Гідратовані n-фулерен-амінокислоти, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція на їх основі

Реферат: Винахід стосується фармацевтичної промисловості й медицини, а саме нових гідратованих амінокислотних похідних фулерену С60 загальної формули С60(Н)3{NH(СН2)nСООН}3·хН2O, де С60 - фулерен, n=5, 6, 7, х=8-10, а також способу їх одержання й створення фармацевтичних композицій на їх основі. Гідратовані N-фулерен-амінокислоти утворюються при взаємодії фулерену з 15-разовим мольним надлишком безводних калієвих солей амінокислот у середовищі органічного ароматичного розчинника при повільному додаванні до отриманої суспензії міжфазного каталізатора при перемішуванні й нагріванні до температури не вище 60 °C до повного знебарвлення розчину й формування твердого осаду, який потім виділяють, після чого здійснюють обробку 0,8 М водних розчинів калієвих солей фулерен-амінокислот 0,1Н розчином органічних або мінеральних кислот з наступним центрифугуванням, промиванням і висушуванням осаду. Фармацевтична композиція, яка проявляє активність проти вірусу UA 110033 C2 (12) UA 110033 C2 герпесу, вірусів грипу різної природи, ВІЛ, а також протипухлинну й протипсоріатичну активність, і яка містить як активну речовину гідратовані N-фулерен-амінокислоти в ефективній кількості. UA 110033 C2 Галузь техніки Винахід відноситься до фармацевтичної промисловості й медицини і стосується нових гідратованих амінокислотних похідних фулерену С60 формули (I), а також способу їх одержання й створення фармацевтичних композицій на їхній основі. H O H HOOC (CH2)n H OH H HN H NH (CH2)n COOH (I) H NH HO H (CH2)n HOOC 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Попередній рівень техніки Можливість використання фулеренів, як біологічно активних сполук викликав інтенсивний розвиток хімії функціональних похідних фулерену, особливо після того, як було показано, що ряд водорозчинних похідних фулерену проявляють високу антивірусну активність (Partha R, Conyers JL, “Biomedical applications of functionalized fullerene-based nanomaterials” Int.J.Nanomedicine, 2009, 4, 261-75 Pat US 6204391, 2005, “Water soluble fullerenes with antiviral activity”, R.Bakry et al., “Medicinal application of fullerenes” International Journal of Nanomedecine, 2007 (4) 639-649, Z.Zhu, D.I.Schuster, M.Tuckermann, “Molecular Dynamics Study of the Connection between Flap Closing and Binding of Fulleren-Based Inhibitors of the HIV-1 Protease”, Biochemistry, 2003, v.42, 1326-1333). Застосування похідних фулерену в медицині засноване на ліпофільних властивостях фулеренового ядра, які дозволяють фулереновим похідним проникати крізь клітинні мембрани, і здатності фулерену з високим квантовим виходом генерувати сінглетний кисень, який розщеплює ДНК. Ці властивості зумовлюють цитотоксичні, антивірусні та інші властивості функціональних похідних фулерену (Bedrov D., Smith G.D., Davande H., “Passive transport of fullerenes through a lipid membrane.” J.Phys.Chem., B, 2008, v.112., p.2078-84, Qiao R., Roberts A.E., “Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilayer”, Nano Lett., 2007, v.7, p.6149. Nelsen G.D., і ін., “In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives”, Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 2008, v.103, p.197-208). Гідратовані форми фулерену проявляють високу біологічну активність як біоантиоксиданти, що зумовлене утворенням активних структурних форм водних кластерів, координованих на сфері фулерену (Andrievsky G.V., Brushkov V.I., Tykhonov A.A., Gudkov S.V. “Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostructures in vitro and in vivo”. Free Radical Biology and Medicine, 2009, v.47, p.786-793). Основною проблемою, яка ускладнює біологічні дослідження фулеренів та їх похідних і створення лікувальних препаратів на їхній основі, є складність введення фулеренових систем у водні розчини. Перспективним методом одержання водорозчинних фулеренових композицій є хімічна модифікація сфери фулерену введенням гідрофільних солюбілізуючих лігандів. На даний час отриманий широкий ряд функціоналізованих фулеренів, які містять гідрофільні фрагменти, як у бічному ланцюзі приєднаних до фулерену лігандів (детергентний тип комплексів), так і сферичний тип похідних, коли є полярні групи, розміщені на фулереновій сфері (такий тип включає фулереноли, аміноадукти). Найбільш перспективними для використання є амінокислотні похідні фулерену. Неприродні амінокислоти аліфатичного ряду, які містять 6 і більше метиленових груп, проявляють ряд особливостей, що проявляються в процесах їх гідратації та їх біохімічної активності. Спектральні дослідження структури води у водних розчинах амінокислот показують, що збільшення числа метиленових груп між аміно- і карбоксильною групами призводить до збільшення деструкції водних кластерів. Дослідження фармакологічних властивостей похідних амінокислот широкого ряду R-(CH)nCOOH показали більш високу активність систем з n більше або рівним 6. Похідні фулерену С60 сферичного типу з амінокислотами, отримані шляхом реакції 1 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеофільного приєднання амінокислот за аміногрупою до сфери фулерен описані в патентах РФ №№ 2196602, 2124022, 2236852, які можна запропонувати як аналоги даного винаходу. У патенті РФ № 2196602 запропонований спосіб інгібування репродукції ВІЛ і ЦМВ-інфекцій за допомогою сполук на основі амінокислотних і дипептидних похідних фулерену. Як амінокислотну похідну фулерену використовують натрієві солі фулеренамінокапронової і фулеренаміномасляної кислот. У патенті РФ № 2124022 для одержання фулеренамінокапронової кислоти до розчину фулерену в о-дихлорбензолі додають водний розчин калієвої солі амінокапронової кислоти й 18-краун-6. Реакційну масу перемішують 6-8 годин при 60°С. Потім розчинники відганяють, залишок обробляють насиченим розчином хлористого калію й залишок фулеренового похідного промивають водою. Вихід цільового продукту кількісний. Отримана (моногідро)Nфулеренамінокапронова кислота розчинна в диметилсульфоксиді, диметилформаміді, піридині. У заявленому методі синтезу не визначені умови виділення кінцевого продукту. Основним недоліком отриманих сполук, які є продуктами моноприєднання, є їхня нерозчинність у воді. Іншим недоліком винаходу є використання в їхньому синтезі краун-ефіру як міжфазного каталізатора, який складно відділити від одержаних продуктів реакції. У патенті РФ № 2236852 захищається засіб для інгібування репродукції оболонкових вірусів, який представлений фулеренполікарбоновими аніонами загальної формули C60Hn[NH(CH2)mС(O)O ]n, отримані в результаті взаємодії фулерену із сіллю амінокислоти в середовищі органічного розчинника в присутності поліалкілененоксиду. Для одержання цих сполук до розчину фулерену в о-дихлорбензолі (толуолі або будь-якому іншому органічному розчиннику) вносять амінокислоту у вигляді солі (калієвої або натрієвої), потім додають солюбілізатор. Порядок внесення в реакційне середовище амінокислоти й солюбілізатора не важливий, можна вносити їх у вигляді комплексу, попередньо змішавши. Як солюбілізатор використовують різні поліалкілененоксиди: поліетиленгліколі мол. маси від 150 до 400, і вище 400 (наприклад, ПЕГ-1500), а також поліетиленгліколі, які мають вільні кінцеві групи, але й із заміщеними (наприклад, диметиловий ефір поліетиленгліколю мол. маси 500). Для збільшення швидкості реакції додають будь-який сильний відновник (лужні метали). Співвідношення фулерену й