Похідні гемцитабіну, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція на їх основі

Цей винахід стосується до визначених 2',2'-дифтор-дезоксицитидинових (гемцитабінових) похідних насичених і мононенасичених жирних кислот із довгим ланцюгом і фармацевтичними композиціями, які містять їх. Гемцитабін має формулу: Гемцитабін представляє собою нуклеозидний аналог, який у дослідженнях in vitro і in vivo показав активність при лікуванні неопластичних станів. (New anticancer agents, Weiss et al, Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers Annual 16, editors Pinedo, Longo and Chabner, 1996. Elsevier Science B.V., Supplement to Seminars in Oncology, Vol.22, № 4, Suppl.11, 1995, editors Yarbro et al. Gemcitabine Hydrochloride: Status of Preclinical Studies). При клінічних випробуваннях гемцитабіну також спостерігається вигідний ефект. У цих дослідженнях як клінічні, так і побічні впливи гемцитабіну є високо залежними. Гемцитабін активується всередині клітини дезоксицитидінкіназою до його активної форми: - трифосфату гемцитабіну (dFdCTP). Паралельно з цим дезоксицитидіндезаміназа інактивує гемцитабін до відповідної похідної урацилу (неактивного). Заявники зненацька виявили, що визначені похідні жирних кислот гемцитабіну характеризуються цілком зміненою фармакокінетикою і розподілом у тканинах. Це відбувається особливо у випадку злоякісних захворювань RES (ретікулоендотеліальної системи), легень, підшлункової залози, кишечника, стравоходу, матки, яєчників, молочної залози і при меланомі. Сполуки даного винаходу представлені формулою 1: де R1, R2 і R3, незалежно вибирають із водню і С18- і С20- насичених і мононенасичених ацильних груп, за умови, що R1, R2 i R3- усі не можуть бути воднем. Гемцитабін має три функціональні групи, а саме 5’- і 3’- гідроксильні групи і N4-aміно групу. Кожну групу вибірково перетворюють в ефірну або амідну похідну, однак також утворяться ди-аддукти (ди-ефіри й ефіраміди) і три-аддукти. У випадку ди- і три-аддуктів немає необхідності, щоб ацильні заміщувані були однаковими. У даний момент переважні моноацильні похідні даного винаходу, тобто із двома з R1, R2 і R3, які є воднем. Особливо переважно, що монозаміщення ацильною групою відбувається в 3'-0 і 5-0 положеннях цукрового фрагмента, найбільш переважно 5'-0 заміщення. Подвійний зв'язок мононенасичених ацильних груп може знаходитися в цис або транс конфігурації, хоча терапевтичний ефект може відрізнятися в залежності від використовуваної конфігурації. Положення подвійного зв'язку в мононенасичених ацильних групах також впливає на активність. У даному випадку переважно використовувати ефіри або аміди, які мають ненасичені зв'язки в w -9 положенні. У wсистемі номенклатури, w положення подвійного зв'язку мононенасиченої жирної кислоти рахують від кінцевої метальної групи так, що, наприклад, ейкозенова кислота (С20:1 w -9) містить 20 атомів вуглецю у ланцюгу й утворює єдиний подвійний зв'язок між 9 і 10 вуглецями, рахуючи від метального кінця ланцюга. У винаході віддають перевагу використовувати ефіри, ефір-аміди й аміди, похідні олеїнової кислоти (С18:1 w -9, цис), елаїдинової кислота (С18:1 w -9, транс), ейкозенової кислота (т) (С20:1 w -9, цис) і (С20:1 w -9, транс), а