Заміщені бензоксазоли та їх аналоги як естрогенні агенти

1. Сполука формули (II), що має структур у 2 (19) 1 3 83620 4 обов'язково заміщені гідроксилом, -CN, галогеном, і) 3-(6-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,2трифторалкілом з 1-6 атомів вуглецю, трифторалдіол, кокси з 1-6 атомів вуглецю, -COR 5, -CO 2R5, -NO2, j) 4-(6-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,2CONR5R6, NR5R6 або -N(R5)COR 6; діол, R5, R6, кожний незалежно, означають водень, алk) 2-(3-хлор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-6кіл з 1-6 атомів вуглецю або арил з 6-10 атомів ол, вуглецю; l) 4-(5-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,3Х означає О, S або NR7; діол, R7 означає водень, алкіл з 1-6 атомів вуглецю, m) 4-(6-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,3арил з 6-10 атомів вуглецю, -COR5 , -CO2R5 або діол, SO2R5; n) 6-хлор-2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-1,3або її фармацевтично прийнятна сіль. бензоксазол-5-ол, 2. Сполука за п. 1, де Х означає О. о) 6-бром-2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-1,33. Сполука за п. 1 або 2, де R1 означає алкеніл з 2бензоксазол-5-ол, 3 атомів вуглецю, який необов'язково заміщений р) 6-хлор-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5гідроксилом, -CN, галогеном, трифторалкілом з 1-6 ол, атомів вуглецю, трифторалкокси з 1-6 атомів вугq) 5-хлор-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-6лецю, -COR5, -CO2R5, -NO 2, CONR5R6, NR5R6 або ол, N(R5)COR 6. r) 7-бром-2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-1,34. Сполука за п. 1, якою є 2-(3-фтор-4бензоксазол-5-ол, гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-5-ол, або її s) 7-бром-2-(2-фтор-4-гідроксифеніл)-1,3фармацевтично прийнятна сіль. бензоксазол-5-ол, 5. Сполука за п. 1, якою є 2-(2-фтор-4t) 7-бром-2-(2,3-дифтор-4-гідроксифеніл)-1,3гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-5-ол, або її бензоксазол-5-ол, фармацевтично прийнятна сіль. u) 2-(4-гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-56. Сполука за п. 1, якою є 2-(2,3-дифтор-4ол, гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-5-ол, або її v) 7-(1,2-диброметил)-2-(4-гідроксифеніл)-1,3фармацевтично прийнятна сіль. бензоксазол-5-ол, 7. Сполука за п. 1, якою є 4-бром-2-(3-фтор-4w) 7-(1-бромвініл)-2-(4-гідроксифеніл)-1,3гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-5-ол, або її бензоксазол-5-ол, фармацевтично прийнятна сіль. х) 7-етиніл-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-58. Сполука за п. 1, якою є 4,6-дибром-2-(3-фтор-4ол, гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-5-ол, або її у) 2-(4-гідроксифеніл)-7-пропіл-1,3-бензоксазол-5фармацевтично прийнятна сіль. ол, 9. Сполука за п. 1, якою є 7-(1-бромвініл)-2-(2z) 7-бутил-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5фтор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5-ол, або її ол, фармацевтично прийнятна сіль. аа) 7-циклопентил-2-(4-гідроксифеніл)-1,310. Сполука за п. 1, якою є 7-(1-бромвініл)-2-(2,3бензоксазол-5-ол, дифтор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5-ол, bb) етил 5-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-1,3або її фармацевтично прийнятна сіль. бензоксазол-7-карбоксилат, 11. Сполука за п. 1, якою є 7-аліл-2-(3-фтор-4сс) 2-(4-гідроксифеніл)-7-феніл-1,3-бензоксазол-5гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5-ол, або її фарол, мацевтично прийнятна сіль. dd) 2-(4-гідроксифеніл)-7-метокси-1,3-бензоксазол12. Сполука за п. 1, якою є 