідентичним, тобто має принаймні 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% і, приблизно, 99% ідентичність нуклеотидної послідовності іншому геномному матеріалу, або ж, якщо не є ідентичним, то є достатньо подібним йому, тобто зберігає його функцію. Таким чином, генетичний матеріал вважається "гомологічним", якщо він містить відмінності, зумовлені, наприклад, точковими мутаціями, делеціями або добавками пар основ за умови, що ці мутації, делеції або добавки не впливають на функції даного генетичного матеріалу. У випадку фланкуючих послідовностей гомологія має місце, якщо дана послідовність є достатньо подібною фланкуючій послідовності нативного гена, тобто настільки, що кожна фланкуюча послідовність може входити у взаємодію у поодинокій події кросінговера з фланкуючою послідовністю нативного гена. Термін "ідентичність" у відповідності із загальноприйнятим його вживанням у даній галузі означає спорідненість між послідовностями двох або більше поліпептидних молекул або двох чи більше молекул нуклеїнових кислот згідно з визначенням шляхом порівняння їхніх послідовностей. При цьому "ідентичність" також означає ступінь послідовністної спорідненості між молекулами нуклеїнових кислот або поліпептидами залежно від випадку, що розглядається, згідно з визначенням шляхом 11 80976 зіставляння ланцюгів двох чи більше нуклеотидних або двох чи більше амінокислотних послідовностей. "Ідентичність" виміряється відсотком ідентичних збігів між меншими із двох або більше послідовностей з порівняннями пробілів (у разі їх наявності), адресованих специфічною математичною моделлю або комп'ютерною програмою (тобто "алгоритмами"). Термін "подібність" використовується в даній галузі у зв'язку з концепцією, що розглядається, але у протилежність "ідентичності", означає міру спорідненості, що включає у себе як ідентичні збіги, так і збіги консервативних заміщень. Якщо дві поліпептидні послідовності мають, наприклад, 10/20 ідентичних амінокислот, а решта їх вся є неконсервативними заміщеннями, то ступінь як ідентичності, так і подібності буде складати 50%. Якщо ж у цьому самому прикладі існує п'ять і більше положень, де є наявними консервативні заміщення, то ступінь ідентичності залишається на рівні 50%, але ступінь подібності буде складати вже 75% (15/20). Таким чином, у ти х випадках, коли існують консервативні заміщення, ступінь подібності між двома поліпептидами буде вищим, ніж ступінь ідентичності між цими двома поліпептидами. Ідентичність і подібність споріднених нуклеїнових кислот і поліпептидів можна легко обчислити за допомогою добре відомих методів. Такі методи описані, наприклад, у [COMPUTATION AL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANAL YSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE AN AL YSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press SEQUENCE AN ALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SI AM J. Applied Math., 48:1073 and Durbin et al., 1998, BIOLOGIC AL SEQUENCE ANAL YSIS, Cambridge University Press]. Кращими є методи визначення ідентичності, які розраховані на те, щоб давати максимальний збіг між послідовностями, що аналізуються. Методи визначення ідентичності описані в широкодоступних комп'ютерних програмах. Кращими серед них є методи визначення ідентичності між двома послідовностями, розроблені в програмних пакетах GCG, включаючи GAP [De vereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, Wl], BLASTP, BLASTN і FASTA [Altschul et al., 1990, J. Mol, Biol., 215:403-410]. Програма BLASTX може бути отримана в Національному центрі біотехнічної інформації (NCBI) або з інших джерел [BLAST Manual Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, supra]. Для визначення ідентичності може використовува тися також добре відомий алгоритм Сміта-Уотермана (Smith Waterman). Деякі схеми порівняння двох амінокислотних або полінуклеотидних послідовностей можуть 12 давати збіг лише короткої ділянки цих двох послідовностей, причому ця невелика ділянка може мати дуже високу послідовністну ідентичність навіть при незначній спорідненості між цими двома послідовностями повної довжини. Отже, в деяких випадках практичного здійснення даного винаходу вибраний метод порівняння послідовностей (GAP-програма) буде давати порівняння, що охоплює, принаймні, 50 суміжних амінокислот поліпептиду-мішені. В деяких випадках практичного здійснення порівняння може охоплювати, принаймні, 60, 70, 80, 90, 100, 110 або 120 амінокислот поліпептиду-мішені. Якщо полінуклеотиди порівнюються за допомогою GAPпрограми, то порівняння може охоплювати, принаймні, 100,150 або 200 нуклеотидів, що можуть бути суміжними. Наприклад, при використанні алгоритму GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) два поліпептиди, відсоток ідентичності послідовностей яких потребується визначити, порівнюють для оптимального зіставляння їхніх відповідних амінокислот ("інтервал зіставляння", як визначено алгоритмом). У деяких варіантах здійснення винаходу штра ф за відкриття пробілу (який обчислюється як помножена на З середня діагональ; де "середня діагональ" є середнім арифметичним діагоналі використовуваної матриці порівняння; "діагональ" являє собою підрахунок або число, надане кожному бездоганному збігу амінокислот специфічною матрицею порівняння) і штраф за розширення пробілу (що звичайно складає одну десяту штрафу за відкриття пробілу), а також матриця порівняння, наприклад, РАМ250 або BLOSUM 62 використовуються у сполученні з алгоритмом. У деяких варіантах здійснення винаходу алгоритмом використовується також стандартна матриця порівняння [Dayhoff et аl., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352] стосовно матриці порівняння РАМ 250 і [Henikoff et аl., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919] стосовно матриці порівняння BLOSUM 62]. У деяких варіантах здійснення винаходу до параметрів порівняння поліпептидних послідовностей включають такі: Алгоритм: [Needleman era/., 1970, J. Moi Biol., 48:443-453]; Матриця порівняння: BLOSUM 62 [Henikoff et al., 1992, supra]; Штраф за пробіл: 12 Штраф за довжину пробілу: 4 Поріг подібності: 0 З цими параметрами може використовуватися GAP-програма. Для порівняння нуклеотидних послідовностей до параметрів може включатися штраф за пробіл - 50 і штраф за довжину пробілу 3, який являє собою 3 за кожний символ у кожному пробілі. В деяких випадках практичного здійснення винаходу ви щеперелічені параметри є параметрами за умовчанням для порівняння поліпептидів (разом з відсутністю штрафу за кінцеві пробіли) за допомогою GAP-алгоритму. Дріжджова клітина може мати різноманітні інші модифікації в її природному геномі. Наприклад, 13 80976 вона може містити різноманітні маркерні гени селекції, більш докладно описані нижче, разом із зв'язаними з ними промоторними і термінаторними послідовностями. Дріжджова клітина може також мати делетований PDC-ген або розрив у PDC-гені. Метод делеції PDC разом з інсерцією D-LDH-гена в локусі PDC-гена більш докладно описаний нижче. Інші методи делеції або переривання PDCактивності описані в [Porro, "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid", BiotechnoL Prog. 1995 May-Jun; 11(3): 294-8; Porro et al., "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. En viron. Mcrobiol 1999 Sep:65(9):4211-5; Bianchi et al., "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Mcrobiol 2001 Dec; 67(12)56215; and WO 99/14335]. Рекомбінантні дріжджові клітини за даним винаходом можуть бути приготовані шляхом інсерції нуклеїнокислотного фрагмента, що містить D-LDH-ген, функціонально зв'язаний з промоторною послідовністю. Цей фрагмент, як правило, утворює частину рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що може містити, а в кращому варіанті містить також інші елементи, включаючи: (а) термінаторну послідовність; (b) один або більше маркерних генів селекції (включаючи асоційовані промотор і термінатор); (с) одну або більше гомологічних фланкуючих послідовностей для інсерції даного фрагмента в особливий локус у геномі клітини-хазяїна; (d) один або більше сайтів рестрикції, які дозволяють зрізати фрагмент з утворенням лінійного фрагмента, що містить LDH-ген, його промотори і фланкуючі послідовності, маркерні гени і зв'язані з ним промотори і термінатори, і т.д. для інсерції в геном дріжджової клітини; і/або (є) остову частину. Використовуваний тут термін "рекомбінантна нуклеїнова кислота" означає будь-яку молекулу (наприклад, нуклеїнову кислоту, плазміду або вірус), що використовується для перенесення інформації кодування білка в клітину-хазяїн. Фахівцям добре відомі методи трансформування клітин, включаючи електропорацію, кальційхлоридний і літій-ацетатний методи. Використовувані в цих трансформаціях ДНК можуть бути як зрізаними, так і незрізаними особливими ферментами рестрикції. Використовуваний тут термін "маркерні гени селекції" означає генетичний матеріал, що кодує білок, потрібний для виживання і/або росту клітини-хазяїна, вирощуваної в селективному культуральному середовищі. Типові маркерні гени селекції кодують білки, які: (а) надають стійкості до антибіотиків та інших токсинів, наприклад, до зеоцину (ген sh blе із клітин Streptoalloteichus hindustanus), G418 (ген із Тn903 стійкості до канаміцину), гігроміцину (ген із E. соlі стійкості до аміноглікозидних антибіотиків), амбіциліну, тетрацикліну або канаміцину для клітин-хазяїнів; (b) доповнюють ауксотрофні дефіцити клітини і/або постачають критичні живильні речовини, 14 недоступні із простих середовищ, такі, як амінокислотний дефіцит лейцину (ген Leu2 із K. marxianus); або urа3-ген із K. marxianus, що дає урацил оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазанегативним клітинам. До числа кращих маркерів селекції належать, наприклад, ген стійкості до зеоцину, ген стійкості до G418 і ген стійкості до гігроміцину. Остові частини створюють звичайно із доступних для придбання дріжджових векторів. Підходящі процеси трансформування дріжджових клітин для інсерції екзогенного LDHгена [описані в WO 00/71738А1 і WO 02/42471А1]. Ці процеси можуть у загальному випадку застосовуватися для створення рекомбінантних дріжджових клітин за даним винаходом із заміщенням описаних у зазначених заявках L-LDHгенів D-LDH-геном. Використовуваний тут термін "трансформування" або "трансформація" означає зміну в генетичних характеристиках клітини, а клітина є "трансформованою", коли вона внаслідок її модифікації містить нову н уклеїнову кислоту. Так, клітина є трансформованою, якщо вона є генетично модифікованою із її природного стану. Наприклад, після трансфекції трансформуюча ДНК у кращому варіанті рекомбінує з клітинною геномною ДНК шляхом фізичного інтегрування в хромосому цієї клітини. В альтернативному варіанті нуклеїнова кислота може, принаймні, тимчасово (тобто в межах 48-06 годин клітинної трансформації) підтримуватися як епісомний елемент без її реплікації, або ж може незалежно відтворюватися як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, якщо дана ДНК інтегрована в дану хромосому і відтворюється при діленні клітини. Використовуваний тут термін "трансфекція" означає поглинання чужорідної або екзогенної ДНК клітиною, а клітина вважається "трансфікованою", якщо під її мембрану введена екзогенна ДНК. Відомі численні методи трансфекції, наприклад [Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABOR ATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; Chu ef al., 1981, Gene 13:197]. Ці та інші подібні методи можуть використовува тися для введення одного і більше видів екзогенних ДНК у підходящі клітини-хазяїни. Множину D-LDH-генів можна інтегрувати шляхом проведення множини трансформацій. Поряд з цим можна конструювати рекомбінантну нуклеїнову кислоту, що містить множину D-LDHгенів, що дозволяє, таким чином, інтегрувати множину D-LDH-генів за одну стадію. Особливо цікавим при цьому є процес трансформування, спрямований на інсерцію DLDH-гена в локусі цільового гена природного походження. Цільовим є будь-який ген, котрий потребується замістити LDH-геном. Кращим цільовим геном є піруватдекарбоксилазний ген, оскільки заміщення його розриває конкурентний шлях, що продукує етанол. Крім того, піруватий 15 80976 ген є схильним до активного поводження в дріжджових видах. Отже, інсерція LDH-гена в геном під контролем PDC-промоторів і термінаторів