найбільш переважними похідними даного винаходу є аміди і 5'-ефіри. У деяких випадках із користю використовують ефіри, ефір-аміди й аміди гемцитабіну, похідні стеаринової кислоти (С18:0) і ейкозанової кислоти (С20:0). Відповідно до даного винаходу похідні гемцитабіну звичайно одержують за наступним рівнянням реакції: Основа Nu - YH + FaX ® Nu - Y - Fa - HX де Nu-YH означає гемцитабін, Υ представляє собою кисень у 3' або 5’ положенні цукрового фрагмента, або азот у 4 положенні піримідинового фрагмента гемцитабіну; Fa представляє собою ацильну групу мононенасиченої С 18 або С20 жирної кислоти, і X представляє собою групу, яка видаляється, наприклад, СІ, Вг, З-тіазолідин-2-тіон або OR1, де R1 представляє собою Fa, COCH3, COEt або COCF3. Таким чином, реакція відбувається за допомогою ацилювання нуклеозиду. Це супроводжується використанням прийнятних реактивних похідних жирних кислот, галоїдангідридів або ангідридів кислоти. Звичайно необхідна присутність акцептора протонів для поглинання кислого НХ, який виділяється реакцією. Тому може бути добавлена основа в реакційну суміш. Наприклад, якщо використовують голоїдангідрид такий, як хлорангідрид, до реакційної суміші добавляють основу третинного аміну таку як триетиламін, Ν,Ν-диметиланілін, піридин або Ν,Ν-диметиламін піридин для зв'язування галоїдводневої кислоти, яка виділяється. В інших випадках, застосовуваний у реакції розчинник служить у якості акцептора протонів. Як правило, реакція ацилювання протікає без каталізатора. У деяких випадках реактивне Похідна жирної кислоти Fa може бути одержана in situ у результаті сполучення реагентів таких як Ν,Νдициклогексилкарбодиімід (ДСС), N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл) карбодиімід (ЕДС) або 0-(1Нбензотриазол-1-іл)-N,N,N',N'-тетраметилуроній тетрафторборат (TBTU). Переважно реакції проводять у нереактивному розчиннику, такому як Ν,Ν-диметилформамід, або галоїдованому вуглеводні, такому, як дихлорметан. При необхідності, будь-яку з вищезгаданих основ третинного аміну використовують у якості розчинника, слідкуючи за присутністю відповідного надлишку. У цьому випадку окремий акцептор протонів не потрібний. Переважно реакцію підтримують при температурі між 5°С і 25°С. Після періоду від 1 години до 60 годин реакція, власне кажучи, завершується. Результат реакції аналізують тонкошаровою хроматографією (TLC=TCX) і відповідної системи розчинників. Після завершення реакції, що встановлюють за допомогою ТСХ, продукт екстрагують органічним розчинником і очищають хроматографією і/або перекристалізацією з відповідної системи розчинників. Так як у гемцитабіні присутні більше однієї гідроксильної групи й аміногрупа може бути отримана сумішшю ацилірованих сполук. При необхідності, індивідуальні моно- і мультиацильовані похідні можуть бути розділені за допомогою, наприклад, хроматографії, кристалізації і вкрай необхідної екстракції, і так далі. Коли необхідно одержати мультиацильну сполуку формули 1, у якій R1 і/або R2 і/або R3 представляють собою ту ж саму ацильну групу, то переважно застосовують вищезгаданий спосіб(способи), використовуючи відповідний ацил-реагент(ацил-реагенти) у надлишку. Для одержання мультиацильних сполук формули 1, у яких R1 