2-(3,5-дифтор-45-ол, гідроксифеніл)-7-вініл-1,3-бензоксазол-5-ол, або її ее) 7-етил-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5фармацевтично прийнятна сіль. ол, 13. Сполука за п. 1, якою є 2-(3-фтор-4ff) 7-етил-2-(2-етил-4-гідроксифеніл)-1,3гідроксифеніл)-7-(1-фторвініл)-1,3-бензоксазол-5бензоксазол-5-ол, ол, або її фармацевтично прийнятна сіль. gg) 5-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол14. Сполука, якою є: 7-карбальдегід, a) 2-(5-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,4hh) 7-(гідроксиметил)-2-(4-гідроксифеніл)-1,3діол, бензоксазол-5-ол, b) 3-(5-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,2іі) 7-(бромметил)-2-(4-гідроксифеніл)-1,3діол, бензоксазол-5-ол, c) 2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5jj) [5-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазолол, 7-іл]ацетонітрил, d) 2-(3-хлор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5kk) 7-(1-гідрокси-1-метилетил)-2-(4-гідроксифеніл)ол, 1,3-бензоксазол-5-ол], e) 2-(2-хлор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-5ll) 2-(4-гідроксифеніл)-7-ізопропеніл-1,3ол, бензоксазол-5-ол, f) 2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-1,3-бензоксазол-6mm) 2-(4-гідроксифеніл)-7-ізопропіл-1,3ол, бензоксазол-5-ол, g) 2-(3-трет-бутил-4-гідроксифеніл)-1,3nn) 7-бром-2-(4-гідрокси-3-(трифторметил)феніл)бензоксазол-6-ол, 1,3-бензоксазол-5-ол, h) 2-(6-гідрокси-1,3-бензоксазол-2-іл)бензол-1,4оо) 7-(2-фурил)-2-(4-гідроксифеніл)-1,3діол, бензоксазол-5-ол, 5 83620 6 рр) 2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-7-(2-фурил)-1,3дять ефективну кількість сполуки за будь-яким з бензоксазол-5-ол, пп. 1-13. qq) 2-(4-гідроксифеніл)-7-тієн-2-іл-1,3-бензоксазол22. Спосіб лікування або інгібування вазомоторних 5-ол, симптомів у ссавця, який потребує цього, що хараrr) 2-(4-гідроксифеніл)-7-(1,3-тіазол-2-іл)-1,3ктеризується тим, що вказаному ссавцю вводять бензоксазол-5-ол, ефективну кількість сполуки за будь-яким з пп. 1ss) 2-(3-фтор-4-гідроксифеніл)-5-гідрокси-1,313. бензоксазол-7-карбонітрил, 23. Спосіб інгібування зачаття у ссавця, який поtt) 4-бром-2-(4-гідроксифеніл)-7-метокси-1,3требує цього, що характеризується тим, що вказабензоксазол-5-ол, ному ссавцю вводять ефективну кількість сполуки uu) 4,6-дибром-2-(4-гідроксифеніл)-7-метокси-1,3за будь-яким з пп. 1-13. бензоксазол-5-ол, 24. Спосіб лікування або інгібування артриту у vv) 7-бром-2-(3,5-дифтор-4-гідроксифеніл)-1,3ссавця, який потребує цього, що характеризується бензоксазол-5-ол, тим, що вказаному ссавцю вводять ефективну або її фармацевтично прийнятна сіль. кількість сполуки за будь-яким з пп. 1-13. 15. Спосіб лікування або інгібування простатиту 25. Спосіб за п. 24, де артритом є ревматоїдний або інтерстиціального циститу у ссавця, який поартрит, остеоартрит або спондилоартропатії. требує цього, що характеризується тим, що вказа26. Спосіб лікування або інгібування опухання або ному ссавцю вводять ефективну кількість сполуки ерозії суглобів, або лікування або інгібування ураза будь-яким з пп. 1-13. ження суглоба після артроскопічних або хірургіч16. Спосіб лікування або інгібування запальної них процедур у ссавця, який потребує цього, що хвороби кишечнику, хвороби Крона, виразкового характеризується тим, що вказаному ссавцю ввопроктиту або коліту у ссавця, який потребує цього, дять ефективну кількість сполуки за будь-яким з що характеризується тим, що вказаному ссавцю пп. 1-13. вводять ефективну кількість сполуки за будь-яким 27. Спосіб лікування або інгібування псоріазу або з пп. 1-13. дерматиту