амінокислоти збільшене більше ніж в 50 разів. Перетворення на бажану фармацевтично прийнятну сіль, особливо натрієву або калієву, виконувалося шляхом обробки кислоти придатною основою або шляхом додавання солі слабкої леткої кислоти. Зокрема, не розчинна у воді фулеренполікарбонова кислота перетворюється на більш фармацевтично прийнятні солі, такі як натрієва сіль, які є розчинними у воді. Додавання солі слабкої леткої кислоти відбувається шляхом обробки розчину сіллю лужного металу й слабкої леткої кислоти. При концентруванні розчину шляхом випаровування або ліофілізації слабка кислота видаляється, а суміш фулеренполікарбонових кислот виділяється у вигляді сумішей їх солей лужних металів. Цільовий продукт за даним винаходом характеризується сталістю складу, вміст у цільовому продукті основної речовини становить усього 87,8 %. Основними недоліками фулеренамінокислотних похідних, отриманих запропонованим у патенті методом одержання є те, що даним способом одержують суміш фулеренкарбоксилатних аніонів, як сольових, так і кислотних форм. Одержати ізольовану сполуку способом, описаним у патенті, не є можливим. Також фулеренполіамінокислоти, отримані запатентованим способом, у кислотній формі практично нерозчинні у воді. Одержати стабільну фармацевтичну композицію з фулеренполікарбоновими аніонами не вдалося, оскільки в процесі зберігання сполуки випадають в осад. Фулеренполіамінокислоти впливають на лейкопоез: викликають зрушення лейкоцитарної формули й індукують появу молодих форм нейтрофілів - нейтрофільних метамієлоцитів у піддослідних тварин (пацюків і кроликів). З погляду безпеки (нешкідливості) це свідчить про наявність у даних субстанцій токсичності, що викликає зазначені зміни. Застосування в синтезі великого надлишку калієвої або натрієвої солей амінокислот і значних надлишків розчинників призводить до виникнення екологічних проблем, пов'язаних з утилізацією відходів виробництва, а також до подорожчання процесу виробництва. Використання лужних металів для збільшення швидкості реакції є технологічно неможливим при використанні хлорованих ароматичних розчинників. Розкриття винаходу Завданням заявленого технічного розв'язку є одержання індивідуальних гідратованих сполук фулерену С60 з амінокарбоновими кислотами, які проявляють активність проти віруса герпесу, вірусу гепатиту С, вірусів грипу різної природи, ВІЛ, а також протипухлинну й протипсоріатичну активність, і які не мають токсичної дії на організм; спосіб одержання даних сполук і фармацевтичні композиції, які включають дані сполуки. Для розв'язання поставленого завдання запропонована група винаходів, об'єднаних єдиним 2 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винахідницьким задумом: сполука, спосіб її одержання та фармацевтичні композиції, які містять зазначену сполуку. Поставлене завдання вирішується індивідуальною гідратованою сполукою фулерену С 60 з амінокарбоновими кислотами загальної формули (II), яка характеризується тим, що на одну молекулу фулерену приходиться три ковалентно зв'язаних амінокислотних фрагменти, які мають у своїй структурі активні центри гідратації, які призводять до утворення водорозчинних гідратів, і довгі вуглеводневі ланцюги, які дозволяють утримувати молекули води у внутрішній координаційній сфері фулеренових комплексів. С60(Н)3{NH(CH2)nCOOH }3xН2О, (II) де С60 - фулерен, n = 5, 6, 7, х = 8-10 Зазначене завдання вирішується тим, що гідратовані фулеренові похідні амінокислот формули (II), утворюються при взаємодії фулерену з 15-разовим мольним надлишком безводних калієвих солей амінокислот у середовищі органічного ароматичного розчинника при повільному додаванні до отриманої суспензії міжфазного каталізатора при перемішуванні й нагріванні до температури не вищої від 60-80°С до повного знебарвлення розчину й формування твердого осаду, який потім виділяють, після чого здійснюють обробку 0,8 М водних розчинів калієвих солей фулеренамінокислот 0,1Н розчином органічних або мінеральних кислот з наступним центрифугуванням, промиванням і висушуванням осаду. Також, відповідно до винаходу, безводні калієві солі амінокислот використовують у дрібнодисперсному стані, що дозволяє підвищити реакційну здатність процесу, його ефективність і економічність, а виділення твердого осаду калієвих солей фулеренамінокислот здійснюють фільтруванням, промиванням етиловим спиртом і висушуванням. Як міжфазний каталізатор використовують метилові ефіри поліетиленоксидів молекулярної маси 200, 400, 500, як найбільш доступні й безпечні каталізатори. Зазначене завдання вирішується також створенням фармацевтичних композицій, які як активну речовину містять водорозчинні гідратовані фулеренамінокислоти формули (II), які появляють активність проти віруса герпесу, вірусу гепатиту С, вірусів грипу різної природи, ВІЛ, а також протипухлинну й протипсоріатичну активність. Фармацевтичні композиції відповідно до запропонованого технічного розв'язку містять сполуку загальної формули (II) у кількості, ефективній для досягнення бажаного результату, і можуть бути введені у вигляді стандартних лікарських форм (наприклад, у твердій, напівтвердій або рідкій формах), які містять сполуку запропонованого технічного розв'язку як активний інгредієнт в суміші з носієм або наповнювачем, придатним для внутрішньом'язового, внутрішньовенного, перорального, сублінгвального, інгаляційного, місцевого, інтраназального й інтраректального введення. Активний інгредієнт може бути включений до композиції разом зі звичайно використовуваними нетоксичними фармацевтично прийнятними носіями, придатними для виготовлення розчинів, таблеток, пігулок, капсул, драже, супозиторіїв, емульсій, суспензій, мазей, гелів і будь-яких інших лікарських форм. Конкретний рівень дозувань і частота прийому ліків для кожного конкретного пацієнта буде залежати від великого переліку факторів, включаючи активність конкретного похідного фулерену, метаболічну стабільність і тривалість дії, швидкість виділення, вік пацієнта, вага тіла, загальний стан здоров'я, стать, лікарські комбінації, а також важкість захворювання даного індивіда, який потребує лікування. Для орального застосування у вигляді суспензій композиції готують згідно з методами, широко відомими в галузі приготування фармацевтичних рецептур, і вони можуть містити мікрокристалічну целюлозу або її похідні для забезпечення маси, альгінову кислоту або альгінат натрію як суспендуючий агент, метилцелюлозу як підсилювач в'язкості і підсолоджуючі агенти та/або віддушки, відомі в цій галузі. У формі таблеток такі композиції можуть містити мікрокристалічну целюлозу, кальцій фосфат, крохмаль, стеарат магнію й лактозу й/або інші ексципієнти, зв'язувальні речовини, розширювачі, дезінтегратори, розріджувачі й змащувальні речовини, відомі в даній галузі. При застосуванні у вигляді назальних аерозолів або шляхом інгаляції такі композиції готують методами, добре відомими в галузі фармацевтичних рецептур, і вони можуть випускатися у вигляді розчинів у фізіологічному розчині, з використанням бензойної кислоти або інших придатних консервантів, промоторів адсорбції для покращення біологічного застосування, і/або інших солюбілізуючих або диспергуючих агентів, відомих у даній галузі. Розчини або суспензії для ін'єкцій можуть формуватися згідно з відомими методами, з використанням нетоксичних, придатних для парентерального застосування розріджувачів або розчинників, таких як маніт, 1,3-бутандіол, вода, розчин Рінґера або ізотонічний