і/або R2 і/або R3 розрізняються, переважно застосовують вищенаведені способи східчасто при відповідному відборі реагенту. Також для проведення специфічної реакції використовують належним чином обрані захищаючі групи. Вибір цих способів поданий на схемі 1 нижче. Використовують будь-яке сполучення способів для одержання специфічного продукту. Наступні приклади ілюструють одержання двох переважних похідних гемцитабіну цього винаходу. У прикладах використовують такі скорочення: DMF - диметилформамід (ДМФ) NMR-ЯМР d - дублет br - широкий S- синглет t - триплет m - мультиплет Приклад 1 Ефір елаїдинової кислоти (5')-гемцитабіну До розчину 2', 2'-дифтордезоксирибофуранозилцитозину (гемцитабіну) (0,42г, 1,6ммоль) у 30 мл ДМФ добавляють 0,81мл ДМФ, який містить 1,6ммоль НСІ (г) із наступним додаванням розчину хлорангідриду елаїдинової кислоти (0,51г, 1,7ммоль) у 3 мл ДМФ і реакційну суміш перемішують при температурі навколишнього середовища протягом 12 годин. Розчинник випарюють під високим вакуумом, а неочищений (сирий) продукт очищають на колонці із силікагелем 15% метанолом у хлороформі в якості елюіюючої системи. Неочищені фракції повторно очищають, щоб одержати в підсумку 0,25 г (30%) названої сполуки. 1 Н ЯМР (DMSO-d6, 300 Мщ) d: 7,5 (1Н, д, АrН), 7,45 (2Н, шир.с, NH2), 6,45 (1Н, д, -ОН), 6,17 (1Н, т, СН-1’), 5,8 (1Н, д, Аr), 5,35 (2Н, м, СН=СН), 4,4-4,05 (3Н, м, СН2-5' і СН-4’), 3,95 (1Н, м, СН-3’), 2,35 (2Н, т, СН2-СОО), 1,95 (4Н, м, СН2-СН=), 1,55 (2Н, м, СН2-С-СОО), 1,25 (20Н, м), СН2), 0,85 ( 3Н, т, СН3). 13 С ЯМР (DMSO-d6, 75 Мгц) d: 172,67 (COO), 165,63 (С-4), 154,51 (С-2), 141,12 (С-6), 130,08 і 130,03 (С9”/С-10"), 126,09, 122,67 і 119,24 (т, С-2’), 94,86 (С-5), 83,90 (С-1’), 77,36 (С-4’), 70,41, 70,11 і 69,80 (т, С-3’), 62,53 (С-5’), 33,24, 31,95, 31,29, 29,00, 28,94, 28,84, 28,72, 28,50, 28,43, 28,33, 24,34, 22,11 (СН2), 13,94 (СН3). Крім того, невелику кількість ефіру елаїдинової кислоти (3’-гемцитабіну (0,05 г) виділяють із неочищених фракцій. 1 Н ЯМР (DMSO-d6, 300 Мгц) d: 7,65 (1Н, д, АгН), 7,40 (2Н, д, ΝΗ2), 6,25 (1Н, т, СН-1’), 5,82 (1Н, д, АгН), 5,45,2 (4Н, м, ОН-5’), СН=СН і СН-3’), 4,15 (1Н, м, СН-4’), 3,85-3,55 (2Н, м, СН2-5’), 2,45 (2Н, т, СН2-СОО), 1,95 (2Н, м, СН2-С=), 1,55 (2Н, м, СН2-С-СОО), 1,25 (20Н, м, СН2), 0,85 (3Н, т, СН3). 13 СЯМР (DMSO-d6, 75 Мгц) d: 171,70 (COO), 165,69 (С-4), 154,46 (С-2), 141,30 (С-6), 130,10 і 130,03 (С-9”/С10"), 125,17,121,72 і 118,27 (τ, С-2’), 94,78 (С-5), 83,78 (С-1’), 78,41 (С-4’), 69,93, 69,60 і 69,30 (τ, С-3’), 59,15 (С5’), 32,95, 31,93, 31,26, 28,98, 28,90, 28,81, 28,69, 28,46, 28,28, 28,23, 24,26, 22,09 (СН2), 13,95 (СН3). Приклад 2 Амід елаїдинової кислоти (N4)-гемцитабіну До розчину 2',2'-дифтордезоксирибофуранозилцитозину (гемцитабіну) (0,38г, 1,3ммоль) у 5мл піридину добавляють хлорангідрид елаїдинової кислоти (0,57г, 1,9ммоль) і реакційну суміш перемішують при температурі навколишнього середовища протягом 2,5 годин. Розчинник випарюють під високим вакуумом і неочищений продукт очищають на колонці із силікагелем 15% метанолом у хлороформі в якості елюіюючої системи. Фракції, які містять продукт, випарюють і залишок обробляють ефір-гексаном в ультразвуковому пристрої. Кристалічний матеріал висушують до одержання 0,1г (15%) названої сполуки. 