у ссавця, який потребує цього, що ха17. Спосіб лікування або інгібування гіпертрофії рактеризується тим, що вказаному ссавцю вводять простати, лейоміоми матки, раку молочної залози, ефективну кількість сполуки за будь-яким з пп. 1внутрішньоматкового раку, синдрому полікістозно13. го яєчника, внутрішньоматкових поліпів, доброякі28. Спосіб лікування або інгібування ішемії, репесної хвороби молочної залози, аденоміозу, раку рфузійного ураження, астми, плевриту, розсіяного яєчників, меланоми, раку простати, раку товстої склерозу, системного червоного вовчака, увеїту, кишки, гліоми або астіобластоми у ссавця, який сепсису, геморагічного шоку або діабету типу II у потребує цього, що характеризується тим, що вкассавця, який потребує цього, що характеризується заному ссавцю вводять ефективну кількість сполутим, що вказаному ссавцю вводять ефективну ки за будь-яким з пп. 1-13. кількість сполуки за будь-яким з пп. 1-13. 18. Спосіб зниження рівнів вмісту холестерину, 29. Спосіб лікування або інгібування ендометріозу тригліцеридів, Lp(a) або LDL; інгібування або лікуу ссавця, який потребує цього, що характеризуєтьвання гіперхолестеринемії, гіперліпідемії, серцевося тим, що вказаному ссавцю вводять ефективну судинної хвороби, атеросклерозу, гіпертензії, хвокількість сполуки за будь-яким з пп. 1-13. роби периферичних судин, рестенозу або вазос30. Фармацевтична композиція, що містить сполупазму, або інгібування ушкодження стінок судин ку за будь-яким з пп. 1-13 і фармацевтичний носій. від клітинних випадків, що ведуть до імуноопосе31. Спосіб лікування або інгібування запальної редкованого судинного ураження, у ссавця, який хвороби кишечнику у ссавця, який потребує цього, потребує цього, що характеризується тим, що вкащо характеризується тим, що вказаному ссавцю заному ссавцю вводять ефективну кількість сполувводять ефективну кількість селективного відноски за будь-яким з пп. 1-13. но ER-b ліганду, де спорідненість зв'язування се19. Спосіб поліпшення пізнавальної здатності або лективного відносно ER-b ліганду з ER-b щонайнейрозахисту, або лікування або інгібування стаменше приблизно у 20 разів більша, ніж його речого слабоумства, хвороби Альцгеймера, зниспорідненість зв'язування з ER-a, і селективний ження пізнавальної здатності, удар у, тривоги або відносно ER-b ліганд являє собою сполуку за будьнейродегенеративних розладів у ссавця, який пояким з пп. 1-14. требує цього, що характеризується тим, що вказа32. Спосіб за п. 31, де запальною хворобою кишеному ссавцю вводять ефективну кількість сполуки чнику є хвороба Крона, виразковий коліт, недетеза будь-яким з пп. 1-13. рмінантний коліт, інфекційний коліт або виразко20. Спосіб лікування або інгібування хворобливих вий проктит. станів, що індукуються вільними радикалами, у 33. Спосіб за п. 32, де спорідненість зв'язування ссавця, який потребує цього, що характеризується селективного відносно ER-b ліганду з ER-b щотим, що вказаному ссавцю вводять ефективну найменше приблизно у 50 разів більша, ніж його кількість сполуки за будь-яким з пп. 1-13. спорідненість зв'язування з ER-a. 21. Спосіб лікування або інгібування вагінальної 34. Спосіб за п. 33, де селективний відносно ER-b або вульварної атрофії, атрофічного вагініту, вагіліганд викликає збільшення маси вологої матки, нальної сухості, пруриту, диспареунії, дизурії, часяке менше ніж близько 10 % від того, яке спостерітого сечовипускання, нетримання сечі, інфекції гається для максимально ефективної дози 17bсечових шляхів у ссавця, який потребує цього, що естрадіолу у стандартній