буде з великою імовірністю продукувати мутант, що добре експресує LDH. Іншими кращими цільовими генами є ADH, Leu2 і Ura3. У кращому варіанті дріжджові клітини за даним винаходом трансформуються рекомбінантними нуклеїновими кислотами за даним винаходом, а селекція їх проводиться шляхом вирощування в селективному середовищі, в якому маркер селекції в рекомбінантній нуклеїновій кислоті дозволяє здійснювати переважне вирощування трансформантів. Трансформовані клітини після селекції вирощуються в неселективних умовах. Вирощування в цих умовах дозволяє отримувати рекомбінантні дріжджові клітини, що мають екзогенний D-LDH-ген, який містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, інтегровану в генетичний локус цільового гена в дріжджовій хромосомі. Отримані у відповідності з процесами за даним винаходом ці клітини мають делетований цільовий ген і інтегрований екзогенний D-LDH-ген, уставлений у локус цільового гена так, що він є функціонально зв'язаний і перебуває під транскрипційним контролем послідовностей регулювання експресії (таких, як промоторні і термінаторні послідовності) цільового гена. Якщо цільовим є PDC-ген, то клітини, в котрих відбувається делеція PDC, втрачають здатність добре рости в анаеробних умовах. Таким чином, колонії ідентифікованих і селектованих клітин можуть піддаватися селекції шляхом створення для них анаеробних умов. Колонії, що не ростуть, ідентифікуються при цьому як такі, в котрих відбулася делеція PDC. Подібним чином, цільове інтегрування в будь-який інший цільовий ген може ідентифікуватися фенотипом, асоційованим з делецією кожного із цільових генів. Дріжджова клітина, що отримується в результаті проведення описаного вище процесу, не містить цільового гена і містить екзогенний DLDH-ген, інтегрований в її геном у локусі цільового гена. Цей D-LDH-ген перебуває під транскрипційним контролем промоторної послідовності і термінаторної послідовності, що є гомологічними промоторній і термінаторній послідовностям цільового гена. Промоторною і термінаторною послідовностями D-LDH-ази можуть бути послідовності, що були наявними у фланкуючих послідовностях, які містилися в рекомбінантній нуклеїновій кислоті, використовуваній для трансформування клітини, або ж можуть бути такі, що від самого початку були наявними в геномі клітини в сайті інтегрування. Можливо також, що термінатор цільового гена буде утримуватися з делецією термінаторної послідовності, що була наявною у векторі інтегрування. Фланкуюча послідовність може безпосередньо прилягати до D-LDH-гена або відділятися від нього проміжною послідовністю чи проміжними парами основ, наприклад, інтервалом 1-1000п.о., а краще 1-100п.о. Фланкуючі послідовності, 16 використовувані в рекомбінантних нуклеїнових кислотах за даним винаходом, у кращому варіанті є гомологічними відповідним фланкуючим послідовностям цільового гена. Довжина типових фланкуючих послідовностей складає, приблизно, від 50 до 4000п.о., у кращому варіанті - приблизно від 100 до 2000п.о. і в особливо кращому варіанті приблизно 1200п.о. Фланкуючі послідовності у кращому варіанті містять промоторну (термінаторну у випадку правої фланкуючої послідовності) послідовність, гомологічну відповідній послідовності цільового гена. У кращих варіантах здійснення винаходу фланкуючі послідовності є гомологічними і містять, відповідно, промоторні і термінаторні послідовності для нативних дріжджів. У найкращому варіанті здійснення винаходу інтегрування рекомбінантної нуклеїнової кислоти в локус цільового гена у хромосомній ДНК дріжджового геному дає екзогенний D-LDH-ген, кодований тим самим таким чином, щоб підпадати під транскрипційний контроль регуляторних послідовностей експресії нативного гена, що містять вищезазначені фланкуючі послідовності. Підхожі фланкуючі послідовності можуть бути отримані шляхом ідентифікації наміченого сайта інтегрування в геномі дріжджової клітини, клонування послідовностей, що фланкують цей сайт (використовуючи будь-який із підходящих методів) і прикріплення цих послідовностей до бажаного положення в рекомбінантній нуклеїновій кислоті. У кращому варіанті здійснення винаходу рекомбінантна нуклеїнова кислота, крім того, включає у себе один чи більше маркерних генів селекції, які у більш кращому варіанті перебувають під транскрипційним контролем їхніх власних промоторних і термінаторних послідовностей. У цьому варіанті здійснення промоторні і термінаторні послідовності для маркерних генів не є промоторними і термінаторними послідовностями для цільового гена. Маркерні гени селекції та їхні відповідні промотори і термінатори в кращому варіанті не переривають послідовності "ліва фланкуюча послідовність LDH-ген -права фланкуюча послідовність" рекомбінантної нуклеїнової кислоти. Маркерні гени селекції та відповідні промотори і термінатори в кращому варіанті розташовані на ділянці від лівого (5і) положення рекомбінантної нуклеїнової кислоти до лівої фланкуючої послідовності. Цільовим геном є будь-який ген, котрий потребується замінити на LDH-ген. Кращим цільовим геном є піруватдекарбоксилазний ген, оскільки його заміщення перериває конкурентний шлях продукування етанолу. Крім того, піруватний ген є схильним до того, щоб бути активним у дріжджових видах. Отже, інсерція LDH-гена в геном під контролем PDC-промоторів і термінаторів з великою імовірністю буде давати мутант, що добре експресує LDH. Кращими цільовими генами, крім того, є алкогольдегідрогеназа (ADH), оротидин-5'фосфа тдекарбоксилаза (urа3) і 3ізопропілмалатдегідрогеназа (Іеu2). 17 80976 Отримувана в результаті цього дріжджова клітина не містить цільового гена, але містить екзогенний D-LDH-ген, інтегрований в її геном у локусі цільового гена. D-LDH-ген перебуває при цьому під транскрипційним контролем промоторної послідовності і термінаторної послідовності, які є гомологічними, відповідно, промоторній і термінаторній послідовностям цільового гена. У цьому варіанті здійснення винаходу промоторною і термінаторною послідовностями LDH-ази можуть бути послідовності, що були наявними в рекомбінантній нуклеїновій кислоті, котра використовувалася для трансформування клітини, або ж можуть бути ті послідовності, що від самого початку були наявними в геномі клітини в сайті інтегрування. Після першої події кросінговера вставлений D-LDH-ген є функціонально зв'язаним з промоторною і термінаторною послідовностями, що були наявними в інтеграційному векторі. Після другої події кросінговера одна з цих послідовностей, промоторна чи термінаторна, або обидві ці послідовності можуть бути заміщені нативними PDC-промотором і/або PDCтермінатором. Наприклад, нативний PDCпромотор може утримуватися з делецією промоторної послідовності, що одержала інтеграційний вектор. Можливо також, що нативний PDC-термінатор буде утримуватися з делеціюєю термінаторної послідовності, що була наявною в інтеграційному векторі. Трансформована дріжджова клітина за даним винаходом може використовуватися для продукування D-молочної кислоти із цукрів у ферментаційному процесі. У кращому варіанті ця клітина не містить функціонуючого L-LDH-гена, або ж якщо такий L-LDH-ген у ній міститься, то його активність є такою, що принаймні 90%, краще - принаймні 95%, ще краще - принаймні 99,0% і ще краще - принаймні 99,5% молочної кислоти, що виробляється цією клітиною, є D-ізомером. Ферментація може здійснюватися за будьяким підходящим процесом. Як правило, дріжджова клітина забезпечується вуглеводом, здатним метаболічно перетворюватися на піруват, і для неї створюються умови, в яких відбувається процес ферментації. Ферментаційне середовище містить також живильні речовини (такі, як джерела азоту, фосфор у, сірки, слідові кількості мінералів і т.д.), що підтримують життєздатність клітин. Вуглеводи, котрі можуть використовува тися в цьому процесі, залежать від конкретної клітинихазяїна і того, чи модифікована ця клітина-хазяїн для здійснення метаболічного перетворення даного вуглеводу на піруват. Кращими при цьому є: гексозні цукри, такі, як глюкоза і фруктоза; олігомери глюкози, такі, як мальтоза, ізомальтоза, мальтотриоза, крохмаль і цукроза, мальтодекстрини і ксилоза (пентозний цукор). Менш прийнятними є такі вуглеводи, як галактоза, маноза й арабіноза. Температуру в процесі ферментації можна встановлювати в межах від кімнатної, у кращому варіанті - приблизно від 30°С, ще краще приблизно від 35°С до приблизно 55°С, краще 18 приблизно до 50°С і ще краще - приблизно до 45°С. Максимальна температура процесу залежить певною мірою від конкретної клітинихазяїна. Якщо клітиною хазяїном є, наприклад, K. marxianus, то рекомбінантна клітина може витримувати відносно високі температури (порядку від 40 до 50°С і особливо до 45°С). Інший кращий вид клітини-хазяїна, С. sonorensis, здатний витримувати температури, приблизно, до 40°С. Така висока температурна стійкість дозволяє здійснювати процес ферментації при таких високих температурах (зменшуючи тим самим витрати на охолодження) без значних втрат продуктивності. Іншою перевагою, що дає хороша толерантність до високих температур, є те, що у випадку забруднення ферментаційного середовища небажаними мікроорганізмами ці мікроорганізми в багатьох випадках можуть бути селективно вбиті нагрівом ферментаційного середовища до температури 40°С і більше, а в особливих випадках - до 45°С і більше, не завдаючи значної шкоди бажаним клітинам за даним винаходом. Під час ферментації концентрація клітин у ферментаційному середовищі, звичайно, лежить у межах, приблизно, 1-150, у кращому варіанті приблизно 3-10, а в ще кращому - приблизно 3-6 г сухи х клітин на літр ферментаційного середовища. Під час фази продукування в процесі ферментації в деяких випадках може потребуватися культивування скоріше в мікроаеробних, ніж у жорстко анаеробних умовах. Оптимальні умови аерації можуть встановлюватися для кожного мікроорганізму шляхом вимірювання питомого поглинання кисню (OUR: oxygen uptake rate) і корелювання цієї величини з виходом продукту, швидкістю споживання субстрату і швидкістю вироблення бажаного продукту ферментації. В багатьох випадках величини виходу продукту і зазначених швидкостей оптимізуються в заданому діапазоні величин OUR. У випадку дріжджів, що мають PDCрозрив, оптимальні величини OUR лежать у межах, приблизно, від 0,8 до 3,5ммоль О2/суха маса клітин/година. OUR визначає собою швидкість, з якою кисень споживається клітинами в процесі ферментації, і виражається в мілімолях або грамах кисню відносно сухої маси клітин за одиницю часу, тобто, наприклад, ммоль О2/суха маса клітин/година. Споживання кисню визначають, звичайно, шляхом вимірювання кількості кисню, введеного у ферментаційне середовище, і кількості кисню, видаленого із цього ферментаційного середовища. Вимірювання OUR можуть служити основою для регулювання умов аерації (а саме швидкості введення газу, перемішування, пропорції кисню в аераційному газі і т.д.) під час стадії продукування в процесі ферментації з метою підтримання величини OUR в межах, оптимальних для даного організму. Водночас концентрація розчиненого кисню у ферментаційному бульйоні підтримується на рівні менше 1% від рівня насиченості, і особливо – на рівні менше 10мкмоль О2/л. В особливо кращому варіанті стадію росту в процесі ферментації 19 80976 проводять таким чином, щоб концентрація розчиненого кисню в бульйоні була знижена до рівня менше 10% від рівня насичення і особливо до рівня менше 10мкмоль О2/л у певному інтервалі часу, наприклад, в інтервалі 15-90 хвилин перед початком стадії продукування (тобто шляхом переключення аеробних умов на стадії росту на мікроаеробні умови на стадії продукування). Під час вироблення D-молочної кислоти величина рН ферментаційного середовища має тенденцію до падіння, якщо до середовища не додається основа для нейтралізації всієї або частини кислоти, що утворюється. В одному з варіантів здійснення такого ферментаційного процесу до ферментаційного бульйону для підтримання його рН у бажаних межах, звичайно, від 5,0 до 8,0 і особливо в межах, приблизно, від 5,5 до 7,5 уводять нейтралізатор, такий, як карбонат кальцію, гідроксид кальцію, карбонат натрію, гідроксид натрію, аміак, гідроксид амонію і т.