1 Н ЯМР (DMSO-d6, 300 Мгц) d: 10,95 (1Н, із, NHCO), 8,25 (1Н, д, Аr), 7,25 (1Н, д, Аr), 6,30 (1Н, д, -ОН), 6,15 (1Н, т, СН-1’), 5,35 (2Н, м, СН=СН), 5,30 (1Н, т, -ОН), 4,2 (1Н, м, СН-4’), 3,9-3,6 (3Н, м, СН-3’ і СН2-5'), 2,35 (2Н, т, CH2-CON), 1,95 (2Н, м, СН2-С=), 1,55 (2Н, м, СН2-С-СОО), 1,25 (20Н, м, СН2), 0,85 (3Н, т, СН3). 13 СЯМР (DMSO-d6, 75 Мгц) d: 174,06 (CONH), 162,89 (С-4), 154,22 (С-2), 144,69 (С-6), 130,04 (С-9”/С-10"), 122,94 (JCF=259гц, С-2’), 95,91 (С-5), 84,11 (JCF=31гц, C-1’), 81,02 (С-4’), 68,35 (JCF=22гц, С-3’), 58,76 (С-5’), 36,38, 31,94, 31,28, 28,99, 28,83, 28,71, 28,56, 28,48, 28,30, 24,34, 22,10 (СН2), 13,94 (СНЗ). Переважні похідні гемцитабіну цього винаходу мають більше терапевтичне значення, ніж сам гемцитабін. Це демонструють на двох моделях in vivo із як однократними, так і багатократними дозами. При лікуванні однократною дозою вплив похідних виявляється кращим або порівняним із дією гемцитабіну. Це особливо виразно виявляється для амідної похідної, коли чудовий ефект одержують із дозою, яка становить тільки 25% дози гемцитабіну. При застосуванні багатократної дози різниці в дії похідних гемцитабіну і гемцитабіну виявляються ще більш разючими. Це відбивається як у збільшенні періоду доживання, так і в збільшенні тривалості життя тих, які вижили. Іншою важливою характеристикою є токсичність, яка спостерігається при використанні самого гемцитабіну як у вищих, так і середніх діапазонах багатократного дозування. Хоча ефект, отриманий із низьким нетоксичним діапазоном доз (1мг/кг), вважають гарним, цей ефект перевершують як N4-амідні, так і 5'ефірні похідні. Гемцитабін має оптимальну дію при концентрації в плазмі приблизно 20мкм, але більш високі концентрації, понад 35мкм, інгібують протираковий ефект, що обумовлено механізмом фосфорилірування. (Gandhi, Cellular Pharmacology of Gemcitabine in Gemcitabine: Rationales for Clinical Trial Design and Evaluation, Mini Symposium, 12.3.96, Vrije Universiteit Amsterdam). На відміну від цього, переважні похідні гемцитабіну створюють оптимальні рівні (концентрації) у плазмі гемцитабіну протягом більш тривалого періоду часу без досягнення інгібіторних концентрацій (>35мкм). Це відбувається тому, що похідні не піддаються фосфориліруванню і, мабуть, не беруть участь у механізмі інгібування також. Головною проблемою лікування раку є розвиток резистентності до терапії. Множинна резистентність до лікарського засобу (MDR) становить одну з головних причин неспроможності в інших випадках ефективних лікарських засобів. Заявники виявляють, що переважні похідні цього винаходу якось блокують (MDR) і, отже, переборюють цю проблему. Поглинання клітиною нуклеозидів і нуклеозидних аналогів таких як гемцитабін здійснюється головним чином через селективний рецептор нуклеозидного транспорту (NT=HT). Модуляцію/інгібування цього рецептора розглядають як резистентність до лікарського засобу в клінічній ситуації. Цей феномен спостерігають in vitro при додаванні інгібіторів НТ (нуклеозидного транспорту). У цьому проекті виявляють, що на похідні даного винаходу не впливає присутність інгібіторів НТ, так як переважні похідні зберігають цитостатичну активність у