розчин хлористого натрію або придатних диспергуючих або змочувальних і суспендуючих агентів, таких 3 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як стерильні, м'які, стійкі олії, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди, або жирні кислоти, включаючи олеїнову кислоту. При ректальному застосуванні у вигляді свічок такі композиції можуть готуватися шляхом змішування ліків з таким неподразнюючим ексципієнтом, як масло какао, синтетичними гліцеридними складними ефірами або поліетиленгліколями, які є твердими речовинами за звичайних температур, але скраплюються й/або розчиняються в ректальній порожнині з виділенням ліків. При місцевому застосуванні у вигляді мазей, гелів, кремів, лініментів тощо такі композиції можуть готуватися шляхом змішування активних інгредієнтів із прийнятною мазевою основою. Як мазеві основи можуть бути використані жирові, вуглеводневі або гідрофільні основи, наприклад вазелін, вазелінове масло, парафін, віск, ланолін, поліетиленгліколь та ін. Як основи для гелів можуть бути використані метилцелюлоза, натрієва сіль карбоксиметилцелюлози, оксипропілцелюлоза, поліетиленгліколь або поліетиленоксид, карбопол, полівінілпіролідон, полівініловий спирт тощо. Запропонований винахід стосується сполук, способу одержання цих сполук та їх фармацевтично прийнятних асоціатів з полярними реагентами. Отримані сполуки не впливають на лейкопоез: не викликають зрушення лейкоцитарної формули й не індукують появу молодих форм нейтрофілів - нейтрофільних метамієлоцитів у піддослідних тварин (пацюків і кроликів). З погляду безпеки (нешкідливості) це свідчить про відсутність у даних сполук токсичності, яка викликає зазначені зміни. Заявлений спосіб дозволяє одержати різні за складом композиції на основі фулеренамінокислот залежно від співвідношення реагентів і умов проведення процесу, а саме: водорозчинні гідратовані фулеренамінокислоти загальної формули (II). Спосіб заснований на використанні в стадії синтезу оптимальних співвідношень вихідних реагентів, мінімальних кількостей органічного розчинника й міжфазного каталізатора, з наступним виділенням заявлених сполук, з використанням концентрованих розчинів органічних і мінеральних кислот, що призводить до кількісного одержання фулеренамінокислотних композицій певного складу й можливості застосування заявленого способу для їхнього промислового синтезу, який відрізняється ефективністю й екологічністю. Технічний результат запропонованого технічного розв'язку полягає в одержанні стійких індивідуальних водорозчинних гідратованих сполук фулерену С 60 з амінокарбоновими кислотами, мають токсичного впливу на організм. Розроблений ефективний спосіб одержання індивідуальних стійких гідратованих похідних фулерену, які проявляють противірусну, протипухлинну й протипсоріатичну активність. Заявлений винахід проілюстровано наступними прикладами. Варіанти здійснення винаходу Приклад 1. Одержання гідрату N-фулерен-(трис--амінокапронової кислоти) (за номенклатурою ІЮПАК - гідрат N-фулерен-(трис-6-аміногексанової кислоти) формули: N-C60(Н)3{NH(CH2)5COOH}310 H2O. До розчину 60 г (0,08 моля) фулерену С60 в 4,5 л о-дихлорбензолу додають 204 г (1,2 молей) тонко подрібненої безводної калійної солі -амінокапронової кислоти. До отриманої суспензії о при перемішуванні й нагріванні не вище 60 С додають протягом 2-х годин суміш одихлорбензолу й метилового ефіру поліетиленгліколю 500 у співвідношенні 5:1. Реакційну суміш перемішують за температури не вище 60°С протягом 5 годин до повного знебарвлення розчину й формування твердого осаду. Потім суміш фільтрують, осад на фільтрі промивають декількома порціями етилового спирту й висушують у вакуумі за температури не вище 60°С. Виділену сумішкалієвих солей фулеренаміногексанової кислоти й аміногексанової кислоти розчиняють в 100 л дистильованої води. У розчин повільно при перемішуванні додають 0,1Н розчин соляної кислоти до рН 5,1. Суміш відстоюють до повного осаджування продукту, потім водний шар декантують. Осад, який представляє собою тонку суспензію твердого продукту у воді, центрифугують і промивають водою до рН 6. Осад висушують за температури не вище 60°С у вакуумній сушильній шафі. Вихід продукту кількісний і становить 115 г. Сполука є темно-коричневою твердою речовиною, розчинною у воді, розчинною в сумішах СН3СN:Н2О - 1:10 і ДМФА:Н2О - 1:100. За даними термогравіметричного аналізу отримана сполука містить 10 молей Н 2О. За температури 350°С відбувається інтенсивне руйнування комплексу. Залишок після розкладання містить фулерен і продукти його окиснення. ІЧ-спектр продукту (I) має смуги поглинання, характерні для N-заміщених амінокислот: група -1 -1 -1 -1 -СООН- 1704 см , 1658 см , N-H-валентні коливання 3400 см , N-H-деформаційні-1552 см , -1 -1 -1 смуги поглинання C60-NH-R- 1104 см , 930 см , 830 см . 4 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Електронний спектр поглинання не має смуги поглинання вільного фулерену. Елементний аналіз сполуки показує наступні співвідношення елементів: %С=72,75; %Н=4,70; %N=2,32; розраховане для брутто-формули С78Н39О6N310Н2О: %С=72,38, %Н=4,3, %N=3,24. Кількість карбоксильних груп у продукті визначалася за реакціями із солями металів і амінами. За реакцією з азотнокислим сріблом кількісно виділений комплекс сполуки С60(Н)3{NH(CH2)5COOAg}310H2О. (Встановлено: %Ag=20,88, %C=57,80, %N=2,51, %H=3,32; розраховано для: С78Н36 О6N3 Ag3(10H2O) - %Ag=20,00, %C=57,88, %N=2,60, %H=3,46). За реакцією із трисаміном отриманий водорозчинний комплекс сполуки + С60(H)3{NH(CH2)nCOO NH3 C(CH2OH)3}3 (встановлено %С=64,88, %Н=4,56, %N=5,08, розраховано для С90Н72О15N6 10H2O: %С=65,2, %Н=4,34, %N=5,10). Приклад 2. Одержання гідрату N-фулерен-(трис--аміноенантової кислоти) (за номенклатурою ІЮПАК - гідрат N-фулерен-(трис-7-аміногептанової кислоти) формули: NC60(Н)3{NH(CH2)6COOH}38 H2O. До розчину 72 г (0,1 моля) фулерену С60 в 4 л о-дихлорбензолу додають 182 г (1,2 молей) тонко подрібненої безводної калійної солі -аміноенантової кислоти. До отриманої суспензії при перемішуванні й нагріванні не вище 80°С додають протягом 3-х годин суміш о-дихлорбензолу й метилового ефіру поліетиленгліколю 500 у співвідношенні 5:1. Реакційну суміш перемішують за температури не вище 80°С протягом 8 годин до повного знебарвлення розчину й формування твердого осаду. Потім суміш фільтрують, осад на фільтрі промивають декількома порціями етилового спирту й висушують у вакуумі за температури не вище 60°С. Виділену суміш калієвих солей фулеренаміноенантової та аміноенантової кислот розчиняють в 120 л дистильованої води. До розчину повільно при перемішуванні додають 0,1Н розчин соляної кислоти до рН 5,1. Суміш відстоюють до повного осаджування продукту, потім водний шар декантують. Осад, який представляє собою тонку суспензію твердого продукту у воді, центрифугують і промивають водою до рН 6. Осад висушують за температури не вище 60°С у вакуумній сушильній шафі. Вихід продукту кількісний і становить 130 г. Сполука є темно-коричневою твердою речовиною, розчинною у воді, розчинною у сумішах СН3СN:Н2О - 1:10 і ДМФА:Н2О - 1:100. За даними термогравіметричного аналізу отримана сполука містить 8 молей Н 2О. За температури 450°С відбувається інтенсивне руйнування комплексу. Залишок після розкладання містить фулерен і продукти його окиснення. ІЧ-спектр продукту має смуги поглинання, характерні для N-заміщених амінокислот: група -1 -1 -1 -1 СООН- 1707 см 1650 см , N-Н-вал. коливання - 3400 см , N-H-деформаційні - 1552 см , смуги -1 -1 -1 поглинання C60-NH-R- 1104 см , 930 см , 830 см . Електронний спектр поглинання має смугу поглинання при 260 нм. Елементний аналіз продукту показує наступні співвідношення елементів: %С=73,55; %Н=4,60; %N=3,18; розраховані значення для брутто-формули С81Н45О6N3 (8H2O) - %C=74,82, %H=4,69, %N=3,23. За реакцією з азотнокислим сріблом виділена срібна сіль фулеренамінокислоти, що кількісно доводить наявність трьох амінокислотних фрагментів у складі отриманого продукту. Приклад 3. Одержання гідрату N-фулерен-(трис-8-амінооктанової кислоти) формули: NC60(Н)3{NH(CH2)7COOH}310H2O. Проводять аналогічно до прикладу 1 тільки замість тонко подрібненої безводної калійної солі - амінокапронової кислоти (-аміноенантової кислоти) використовують калієву сіль амінооктанової кислоти. Аналіз отриманої сполуки доводить склад представленого комплексу. Була вивчена противірусна активність сполуки у відношенні ВІЛ, ВПГ, вірусу грипу, а також протипухлинна активність. Сполука має високу протипухлинну й противірусну активність у відношенні всіх названих вірусів. Нижче наведені кращі приклади здійснення винаходу. У наведених нижче прикладах сполука, отримана способом, описаним у прикладі 1, названа за текстом препарат № 1 (фулерен-трис-амінокапронової кислоти гідрат). Приклад 4. Вивчення активності фулерен-трис-амінокапронової кислоти щодо вірусу імунодефіциту людину. Дослідження проводилися в ГУ НДІ вірусології ім. Д.І.Івановського РАМН, м. Москва. До завдань дослідження входило вивчення активності препарату щодо вірусу імунодефіциту людину. До клітин додавали досліджуваний препарат та інфікували вірусом у дозі 0,01 TCID50/клітину. Інкубували культури клітин при 37°С в атмосфері з 5% СО 2 і 98% вологості 4-5 днів. Результати підраховували фарбуючи клітини за допомогою барвника й світлової мікроскопії: дослідження цитопатичної дії вірусу (ЦПД) і вирусіндукованого синцитійутворення 5 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (синцитій - конгломерат декількох клітин із спільною клітинною оболонкою, яка утворилася в результаті злиття їх мембран). Ступінь цитодеструкції оцінювали під мікроскопом за загальноприйнятою чотирихрестовою системою знаками + або - відповідно до кількості загиблих клітин у кожній із чотирьох комірок, які відповідають одному досліджуваному показнику. а ++++ - 100% загибель клітин у чотирьох комірках, використаних у досліді на одне розведення а +++ - 75% загибель клітин у кожній із чотирьох комірок, а ++ - 50% загибель клітин у кожній із чотирьох комірок, а + - 25% загибель клітин у кожній із чотирьох комірок, +- - початок дегенерації, - - відсутність цитодеструкції. Результати дослідження представлені в таблицях 1-2. Отримані дані (таблиця 1, 2) показали, що препарат № 1 проявляє противірусну активність щодо вірусу імунодефіциту людини типу 1 у концентрації 1-10 мкг/мл. ЕК50 (50%-ефективна концентрація) запропонованого препарату 5,0 мкг/мл. Приклад 5. Вивчення активності фулерен-трис-амінокапронової кислоти у відношенні до вірусу грипу. Дослідження проводилися в ГУ НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, м. Москва. До завдань дослідження входило вивчення противірусної активності препарату в культурі клітин MDCK щодо вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl. Препарат розводили в диметилсульфоксиді (ДМСО) (5 мг субстанції + 0,5 мл ДМСО) з наступним додаванням 4,5 мл середовища для культур клітин МЕМ, одержуючи таким чином стік у концентрації 1,0 мг/мл. Надалі проводили розведення стоків середовищем МЕМ до робочих концентрацій 6,5 мкг/мл - 12,5 - 25,0 - 50,0 - 100 мкг/мл. Визначення противірусної активності речовини проводили за зниженням репродукції вірусу грипу в культурі клітин MDCK, яка виявляється ІФА. З цією метою клітини МДСК вирощували в 96-коміркових планшетах до повного моношару, відмивали від ростового середовища й вносили речовини у дворазовій концентрації в 100 мкл середовища МЕМ. Інфікування вірусом у робочій дозі 100-1000 TCID50 проводили у двох режимах: через 2 години після внесення речовин і одномоментно. Планшети інкубували в термостаті із СО2 протягом 24 годин при 37°С. Після інкубації середовище видаляли й клітини фіксували 80% ацетоном в PBS протягом 15 хвилин, добре висушували й здійснювали постановку ІФА, проводячи послідовно адсорбцію специфічних реагентів - моноклональних антитіл, кон′югату й субстрату (ортофенілендиамін). Реакцію враховували за оптичною щільністю при 492 нМ на спектрофотометрі фірми «Біоком». Кожне розведення вірусу досліджували в 3-х повторах, для яких обчислювали середнє значення оптичної щільності (ОЩ). Відсоток інгібування визначали, як відношення між різницею ОЩ досліду й ОЩ клітинного контролю, розділене на різницю ОЩ вірусного контролю й ОЩ клітинного контролю, помножене на 100%. Виходячи із отриманих даних були визначені значення мінімальної концентрації речовини, яка викликає 50,0% інгібування вірусної репродукції (МІК50). Оцінку придушення репродукції вірусу грипу A(H1N1) проводили в 3-х дослідах за різної множинності зараження. Результати представлені в табл. 3 (протоколи 3-х дослідів) і табл. 4 (середні значення отриманих результатів 3-х дослідів). Як видно з таблиці 4, найбільшу активність із зниження репродукції вірусу грипу в культурі клітин MDCK виявила серія препарату 1. Чітко прослідковується залежність ступеня репродукції й концентрації препарату: з підвищенням концентрації - знижується репродукція вірусу. Крім того, значних відмінностей у показниках за різних режимів інфікування (через 2 години після внесення препарату або одномоментно) не було відзначено. При цьому показники мінімальної інгібуючої репродукцію вірусу в 2 рази концентрації (МІК50), склали: у режимі внесення препарату за 2 год. - 9,5 мкг/мл і при одномоментному внесенні - 12,5 мкг/мл. Розрахунки проведені за графічною побудовою отриманих даних. Таким чином, отримані результати вивчення активності різних серій препарату № 1 щодо вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl виявили високу активність придушення його репродукції в культурі клітин MDCK серією 1, з середньою активністю - серії 2. При цьому режими внесення препаратів за 2 години до інфікування або одночасно з інфікуванням не впливали на їхню активність у культурі клітин MDCK. Приклад 6. Вивчення противірусної активності фулерен-трис-амінокапронової кислоти на моделі грипозної пневмонії мишей. Дослідження виконувалися в центрі хімії лікарських засобів (ЦХЛЗ - ВНІХФІ), м. Москва. 