п. Коли додається така основа, утворюється відповідна сіль молочної кислоти - лактат. Отже відновлення молочної кислоти потребує регенерації вільної молочної кислоти. Звичайно, це здійснюється шляхом відділяння клітин і підкислення ферментаційного бульйону сильною кислотою, якою можуть бути, наприклад, сірчана кислота. Утворювану при цьому побічну сіль (у випадку застосування, як нейтралізатора, солі кальцію, а як підкислювача - сірчаної кислоти такою сіллю є сульфат кальцію) відділяють від молочної кислоти. Після цього молочну кислоту відновлюють за допомогою таких процесів, як екстрагування рідких речовин рідинами, дистиляція, абсорбція і т.д., описаних, наприклад, у [Т.В. Vickroy, Vol.3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995; 16:221-231; U.S. Patent No.4,275,234, 4,771,001, 5,132,456, 5,420,304, 5,510,526, 5,641,406, 5,831,122, Міжнародна патентна заявка No: WO 93/00440]. В альтернативному варіанті величині рН ферментаційного середовища може бути дозволено падати у міру продукування молочної кислоти клітинами. У цьому випадку, в результаті продукування молочної кислоти рН ферментаційного середовища може потрапляти в інтервал, приблизно, від 1,5 до 5,0, у кращому варіанті - приблизно від 1,5 до 4,2, у ще кращому приблизно від 1,5 до 3,86 (рKа молочної кислоти) і в найкращому - приблизно від 2,0 до нижче, ніж 3,86. Проведення процесу ферментації в цьому режимі може давати декілька переваг за умови забезпечення бажаних рівнів продуктивності і виходу продукту. Такий підхід дозволяє знизити або виключити повністю витрати на нейтралізатор. Якщо рН ферментаційного середовища (наприкінці процесу ферментації) падає нижче рКа молочної кислоти, то молочна кислота буде існувати, головним чином, у кислотній формі. Це дозволяє виключити із процесу стадію підкислення, запроваджуючи цим економію на додаткових стадіях процесу, витратах на підкислення і витратах на виведення відходів у 20 формі побічних сольових продуктів. Таким чином, запропонований процес у кращому варіанті передбачає продовження ферментації доти, поки рН ферментаційного бульйону не впаде нижче рівня 3,86. Молочна кислота може бути відділена від такого ферментаційного бульйону за допомогою процесів, описаних, наприклад, у [WO 99/19290]. Толерантність даної клітини до середовища з низькою рН дає ще один механізм позбавлення забруднення небажаними мікроорганізмами. Для цього в культурі, що містить клітини за даним винаходом, можуть бути створені умови зниженої рН, де рН буде складати, приблизно, від 1,5 до 4,2, у кращому варіанті - приблизно від 2,0 до 3,86 протягом часу, достатнього для ліквідації забруднюючих мікроорганізмів, що не є стійкими до кислот. Для застосування в промислових процесах рекомбінантні дріжджі за даним винаходом повинні мати декілька певних характеристик. Ці дріжджі повинні перетворювати значну відносну частину вуглеводу на молочну кислоту (тобто забезпечувати високий вихід продукту). Вони повинні також володіти високою питомою продуктивністю, тобто виробляти велику кількість молочної кислоти на масу клітин за одиницю часу. Дріжджі повинні також переносити умови рН у ферментаційному бульйоні нижче, приблизно, 5,0, у кращому варіанті - від 1,5 до 4,2 і, особливо, від 2,0 до 3,86, забезпечуючи при цьому високий вихід продукту і високу продуктивність. Бажано також, щоб клітина була толерантною до високих концентрацій D-молочної кислоти і/або солей Dмолочної кислоти при величинах рН у межах 5,08,0, краще - в межах від 1,5 до 5,0, ще краще - в межах від 1,5 до 4,2, і найкраще - в межах від 2,0 до 3,86. Остання з цих властивостей дозволяє використовува ти в процесі ферментації високі початкові концентрації вугле воду. У загальному випадку є бажаним, щоб процес ферментації, в якому використовуються рекомбінантні клітини за даним винаходом, забезпечував усі або деякі з таких параметрів: А - Вихід, принаймні, 30, у кращому варіанті принаймні 40, у ще кращому - принаймні 60, і в найкращому - принаймні 75г молочної кислоти на грам вуглеводу. Теоретичний вихід процесу становить 100%, але на практиці він обмежується величиною, приблизно, 98% (г/г). В - Питома продуктивність - принаймні 0,1, у кращому варіанті - принаймні 0,3, ще краще принаймні 0,4, і найкраще - принаймні 0,5г Dмолочної кислоти на грам клітин за годину. Питому продуктивність бажано мати якомога вищою. С - Титр (максимальна концентрація Dмолочної кислоти) принаймні 15г/л ферментаційного середовища, краще - принаймні 20г/л, ще краще - принаймні 40г/л, і найкраще принаймні 80г/л, до 150г/л, і ще краще - приблизно до 120г/л ферментаційного середовища. Температура ферментаційного середовища деякою мірою впливає на верхній край легко досяжних титрів, оскільки висококонцентровані 21 80976 розчини молочної кислоти (тобто вище, ніж приблизно 150г/л) мають схильність до того, щоб ставати дуже в'язкими або приймати гелеподібну форму при температурах нижче, ніж приблизно 35°С. Отже, застосування більш високої температури ферментації, наприклад, у межах, приблизно, 35-50°С дозволяє на більш високі титри без утворення гелю або небажаного підвищення в'язкості розчину. Рекомбінантні клітини за даним винаходом продемонстрували вихід корисного продукту в межах, приблизно, 92-98%, об'ємну продуктивність 1,5-2,2г/л/год. і титри 81-90г/л в умовах нейтрального (рН5,0-8,0) ферментаційного середовища на глюкозі. У ферментаційних середовищах з низькими рН, де допускалася можливість зниження рН до рівня, приблизно, 3,0, клітини за даним винаходом показували вихід порядку 80% і більше, і титри в межах 1,2-3,3г/л. Ці результати в усіх випадках були отримані без оптимізації умов ферментації. Крім того, процес ферментації згідно з даним винаходом у кращому варіанті забезпечує високу об'ємну продуктивність. Об'ємна продуктивність виражається в кількості продукту, виробленого на одиницю об'єму ферментаційного середовища за одиницю часу і вимірюється в грамах продукту на літр середовища за годину. Бажаними є такі величини об'ємної продуктивності: принаймні, 1,5г/л/год., у кращому варіанті - принаймні 2,0г/л/год. і в ще кращому - принаймні 2,5г/л/год. При кращих значеннях густини клітин до 3-6г клітин на літр ферментаційного середовища максимальні значення продуктивності досягають, приблизно, 5,0г/л/год., а в більш типових випадках - приблизно 4,0г/л/год. При цьому проводити процес ферментації дуже бажано так, щоб ці величини об'ємної продуктивності досягалися при величинах рН середовища і/або температури в межах, зазначених у попередньому абзаці. Молочна кислота, вироблена згідно з даним винаходом, може використовува тися для одержання лактиду, циклічного ангідриду із двох молекул молочної кислоти. Залежно від стереоізомеру молочної кислоти цей лактид може бути D-лактидом (утвореним із двох молекул Dмолочної кислоти), L-лактидом (утвореним із двох молекул L-молочної кислоти) або D-L-лактидом (утвореним із однієї молекули L-молочної кислоти і однієї молекули D-молочної кислоти). Підходящим процесом для одержання лактиду із молочної кислоти є процес полімеризації-деполімеризації, описаний у [патентні США №5,142,023 (Gruber et al)]. Лактид, у свою чергу, являє собою дуже корисну сировину як мономер для одержання полілактидних полімерів (PLA) і співполімерів. Підходящі процеси для цього описані, наприклад, у [патенті США №5,142,023 (Gruber et al)]. Кращими PLA-продуктами є стійкі при плавленні полімери, описані в [патенті США №5,338,822 (Gruber et al)]. PLA-полімери можуть бути напівкристалічними або аморфними. Нижче розглянуто приклади, що ілюструють деякі варіанти практичного здійснення даного 22 винаходу і не несуть з собою будь-яких обмежень щодо його об'єму та ідеї. Приклади Приклад 1А. Конструювання рNС2-плазмщи експресії на основі PGK-промотора із виду S. cerevisiae і рNС4-плазмщи експреси на основі PDC1-промотора із виду S. cere visiae. Плазміда pNC2 експресії (Фіг.1) була створена шляхом комбінування PGK-промотора із виду S. cerevisiae і GAL10-термінатора із виду S. cere visiae на остовому векторі pGEM5Z(+) (Promega, Wisconsin). PGK-промотор і GAL70-термінатор із S. cerevisiae були розділені полілінкерною ділянкою з сайтами рестрикції Хbа1, EcoR1 і ВаmН1 для інсерції особливих генів для їх експреси між дріжджовими промотором і термінатором. При цьому використовувався PGK1-промотор із виду S. cerevisiae, що мав такі послідовності (SEQ ID No.1): Він був отриманий як фрагмент рестрикції із плазміди pBFY004. Іншим чином він може бути приготований шляхом PCR-ампліфікації (PCR: полімеразно-ланцюгова реакція), використовуючи як матрицю хромосомну ДНК із виду S. cerevisiae і праймери, розроблені на основі послідовності: Використовуваний вАМО-термінатор із виду S. cerevisiae мав таку послідовність: Ця послідовність була отримана як фрагмент рестрикції із плазміди pBFY004. Іншим чином вона може бути створена шляхом PCR-ампліфікації, використовуючи як матрицю хромосомну ДНК із виду S. cerevisiae і праймери, спроектовані на основі послідовності: Був сконструйований і використаний як загальний вектор експресії полігенний експресуючий кластер, що містив плазміду pNC4, на основі PDC1-промотора і GAL10-термінатора із S. cerevisiae. Під контролем цього промотора було експресовано багато маркерних генів. Плазміда pNC4 показана на Фіг.2. 23 80976 Остовом плазміди pNC4 є pGEM5Z(+) (Promega Corporation; Madison, Wl). PDC1промотор із S. cerevisiae був PCR-ампліфікований при використанні праймерів PSPDCS1 (5'-ССА TCG ATA АС А AGC TC A TGC AAA GAG-3'; SEQ ID No:3) і PSPDCAS2 (5'-GCT СТА GAT TTG ACT GTG TTA TTT TGCG-3'; SEQ ID No:4) і при використанні як матриці хромосомної ДНК із штаму GY5098 S. cerevisiae. Було проведено 30 циклів термоциклування по 1хв. при 94°С, 1хв. при 56°С, 1хв. при 72°С і наступним завершальним інкубуванням протягом 7хв. при 72°С, використовуючи ДНК-полімеразу PfuTurbo (Stratagene). GAL10-термінатор із виду S. cerevisiae був одержаний так, як описано вище. Послідовностями SEQ ID NO 41 (Фіг.3А) і 3В SEQ ID NO 42 (Фіг.3В) відображений фрагмент, що містить PGK1промотор і GAL10-термінатор із сайтами мультиклонування і РОС1-промотор і GAL10термінатор із сайтами мультиклонування. Приклад 1В. Конструювання плазміди pVR24, що містить L-LDH із В. Megaterium, під контролем PGK1 -промотора із S. cerevisiae. ДНК штаму В. megatenum, яка кодує L-LDHген, була виділена таким чином. Штам В. megatenum був отриманий від Американської колекції типових культур (АТСС номер доступу 6458) і вирощувався в стандартних умовах. Геномна ДНК була очищена від цих клітин за допомогою набору "Easy-DNA" фірми Invitrogen згідно з протоколом виробника. Праймери були сконструйовані на основі послідовності, наявної в Генбанку для L-LDH із штаму B. megatenum (Genbank, номер доступу М22305). PCR-реакції ампліфікації проводилися при .використанні буферу II Перкіна-Ельмера (Perkin Elmer) (1,5мМ MgCI2) і полімерази AmpliTaq Gold. Кожне реакційне середовище містило геномну ДНК із В. megatenum у концентрації 6нг/мкл, один із чотирьох dNTP у концентрації 0,2мМ і один із двох праймерів ампліфікації ВМ1270, ВМ179 у концентрації 1мкМ. Зазначені праймери мали такі послідовності: Реакції проводили в таких умовах термоциклування: початкове інкубування протягом 10хв. при 95°С, після чого йшли 35 циклів по 30с при 95°С, 30с при 50°С і 60с при 72°С. Утворюваний у результаті цього процесу міцний фрагмент (1100п.