фармакологічній тестхарактеризується тим, що вказаному ссавцю вво 7 83620 8 процедурі, що вимірює утеротрофічн у активність, і найменше приблизно у 50 разів більша, ніж його селективний відносно ER-b ліганд викликає збільспорідненість зв'язування з ER-a. шення mRNA казеїнкінази II, яке менше ніж близь43. Спосіб лікування або інгібування ендометріозу ко 10 % від того, яке спостерігається для максимау ссавця, який потребує цього, що характеризується тим, що вказаному ссавцю вводять ефективну льно ефективної дози 17b-естрадіолу у стандартній фармакологічній тест-процедурі, що кількість селективного відносно ER-b ліганду, де вимірює мамотрофічну активність. спорідненість зв'язування селективного відносно 35. Спосіб за п. 34, де селективний відносно ER-b ER-b ліганду з ER-b щонайменше приблизно у 20 ліганд не збільшує значно (р>0,05) масу вологої разів більша, ніж його спорідненість зв'язування з матки у порівнянні з контролем, тобто позбавлеER-a, і селективний відносно ER-b ліганд являє ний утеротрофічної активності, і не збільшує значсобою сполуку за будь-яким з пп. 1-14. но (р>0,05) mRNA казеїнкінази II у порівнянні з 44. Спосіб за п. 43, де спорідненість зв'язування контролем, тобто позбавлений мамотрофічної селективного відносно ER-b ліганду з ER-b щоактивності. найменше приблизно у 50 разів більша, ніж його 36. Спосіб лікування або інгібування артриту у спорідненість зв'язування з ER-a. ссавця, який потребує цього, що характеризується 45. Спосіб за п. 44, де селективний відносно ER-b тим, що вказаному ссавцю вводять ефективну ліганд викликає збільшення маси вологої матки, кількість неутеротрофічного немамотрофічного яке менше ніж близько 10 % від того, що спостеріселективного відносно ER-b ліганду, де споріднегається для максимально ефективної дози 17bність зв'язування селективного відносно ER-b лігаестрадіолу у стандартній фармакологічній тестнду з ER-b щонайменше приблизно у 20 разів біпроцедурі, що вимірює утеротрофічн у активність, і льша, ніж його спорідненість зв'язування з ER-a, і селективний відносно ER-b ліганд викликає збільселективний відносно ER-b ліганд являє собою шення mRNA казеїнкінази II, яке менше ніж близьсполуку за будь-яким з пп. 1-14. ко 10 % від того, що спостерігається для максима37. Спосіб за п. 36, де артритом є ревматоїдний льно ефективної дози 17b-естрадіолу у артрит, остеоартрит або спондилоартропатії. стандартній фармакологічній тест-процедурі, що 38. Спосіб за п. 37, де спорідненість зв'язування вимірює мамотрофічну активність. селективного відносно ER-b ліганду з ER-b що46. Спосіб за п. 45, де селективний відносно ER-b найменше приблизно у 50 разів більша, ніж його ліганд не збільшує значно (р>0,05) масу вологої спорідненість зв'язування з ER-a. матки у порівнянні з контролем, тобто позбавле39. Спосіб за п. 38, де селективний відносно ER-b ний утеротрофічної активності, і не збільшує значліганд викликає збільшення маси вологої матки, но (р>0,05) mRNA казеїнкінази II у порівнянні з яке менше ніж близько 10 % від того, що спостеріконтролем, тобто позбавлений мамотрофічної активності. гається для максимально ефективної дози 17b47. Спосіб одержання сполуки за будь-яким з естрадіолу у стандартній фармакологічній тестпп. 