6 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У роботі використовували препарат № 1 у вигляді темно-коричневого порошку. Для перорального застосування готували необхідні дози препарату, розчиняючи наважку в 1% розчині крохмалю, звареного на воді. Для внутрішньоочеревинно й внутрішньом'язового застосування наважку препарату № 1 розчиняли в 1,5% розчині диметилсульфоксиду. У роботі був використаний вірус грипу А/Аічі/2/69 (H3N2), адаптований до мишей. Даний вірус широко використовується для визначення ефективності противірусних препаратів на моделі грипозної пневмонії мишей і був отриманий з музею вірусних штамів і клітинних культур ГУ НДІ вірусології РАМН. Для підготовки інфікуючого матеріалу мишей заражали інтраназально алантоісним вірусом, після того, як з'являлись ознаки хвороби їх забивали й за стерильних умов одержували гомогенат легеневої тканини. Далі цей гомогенат використовували для зараження 10-денних ембріонів курчат, з яких одержували алантоісний вірус і після титрування на мишах його використовували для інфікування тварин. Білих безпородних мишей (самки) масою 12-14 г одержували з розплідника «Андрєєвка» (Московська обл.) і розміщували на стандартному раціоні за регламентованих умов віварію. Попередньо зважені миші (самки нелінійні, середня вага 12-14 г) інфікувалися інтраназально під легким ефірним наркозом вірусом грипу А/Аічі/2/69 (H3N2) (10ЛД 50 в 100 мкл). У попередньому досліді було проведене визначення ЛД50 шляхом титрування алантоісного вірусу на таких же мишах, які потім були використані в основному досліді. Була використана наступна схема лікування досліджуваним препаратом: за 24 години до інфікування, за 1 годину до інфікування, через 24 години й далі 1 раз на день через 24 години протягом 5 днів. Для перорального введення використовували одноразовий інсуліновий шприц зі спеціальною голкою (лаваж), кожну дозу вводили в об'ємі 100 мкл. Для внутрішньоочеревинного й внутрішньом'язового лікування також кожну дозу вводили в об'ємі 100 мкл. Група вірусного контролю складалась із 10 мишей, інфікованих вірусом, але яких не лікували препаратами. Також у досліді були дві групи по 10 неінфікованих мишей, яким уводили внутрішньоочеревинно й внутрішньом’язово по 100 мкл 1,5% DMSO, який використовувався як розчинник препаратів. В інших групах також початково було по 10 тварин. За пролікованими й контрольними тваринами велося щоденне спостереження, у перші 5 днів після інфікування миші зважувалися щодня, далі - через день. Хіміотерапевтичну активність препарату № 1 на моделі грипозної пневмонії мишей оцінювали за трьома критеріями: показник захисту від смертельної вірусної інфекції, збільшення середньої тривалості життя й зменшення втрати ваги в групах тварин, які були проліковані препаратом у порівнянні з контрольною групою. Лікування препаратом № 1 було ефективним, зменшуючи смертність мишей від грипозної пневмонії й втрату ними ваги, і збільшуючи середню тривалість життя у порівнянні з вірусним контролем. Ефективність даного лікування залежала від дози препарату й способу лікування. Ефективність перорального лікування фулерен-трис-амінокапроновою кислотою гідрат збільшувалася зі збільшенням дози препарату. Пероральне лікування препаратом № 1 було ефективним, збільшуючи середню тривалість життя в 1,6-1,7 разів. Найбільш ефективним за всіма трьома параметрами (показник захисту від смертності, середня тривалість життя й втрата ваги) було лікування фулерен-трис-амінокапроновою кислотою гідрат внутрішньом’язово, яке в дозах 100 і 200 мг/кг/день запобігало загибелі 70-80% заражених тварин і втрату ними ваги, а також збільшувало тривалість їх життя майже в 2 рази. Внутрішньоочеревинне лікування фулерен-трис-амінокапроновою кислотою було ефективним тільки в дозах 50 і 100 мг/кг/день. Загибель тварин, значне зниження середньої тривалості життя й ваги мишей при внутрішньоочеревинному лікуванні їх препаратом № 1 у дозі 200 мг/кг/день дають підставу вважати, що дана доза при цьому способі введення є токсичною для інфікованих мишей. Результати представлені в таблицях 5-6. Приклад №7. Вивчення протективної активності фулерен-трис-амінокапронової кислоти при експериментальній летальній грипозній інфекції в білих мишей, викликаній вірусами різного походження. Дослідження виконувалися в науково-дослідному інституті грипу, м. Санкт-Петербург. У роботі використовували препарат № 1 у вигляді чорного дрібнодисперсного порошку. Наважки препарату були розчинені в середовищі для клітинних культур Іґла МЕМ (Біолот, Санкт-Петербург, кат. № 1.3.3). З отриманого розчину були приготовлені серії розведень на середовищі МЕМ для визначення противірусної активності зразків у дослідах на тваринах. Як референс-препарати використовували Ремантадин (1-(1-адамантил)-аміноетил гідрохлорид, Aldrich Chem. Co., Milw.,WI, cat. № 39.059-3) і Таміфлю (Етил(3R,4R,5S)-4ацетамідо-5-аміно-3-(1-етилпропокси)-1-карбоксилат фосфат, Hoffmann Laroche, Швейцарія). Віруси. У роботі були використані адаптовані для мишей віруси грипу наступних штамів: -A/Swine/1976/31 (H1N1) - свинячого походження; 7 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 -A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) - людського походження (ремантадин-стійкий); -А/Владивосток/2/09 (H1N1) - людського походження (Таміфлю-стійкий). Віруси пасерували в алантоїсні порожнини 10-12 денних ембріонів курчат протягом 48 годин при 36°С. Штам А/Владивосток/2/09 (H1N1) попередньо адаптували для мишей шляхом трьох пар почергових пасажів на тваринах і в ембріонах курчат. Для зараження тварин була використана алантоїсна рідина ембріонів курчат, яка утримує вірус. З неї готували серію 10-разових розведень на фізіологічному розчині, після чого інфекційна активність вірусу в матеріалі, яким проводили зараження, була визначена в окремому експерименті за допомогою титрування за летальністю на тваринах. Титр вірусу розраховували методом Ріда й Менча (Am.J.Hyg.,1938,27:493-497). Білих безпородних мишей (самки) масою 14-16 г одержували з розплідника «Раполово» (Ленінградська обл.) і розміщували на стандартному раціоні за регламентованих умов віварію НДІ грипу РАМН. Відбір тварин у групи досліду проводили методом випадкової вибірки. До початку досліду тварини перебували під спостереженням 2 тижня. Досліджувані препарати вводили тваринам внутрішньоочеревинно в об'ємі 0,2 мл у наступних дозах: Препарат №1 - 300, 100 і 30 мг/кг, Ремантадин - 50 мг/кг, Таміфлю - 20 мг/кг ваги тварин. Препарати вводили за лікувально-профілактичною схемою: за 24 години й 1 годину до зараження й через 24, 48 і 72 годин після зараження. Як плацебо контрольній групі тварин уводили фізіологічний фосфатний буфер. Як негативний контроль використовували інтактних тварин, які утримувалися за тих же умов, що й дослідні групи. Віруси вводили тваринам інтраназально під легким ефірним наркозом в дозах 1 і 10 LD 50. У кожну групу спостереження брали по 25 мишей. На 3 день після зараження 10 тварин з кожної групи забивали, розтинали й ізолювали легені. Із цих 10 легенів 5 використовували для виділення вірусу (заморожували й зберігали при - 20°С до постановки відповідних експериментів), решту 5 фіксували 10% формаліном і використовували для гістологічного аналізу (див. нижче). Спостереження за тваринами, які залишилися, здійснювали протягом 14 днів, тобто строку, протягом якого при експериментальному грипі відбувається смертність тварин. Щодня фіксували смертність тварин у контрольних і дослідних групах. Виходячи із отриманих показників смертності в кожній групі розраховували відсоток смертності (M, відношення числа тварин, які загинули за 14 днів до загального числа заражених тварин у групі), індекс захисту (IP, відношення різниці відсотків смертності в контрольній і дослідній групах до відсотка смертності в контрольній групі) і середню тривалість життя тварин (DL) з розрахунку 14 днів спостереження. Проводили розтин тварин, які вижили до 15 доби після інфікування й візуально оцінювали величину вогнищ постгрипозної пневмонії в легенях. Розмір вогнищ виражали у відсотках від загальної поверхні легенів. Клінічні ознаки захворювання були типовими для грипозної інфекції й включали ускладнене дихання, атаксію, тремор, а також зниження споживання корму й води і як наслідок, ваги тварин. Дані щодо динаміки смертності тварин у контрольних і дослідних групах приведені в табл. 79. Як видно із представлених результатів, вірус