о.) очищали і відділяли за допомогою електрофорезу на агарозному гелі, клонували і секвенували. Отримувану послідовність можна було транслювати в поліпептид, що демонстрував чудову гомологію по відношенню до відомих генів, що кодують L-LDH (наприклад, під номером доступу М22305 в Генбанку). Кодуюча послідовність для LDH-кодуючого гена штаму В. megatenum була функціонально зв'язана з промотором із фосфогліцераткіназного (PGK) гена і транскрипційним термінатором із 24 GAL10-гена, обидва із дріжджових клітин S. cerevisiae. На основі цієї послідовності були розроблені два олігонуклеотидні праймери, Bmeg5' і Втед3', для введення сайтів рестрикції на кінцях кодуючої послідовності цього гена: Ця реакція ампліфікації проводилася при зазначених вище концентраціях dNTP і праймера і при використанні полімерази Pfu Turbo (Stratagene) у буфері виробника. Термоциклування проводили в режимі з початковою інкубацією протягом 3хв. при 95°С, після чого йшли 20 циклів по 30с при 95°С, 30с при 50°С і 60с при 72°С і завершальна інкубація протягом 90хв. при 72°С. Продукт гідролізувався ферментами рестрикції ХbаІ і ВаmНІ і лігувався у сайти Xbdl і ВаmНІ рNС2-плазмщи. Внаслідок цього лігування PGKпромотор і GAL 10 ставали функціонально зв'язаними з В. megatenum LDH-кодуючою послідовністю, ідентифікованою як pVR24 (Фіг.4). Приклад 1С. Конструювання р\/К22-плазміди, що заховує кластер стійкості до G418, функціонально зв'язаний з РDС1-промотором і GAL-10-терміиатором із штаму S. cere visiae Маркер стійкості до G418 був клонований під контролем PDC1-промотора із штаму S. cerevisiae, і отримані генетично модифіковані конструкції були позначені як pVR22 (Фіг.5). У цій плазміди GAL10-термінатор із S. cerevisiae використовувався як термінатор для гена стійкості до G418. Ген стійкості до G418 був ампліфікований шляхом полімеразно-ланцюгової реакції при використанні полімерази Pfu Turbo (Stratagene) з праймерами 5'-GCT СТА GAT GAG CCA ТАТ ТСА ACG GGA ААС (5' G-фрагмент; SEQ ID No:9) і 5'-ATG GAT ССТ TAG ААА ААС ТС А TCG AGC АТС (3' G-фрагмент; SEQ ID No:10) і плазмідою рРІС9К (Invitrogen, Carlsbad, CA) як матрицею. Термоциклування проводили в режимі з початковим інкубуванням реакційного середовища протягом 5хв. при 95°С з наступними 35 циклами по 30с при 95°С, 30с при 49°С, 2хв. при 72°С, після чого йшло завершальне інкубування протягом 10хв. при 72°С. Продукт PCR-ампліфікації гідролізувався ферментами ВаmНІ і Xbal, 821п.о. фрагмент виділявся і піддавався лігуванню в 4303п.о. фрагмент ВаmНІ і Xbal плазміди pNC2. Отримувана в результаті плазміда мала PGK-промотор і GAL10-термінатор, функціонально зв'язані з геном стійкості до G418 під назвою pVR22, що схематично показаний на Фіг.5. Приклад 1D. Конструювання плазміди pNC7 для експресії L-LDH-гена із виду Bacillus megaterium на реплікуючій плазміді pKDI. Плазміда pNC7 (Фіг.6) була сконструйована таким чином. Кластер експресії, що містив В. megatenum-LDH-ген, був відділений від pVR24 як фрагмент Notl під транскрипційним контролем PGK-промотора і GAL10-термінатора (S. cerevisiae) і лігований у плазміду рІМС3, зрізану фрагментом Notl, з утворенням плазміди pNC7. 25 80976 Плазміда pNC3 була сконструйована шляхом лігування всієї pKD1-плазміди [Wesolowski-Louvel et al., Nonconventional Yeasts in Biotechnology; "Ktuweromyces lactis", pp.139-201; K.Wolf ed.; Springer-Verlag, Berlin, 1996], лінеаризованої Sph1 в унікальний сайт Sph1 плазміди pTEFI/Zeo (Invitrogen). Структура pNC3-плазміди показана на Фіг. Приклад 1Е. Конструювання штаму NC39 виду Kluyveromyces marxianus Плазміда pNC7 була трансформована в K.marxianus (штам CD21) за допомогою стандартних методів для одержання рекомбінантного штаму NC39, який мав В. megaterium L-LDH-ген на багатократно реплікуючій pKDI-плазміді. Приклад 1F. Конструювання плазмід pSO28 і pSO29 для розривання PDC1-векторів розривання За допомогою праймерів SO-M2 5'-СТТ CC A GTC CAG C AG GTC GAG C AGI - 3'; SEQ. ID No:11 і SO-M1 5>-GTC CAG CAT GTC GAG CAG-3'; SEQ. ID.No:12 була сконструйована плазміда pSO21. Як матриця при цьому використовувалася геномна ДНК із виду K. marxianus (штам CD21), а описані вище праймери використовувалися за допомогою звичайних PCR-методик. У результаті був одержаний 5,5kb (тис.п.о.) фрагмент, що містив PDC1-ген із K. marxianus разом з промотором, термінатором і великою ділянкою на лівому і правому кінцях гена. Цей 5,5kb фрагмент був клонований у плазміду pCRII (Invitrogen), у результаті чого була отримана плазміда pSO21 (Фіг.7а). Плазміда pSO27 (Фіг.7b) була синтезована шляхом PCR-ампліфікації 3,3kb PDC1-фрагмента (PDC1-гена, промотора) із pSO21, використовуючи праймери SO-M4 5'-GAA CGA AAC GAA СТТ СТС ТС-3', SEQ ID No:13, і SOM5 5'-СТТ GGA ACT TCT TGT CAG TG-3', SEQ ID No:14, за допомогою звичайних PCR-методик. Утворюваний у результаті фрагмент очищали і виділяли шляхом гель-електрофорезу і після цього лігували в - плазміду pCRH (Invitrogen), отримуючи плазміду pSO27. Плазміда pSO28 (Фіг.8) була сконструйована шляхом гідролізу плазміди pSO27, заховання PDC1 і делеції за допомогою Bbsl 417п.о. із РDС1кодуючої ділянки. Утворювані в результаті нуклеотидні звиси були заповнені ДНКполімеразою Рfu (Stratagene). Цей фрагмент (приблизно 2,9kb) був лігований у Pfuдефосфорильований на кінцях фрагмент Nοtl із pVR22 (Приклад 1С), що містив PGK-промотор S. cerevisiae і ген стійкості до G418, за яким йшов GAL10-термінатор із S. cerevisiae. Подібним чином плазміда pSO29 (Фіг.9) була сконструйована шляхом гідролізу плазміди pSO27 ферментом Bbsl для делецй 417п.о. із PDC1кодуючої ділянки. Нуклеотидні звиси були заповнені ДНК-полімеразою Pfu DNA (Stratagene). Цей фрагмент був лігований у Рfuдефосфорильований фрагмент Xhol/Xbal із pTEF1/Zeo (Invitrogen), що містив S. cere visiae ТЕР7-промотор і ген стійкості до зеоцину, за яким йшов S. cere visiae CYC1-термінатор. 26 Ці конструкції були приготовані з метою розробки різноманітних інтеграційних кластерів, що можуть застосовуватися у створенні штамів K. marxianus, які мають pdc1-нульовий генотип, з різними інтегрованими генами селекції. Трансформанти спочатку були добрані для перевірки інсерції даної конструкції в локусі PDC7, а після цього піддані скринінгу за їхньою нездатністю виробляти етанол і нездатністю рости в анаеробних умовах. Кращою подією рекомбінації є подвійний кросінговер у PDC1 на геномі. Проте, може відбуватися як поодинока, так і подвійна подія рекомбінації, або ж навіть подія ДНКінсерційного мутагенезу. Приклад 1G. Трансформування і селекція K. marxianus для pdc1-нульового генотипу, використовуючи Pdc-фенотип: конструювання штамів CD181, CD186, CD214, CD215, CD216, CD217, CD218, CD219, CD220 і CD221. Як хазяїн трансформування був вибраний штам NC39, оскільки він містить плазміду pNC7 в хазяїні як реплікуючу плазміду, що містить L-LDH на pKD1-остові, наявність якого може підвищува ти імовірність делеції в PDC1 [Chen XJ, et al., Curr. Genet, 1989 Aug; 16(2):95-8]. Штам NC39 вирощували протягом ночі в YPDсередовищі із селекцією на зеоцин (Invitrogen) 100мкг/мл з метою утримання плазміди pNC7, а трансформування проводили за таким протоколом хімічного трансформування дріжджів. Клітини вирощувалися протягом ночі в 5мл YPDсередовища при температурі 30°С і струшуванні з частотою 250об./хв. Культур у розбавляли 50мл YPD-середовища до початкової оптичної густини OD600 приблизно 0,2. Після цього культуру вирощували при 30°С і струшуванні в режимі 250об./хв. до величини OD600, приблизно, 3,0. Далі клітини збирали шляхом центрифугування зі швидкістю 2500об./хв. протягом 5хв. і повторно суспендували в 50мл стерильної води. Клітини збирали шляхом центрифугування при 2500об./хв. протягом 5хв. Цикл повторного суспендування і центрифугування проводили ще один раз. Після цього клітинний осад повторно суспендували в 1,0мл розчину 10мМ Tris. pH7,5, 1мМ EDTA, 20мМ ацетату лі тію, рН7,5. У пробірку мікроцентрифуги додавали: 4,0мкг лінійного pSO28 ДНК-фрагмента, зрізаного Sacl/Αрαl, що містив маркер селекції G418 і фланкуючу PDC1-ділянку, 25мкл носійної ДНК (Colette, 10мг/мкл, обробленої піском), і до суміші при інтенсивному перемішуванні добавляли 500мкл приготованих клітин штаму NC39. Після цього добавляли 3мл 40% PEG, 10мМ Tris, рН7,5, 1мM EDTA, 20мМ ацетату літію, рН7,5, і суміш інтенсивно перемішували. Далі суміш інкубували протягом 30хв. при 30°С у стані струшування з частотою 250об./хв. По завершенню інкубування до суміші добавляли 350мкл DMSO і перемішували її перевертанням пробірок. Після цього клітини піддавали обробці температурним шоком при 42°С протягом 15 хвилин, а потім швидким охолодженням на льоду протягом 3 хвилин. Клітини осаджували центрифугуванням протягом 10с зі швидкістю 14000об./хв., а супернатант видаляли. Далі клітини повторно 27 80976 суспендували в 1мл YPD. Після цього клітинам давали можливість відновитися шляхом інкубування протягом 4 годин при 30°С у стані струшування з частотою 250об./хв. По завершенню періоду відновлення клітини знову осаджували центрифугуванням, а супернатант видаляли. Одразу після цього клітини знов суспендували в остаточному об'ємі, приблизно, 500мкл YPD-середовища. Аліквоту (20мкл) клітинної суспензії висаджували на одну селекційну ча шку, а аліквоти по 100мкл висаджувалися на 6 інших селекційних чашок. Висаджені клітини піддавали інкубуванню при температурі 30°С до появи ознак росту колоній. Чашки, що використовувалися в цьому трансформуванні, містили 300мкг/мл селекційної субстанції (G418). Трансформанти, що виросли на цих первинних чашках, висаджувалися плямами на вторинні чашки з такою ж концентрацією селекційної субстанції. Колонії, що росли на вторинних чашках, піддавалися скринінгу PCRреакцією за звичайними методами для інтеграції подій на PDC1, використовуючи 3'-праймер справа і зовні фрагмента інтеграції (SO4549 5'-ССА ТСС GAA GAA GTC GAT СТС-3'; SEQ ID No:15) і 5'праймер, що лежав усередині гена стійкості до G418 (SO285 5'-СТТ GCC АТС СТА TGG ААС TGC-3'; SEQ ID No:16). За результатами PCRаналізу лише одна із 200 колоній була позитивною. Для підтвердження наявності інтактних PDC1 дикого типу проводили додатковий PCR-аналіз за звичайними PCR-методиками при використанні PDC1-праймерів, націлених на делетований Вbsl-фрагмент із р8О27-плазміди (SO2740 5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3'; SEQ ID No:17 і -SO2444 5'-GCT CCA TCT GAA АТС GAC AG-3';SEQ ID No:18). Один позитивний трансформант відділяли поодинокою колонією і використовували для вироблення гліцеринового штаму, який був ідентифікований як CD181. Цей штам позбавляли рNС7-плазмщи шляхом культивування без селекційного тиску з подальшим висіванням культивованих клітин на чашки з YPD-агаром, що містили G418 (300мкг/мл). Чотири колони відбирали й тестували на чутливість до зеоцину і недостатність вироблення L-молочної кислоти. Всі чотири колонії показували чутливість до зеоцину і втрачали здатність продукувати L-молочну кислоту. Була вибрана одна з колоній, що використовувалася для продукування гліцеринового штаму і була ідентифікована як CD186. Для створення штаму K. marxianus з PDCфенотипом (що не продукує етанол і не росте в анаеробних умовах) було необхідно провести ще одне трансформування CD186. Штам CD186 був трансформований за описаним вище протоколом з 6,8мкг лінеаризованого ДНК-фрагмента pSO29, зрізаного ферментами Nhel/Notl, що містили маркер селекції на зеоцин і делецію на PDC1ділянці. Утворені в результаті трансформанти були висіяні на чашки з YPD-агаром, що містили 300мкг/мл зеоцину. Трансформанти, які 28 вирощувалися на цих первинних чашках, були висіяні плямами на вторинні чашки з 300мкг/мл G418 і 300мкг/мл зеоцину. Колонії, що росли на цих вторинних чашках, були піддані скринінгу на інтегрування в PDC1-локусі за допомогою PCRреакції, що було піддано тестуванню на відсутність PDC1 дикого типу, за допомогою праймерів, наявних на делетованому Sbsl-фрагменті із плазмід pSO27, -SO2740 5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3', SEQ ID No:17; SO2444 5'-GCT CCA TCT GAA АТС GAG AG-3'; SEQ ID No:18. У восьми колоніях була встановлена наявність делецій у PDC1. Це було перевірено за допомогою PCR-аналізу, який показав наявність очікуваної делеції із PDC1 дикого типу і PDC-фенотипу (нездатність виробляти етанол і рости в анаеробних умовах). Із ци х восьми трансформантів були відділені поодинокі колонії і введені в колекцію культур Cargill Dow Culture collection. Ці вісім РОС7-нульових штамів K. marxianus одержали назви CD214, CD215, CD216, CD217, CD218, CD219, CD220 і CD221. Штам CD215 був підданий випробуванням на вироблення етанолу шляхом інокуляції колонії в 50мл YPD-середовища у 250мл шейк-колбі. Культуру інкубували при температурі 30°С в умовах струшування з частотою 70об./хв. Аналіз методом рідинної хроматографії високого розрізнення (HPLC) зразків цієї культури не виявляв наявності етанолу. Приклад 1Н. Конструювання плазміди pPSI, що функціонально зв'язує ген стійкості до гігроміцину з PDC1-промотором і САL10термінатором виду S. cere visiae. Рекомбінантну нуклеїнову кислоту, що надає трансформованим дріжджовим клітинам стійкості до гігроміцину, дозволяючи цим проводити селекцію трансформантів дріжджових клітин, що містять рекомбінантну нуклеїнокислотну конструкцію, яка кодує білок, придатний до синтезу органічного продукту, готували таким чином. Маркер стійкості до гігроміцину (hph виду Е. соlі) клонували під транскрипційним контролем PDC1промотора виду Saccharomyces cerevisiae. Ген hph із клітин E. Соlі, що надає стійкості до гігроміцину В, піддавали PCR-ампліфікації, використовуючи праймери 5HYGXBA1 (5'-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTC AC-3'; SEQ ID No:19) і 3'HYGBAMH1 (5'-CGC GGA ТСС СТА TTC CTT TGC CCT CGG AC-3'; SEQ ID No:20) і як матриці - плазміди pRLMex30 [Mach et al., 1994, Curr. Genet 25, 567-570; Rajgarhia et al., заявка на патент США No:10/154,460, подана 23 травня 2002p.], включені тут в усій їхній повноті шляхом посилання. Ген hph може бути також одержаний при використанні таких самих праймерів з хромосомною ДНК виду Е. соlі як матрицею. Термоциклування проводилося за такою програмою: 30 циклів по 1хв. при 94°С, 1хв. при 56°С, 3хв. при 72°С і наступне за цим остаточне інкубування протягом 7хв. при 72°С, використовуючи ДНК-полімеразу Pfu Turbo DNA (Stratagene). PCR-продукт був відділений шляхом електрофорезу на 0,8% агарозному гелі і складався із 1026п.