присутності таких інгібіторів. Період піврозпаду гемцитабіну в плазмі становить приблизно 10 хвилин внаслідок швидкого його дезамінірування ендогенним ферментом - дезоксицитидіндезаміназою до відповідної похідної урацилу (P.G.Johnston et al, Cancer Chromatography and Biological Response Modifiers, Annual 16, 1996, Chap.1, ed. Pinedo H.M. et al.). Похідні цього винаходу є поганими субстратами для ферменту, який інактивує, і тому їхній період піврозпаду збільшується. Отже, похідні даного винаходу більш підходять для системного або місцевого лікування злоякісних пухлин, ніж сам гемцитабін. Нові сполуки цього винаходу не тільки, мабуть, корисні при лікуванні раку, але вони також активні як противірусні агенти. Біологія Експеримент Цитотоксичну активність аміду гемцитабін-N4-елаїдинової кислоти й ефіру гемцитабін-5'-елаїдинової кислоти досліджують на 2 парах гризунів і лініях клітин пухлин людини, кожна з який складається з вихідної (батьківської) лінії і сублінії або стійкої, або перехресно-стійкої (резистентної) до гемцитабіну. Клітинні лінії представляють собою лінію А2780 пухлини яєчників людини і сублінію AG6000, яка резистентна до гемцитабіну і характеризується недостатністю дезоксицитидінкінази, і лінію С26А пухлини прямої кишки миші і сублінію C26G із незмінною дезоксицитидінкіназою, але з 10-кратним зниженням тимідинкінази 1. Цитотоксичність кожної сполуки оцінюють, спостерігаючи за безупинною експозицією лікарського засобу протягом 72 годин. Число клітин визначають за допомогою SRB-аналізу і відсоток інгібування росту розраховують для кожної пухлинної лінії як розмір ІС50 виражену в мкм, що складає концентрацію сполуки, яка дає збільшення до 50% інгібування росту в порівнянні з контролем. Результати Значення ІС50 цитотоксичної активності гемцитабіну, у мкм, у порівнянні з цитотоксичною активністю аміду гемцитабін-5'-елаїдинової кислоти й ефіру гемцитабін-5’-елаїдинової кислоти представляють у таблиці нижче. Активність похідних гемцитабіну значно вища, ніж цитотоксична активність гемцитабіну в досліджуваних клітинних лініях. Таблиця Значення IC50 (мкм) цитотоксичності гемцитабіну, аміду гемцитабін-N4-елаїдинової кислоти й ефіру гемцитабін-5'елаїдинової кислоти в клітинних лініях С26-А, C26-G, А2780 і AG6000 Гемцитабін Амід гемцитабін-N4елаїдинової кислоти Ефір гемцитабін-5'елаїдинової кислоти С26-А C26-G А2780 AG6000 0,0055 0,0075 0,0005 100 35 ДНІВ) Токсична смерть 75 186,3 1/6 0/6 100 138,9 0/6 0/6 75 138,9 0/6 0/6 Доза мг/кг Середній час доживання Т/С [%] 1 178 2/6 0/6 4 183 1/6 0/6 15 58,0 0/6 6/6 Обробка багатократною дозою, дні 1-4 Кіл-ть мишей 8 6 6 6 Сполука Фізіологічний розчин Амід гемцитабін-N4-елаїдинової кислоти Амід гемцитабин-N4элаидиновой кислоти Гемцитабін Довгостроково Токсична залишаються в смерть живих (>35 днів) При застосуванні багатократної дози протягом 1-4 днів активність аміду гемцитабін-N-елаїдинової кислоти чітко виявляється у відношенні спостерігаємих тварин, які довгостроково залишаються в живих і пролонгованого середнього періоду доживання як при дозі 1мг/кг, так і 4мг/кг. У контрольній групі, обробленої гемцитабіном у дозі 15мг/кг, усі тварини гинуть у результаті токсичності. Обробка багатократною дозою, обробка протягом 