1-13, що містить одне з наступного: процедурі, що вимірює утеротрофічн у активність, і а) проводять взаємодію сполуки формули селективний відносно ER-b ліганд викликає збільR 2a шення mRNA казеїнкінази II, яке менше ніж близьHO ко 10 % від того, що спостерігається для максимаNH 2 льно ефективної дози 17b-естрадіолу у R2 стандартній фармакологічній тест-процедурі, що X вимірює мамотрофічну активність. H 40. Спосіб за п. 39, де селективний відносно ER-b R1 , ліганд не збільшує значно (р>0,05) масу вологої де R1, R2, R2a і X є такими, як визначено у п. 1, зі матки у порівнянні з контролем, тобто позбавлесполукою формули ний утеротрофічної активності, і не збільшує значF но (р>0,05) mRNA казеїнкінази II у порівнянні з O контролем, тобто позбавлений мамотрофічної OH активності. R 3a 41. Спосіб лікування або інгібування опухання або Y ерозії суглобів, або лікування або інгібування ураR3 , ження суглоба після артроскопічних або хірургічде R3 і R3a є такими, як визначено у п. 1, і Y ознаних процедур у ссавця, який потребує цього, що чає галоген, -ОН або алкокси з 1-6 атомів вуглецю; характеризується тим, що вказаному ссавцю ввоабо дять ефективну кількість неутеротрофічного неb) проводять перетворення сполуки формули II, мамотрофічного селективного відносно ER-b лігаяка визначена у п. 1, на її фармацевтично прийнянду, де спорідненість зв'язування селективного тну сіль; відносно ER-b ліганду з ER-b щонайменше приабо близно у 20 разів більша, ніж його спорідненість c) проводять розділення ізомерної суміші сполук зв'язування з ER-a, і селективний відносно ER-b формули II, щоб ізолювати енантіомер сполуки ліганд являє собою сполуку за будь-яким з пп. 1формули II або її фармацевтично прийнятної солі. 14. 42. Спосіб за п. 41, де спорідненість зв'язування селективного відносно ER-b ліганду з ER-b що 9 83620 Даний винахід відноситься до заміщених бензоксазолів, які можуть застосовуватися як естрогенні агенти. Плейотропні ефекти естрогенів у тканинах ссавців одержали хороше документальне підтвердження і у наш час визнано, що естрогени впливають на багато систем органів [Mendelsohn and Karas, New England Journal of Medicine 340: 18011811 (1999), Epperson, et al., Psychosomatic Medicine 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 11551166 (1999), Monk and Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1-10 (2000), Hum and Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking, et al., Zeitschrift fur Kardiologie 89: 442-453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292-304 (2001)]. Естрогени можуть здійснювати впливи на тканини різними шляхами, і найбільш добре охарактеризованим механізмом дії є їх взаємодія з естрогенними рецепторами, що веде до альтерацій у генній транскрипції. Естрогенні рецептори є лігандактивованими факторами транскрипції і належать до надсімейства нуклеарних гормональних рецепторів. До інших членів вказаного сімейства відносяться рецептори прогестерону, андрогену, глюкокортикостероїду та мінералокортикоїду. Під дією зв'язувального ліганду вказані рецептори димеризуються і можуть активувати генну транскрипцію або безпосереднім зв'язуванням зі специфічними послідовностями DNA (відомими як чутливі елементи), або шляхом взаємодії з іншими факторами транскрипції (такими як АРІ), які, у свою чергу, зв'язуються безпосередньо зі специфічними послідовностями DNA [Moggs and Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation, p.351-361 (2000)]. Клас "корегуляторних" протеїнів, які можуть також взаємодіяти з лігандзв'язувальним рецептором і далі модулювати його транскрипційну активність [McKenna, et al., Endocrine Reviews 20: 321-344 (1999)]. Було також показано, що естрогенні рецептори можуть пригнічувати NFkB-опосередковувану транскрипцію як залежним від ліганду, так і незалежним чином [Quaedackers, et al., Endocrinology 142: 11561166 (2001), Bhat, et al., Journal of Sreroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233-240 (1998), Pelzer, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153-7 (2001)]. Естрогенні рецептори також можуть бути активовані фосфорилюванням. Дане фосфорилювання опосередковується ростовими факторами, такими як EGF, і викликає зміни у генній транскрипції за відсутності ліганду [Moggs and Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)]. Менш добре охарактеризовані механізми, за допомогою яких естрогени можуть впливати на клітини, - це через так званий мембранний рецептор. Існування такого рецептора є спірним, але 10 документально добре підтверджено, що естрогени можуть викликати дуже швидкі негеномні відгуки від клітин. Молекулярна суть, що відповідає за трансдукцію вказаних ефектів, оста точно не виділена, але є підстави стверджувати, що вона щонайменше відноситься до нуклеарних форм естрогенних рецепторів [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinolody & Metabolism 10: 374-377(1999)]. На даний момент відкрито два естрогенних рецептори. Перший естрогенний рецептор клонований близько 15 років тому і у наш час згадується як ERa [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)]. Друга форма естрогенного рецептора виявлена порівняно нещодавно і названа ERb [Kuiper, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925-5930 (1996)]. Початкова робота по ERb була сфокусована на визначенні його спорідненості з різноманітними лігандами і, дійсно, були виявлені деякі відмінності з ERa. Тканинний розподіл ERb був добре картований на гризунах, і він не співпадає з ERa. Тканини, такі як матка мишей і щурів, експресують переважно ERa, тоді як легеня мишей і щурів експресує переважно ERb [Couse, et al., Endocrinolody 138: 4613-4621 (1997), Kuiper, et al., Endocrinolody 138: 863-870 (1997)]. Навіть всередині одного і того ж органу розподіл ERa і ERb може бути розмежований. Наприклад, в яєчнику мишей ERb високо експресується у зернистих клітинах, і ERa обмежується оболонковими клітинами і клітинами, що відносяться до строми, [Sar and Welsch, Endocrinolody 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick, et al., Endocrinolody 140: 2581-2591 (1999)]. Однак є приклади, де рецептори спільно екпресуються, і є підстава, виходячи з досліджень in vitro, вважати, що ERa і ERb можуть утворювати гетеродимери [Cowley, et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)]. Була описана велика кількість сполук, які або стимулюють, або блокують активність 17bестрадіолу. Сполуки, що мають приблизно такі ж біологічні ефекти, як 17b-естрадіол, найбільш сильний ендогенний естроген, названі "агоністами естрогенного рецептора". Ті ж, які у поєднанні з 17b-естрадіолом блокують його ефекти, названі "антагоністами естрогенного рецептора". У реальності ж існує континіум між активністю агоніста естрогенного рецептора і антагоніста естрогенного рецептора, і, насправді, деякі сполуки поводяться як агоністи естрогенного рецептора у деяких тканинах і як антагоністи естрогенного рецептора в інших. Такі сполуки зі змішаною активністю названі селективними модуляторами естрогенного рецептора (SERMS) і є терапевтично застосовними агентами (напр. EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S 10-Sl 5 (2000), Goldstein, et al., Human Reproduction Update 6: 212-224 (2000)]. Точна причина, чому одна і та ж сполука може мати специфічні відносно клітин ефекти, не з'ясована, але відмінності у конформа 11 83620 12 ції рецептора і/або серед корегуляторних протеїнів трифторалкіл з 1-6 атомами вуглецю або