о. PCR-продукт був підданий 29 80976 гідролізу ферментами Хbаl і ВаmНl і лігований у зрізану ферментами Хbаl і ВаmНl плазміду pNC4 з одержанням плазміди pPS1 (Фіг.10). Приклад 11. Конструювання плазміди pVR43, що містить L. helveticus D-LDH D-LDH була відділена від штаму Lactobacillus helveticus таким чином. Клітини Lactobacillus helveticus були отримані від Американської колекції типових культур (АТСС, номер доступу 10797) і вирощувалися в стандартних умовах. Геномну ДНК очи щали від ци х клітин за таким протоколом. 1. Одну колонію або 5мкл із гліцеринового маточного розчину бактерій молочної кислоти використовували для інокуляції 2x50мл стерильного MRS-бульйону в 250мл стерильних колбах. Культур у вирощували в умовах перемішування зі швидкістю 170об./хв. при температурі 37°С протягом 48 годин. 2. Культуру переносили у 50мл стерильні пробірки із синіми кришками і піддавали центрифугуванню зі швидкістю 3000об./хв. протягом 10 хвилин. Клітинний осад піддавали повторному суспендуванню в 50мл 12,5% мас/об, розчину са харози і знову піддавали центрифугуванню зі швидкістю 3000об./хв. протягом 10 хвилин. Після цього осади повторно суспендували і об'єднували в 5мл 12,5% мас/об, сахарози в 50мл стерильних пробірках, закритих синіми кришками, фірми Falcon (каталог. №29050). До клітинної суспензії додавали 5мл розчину TES (TES: 10мМ Tris (pH8,0), 50мМ EDTA (рН8,0), 50мМ NaCI, стерильний профільтрований). Далі додавали ще 5мл 25% мас/об, розчину сахарози, і суміш перемішували. Після цього до суспензії додавали порошок лізоциму (300мг), і все це інтенсивно перемішували. Після достатньо ретельного перемішування до суміші до суміші додали 25мкл розчину мутанолізину (вихідна концентрація 2,2мг/мл). Суспензію інкубували протягом ночі (приблизно 10-12 годин) при 37°С. 3. Після нічного інкубування додавали 2,5мл 20% розчину SDS (додецилсульфату натрію) і 168мкл розчину протеїнази K (концентрація маточного розчину 28мг/1,4мл). Уміст пробірки перемішували шля хом перевертання, але без струшування. Далі пробірку інкубували при 50°С протягом 1 години. По витіканню цього часу в мембранній речовині клітин з'явилися розриви, і розчин став напівпрозорим. До розчину додали NaCI у кількості, достатній для концентрації 0,15 М. Далі розчин ретельно перемішали шляхом перевертання. 4. Розчин переносили до 50мл пробірки Окриджа (Oakridge) (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, C A) або, в іншому варіанті, розділяли по двох пробірках і піддавали обробці однаковим об'ємом суміші фенолу, хлороформу та ізоамілового спирту (25:24:1). Далі суміш перемішували і піддавали центрифугуванню зі швидкістю 10000об./хв. протягом 10 хвилин. 5. Водний супернатант видаляли в чисту пробірку Окриджа, і до нього добавляли такий самий об'єм хлороформу. Утворений розчин перемішували струшуванням і піддавали 30 центрифугуванню зі швидкістю 5000об./хв. протягом 10 хвилин. 6. Супернатант відбирали сифоном і поміщали у чисту пробірку. До цього супернатанту додавали 25мкл РНК-ази (вихідна концентрація 100мг/мл), і суміш перемішували шляхом перевертання пробірки. Далі пробірку інкубували при 37°С протягом 15 хвилин. Для швидкого розкладання РНК у пробірку з надлишком додали ДНК-азу без РНК-ази. 7. Нарешті, до суміші шля хом обережного зливання уздовж стінки пробірки додавали 2,5 об'єми ЕtOН. Шар ЕtOН не змішувався з умістом пробірки. ДНК, що утворювалася на поверхні розділу рідин, відбирали скляною піпеткою і промивали в 70% ЕtOН. Далі ДНК сушили на відкритому повітрі і повторно суспендували у 10мМ Tris-HCI, рН8,5 (буферний розчин для елюювання в більшості наборів Qiagen) у пробірці для мікрофугування. Після цього пробірку інкубували при 50°С доти, аж поки ДНК не виходила в розчин. Праймери були сконструйовані на основі наявної в Генбанку послідовності для D-LDH із штаму L helveticus (Genbank, номер доступу 1107604 або Х66723 (SEQ ID No.43)). Використовуючи полімеразу Pfu Turbo (Stratagene, Wl, USA), були проведені реакції PCRампліфікації. Кожне реакційне середовище містило геномну ДНК із L helveticus в концентрації 500нг, один із чотирьох dNTP в концентрації 0,2мМ і один із праймерів ампліфікації VR150 5'-GGT TGG ATT TAT GAC ААА GGT ТТТ GCTT-3'; SEQ ID No.21) і VR153 5'-ΑΑΤ ТАА ААС TTG ТТС TTG ТТС ААА GCA АСТ-3'; SEQ ID No.22) в концентрації 1мкМ. Реакції проводили в такому режимі циклування: початкове інкубування протягом 10хв. при 95°С, слідом за цим 35 циклів по 30с при 95°С, 30с при 51°С і 60с при 72°С. Міцний фрагмент продукту із 1027п.о. очищали в гелі за звичайними методиками і ТА клонували у вектор PCR-Bluntll для топоклонування (Invitrogen, Carlsbad, CA). Утворювану в результаті плазміду під назвою pVR43 (показану на Фіг.11а) піддавали секвенуванню. Отриману послідовність можна було транслювати в поліпептид, що демонстрував чудову гомологію з відомими послідовностями DLDH-кодуючих генів L. helveticus у Генбанку (номера доступу U07604 або Х66723). Приклад 1J. Конструювання плазміди pVR47, що містить L. helveticus D-LDH, під контролем PGK1-промотора і GAL10-термінатора із клітин S. cerevisiae. Були сконструйовані праймери для введення сайтів Хbаl і ВаmНl у 5' і 3' кінці D-LDH-гена для клонування в плазміду pNC2. Були проведені PCRреакції ампліфікації, використовуючи полімеразу Pfu Turbo (Stratagene, Wisconsin, USA). Кожне реакційне середовище містило pVR43 (заховання L. helveticus D-LDfJ) (5нг), один із чотирьох 4 dNTP з концентрацією 0,2мМ і один із праймерів ампліфікації VR165 5'-CGT СТА GAT ТТА TGA САА AGG ТТТ TGCT-3'; SEQ ID No.23 і VR166 5'GCG GAT CCT ТАА ААС TTG ТТС TTG ТТС АА-3'; SEQ ID No.24 з концентрацією 1мкМ. Реакції 31 80976 проводили в такому режимі циклування: початкове інкубування протягом 10хв. при 95°С, слідом за цим 35 циклів по 30с при 95°С, 30с при 55°С і 60с при 72°С. Утворюваний міцний фрагмент продукту завдовжки 1035п.о. очищали гелем за звичайними методиками і піддавали ТА-клонуванню, використовуючи вектор для топоклонування PCRBluntll (Invitrogen, Carlsbad, СА). Утворювану в результаті плазміду, що о тримала назву pVR44 (Фіг.11b), піддавали секвенуванню. Цю послідовність можна було транслювати в поліпептид, що виказував чудову гомологію з відомим D-LDW-кодуючим геном із виду L. helveticus і мав сайти Хbаl і BаmНІ на 5' і 3' кінцях D-LDH-гена. Плазміду pNC2 піддавали гідролізу ферментами Хbаl і BаmНІ. Фосфатні 5'-кінці лінеаризованої pNC2-плазміди дефосфорилювали за допомогою лужної фосфатази дрібних ракоподібних (Roche Diagnostics, USA) згідно з протоколом виробника. Конструкцію pVR44 також піддавали гідролізу ферментами Хbаl і BаmНІ, і утворюваний в результаті цього L helveticus DLDH-ген завдовжки 1027п.о. відділяли шляхом гель-електрофорезу (0,8% агарозний гель). Ці два фрагменти лігували, і утворену в результаті плазміду під назвою pVR47 (Фіг.4) піддавали секвенуванню. Плазміда pVR47 має PGKпромотор і GAL10-термінатор із виду S. cerevisiae, функціонально зв'язані (тобто транскрипційно активні в дріжджовій клітині) з D-LDH-геном із L. helveticus, як показано на Фіг.12 (SEQ ID NO 43). Приклад 1K. Конструювання плазміди pVR48, що містить D-LDH-ген із L. helveticus і суміжний з ним маркер стійкості до гігроміцину. Плазміду pPS1 піддавали гідролізу ферментом Sph\. Фрагмент завдовжки 2259п.о., що містив ген стійкості до гігроміцину, був експресований під контролем PDC1-промотора і GAL10-термінатора із клітин S. cerevisiae і відділений шляхом електрофорезу на 0,8% агарозному гелі. Плазміду pVR47 гідролізували ферментом Sphl, і 5'-фосфатні кінці лінеаризованої плазміди дефосфорилювали лужною фосфатазою дрібних ракоподібних (Roche Diagnostics, США) згідно з протоколом виробника. Ці два фрагменти зшивали, і утворена в результаті плазміду, яка одержала назву pVR48, піддавали 32 секвенуванню (Фіг.13). Ця плазміда містить D-LDHген із виду L. helveticus і суміжні один до одного кластери маркера стійкості до гігроміцину. Приклад 1L. Уведення ДНК, що кодує D-LDHген із клітин L. helveticus, шляхом випадкового інтегрування в геном K. marxianus. Фрагмент завдовжки 4540п.о., що містив кластер L. helveticus D-LDH: HPH-ген стійкості, відділяли від плазміди pVR48 шляхом гідролізу плазміду ферментами Sstl і Араl. Цей фрагмент використовували для трансформування pdd нульового мутанта Kluyveromyces marxianus (CD215; див. Приклади 1F, 1G) згідно з описаним нижче протоколом електропорації. Однією колонією K. marxianus інокулювали 50мл YPD-середовища, що містило 10г/л дріжджового екстракту, 20г/л пептону, 20г/л глюкози і 2% агару) у 250мл шейк-колбі бічного качання до оптичної густини OD600 0,1. Культуру вирощували протягом 16год. при температурі 30°С з частотою стр ушування 250об./хв. до остаточної OD600 10. Клітини із 10мл культури збирали шляхом центрифугування й один раз промивали буфером для електропорації (ЕВ: 10мМ Tris-CI, 270мМ сахарози, 1мМ МgСІ2, рН7,5). Далі клітини повторно суспендували у буфері для інкубування (IB: YPD +25мМ DTT, 20мМ HEPES, рН8,0) та інкубували при температурі 30°С з частотою струшування 250об./хв. протягом 30 хвилин. Після цього клітини збирали шляхом центрифугування і один раз промивали буфером для електропорації. Далі клітини повторно суспендували в 1мл буферу для електропорації, і 400мкл цих клітин переносили до 0,4см кювети для електропорації (BioRad; Hercules, CA). До кювети додавали 2мкг Sstl/Apal-фрагмента завдовжки 4540п.о. із pVR48-плазміди, і клітини піддавали електропорації з параметрами 1,8кВ, 1000Ом, 25мкФ. Після цього клітини переносили до 1мл YPD-середовища в 50мл пробірці Фалькона із загвинчуваною кришкою й інкубували при 30°С з частотою струшування 250об./хв. протягом 4 годин, після чого проводили селективне засівання на 200мкг/мл гігроміцину, що містив YPD-середовище. Трансформанти вирощували при 37°С протягом 3 днів. Трансформанти, що були стійкими до гігроміцину, повторно висівали штрихами на свіжі селективні чашки, що містили 200мкг/мл. PCR-аналіз Перевірку інтегрування даного фрагмента в геном CD21 клітин K. marxianus здійснювали за допомогою двох наборів PCR-праймерів. 1. Один набір праймерів був сконструйований у розрахунку на гомологію з D-LDH-геном із штаму L helveticus, а реверс-праймер - на гомологію з геном стійкості до гігроміцину. Праймери VR161 5'AGT TGG TGT ATT ТАА С АА GG-3'; SEQ ID No.25 і VR142 5'-GTG АС А ССС TGT GCA CGG CGG GAG ATG-3'; SEQ ID No.26 були сконструйовані для ампліфікації 1748п.о. продукту між D-LDH-геном із клітин L helveticus і геном стійкості до гігроміцину в штамах, що мали цей кластер і не повинні були ампліфікувати будь-який фрагмент у штамах, що не мали цього кластера. Термоциклування 33 80976 проводили на колоніях трансформанту, використовуючи ДНК-полімеразу Taq (Qiagen, США), в такій послідовності: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, 35 циклів по 30с при 94°С, 30с при 43°С, 3хв. при 72°С і остаточне інкубування протягом 7хв. при 72°С. 2. Другий набір праймерів був спроектований у розрахунку на гомологію з PGK-промоторною ділянкою, а реверс-праймер - на гомологію з DLDH-геном із L helveticus. Праймери VR173 5'-GCG ACG GCT C AC AGG ТТТ TG-3', SEQ ID No.27, і VR170 5'-СТТ GTC TTG ACG ТАА TAG ACG TGC AGC-3', SEQ ID No.28, були спроектовані для ампліфікування 0,75kb (750п.