грипу викликав летальну інфекцію в білих мишей,яка супроводжується загибеллю тварин починаючи з 3-4 доби після інфікування залежно від дози вірусу. Такий показник, як тривалість життя тварин, був пов'язаний з використаною дозою вірусу оберненою залежністю. Ремантадин, який використовували у досліді як референс-препарат, виявляв при цій інфекції досить помірну протективну дію, яка проявлялась деяким зниженням смертності в дослідних групах у порівнянні з контролем (індекс захисту 13-29 %) і незначним збільшенням тривалості життя (на 1,1-1,6 доби залежно від дози вірусу). Отримані дані, таким чином, узгоджуються з раніше отриманими результатами експериментів in vitro та in vivo, які свідчать про нечутливість використаного штаму вірусу до ремантадину. Деякий протективний ефект у цьому випадку можна пояснити антитоксичною дією препарату. У той же час препарат порівняння Таміфлю проявляв виражений захисний ефект, як знижуючи смертність у групах мишей, які одержували лікування (приблизно на 70% у порівнянні з контролем), так і збільшуючи середній строк життя тварин (на 2-6 доби). Таким чином, використаний вірус виявився стійким до ремантадину, однак чутливим до Таміфлю. При аналізі отриманих даних було виявлено, що досліджений зразок препарату за своїми протективними властивостями наближався до препарату порівняння - Таміфлю (таблиця 7). Отримані результати були підтверджені при використанні моделі грипозної пневмонії, спричиненої двома іншими штамами вірусу грипу. Дані цих дослідів приведені в таблицях 8-9. 8 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як видно з наведених даних, активність хіміопрепаратів відносно використаних вірусів суттєво різнилася. Так, відносно штаму грипу А/Владивосток/2/09 етиотропний препарат Таміфлю виявився неактивним. Таким чином, раніше отримані дані про стійкість цього ізоляту до Таміфлю були підтверджені у дослідах на тваринах. У той же час активність досліджуваного препарату проти цього штаму виявилася досить високою, що, безсумнівно, слід розглядати як перевагу препарату. Показник активності досліджуваного препарату (індекс захисту - продовження тривалості життя) склав - 21-72 % і 0,8 - 4,4 доби., залежно від використаного штаму вірусу, інфікуючої дози та дози препарату. Для дослідження впливу препарату № 1 на реплікативну активність вірусів грипу в тканині легень інфікованих тварин на 3 добу після зараження з легенів тварин були приготовлені гомогенати, в яких потім визначали інфекційний титр вірусу в культурі клітин. Дані про рівень реплікації модельних вірусів грипу в організмі тварин наведені в табл. 10. Як можна бачити із представлених результатів, усі три використані віруси були здатні ефективно реплікуватися в легеневій тканині мишей, досягаючи до 3 доби титрів 3,4-6,4 log10EID50/20 мг залежно від використаного штаму вірусу та інфікуючої дози. Застосування хіміопрепаратів - досліджуваного препарату й препаратів порівняння - обмежувало розмноження вірусу в різному ступені. Так, ремантадин не суттєво (на 2-3 порядки) знижував інфекційну активність чутливих вірусів A/Swine/1976/31 і А/Владивосток/2/09, однак не проявляв достовірної інгібуючої активності у відношенні ремантадин-стійкого штаму A/Puerto Rico/8/34. Таміфлю виявився активним проти вірусів A/Swine/1976/31 і A/Puerto Rico/8/34. У той же час при тестуванні його на моделі стійкого штаму А/Владивосток/2/09 було виявлене деяке зниження інфекційних титрів вірусу, однак відмінності від контролю були недостовірними. Препарат дослідження проявляв істотну інгібуючу активність проти всіх досліджених вірусів. Проте її рівень не перевищував, а виявився співрозмірним з активністю препаратів порівняння Ремантадину й Таміфлю. При використанні вірусів, стійких до хіміопрепаратів, активність досліджуваного препарату була значно вищою, ніж активність Таміфлю проти озельтамівірстійкого штаму А/Владивосток/2/09, і вищою, ніж активність ремантадину проти ремантадинстійкого штаму A/PR/8/34. При вивченні особливостей морфогенезу експериментальної грипозної інфекції при лікувально-профілактичному уведенні препарату № 1 у дозі 300 мг/кг було відзначено, що морфогенез інфекційного процесу в легенях тварин, які одержували препарат, багато в чому відрізнявся від морфологічних змін у легенях контрольних тварин. Основна відмінність на 3 добу після інфікування стосувалася характеру запального ексудату і полягала в тому, що за однакової його інтенсивності в ньому практично не відзначалося клітин у стадії розпаду, характерних для гострої стадії грипозної пневмонії. Клітинний компонент ексудату був представлений винятково інтактними нейтрофілами, лімфоцитами й макрофагами. Крім того, серозний і геморагічний компоненти ексудату були також виражені слабше. Клітини бронхіального епітелію виглядали менш пошкодженими, ніж у контрольних тварин. Самі вогнища запалення займали меншу в порівнянні з контролем площу. Ті ж тенденції відзначалися й на стадії постгрипозної пневмонії. Вогнища ураження легенів були більш суттєво локалізовані за розмірами, при морфологічному дослідженні була виявлена помірна метаплазія епітелію й інфільтрація інтерстицію інтактними нейтрофілами й круглоклітинними елементами. Слід зазначити, що ефект препарату спостерігався при зараженні тварин кожним із трьох досліджених вірусів незалежно від їхньої чутливості або стійкості до препаратів порівняння. Додатковим критерієм протективної дії препарату № 1 служила оцінка розмірів вогнищ хронічних уражень легень у тварин. Результати цього тесту наведені в табл. 11. Як видно з наведених результатів, усі три віруси індукували формування в легенях стійких вогнищ хронічних уражень, які виявляються візуально у тварин, що вижили, на 15 добу після інфікування. Препарати порівняння ремантадин і Таміфлю - вірогідно знижували розміри вогнищ постгрипозної пневмонії, спричиненої чутливими до них вірусами, і були неактивними у випадку стійких штамів. У той же час препарат № 1 вірогідно знижував цей показник незалежно від використаного вірусу. Таким чином, показано, що за досліджуваних концентрацій (300-30 мг/кг) препарат № 1 проявляє дозозалежну протективну активність на використаних моделях. Ця активність проявлялася в наступних показниках: - 6-200-разове зниження інфекційних титрів вірусу в тканині легень інфікованих тварин; - продовження тривалості життя заражених тварин (на 0,1-4,4 доби залежно від використаного штаму, дози вірусу, партії синтезу й дози препарату); 9 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - зниження специфічної смертності в групах досліду на 7-72 % залежно від використаного штаму, дози вірусу, партії синтезу й дози препарату; - зниження в 2-4 рази середнього розміру вогнищ хронічної постгрипозної пневмонії. За сукупністю показників протективна активність препарату № 1 за деяких доз виявилася співрозмірною з активністю препарату порівняння - ремантадином. Отримані дані свідчать про наявність у препарату № 1 високої протигрипозної активності, у тому числі відносно штамів свинячого походження, а також відносно вірусів, стійких до застосовуваних у клініці протигрипозних препаратів Ремантадину й Таміфлю. Приклад 8. Дослідження протипухлинної активності препарату фулерен-трисамінокапронової кислоти на моделях солідної й асцитної форм карциноми Ерліха у білих мишей. Завданнями даного дослідження були: - дослідження впливу препарату № 1 на динаміку росту асцитної пухлини при внутрішньоочеревинному введенні ракових клітин; - дослідження