1-11 днів Кіл-ть мишей 9 6 6 6 6 6 6 Сполука Фізіологічний розчин Амід гемцитабін-N4-елаїдинової кислоти Амід гемцитабин-N4-элаидиновой кислоти Ефір гемцитабін-5'-елаїдинової кислоти Ефір гемцитабін-5'-елаїдинової кислоти Гемцитабін Гемцитабін Доза мг/кг Середній час виживання Т/С [%] Довгостроково залишаються в живих(>45 днів) Токсична смерть 1 172,5 1/6 0/6 4 215,7 0/6 0/6 1 317,0 0/6 0/6 4 220,6 2/6 0/6 1 4 178,8 71,9 0/6 0/6 0/6 6/6 Обробка протягом 10 днів збільшує протипухлинну активність у порівнянні з більш короткочасною обробкою. Токсичність гемцитабіну, виходячи з мг/кг, виявляється більш високою зі смертністю 6/6 при дозі 4 мг/кг. Відзначають кількість тварин, які довгостроково залишаються в живих після обробки багатократною дозою як амідом гемцитабін-N4-елаїдинової кислоти, так і ефіром гемцитабін-5'-елаїдинової кислоти, а також спостерігають значно збільшений період доживання як для аміду гемцитабін-N4-елаїдинової кислоти, так і ефіру гемцитабін-5'-елаїдинової кислоти. Ефіри або аміди гемцитабіну даного винаходу вводять системно або ентерально, або парентерально. Для ентерального введення активні сполуки даного винаходу представляють у вигляді, наприклад, м'яких або твердих желатинових капсул, таблеток, гранул, дрібних гранул або порошків, драже, сиропів, суспензій або розчинів. Для парентерального введення прийнятні композиції ефірів або амідів гемцитабіну у вигляді розчинів для ін'єкцій або вливань, суспензій або емульсій. Композиції містять інертні або фармакодинамічно-активні добавки, добре відомі фахівцям у галузі приготування лікарських засобів. Наприклад, таблетки або гранули містять ряд зв'язуючих агентів, наповнювачів, емульгуючих реагентів, носіїв або розріджувачів. Рідкі композиції існують, наприклад, у формі стерильного розчину. На додаток до активного інгредієнта капсули містять наповнювач або загусник. До того ж, також присутні добавки, які поліпшують смак, як і речовини, звичайно використовувані в якості консервуючих, стабілізуючих, зберігаючих вологість і емульгуючих агентів, солі для зміни осмотичного тиску, буфера й інші добавки. Дозу, у якій вводять композиції відповідно до даного винаходу, змінюють відповідно до форми застосування і способу застосування, а також потреби пацієнта. Звичайно щоденна доза для системної терапії для дорослого середнього (нормального) пацієнта становить приблизно 0,1-150мг/кг ваги тіла/день, переважно 1-40мг/кг день. Для місцевого введення мазі, наприклад, містять від 0,1 до 10% за вагою фармацевтичної композиції, особливо 0,5-5% за вагою. Якщо необхідно, фармацевтична композиція, яка містить ефіри й аміди гемцитабіну, містить антиоксидант, наприклад, токоферол, N-метил-токофермін, бутиловий гідроцианізол, аскорбінову кислоту або бутиловий гідрокситолуол. Також передбачають проведення комбінованої терапії, тобто терапії, при якій введення гемцитабінового ефіру або аміду даного винаходу здійснюють у сполученні з іншими видами лікування, наприклад, хірургією, опроміненням і хіміотерапією. Наприклад, для переважного лікування пухлин мозку застосовують сполучення хірургічного лікування і лікування гемцитабіновим ефіром або амідом цього винаходу за допомогою системного або місцевого введення.