о.) продукту між PGKпромотором і D-LDH-геном із клітин L helveticus у штамах, які мали цей кластер, і відсутності ампліфікування будь-якого фрагмента у штамах, які не мали цього кластера. Термоциклування проводили з колоніями трансформанту, використовуючи ДНК-полімеразу Taq (Qiagen, США) в режимі з початковим інкубуванням реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, наступними за цим 35 циклами по 30с при 94°С, 30с при 55°С, 1хв. при 72°С і остаточним інкубуванням протягом 7хв. при 72°С. Дев'ятнадцять серед аналізованих трансформантів дали очікувані PCR-продукти. Ферментативний і газохроматографічний (GO аналізи D-молочної кислоти Оптична чистота Dмолочної кислоти, виробленої трансформантами, визначалася за допомогою набору для детектування D-молочної кислоти фірми Boehringer Mannheim (Roche Diagnostics, США). Проведений за протоколом виробника аналіз показав, що шість із дев'ятнадцяти трансформантів продукували 0% L-молочної кислоти. Газохроматографічний (GC) аналіз супернатанту від трансформантів показав, що дані штами виробляли більше 99% D-молочної кислоти. Методика GC-аналізу Розділяння і кількісну оцінку "D" і "L" енантіомерів молочної кислоти проводили методом хіральної газової хроматографії. Використовувана методика включала у себе каталізований основою гідроліз зразків у метанолі з наступним за цим підкислюванням сірчаною кислотою для каталізу естерифікації, та слідом за цим - екстрагування метиллактатних енантіомерів у ди хлорметан. Після цього органічний шар піддавали газохроматографічному (GC) аналізу, використовуючи полум'я-іонізаційний детектор (FID: flame ionization detector) (Hewlett Packard 6890, інжектор з розщепленням і без розщеплення, встановлений в режим розщеплення, автоінжекція і FID-детектор). Енантіомери метиллактату розділяли на хіральній капілярній колонці (капілярна колонка β-Dex 325, 30м ´ внутр. діаметр 0,25мм, товщина плівки 0,25мкм, Supelco., №24308). Дана методика дозволяла отримувати нормований відносний відсоток "D" і "L" молочної кислоти. 34 Зразки для GC-аналізу готували шля хом навішування певної кількості зразка (1,000г) у 20мл скляну пробірку, до якої додавали 4мл метанолу. Пробірку закривали кришкою і повільно додавали 150мкл концентрованої сірчаної кислоти. Після цього пробірку поміщали на 10 хвилин у мішалку з нагрівом Reati-therm при температурі 65°С. Далі до пробірки додавали іонізовану воду (5мл) і потім 10мл дихлорметану. Пробірку закривали кришкою і інтенсивно струшували. Далі за допомогою пластмасового шприца з фільтром і трубчатим наконечником видаляли частину донного органічного шару, а решту донного органічного шару переносили до 2мл GC-пляшечки для впорскування в GCхроматограф. Приклад 1М. Вироблення D-молочної кислоти в шейк-колбах з культуральними середовищами на YPD з глюкозою клітинами K. marxianus із захованим у них D-LDH-геном штаму L. helveticus, інтегрованим у геном у буферизованих умовах. Використовувалися шість трансформантів під назвами CD554, CD555, CD556, CD557, CD558 і CD559, що виробляли оптично чисту D-молочну кислоту. Ці штами культивувалися в 250мл шейкколбах бічного качання, що містили 50мл YPDсередовища, доповненого 100г/л глюкози, і засівалися із чашок з YPD-агаром. Культури вирощували протягом 16 годин при 30°С у режимі струшування з частотою 250об./хв. до оптичної густини OD600 0,1. Як тільки кількість глюкози в колбі ставала залишковою, а ріст клітин виходив на експоненціальну фазу, продукт культивації в кількості 4г/л еквіваленту сухої маси клітин, збирали шляхом центрифугування і повторно суспендували у 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 50мл YPD-середовища, доповненого приблизно 100г/л глюкози і 55г/л СаСО3. Культури витримували при 30°С і 70об./хв. Через різні інтервали часу відбирали зразки культури, і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, Dлактат, піруват і етанол методом HPLCхроматографії (описаний нижче). Методика HPLC-аналізу В HPLC-аналізі, що застосовувався в описаних нижче експериментах, використовувалася колонка Bio-Rad для швидкого кислотного аналізу, об'єднана з колонкою Rezex для швидкого аналізу фр уктів, кожна з яких містила стиролдивінілбензольну смолу у водневій формі. Кількісний аналіз органічних компонентів здійснювали за допомогою детектора індексу заломлення, об'єднаного з ультрафіолетовим детектором на 220нм, використовуючи як внутрішній еталон ізомасляну кислоту. Зразки готували шля хом навантаження відомої їх кількості і розбавлення їх при наявності внутрішнього еталону. Приготований таким чином розчин упорскували в HPLC-установку і проводили кількісний аналіз за відомими методиками. В описаних умовах культивування штами CD554, CD555, CD556, CD557, CD558, CD559 продукували більше 99% D-молочної кислоти з корисним виходом 92-98% на основі глюкози, 35 80976 причому титр D-молочної кислоти лежав у межах 82-90г/л, а об'ємна продуктивність перевищувала 2,2г/л/год. при температурі 30°С. Приклад 2А. Конструювання штамів з делеціями PDC1-кодуючої послідовності і D-LDHтеиом із клітин L. helveticus, інтегрованим у локус PDC1 методом заміщення в одну стадію. Була сконструйована плазміда рСА50 шляхом лігування 4700п.о. NgoMIV/Pstl фрагмента із плазміди pVR48 (Приклад 1K) в остов плазміди рВН5с (описаної в Прикладі 3В, Фіг.16с), зрізаної ферментами Mscl і SgrAl. Фрагмент pVR48 містив D-LDH-ген із L helveticus, стимульований PGKпромотором із S. cerevisiae, і наступну за ним послідовність GAL10 із S. cerevisiae завершення транскрипції. Цей полігенний експресуючий кластер є суміжним з геном стійкості до гігроміцину (hph), що стимулюється РDС1-промотором із S. cerevisiae з наступним за ним GAl10-термінатором (S. cerevisiae). Фрагмент pVR48 був лігований в остов рВН5с, що генерує плазміду рСА50, в котрій конструкція D-LDH:hph фланкована послідовностями безпосередньо зліва і справа локусу PDC1 із K. marxianus (Фіг.14). Плазміда рСА50 була піддана гідролізу ферментами Sbft and BseRI для створення фрагмента завдовжки 6272п.о. Частина 2,5мкг цього фрагмента була відділена й очищена шляхом гель-електрофорезу для використання в трансформуванні. K. marxianus (CD21) дикого типу був трансформований цим очищеним фрагментом згідно з протоколом електропорації, описаним у Прикладі 1М. Трансформовані клітини були висіяні на чашки для селекції з YPD-середовищем, що містили 150мкг/мл гігроміцину для добору клітин, які містили чи то випадкове інтегрування фрагмента рСА50 у геном, чи то гомологічне заміщення цим фрагментом PDC1 локусу дикого типу. Через 3 дні культивування при 30°С колонії були відділені і висіяні штрихами на свіже YPDсередовище з 150мкг/мл гігроміцину для підтвердження фенотипу. Колонії були піддані PCR-аналізу з метою ідентифікації тих з них, що містили гомологічне заміщення локусу PDCi дикого типу фрагментом рСА50. Клітини були повторно суспендовані в PCR-реакційному середовищі з метою приготування матричної ДНК. Для ампліфікації 3'кінця hph-гена був приготований 5'-праймер оСА85 5'-GGA CCG ATG GCT GTG TAG AA-3', SEQ ID No.29. Для ампліфікації послідовності справа від локусу PDC1 із K. marxianus був сконструйований 3'-праймер оСА80 5'-TCG СТТ АСС TCG GTA CAG АА-3'; SEQ ID No.30, якого не було в конструкції рСА50. В ампліфікаційному аналізі як зонд для цільової послідовності використовувалася Tagполімераза (Qiagen), a умови PCR-реакції були такими: стадія початкового плавлення при 95°С протягом 10хв., після цього 40 циклів ампліфікації по 30с при 95°С, 30с при 55°С і 3хв. при 72°С, слідом за чим 10хв. при 72°С. Трансформовані клітини, що мали подію гомологічного заміщення, генерували 2500п.о. PCR-продукту. Випадкові події інтеграції не генерували PCR-продукт з праймерами оСА85 і 36 оСА80. Штами від CD597 до CD601 були позитивними щодо цього 2500п.о. PCR-продукту. Приклад 2В. Вироблення D-молочної кислоти в комплексному СаСО3-буферизованому середовищі в мікроаеробних шейк-колбах з культурами K. marxianus, що містили одну копію DLDH, інтегровану в локус PDC1 методом заміщення в одну стадію. Було проведено порівняння pdc1A::Lh-D-LDH штаму CD587 (із Прикладу 3Е), утвореного в результаті події двостадійного заміщення, з pdc1A::Lh-D-LDH штамами CD597, CD599 і CD600, створеними шляхом події заміщення в одну стадію (із Прикладу 2А) для визначення того, чи продукують ці штами подібні між собою титри молочної кислоти незалежно від методу їх створення. Була створена біомаса в шейк-колбах бічного качання шляхом вирощування протягом ночі при 37°С і частоті струшування 225об./хв. у середовищі YPD+100г/л глюкози і +50г/л СаСО3. Із цих шейк-колб з вирощеною протягом ночі біомасою 2г/л сухої маси клітин було інокульовано в колби для виробляння продукту. Застосовувалися такі умови продукування: середовище YPD +100г/л глюкози і +50г/л СаСО3 у режимі струшування з частотою 70об./хв. у шейкколбах бічного качання при 35°С. Зразки відбирали з різними інтервалами часу: біомасу і СаСО3 видаляли шляхом фільтрації, а фільтрати піддавали аналізу на глюкозу, лактат, ЕtOН і піруват за допомогою HPLC-хроматографії (Приклад 1М). Через 54 години штами CD587, CD589 і CD590 спожили 85-88г/л глюкози, виробивши 81г/л лактату і 2,5г/л пірувату. Ці титри лактату представляли лактатний вихід 92-95% на глюкозі і об'ємну продуктивність більше 1,5г/л за годину в мікроаеробних умовах. Дані результати свідчать про те, що D-LDH-трансформанти здатні продукувати D-молочну кислоту. Ферментативний аналіз молочної кислоти, виробленої цими штамами, показав, що така молочна кислота більш ніж на 99% є енантіомерно чистою D-молочною кислотою. Наведені результати показують, що D-LDHтрансформанти (CD597, CD599 і CD600), створені методом генного заміщення в одну стадію, здатні виробляти D-молочну кислоту подібно штаму CD587 з двостадійним заміщенням. Приклад 3А. Конструювання плазміди pVR29, що має ген стійкості до G418, функціонально зв'язаний з PGK-промотором і GAL 10термінатором із S. cerevisiae (pVR29). Маркер стійкості до G418 (pVR22; Приклад 1С) був клонований у pNC2 (Приклад 1А), і ця конструкція була позначена як pVR29 (Фіг.15). Для експресії гена стійкості до G418 використовувалися PGK-промотор S. cerevisiae і в/\МО-термінатор S. cerevisiae Ген стійкості до G418 був PCR-ампліфікований при використанні Pfu-полімерази (Stratagene, Madison, WI) з праймерами 5'-GOT СТА GAT GAG CC A TAT TCA ACG GGA ААС (5'G-фрагмент; SEQ. ID NO.9) і 5'ATG GAT CCT TAG ААА ААС TCA TCG AGC АТС 37 80976 (3'G-фрагмент; SEQ. ID NO.10) і як матриці плазміди pVR22 (Приклад 1С). В альтернативному варіанті як матрицю можна використовувати також плазміду рРІС9K (Invitrogen, Carlsbad, CA). Термоциклування проводили в такому режимі: початкове інкубування реакційної суміші протягом 5хв. при 95°С, після цього 35 циклів по 30с при 95°С, 30с при 49°С і 2хв. при 72°С і остаточне інкубування протягом 10хв. при 72°С. PCR-продукт піддавали гідролізу ферментами BamНІ і Хbаl, і 821п.о. фрагмент був виділений і лігований у 4303п.о. BamHI-ХbаІ-фрагмент плазміди pNC2. Утворювана в результаті плазміда pVR29 (Фіг.15) містила PGK-промотор і GAL10-термінатор, функціонально зв'язані (тобто транскрипційно активні в дріжджовій клітині) з геном стійкості до G418. Приклад 3В. Плазміда для цільового інтегрування ДНК у PDC1-локус штаму K. marxianus Послідовність ДНК, що фланкує PDC1-ген клітин K. marxianus була клонована у плазміду pVR29 (Приклад 3А, Фіг.15) з утворенням рекомбінантної нуклеїнової кислоти для спрямованого інтегрування ДНК у локусі PDC1. Отримана в результаті конструкція була позначена як рВН5а (Фіг.16А). Конструкція рВН5а містить сайт рестрикції Sbfl, який дозволяє клонованим генам бути оперативно зв'язаними з PDC1промотором. Фрагмент ДНК завдовжки 1254п.о. безпосередньо зліва від PDC1 був ампліфікований шляхом PCR-реакції з праймерами 5'-САА GAA GOT АСС ССТ СТС ТАА ACT TGA АСА-3'(5'-бік 5'; SEQ ID No.31) і 5'-GTA ATT CCT GC A GOT GCA ATT ATT TGG TTT GG-3'(5'-бік 3'; SEQ ID No.32) і плазмідою pSO21 (Фіг.7В, Приклад 1F) у ролі матриці. Термоциклування проводили в такому режимі: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, далі 35 циклів по 30с при 94°С, 30с при 55°С і 1,5хв. при 72°С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 7хв. при 72°С. PCR-продукт завдовжки 1254п.о. був шляхом електрофорезу відділений на 0,8 агарозному гелі та ізольований. PCR-продукт і плазміда pVR29 (Фіг.15а) були піддані гідролізу ферментами Kрnl і Sbfl. Пдролізований PCR-продукт був лігований у 5067п.