дії препарату № 1 на динаміку росту солідної пухлини, дослідження впливу препаратів на морфологію й морфометричні показники солідної форми карциноми Ерліха; - дослідження дії препарату № 1 на апоптотичну активність клітин асцитної форми карциноми Ерліха. У роботі використовували водний розчин препарату № 1 у двох дозах - у концентраціях 30 і 10 мг/кг. Тваринам уводили підшкірно 0,2 мл розчину кожної з концентрацій за 24 години до інокуляції й далі щодня протягом усього строку експерименту. Кінцеві концентрації препарату склали 300 і 100 мг/кг ваги. Як препарату порівняння використовували Цисплатин - протипухлинний препарат, який застосовують у практиці онкологічної терапії людини. Цисплатин уводили одноразово на 2 добу після перевивання пухлини, враховуючи його високу токсичність. Кінцева концентрація Цисплатину становила 5 мг/кг ваги. Експерименти проводилися на білих безпородних мишах середньою вагою 20±3 г (тваринницька ферма Раполово, Лен. область). Клітини карциноми Ерліха були отримані з музею клітинних ліній НДІ онкології й культивовані в черевній порожнині білих мишей. Для цього 0,2 мл клітинної суспензії вводили тваринам внутрішньоочеревинно. Через 7-10 днів після інокуляції тварин забивали, асцитну рідину збирали через прокол очеревини, розводили фізіологічним розчином в 10 разів і поміщали на лід. З метою моделювання солідної форми карциноми Ерліха тваринам уводили підшкірно в область правого стегна 0,2 мл клітинної суспензії протягом 40 хвилин після збору асцитної рідини, поміщеної на лід. У ході досліду протягом 28 днів, двічі на тиждень починаючи з 8 доби після інокуляції, проводили вимірювання пухлинних вузликів за допомогою мікрометра. Розмір пухлини вираховували множенням половини довжини вузлика на квадрат ширини й виражали в 3 мм . Фіксували також смертність тварин у контрольних і дослідних групах. На 29 день після перевивання тварин забивали. Для вивчення впливу препаратів на асцитну форму пухлини тваринам уводили внутрішньоочеревинно 0,2 мл клітинної суспензії протягом не більше ніж 40 хвилин після збору вихідної асцитної рідини. У ході досліду контролювали вагу мишей як показник нагромадження асцитної рідини в черевній порожнині. Спостереження за тваринами здійснювали протягом 16 днів. На 17 день після перевивання тварин забивали. Дані про динаміку росту пухлин й смертності тварин з асцитною формою корциноми в контрольній і дослідних групах представлені в таблиці 12. Як видно з наведених результатів, інокуляція клітин пухлин у черевну порожнину тварин викликала швидке нагромадження в порожнині асцитної рідини. Використання лікувальних препаратів мало виражений терапевтичний ефект і призводило до гальмування нагромадження асциту. Лікування тварин запропонованим препаратом і препаратом порівняння - Цисплатином призводило до істотного гальмування динаміки збільшення ваги тварин. На пізніх стадіях розвитку процесу ці відмінності досягали статистично значимих величин. Вплив препарату на процеси апоптозу в клітинах середнього розміру й гранулярності асцитної форми карциноми Ерліха в білих мишей наведено в таблицях 13-14. Як випливає з представлених результатів, лише невелика частина клітин в обох пухлинних субпопуляціях перебувала в стадії зворотного або незворотного апоптозу в контрольних тварин. Застосування цисплатину приводило до різкого зростання частки клітин у ранній стадії апоптозу серед імунних клітин (табл. 13) і пізнього апоптозу й некрозу - серед клітин пухлин (табл. 14). 10 UA 110033 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Препарат № 1 діяв на рівні Цисплатину: подібно до препарату порівняння, він стимулював ранній апоптоз в імунних клітинах і пізній апоптоз - у субпопуляції клітин пухлин. Живих (AnV 7AAD ) серед клітин пухлин після впливу препарату практично не залишалося. За рівнем індукції некрозу в клітинах пухлини він навіть перевершував Цисплатин (30,2 % проти 26,6 % для Цисплатину). Механізм протипухлинної дії препарату № 1, як і дії Цисплатину, полягав в індукуванні апоптотичних процесів у пухлинних і імунних клітинах, які утворюють асцит. Процес апоптозу йшов вибірково й вірогідно швидше в клітинах пухлини, ніж в нейтрофілах та лімфоцитах, які знаходяться в асцитній рідині. Результати цитофлюорометричного аналізу дозволяють говорити про вибірковість дії препарату порівняння - Цисплатину - на клітини пухлини в порівнянні з нормальними лейкоцитами, також присутніми в складі асцитної рідини. Через той же самий термін після введення препарату нормальні клітини, які становлять фракцію середнього розміру й гранулярності - нейтрофіли, макрофаги, лімфоцити тощо - перебували в стадії раннього апоптозу, а пухлинні клітини - пізнього (необоротного) апоптозу або некрозу. Дані про динаміку розвитку солідної пухлини під дією досліджуваного препарату й препарату Цисплатин у порівнянні з контрольною групою тварин представлені в таблиці 15. Як видно із представлених результатів, усі використані препарати тією чи іншою мірою гальмували ріст пухлини протягом усього досліду. У цілому, найбільш вираженою протипухлинну дію проявляв Цисплатин. Достовірне інгібування росту пухлини відзначалося при його застосуванні аж до 17 доби після перевивання. У той же час обидві серії препарату також проявляли дозозалежний антитуморогенний ефект. Достовірне зниження розмірів пухлини й гальмування її росту відзначалося до 8 доби експерименту. Надалі препарати також стримували ріст пухлини на всіх строках дослідження, хоча відмінності з контролем і не досягали статистичної вірогідності. У цілому слід зазначити препарат № 1 у дозі 100 мг/кг ваги як найбільш близький за ефективністю до Цисплатину практично на всіх строках експерименту. Отримані результати не дозволяють розглядати препарат № 1 як провідний препарат для спрямованої терапії онкологічної патології. Однак виходячи з цих даних можна говорити про нього як про перспективний для подальшої розробки засіб комплексної терапії для спільного застосування з іншими протипухлинними препаратами, особливо при асцитних формах пухлин. Фармацевтичні готові форми запропонованого препарату можуть застосовуватися орально, парентерально (включаючи підшкірні ін'єкції, внутрішньовенні, внутрішньом'язові, внутрішньосідничні ін'єкції або вливання), шляхом інгаляційного розпилення або ректально для терапії або профілактики вірусних інфекцій таких, як ВІЛ, герпес, грип різного походження, а також як протипухлинних препаратів для проведення комплексної терапії. Сполуки змішують зі звичайними фармацевтичними носіями й ексципієнтами й використовують у формі таблеток, капсул, свічок, мазей, емульсій, розчинів, спреїв. Слід зазначити, що для приготування розчинів, спреїв, а також м'яких лікарських форм (мазей, свічок) сполуки попередньо розбавляють у суміші ДМСО з водою. Лікування інфекційних захворювань шляхом впливу фармацевтично прийнятних доз сполук формули II, який здійснюється одночасно на кілька вірусів (у випадку мікст-інфекцій) і торкається різних стадій реплікації вірусу. Показано, що лікування супроводжується зниженням стресового ефекту на введення препарату, посиленням антиоксидантного захисту організму від інфекцій, виведенням з організму токсинів. Інтоксикація організму характерна для протікання ряду вірусних інфекцій і визначає тяжкість захворювання. Можливі комбінації сполук формули II з іншими антивірусними агентами, імуномодуляторами, протиінфекційними агентами або вакцинами в різних комбінаціях з будьякими фармацевтичними сполуками, призначеними для лікування. 