о. плазміду pVR29 з одержанням плазміди рВН5а завдовжки 6315п.о. (Фіг.11 А). Отримувана в результаті плазміда містила ген стійкості до G418, функціонально зв'язаний з PDC1промотором і GAL10-термінатором із клітин S. cerevisiae, і 1240п.о. фрагмент ДНК, гомологічний до ДНК безпосередньо зліва від РDС1-гена. Фрагмент ДНК завдовжки 535п.о. безпосередньо справа від PDC1 був PCRампліфікований з праймерами 5'-ССА AGC ССТ GCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3'(3'-бік 5'; SEQ ID No.33) і 5'-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAA CAA-3' (3'-бік 3': SEQ ID No.34), використовуючи як матрицю плазміду pSO21 (Фіг.7А). Термоциклування проводили в такому порядку: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, після цього 35 циклів ампліфікації по 30с при 94°С, 30с при 55°С і 45 с 38 при 72°С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 4хв. при 72°С. PCR-продукт був відділений методом електрофорезу на 0,8% агарозному гелі, і був відділений 535п.о. продукт. PCR-продукт був підданий гідролізу ферментами Sbfl і МІul. Фрагмент завдовжки 529п.о. був лігований з фрагментом Sbfl-МІul плазміди рВН5а з утворенням плазміди pBH5b. Плазміда pBH5b містила 1200п.о. ДНК безпосередньо зліва і 500п.о. ДНК безпосередньо справа від PDC1 з унікальним сайтом Sbfl, розташованим між фланкуючими послідовностями PDC1, включаючи також маркер стійкості до G418, що піддається селекції, функціонально зв'язаний з PDC1промотором і GAL10-термінатором із клітин S. cerevisiae. Ця плазміда схематично показана на Фіг.16b. Частина локусу PDC1 (K. marxianus) була також клонована у продажну плазміду pUC19 (Invitrogen) для створення рВН5с таким чином. Плазміду pSO21 піддавали гідролізу ферментами Nhe І і Nde І, і 3339п.о. фрагмент ДНК, що містив 486п.о. ДНК безпосередньо зліва від PDC1, повну послідовність PDC1 і 1157п.о. ДНК безпосередньо справа від PDC1, був виділений методом електрофорезу на 0,8% агарозному гелі. Плазміда pUC19 піддавалася гідролізу ферментами Хbаl і Ndel, і 2452п.о. фрагмент ДНК був виділений методом електрофорезу на 0,8% агарозному гелі. Гідролізована плазміда pUC19 і локус PDC1 були зшиті разом, утворюючи 5791п.о. плазміду рВН5с, яка схематично зображена на Фіг.16с. Приклад 3С. Плазміда для спрямованого інтегрування D-LDH-гена із L. helveticus у локус PDC1 із штаму K. marxianus. D-LDH-ген із плазміди pVR48 (Приклад 1К) був клонований у сайт Sbfl плазміди pBH5b для створення рекомбінантної нуклеїнової кислоти, здатної інтегрувати D-LDH у локус PDC1 штаму K. marxianus і експресувати D-LDH під контролем ендогенних PDC1-промотора і термінатора. D-LDH-ген був PCR-ампліфікований при використанні праймерів 5'-ТТТ ТТА ССТ GCA GGC TAG ATT TAT GAG AAA GG-3' (Lh-D-LDH 5'; SEQ ID No. 35) і 5'-TCT ACC CCT GCA GGA AAA CTT GTT CTT GTT CA-3' (Lh-D-LDH 3'; SEQ ID No.36) і плазміди pVR47 (Приклад 1J) у ролі матриці. Термоциклування проводили в такому порядку: 30 циклів по 30с при 94°С, 30с при 55°С, 1,5хв. при 72°С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 4хв. при 72°С у безперебійній PCRустановці (Epicentre, Madison, Wl). PCR-продукт відділяли методом електрофорезу на 0,8% агарозному гелі, отримуючи продукт завдовжки 1028п.о. PCR-продукт піддавали гідролізу ферментом Sbfl і зшивали з 6844п.о. Sbflгідролізованою рВН5b-плазмідою з утворенням 7872п.о. плазміди рВН6. Плазміда рВН6 містила D-LDH-ген, функціонально зв'язаний з PDC1промотором і термінатором, а також з маркером стійкості до G418, функціонально зв'язаним з PDC1-промотором і GAL10-термінатором S. cerevisiae. Плазміда рВН6 схематично зображена на Фіг.17. 39 80976 Приклад 3D. Інтегрування плазміди рВН6 у локус PDC1, створення штаму CD588 штаму K. marxianus Плазміда рВН6 для інтегрування, що містила D-LDH, була трансформована в K. marxianus (CD21) дикого типу. Плазміда була повністю інтегрована в локус PDC1 шляхом початкової одиночної гомологічної рекомбінації між фланкуючою PDC1 ДНК безпосередньо зліва від D-LDH-гена плазміди рВН6 і ДНК безпосередньо справа від PDC1-гена на хромосомі. Утворюваний у результаті штам містив копію PDC1 дикого типу, а також одну копію рВН6, інтегровану в локус PDC1. Штам CD21 використовувався для інокуляції 50мл YPD середовища, доповненого 100г/л глюкози в 250мл шейк-колбі бічного качання до оптичної густини OD600 0,1. Культур у вирощували протягом 16год. при 30°С і частоті струшування 250об./хв. до остаточної OD600 12. Клітини із 10мл культури збирали шляхом центрифугування і один раз промивали буфером для електропорації (ЕВ: 10мМ Tris-CI, 270мМ цукрози, 1мМ МgСІ 2, рН7,5). Клітини повторно суспендували у буфері для інкубування (YPD +25мМ DTT, 20мМ HEPES, рН8,0) та інкубували при температурі 30°С з частотою струшування 250об./хв. протягом 30хв. Клітини збирали шляхом центрифугування й один раз промивали буфером для електропорації. Далі клітини знов суспендували в 1мл буферу для електропорації, і 40мкл цієї суспензії переносили до 0,4см кювети для електропорації. До цієї ж кювети додавали 12мкг незрізаної рВН6-плазміди в загальному об'ємі 50мкл, і клітини піддавали електропорації з параметрами 1,8кВ, 1000Ом, 25мкФ. Далі клітини переносили до 1мл YPDсередовища в 50мл пробірці Фальконе із загвинчуваною кришкою та інкубували при температурі 30°С з частотою струшування 250об./хв. протягом 4 годин, і після цього селективно висівали на YPD-середовище, що містило 300мкг/мл G418. Трансформанти вирощували при 37°С протягом 2 днів. Трансформанти, що росли, були висіяні штрихами на свіжі чашки для селекції. Перевірка на правильність проведення інтегрування плазміди рВН6 у локус PDC1 шляхом одиничної гомологічної рекомбінації між фланкуючою PDC1 DNA безпосередньо зліва від D-LDH-гена плазміди рВН6 і ДНК безпосередньо справа від PDC1-гена на хромосомі K. marxianus проводили при використанні праймерів 5'-AAG САС САА GGC СТТ САА CAG-3' (PDC1 хромосома 5'; SEQ ID No.37) і 5'-СТТ GTC TTG ACG ТАА TAG ACG TGC AGC-3' (D-LDH 3'; SEQ ID No.38), спроектованих на ампліфікацію 2700п.о. продукту між хромосомною ДНК зліва від РОС7-гена і зовні гомології, інкорпорованої у рВН6, і О-LDH-геном. Термоциклування проводили шляхом інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, далі 35 циклів по 30с при 94°С, 30с при 55°С і 3хв. при 72°С,за чим йшло остаточне інкубування протягом 7хв. при 72°С. Сім із десяти проаналізованих трансформантів дали очікуваний 2700п.о. PCR-продукт. Два продукти PCR-аналізу з 40 праймерами, розрахованими на ампліфікацію PDC1-локусу, 5'-CGC ААА GAA AAG СТС САС АСС-3' (PDC1 5'; SEQ ID No. 39) і 5'-ССС ATA CGC ТТА ТАА ТСС ССС-3' (PDC1 3'; SEQ ID No. 40), мали смугу завдовжки 1700п.о., що відповідала PDC1, і смугу завдовжки 1000п.о., що відповідала D-LDH. Термоциклування проводили шляхом інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, далі 35 циклів ампліфікації по 30с при 94°С, 30с при 55°С і 2хв. при 72°С і остаточне інкубування протягом 5хв. при 72°С. Для подальшої перевірки події інтеграції однієї копії був застосований аналіз методом Саузернблотінгу із зондом, розрахованим на детектування гена стійкості до G418. Один із семи проаналізованих трансформантів показав правильний характер покресленості, що узгоджувався з інтегруванням однієї копії рВН6. Штам з однією копією рВН6, розташованою в локусі PDC1, згідно з результатами PCR-аналізу й аналізу методом Саузерн-блотінгу був позначений як CD588. Подані результаті показують, що спрямоване інтегрування трансформованої ДНК рВН6 у локус PDC1 штаму CD21 із K. marxianus дикого типу відбулося шляхом однієї гомологічної рекомбінації між промоторними послідовностями PDC1. Ці результати також підтверджують те, що плазміда рВН6 є наявною в єдиній копії в штамі CD588. Приклад 3Е. Втрата остову плазміди рВН6 і PDC1-гена зі штаму CD588, створення штамів CDS87, CD589 і CD590 Штам CD588 був розведений на неселективному середовищі для декількох циклів вирощування з метою проведення другої гомологічної рекомбінації між PDC1термінаторними послідовностями інтегрованої рВН6 і нативним РDС1-термінатором. Результатом другої події гомологічної рекомбінації в термінаторних послідовностях став штам, в якому PDC1-ген був заміщений на D-LDH-ген. Цей штам не містив маркерного гена стійкості до G418 через втрату гена разом із геном PDC1, що відбувається внаслідок другої події рекомбінації. Утворюваний у результаті цього штам, у якому PDC1 заміщений на D-LDH, демонстрував G418чутливий фенотип поряд з відсутністю анаеробного росту. Штам CD588 висіювали на чашки з YPDагаром і вирощували протягом ночі при температурі 37°С. Мазок колоній був перенесений до свіжих чашок з YPD-агаром. Цю процедуру повторяли чотири рази. Після п'ятого циклу неселективного вирощування на чашках з YPDагаром шість 250мл шейк-колб бічного качання, що містили по 50мл середовища YPD, доповненого 100г/л глюкози і 42г/л СаСО3, були інокульовані клітинами CD588 із п'яти циклів неселективного висівання до оптичної густини OD600 0,1. Вирощування в шейк-колбах тривало 16 год. при 30°С з частотою струшування 250об./хв. Після цього культури розбавили і використовували для засівання поодиноких колоній на чашках з YPD-агаром. Крім того, по одному мазку колоній із чашок п'яти циклів неселективного вирощування 41 80976 було суспендовано в 1мл PBS (забуференого фосфа том сольового розчину), після чого суспензії розбавили і використовували для засівання поодиноких колоній на чашках з YPD-агаром. Поодинокі колонії, отримувані внаслідок проведення цих циклів засівання, висівали на YPD-aгap і поміщали в анаеробну камеру. Через 2 дні інкубування при температурі 37°С анаеробну камеру відкривали, і помічали колонії, що росли в анаеробних умовах. Після цього чашки інкубували ще 1 день при 37°С. Далі колонії, що росли в аеробних умовах, але не росли в анаеробних умовах, переносили до трьох однакових чашок для скринінгу. Чашками для даних умов скринінгу були: чашки з YPD (аеробні), чашки з YPD (анаеробні) і чашки з YPD, до яких було добавлено 300мкг/мл G418. Були ідентифіковані 3 трансформанти бажаного фенотипу, що мали чутливість до G418 і не росли в анаеробних умовах. Ці трансформанти були позначені як CD587, CD589 і CD590. Підтвердження заміщення PDC1 на D-LDH було одержане за допомогою праймерів 5'-CGC ААА GAA AAG СТС САС АСС-3' (PDC1 5'; SEQ ID No.39) і 5'-ССС ATA CGC ТТА ТАА ТСС ССС-3' (PDC1 3'; SEQ ID No.40), розроблених для ампліфікації локусу PDC1, використовуючи в ролі матриць хромосомні ДНК зі штамів CD587, CD589 і CD590. Термоциклування проводили в такому режимі: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 94°С, після цього 35 циклів по ЗО с при 94°С, ЗО с при 55°С, 2хв. при 72°С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 5хв. при 72°С. Хромосомні ДНК від усіх трьох штамів давали один 1100п.