11 UA 110033 C2 Таблиця 1 Дослідження цитотоксичності запропонованого препарату на моделі лімфобластоїдних клітин людини Умови досліду, концентрація, мкг/мл Контроль клітин 96 95 94 96 92 70 0,5 1,0 5,0 10,0 100 Препарат № 1 Кількість клітин 3 ×10 /мл 833 633 599 530 500 433 Життєздатність клітин, % Таблиця 2 Дослідження противірусної активності препарату № 1 на моделі клітин людини, інфікованих ВІЛ1 Умови досліду Концентрація, мкг/мл Життєздатність клітин, % Контроль клітин Контроль вірусу 0 0 0,5 1,0 5,0 10 96 20 27 75 92 95 Препарат №1 Кількість ЦПЕ/ 3 клітин ×10 /мл синцитії(+) 833 0 83,5 4,0 133,2 4,0 320,4 2,0 480,0 0 529,3 0 Таблиця 3 Результати вивчення активності препарату № 1 щодо вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl Концентрації препаратів (мкг/мл) 6,25 12,5 25,0 50,0 100,0 Зниження (%) репродукції вірусу грипу в культурі клітин MDCK стосовно контролю в присутності серій пропонованого препарату 24,0 - 80,0 - 0 Внесення препарату за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням 54,0 - 21,0 45,0 - 100 - 6,0 78,0 -37,0 40,0 - 100 - 43,0 88,0 - 35,0 47,0 - 77,0 - 69,0 96,0 - 43,0 72,0 - 88,0 - 66,0 69,0 - 76,0 5 12 UA 110033 C2 Таблиця 4 Результати вивчення активності препарату № 1 щодо вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, середні показники Концентрації препаратів (мкг/мл) 6,25 12,5 25,0 50,0 100,0 Зниження (%) репродукції вірусу грипу в культурі клітин MDCK стосовно контролю в присутності серій пропонованого препарату 35,0 Внесення препарату за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням за 2 години до інфікування одномоментно з інфікуванням 38,0 50,0 58,0 61,0 62,0 64,0 70,0 75,0 73 Таблиця 5 Ефективність фулерен-трис-амінокапронової кислоти гідрат на моделі грипозної інфекції в мишей Дані на 16 день спостереження Середня тривалість Показник захисту Виживання абсолютне Смертність життя (дні)** від смертності (які вижили/загальне) (%) (%) Фулерен-трис-амінокапронової кислоти гідрат перорально 10,4 (2-7 д., 1-9 д., 1100 мг/кг/день 5/10 50 40 10 д.) 13,0 (1-7 буд., 1200 мг/кг/день 7/10 30 60 10 д., 1-11 д.) Фулерен-трис-амінокапронової кислоти гідрат внутрішньом’язово 50 мг/кг/день 6/10 40 50 100 мг/кг/день 12,4 (1-7 д., 1-9 д., 2-11 8/10 20 70 200 мг/кг/день д.) 13,5 (1-8 д., 1-9 д.) 9/10 10 80 1,5% розчин 14,4 (1-10 д.) >16 10/10 0 DMSO Фулерен-трис-амінокапронової кислоти гідрат внутрішньоочеревинно 50 мг/кг/день 5/10 50 40 11,5 (1-5 д.,1-7 д., 3-11 д.) 100 мг/кг/день 5/10 50 40 11,0 (3-7 д.,1-8 д., 11,5% розчин 10/10 0 11 д.)>16 DMSO Вірусний контроль (10 1/10 90 7,3 (5-7 д., 4-8 д.) LD50) Доза препарату 5 Примітка: * - схема лікування: за 24 і 1 години до зараження, далі через 24, 48, 72 і 96 годин після зараження ** Середню тривалість життя визначали за формулою ∑f(d-1)/n, де f-кількість мишей, які загинули на день d (миші, які вижили, включені в f і d у цьому випадку дорівнює 16), n-кількість мишей у групі 13 UA 110033 C2 Таблиця 6 Зміна ваги тварин, заражених вірусом грипу А/Аічі/2/69, яких лікували препаратом № 1 Зміна ваги в % по днях після інфікування 1 день 2 день 3 день 4 день 5 день 7 день 9 день 11 день 13 день Фулерен-трис-амінокапронова кислота перорально 100 мг/кг/день +12 +17 +23 +25+24 +21 +23 +34 +44 200 мг/кг/день +15 +20 +23 +25 +24 +22 +25 +45 +57 Фулерен-трис-амінокапронова кислота внутрішньом’язово 50 мг/кг/день +9 +14 +21 +26 +30 +27 +38 +64 +74 100 мг/кг/день +13 +17 +23 +28 +31 +39 +65 +71 +82 200 мг/кг/день +11 +20 +26 +35 +39 +43 +51 +62 +70 Фулерен-трис-амінокапронова кислота внутрішньоочеревинно 50 мг/кг/день +11 +17 +22 +25 +28 +35 +41 +67 +77 100 мг/кг/день +9 +15 +19 +21 +21 +27 +37 +50 +82 Вірусний контроль +18 +16 +9 +1 -8 +3 +56 +72 +74 Доза препарату Таблиця 7 Протективна активність фулерен-трис-амінокапронової кислоти на моделі експериментальної летальної грипозної пневмонії, спричиненої ремантадин-стійким вірусом грипу A/Puerto Rico/8/34(H1N1) Препарат, доза 1 Препарат № 1, 300 мг/кг Препарат № 1, 100 мг/кг Препарат № 1, 30 мг/кг Ремантадин Таміфлю Контроль вірусу Доза вірусу, LD50 Кількість тварин у групі 2 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 3 14 15 29 15 15 30 15 14 29 15 15 30 15 13 28 13 15 28 Середня Кількість тривалість тварин, що життя вижили (СТЖ), діб. 4 5 8 11,3 12 13,7 20 12,5 6 11,3 12 13,9 18 12,6 4 10,4 9 13,3 13 11,8 4 9,7 10 13,5 14 11,6 11 13,5 11 14,4 22 13,9 2 8,1 8 12,3 10 10,4 14 Смертність, % Індекс захисту, % Збільшення СТЖ, діб. 6 42,9 20,0 31,0 60,0 20,0 40,0 73,3 35,7 55,2 73,3 33,3 53,3 26,7 15,4 21,4 84,6 46,7 64,3 7 49,4 57,1 51,7 29,1 57,1 37,8 13,3 23,5 14,2 13,3 28,6 17,0 68,5 67,0 66,7 ------ 8 3,2 1,3 2,2 3,2 1,6 2,2 2,3 1,0 1,4 1,6 1,1 1,2 5,5 2,1 3,6 0,0 0,0 0,0 UA 110033 C2 Таблиця 8 Протективна активність фулерен-трис-амінокапронової кислоти на моделі експериментальної летальної грипозної пневмонії, спричиненої вірусом грипу A/swine/1976/31 (H1N1) Препарат, доза 1 Препарат № 1, 300 мг/кг Препарат № 1, 100 мг/кг Препарат № 1, 30 мг/кг Ремантадин Таміфлю Контроль вірусу Доза вірусу, LD50 Кількість тварин у групі 2 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 10 1 Сума доз 3 14 14 28 13 15 28 15 15 30 15 15 30 13 13 26 14 15 29 Середня Кількість тривалість тварин, що життя вижили (СТЖ), діб 4 5 8 11,0 11 13,6 19 12,3 6 10,3 11 13,1 17 11,8 4 8,9 9 12,3 13 10,6 9 11,8 13 14,3 22 13,1 8 11,0 11 13,5 19 12,2 1 6,6 7 10,6 8 8,7 Смертність, % Індекс захисту, % Збільшення СТЖ, діб. 6 42,9 21,4 32,1 53,8 26,7 39,3 73,3 40,0 56,7 40,0 13,3 26,7 38,5 15,4 26,9 92,9 53,3 72,4 7 53,8 59,8 55,6 42,0 50,0 45,7 21,0 25,0 21,7 56,9 75,0 63,2 58,6 71,2 62,8 ------ 8 4,4 3,0 3,7 3,7 2,5 3,1 2,4 1,7 1,9 5,2 3,7 4,4 4,4 2,9 3,6 0,0 0,0 0,0 Таблиця 9 Протективна активність фулерен-трис-амінокапронової кислоти на моделі експериментальної летальної грипозної пневмонії, спричиненої озельтамівір-стійким вірусом грипу A/Владивосток/02/09 (H1N1) Препарат, доза 1 Доза вірусу, LD50 2 2 Препарат № 1, 0,4 300 мг/кг Сума доз 2 Препарат № 1, 0,4 100 мг/кг Сума доз 2 Препарат № 1, 0,4 30 мг/кг Сума доз 2 Таміфлю 0,4 Сума доз 2 Ремантадин 0,4 Сума доз 2 Контроль 0,4 вірусу Сума доз Середня Кількість Кількість тривалість Смерттварин у тварин, що життя ність, % групі вижили (СТЖ), діб. 3 4 5 6 13 10 13,8 23,1 13 12 14,5 7,7 26 22 14,2 15,4 12 8 13,3 33,3 10 8 14,0 20,0 22 16 13,6 27,3 12 7 13,2 41,7 13 11 14,2 15,4 25 18 13,7 28,0 10 5 11,7 50,0 9 7 13,4 22,2 19 12 12,5 36,8 13 12 14,6 7,7 13 13 15,0 0,0 26 25 14,8 3,8 10 4 11,4 60,0 11 8 13,2 27,3 21 12 12,3 42,9 15 Індекс Збільшення захисту, % СТЖ, діб. 7 61,5 71,8 64,1 44,4 26,7 36,4 30,6 43,6 34,7 16,7 18,5 14,0 87,2 100,0 91,0 ------ 8 2,4 1,4 1,8 1,9 0,8 1,3 1,8 1,0 1,4 0,3 0,3 0,2 3,2 1,8 2,5 0,0 0,0 0,0 UA 110033 C2 Таблиця 10 Інфекційна активність вірусів грипу в тканині легень білих мишей за умов застосування хіміопрепаратів Інфекційний титр вірусу (log10EID50/20 мг тканини) при дозі вірусу (LD50) Препарат, доза A/Swine/1976/31 (H1N1) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) А/Владивосток/2/09 (H1N1) 1 5 1 5 0,4 2 Препарат № 1, 3,7±0,3 4,1±0,2 3,2±0,3 4,1±0,2 1,8±0,2 2,9±0,2 300 мг/кг Ремантадин 2,9±0,2 3,4±0,3 4,5±0,2 5,1±0,3 1,2±0,2 2,0±0,3 Таміфлю 3,1±0,1 3,8±0,3 2,2±0,4 2,4±0,3 2,5±0,2 3,1±0,3 Контроль вірусу 6,0±0,0 6,4±0,2 4,9±0,3 5,5±0,2 3,4±0,4 4,0±0,3 Примітка: * - відмінності від контролю достовірні при p