о. PCR-продукт, що відповідав D-LDH. Аналіз методом Саузерн-блотінгу із зондом, спроектованим для гібридизації з геном G418, показав відсутність гена G418. Крім того, Саузерн-блотінг із зондом для ділянки, що кодує PDC1, не показав ніяких смуг. Зонди, спроектовані для гібридизації з ділянками безпосередньо зліва і справа від PDC1, давали смуги, розміри яких узгоджувалися із заміщенням PDC1 на D-LDH. Ці результати свідчать про те, що PDCV-ген разом з остовом плазміди рВН6 , що містив маркер стійкості до G418, функціонально зв'язаний з PDC t-промотором і GAL10-термінатором із S. cerevisiae, були втрачені із хромосоми клітини CD588 внаслідок другої події гомологічної рекомбінації, що відбувалася між двома PDC1термінаторами, наявними в локусі PDC1 клітини CD588. Зазначена друга подія рекомбінації приводила до утворення штаму, в якому саме PDC1-ген був заміщений на D-LDH-ген з боковими Sbfl -сайтами. Приклад 3F. Продукування D-молочної кислоти в комплексному СаСО3-буферизованому середовищі в поміщених в мікроаеробні шейкколби культурах K. marxianus з однією копією DLDH, інтегрованої в локус PDC1 Штам CD588 з Pdc+ Lh-D-LDH і штами CD587, CD589 і CD590 з Pdc- Lh-D-LDH культивували протягом 16год. при 30°С і частоті струшування 250об./хв в 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 50мл YPD, доповненого 100г/л глюкози 42 і 50г/л СаСО3, з наступною інокуляцією до оптичної густини OD600 0,1 із чашок з YPD-агаром. Після засвідчення того, що в колбах залишилися тільки невеликі кількості глюкози і що клітини вийшли на експоненціальну фазу росту, було зібрано 4г/л еквіваленту сухої маси клітин шляхом центрифугування і повторно суспендувано в 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 50мл YPD, доповненого 100г/л глюкози і 50г/л СаСО3. Культури витримувалися при 30°С з частотою струшування 70об./хв. Через різні інтервали часу із культур відбирали зразки, і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, лактат, піруват і етанол за допомогою HPLC-аналізу (описаного у Прикладі 1М). Через 23год. Pdc+ Lh-D-LDH штам CD588 спожив 127г/л глюкози і виробив 33г/л лактату, 37г/л етанолу і 0,2г/л пірувату. Pdc- Lh-D-LDH штами CD587, CD589 і CD590 спожили 40-43г/л глюкози і виробили 36-39г/л лактату і 1,0-1,3г/л пірувату. Через 54год. штами CD587, CD589 і CD590 спожили 85-88г/л глюкози і виробили 81г/л лактату і 2,5г/л пірувату. Ці титри лактату відповідали 9295% виходу лактату на глюкозі і об'ємній продуктивності більше 1,5г/л/год. протягом виробничої фази в мікроаеробних умовах. Через 54год. внаслідок високих рівнів D-лактату, виробленого в культурах, утворився нерозчинний кальцій-лактатний осад, що перешкоджав подальшому аналізу. Ферментативний і газохроматографічний аналізи згідно з Прикладом 1L показали, що більше 99% виробленого лактату становив D-лактат. В культурах CD587, CD589 і CD590, що узгоджувалися із заміщенням PDC1 на LDH, наявності етанолу не виявлялося. Наведені результати показують, що D-LDHтрансформанти здатні виробляти D-молочну кислоту. Вироблення молочної кислоти функціональним PDC1 давало приблизно однакові кількості молочної кислоти й етанолу, демонструючи те, що D-LDH здатний конкурува ти з природним PDC1 за піруват. Заміщення PDC1 на D-LDH із штаму. L helveticus удвічі збільшує ти тр молочної кислоти, приводячи в результаті до підвищення титрів і виходів продукту з наближенням їх до теоретичного максимуму. Крім того, ці штами не виробляють етанол, що свідчить про заміщення в них PDC1 на D-LDH. Ферментативний аналіз молочної кислоти, виробленої цими штамами, показує, що ця молочна кислота є більш ніж на 99% енантіомерно чистою D-молочною кислотою. Приклад 3G. Вироблення D-молочної кислоти при високих температурах у комплексному СаСО3буферизованому середовищі в мікроаеробних шейк-колбах з культурами із штамів K. marxianus Штам CD21 K. marxianus дикого типу, PDC+ Lh-D-LDH штам CD588 і Pdc- Lh-D-LDH штами CD558 і CD587 інокулювали в чашки з YPD-агаром (OD600 0,1) і вирощували протягом 16год. при 33°С у 250мл шейк-колбах бічного качання з частотою 250об./хв., що містили 50мл YPD, доповненого 100г/л глюкози і 50г/л СаСО3. Після визначення 43 80976 того, що в колбах залишилися невеликі кількості глюкози і що клітини вийшли на експоненціальну фазу росту, збирали шляхом центрифугування 4г/л еквіваленту сухої маси клітин і повторно суспендували в 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 50мл YPD, доповненого 100г/л глюкози і 50г/л СаСО3. Культури вирощували в різних температурних умовах 37°С, 42°С і 50°С при частоті струшування 70об./хв. З певними інтервалами часу із культур відбирали зразки і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, лактат, піруват, ацетат, гліцерин і етанол шляхом HPLC-хроматографії (згідно з Прикладом 1М). Через 23 год. PDC+ Lh-D-LDH штам CD588, процес ферментації якого відбувався при температурі 37°С, спожив 115,5г/л глюкози і виробив 16,2г/л лактату, 37,6г/л етанолу, 7,6г/л гліцерину, 2,6г/л ацетату і 0,2г/л пірувату. Через 47 год. ферментації при 37°С PDC- Lh-D-LDH штами CD558 і CD587 спожили 99-105г/л глюкози і виробили 90-99г/л лактату, 2,7-3,5г/л пірувату і 1,21,4г/л ацетату. У протилежність цьому, штам CD21 дикого типу спожив 115,5г/л глюкози і виробив принциповий для нього продукт - етанол (43,5г/л) і малу кількість лактату (1,7г/л). Через 23 год. PDC+ Lh-D-LDH штам CD588, процес ферментації якого відбувався при температурі 42°С, спожив 115,5г/л глюкози і виробив 12,8г/л лактату, 34,7г/л етанолу, 6,9г/л гліцерину, 3,0г/л ацетату і 0,3г/л пірувату. Через 47год. ферментації при 42°С PDC- Lh-D-LDH штами CD558 і CD587 спожили 80г/л глюкози і виробили 75г/л лактату, 2,5г/л етанолу і 1,2-1,4г/л ацетату. У протилежність цьому, штам CD21 дикого типу спожив 115,5г/л глюкози і виробив принциповий для нього продукт - етанол (39,7г/л) і малу кількість лактату (1,0г/л). Через 47год. PDC+ Lh-D-LDH штам CD588, процес ферментації якого відбувався при температурі 50°С, спожив 49,6г/л глюкози і виробив 6,8г/л лактату, 9,5г/л етанолу, 4,5г/л гліцерину і 1,8г/л ацетату. Через 47 год. ферментації при 50°С PDC- Lh-D-LDH штами CD558 і CD587 спожили 15г/л глюкози і виробили 100г/л лактату, 1,2-1,4г/л пірувату і 1,6-1,7г/л ацетату. У протилежність цьому, штам CD21 дикого типу спожив 70,5г/л глюкози і виробив принциповий для нього продукт - етанол (13,6г/л) і малу кількість лактату (0,5г/л). Наведені результати показують, що трансформанти D-Ldh+ здатні виробляти Dмолочну кислоту при температурах до 50°С. За даними ферментативного аналізу молочна кислота, вироблена цими штамами, є більш ніж на 99% енантіомерно чистою D-молочною кислотою. Хоча загальне споживання глюкози і вихід лактатного продукту зі зростанням температури в цих штамах зменшується, вихід лактату із глюкози у PDC- Lh-D-LDH штамів CD558 і CD587 залишається в межах 88-100%. Приклад 3Н. Вироблення D-молочної кислоти в небуферизованому комплексному середовищі в мікроаеробних шейк-колбах з культурами K. 44 marxianus з однією копією L. helveticus D-LDH, інтегрованою в хромосому, штами. Штам CD21 K. marxianus дикого типу, PDC+ Lh-D-LDH штам CD588 і Pdc- Lh-D-LDH штами CD558 і CD587 інокулювали в чашки з YPD-агаром (OD600 0,1) і вирощували протягом 16 год. при 30°С у 250мл шейк-колбах бічного качання з частотою 250об./хв., що містили 50мл YPD, доповненого додатковими 100г/л глюкози. Після визначення того, що в колбах залишилися невеликі кількості глюкози і що клітини вийшли на експоненціальну фазу росту, збирали шляхом центрифугування 4г/л еквіваленту сухої маси клітин і повторно суспендували в 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 50мл YPD, доповненого двома порціями 40г/л глюкози. Культури витримували при 37°С і частоті струшування 70об./хв. З певними інтервалами часу із культур відбирали зразки і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, лактат, піруват, ацетат, гліцерин і етанол шляхом HPLC-хроматографії. Через 23год. PDC+ Lh-D-LDH штам CD588 спожив 58,9г/л глюкози і виробив 0,9г/л лактату, 0,2г/л пірувату, 2,6г/л гліцерину, 0,6г/л ацетату. Величина рН остаточної культури складала 4,6. Головним продуктом цього ферментаційного процесу був етанол у кількості 24-24,7г/л. Через 23 год. PDC- Lh-O-LDH штами CD558 і CD587 спожили 4,1г/л глюкози і виробили 2,5г/л лактату, 1,0г/л пірвату, 0,8г/л гліцерину і 0,4г/л ацетату. Величина рН остаточної культури штамів CD558 і CD587 лежала в межах 3,31-3,65. Головним продуктом цих процесів ферментації був лактат, кількість якого лежала в межах 1,2-33г/л. Штам CD21 дикого типу спожив 58,9г/л глюкози протягом 23 годин і виробив, головним чином, етанол (12,820,4г/л) і малу кількість лактату (1,2-1,3г/л), а його остаточна величина рН становила 4,65. Наведені результати показують, що трансформанти D-Ldh+ виробляють D-молочну кислоту при величинах рН 3,31 і вище. Ферментативний аналіз молочної кислоти, виробленої цими штамами, показав, що вона більш ніж на 99% є енантіомерно чистою Dмолочною кислотою. Приклад ЗІ. Вироблення D-молочної кислоти із D-ксилози в штамах Три генетично модифіковані штами K. marxianus були піддані випробуванням на вироблення D-молочної кислоти із D-ксилози у порівнянні зі штамом CD21 (дикого типу) і серед них штам CD558 (з випадковим чином інтегрованим D-LDH-геном із виду L. helveticus з нульовим умістом PDC1), штам CD587 (PDCI::LhD-LDH) і штам CD588 (що містив D-LDH-ген із виду L helveticus). Наведені нижче результати показують, що ці генетично модифіковані штами здатні виробляти D-молочну кислоту із безглюкозного субстрату. Клітини штамів CD21, CD558, CD587 і CD588 вирощувалися в чашках з YPD+20г/л D-ксилозного агару і використовувалися для інокуляції 100мл культурального середовища, що містило 20г/л дріжджового екстракту, 100г/л пептону, 17г/л 45 80976 СаСО3 і 50г/л D-ксилози в шейк-колбах бічного качання. Інокульовані шейк-колби інкубували при 35°С з частотою струшування 250об./хв. Протягом цього процесу із колб відбирали зразки і виміряли їхню оптичну густину OD600нм з метою моніторингу росту к ультури і споживання цукру. Приблизно через 36 годин клітини збирали шляхом центрифугування і визначали суху масу клітин (CDW: cell dry weight) кожної культури. У здвоєних шейк-колбах бічного качання, що містили 20г/л дріжджового екстракту, 10г/л пептону і 50г/л Dксилози, додавали 3,0г/л CDW клітин кожного штаму. Колби інкубували при 35°С з частотою струшування 70об./хв. Через різні інтервали часу протягом інкубування із колб відбирали зразки для HPLC-аналізу і кількісного аналізу складу середовища на глюкозу, D-лактат, ксилітол і етанол. Головним органічним компонентом, що вироблявся штамами CD558 і CD587, була Dмолочна кислота, титр якої в середньому досягав 13,7г/кг. Це відповідало виходу D-молочної кислоти із D-глюкози, приблизно, 33%. Головним органічним компонентом продукту, що вироблявся штамом CD21, був ксилітот, кількість якого в середньому досягала 25,0г/кг. Це відповідало приблизно 50% виходу ксилітолу із D-глюкози. Головним органічним компонентом продукту, що вироблявся штамом CD588, був ксилітот, кількість якого в середньому досягала 19,6г/кг. Це відповідало приблизно 44% середньому ви ходу ксилітолу із D-ксилози. HPLC-аналіз не виявив наявності гліцерину, цитрату, пірувату, сукцинату та ацетату в продукта х будь-якого з інших штамів. Приклад 4. Плазміди для експресії D-LDH-гена із виду В. megaterium і для цільового інтегрування трансформованої ДНК в локус PDC1 Плазміди, що містили D-LDH-ген із В. Megaterium для цільового інтегрування в локус PDC1-гена із С Sonorensis були приготовані таким чином. Плазміду рМІ257 (Candida) лінеаризували ферментом Ncol, і 5'-звиси були частково наповнені ДНК-полімеразою І, фрагментом Кленова і сумішшю dATP, dCTP, і dTTP, за винятком dGTP, із реакційного розчину. Після цього шляхом обробки нуклеазою квасолі золотистої це однониткове розширення видалили. Далі ДНК гідролізували ферментом BamHl, і з 0,8% агарозного гелю після електрофоретичного розділяння виділили фрагмент завдовжки 9200п.о. Із геномної ДНК штаму В. megaterium була утворена плазміда pVR47 (Приклад 1J), що містила D-LDH-ген із В. Megaterium. Ця плазміда показана на Фіг.12. Із плазміди pVR47 ферментом ХЬа\ був ексцизований 1023п.о. фрагмент, що містив LDH-ген із В. Megaterium, і гідролізований з наступним наповненням 5'-звисів ДНКполімеразою, фрагментом Кленова і всіма чотирма dNTP, і гідролізований ферментом BаmНІ. 9200п.о. Ncol (дефосфорильований)ВаmНІ-фрагмент із рМІ257 і 976п.о. ХЬаІ(дефосфорильований)-БатНІ-фрагмент із pVR47 були зшиті, внаслідок чого була утворена плазміда, позначена рМІХХХ, як показано на 46 Фіг.18. Плазміда рМІЮО містить послідовно С sonorensis PDC1-промотор, С. sonorensis PGK1промотор, функціонально зв'язаний з S. cerevisiae MEL5-геном, C. sonorensis PGK1-промотор, функціонально зв'язаний з В. megaterium D-LDHгеном, і С. sonorensis PDC1-термінатор. Плазміду рММОО гідролізували ферментом Nofl для ексцизії 7300п.о. фрагмента, що містив кластери експресії MEL5 і LDH, фланковані 5'- і 3'-ділянками PDC1. Цей 7500п.о. фрагмент використовували для трансформування С. Sonorensis (Candida), і трансформанти були піддані скринінгу на чашках з YPD, доповненого Χ-α-gal в концентрації 40мкг/мл. Трансформанти вирощували на чашках з YPDагаром, доповненим X-a-gal (40мкг/мл). Цілком зрозуміло, що викладене вище ілюструє деякі конкретні варіанти здійснення даного винаходу і жодним чином не виключає будь-яких модифікацій або альтернатив, еквівалентних їм і охоплюваним ідеєю та об'ємом даного винаходу, окресленими наведеною нижче Формулою винаходу. Всі цитовані тут першоджерела включені в даний опис в усій їхній повноті шляхом посилання. 47 80976 48 49 80976 50 51 80976 52 53 80976 54 55 80976 56 57 80976 58 59 80976 60