трифтопідтверджені. ралкокси з 1-6 атомами вуглецю, де групи алкіл Відомо, що на якийсь час естрогенні рецептоабо алкеніл необов'язково заміщені гідроксилом, ри приймають різні конформації, коли зв'язуються CN, галогеном, трифторалкілом з 1-6 атомами з лігандами. Однак наслідок і тонка відмінність вуглецю, трифторалкокси з 1-6 атомами вуглецю, вказаних змін виявлені тільки нещодавно. ТривиCOR5, -CO2R5, -NO2 , CONR5R6, NR5R6 або N(R5)COR 6; мірні структури ERa і ERb були розділені спільною кристалізацією з різними лігандами і чітко показаR3, R3a і R4 , кожний незалежно, означають водень, алкіл з 1-6 атомами вуглецю, алкеніл з 2-7 ли репозиціонування спіралі 12 у присутності антаатомами вуглецю, алкініл з 2-7 атомами вуглецю, гоніста естрогенного рецептора, яке стерично галоген, алкокси з 1-4 атомами вуглецю, трифтоутруднює послідовності протешу, необхідні для ралкіл з 1-6 атомами вуглецю або трифторалкокси взаємодії рецептор-корегуляторний протеїн [Pike, et аі, Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau, et al., Cell з 1-6 атомами вуглецю, де гр упи алкіл або алкеніл необов'язково заміщені гідроксилом, -CN5 галоге95: 927-937 (1998)]. На додаток, методика демонном, трифторалкілом з 1-6 атомами вуглецю, тристрації фагів була застосована для ідентифікації фторалкокси з 1-6 атомами вуглецю, -COR5, пептидів, які взаємодіють з естрогенними рецепCO2R5, -NO 2, CONR 5R6 , NR5R6 або N(R 5)COR 6; торами у присутності різних лігандів [Paige, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of R5, R6, кожний незалежно, означають водень, алкіл з 1-6 атомами вуглецю, арил з 6-10 атомами the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. вуглецю; Наприклад, був ідентифікований пептид, який відX означає O, S або NR7; різняє ERb, зв'язаний з повними агоністами естроR7 означає водень, алкіл з 1-6 атомами вуглегенного рецептора 17b-естрадіолом і діетилстилцю, арил з 6-10 атомами вуглецю, -COR5, -CO2R5 бестеролом. Був виявлений інший пептид, який або -SO2R5; відрізняє кломіфен, зв'язаний з ERa і ERb. Ці дані або до її фармацевтично прийнятної солі. показують, що кожний ліганд потенційно розташоФармацевтично прийнятні солі можуть бути вує рецептор в унікальній і непередбачуваній конутворені з органічних і неорганічних кислот, наприформації, яка, ймовірно, має біологічні активності, клад, оцтової, пропіонової, молочної, лимонної, що відрізняються. винної, бурштинової, фумарової, малеїнової, маЯк згадувалося вище, естрогени впливають на лонової, мигдалевої, яблучної, фталевої, хлорисзахисні біологічні процеси. На додаток, коли родотоводневої, бромистоводневої, фосфорної, азові відмінності описані (напр.., частота захворютної, сірчаної, метансульфонової, вань, відгуки на виклик і т.п.), можливо, що пояснафталінсульфонової, бензолсульфонової, толуонення передбачає відмінність у рівнях вмісту лсульфонової, камфорсульфонової і подібних віестрогену між чоловічими і жіночими особинами. домих прийнятних кислот, коли сполука за винаВинахід відноситься до естрогенної сполуки ходом містить групу основного характеру. Солі формули (І), що має стр уктуру також можуть бути утворені з органічних і неорганічних основ, такі як солі лужних металів (наприклад, натрію, літію або калію), солі лужноземельних металів, солі амонію, солі алкіламонію, що містять 1-6 атомів вуглецю або солі діалкіламонію, що містять 1-6 атомів вуглецю у кожній алкілгрупі, і солі триалкіламонію, що містять 1-6 атомів вуглецю у кожній алкілгрупі, коли сполука за винаходом містить кислотну груп у. де R1 означає водень, гідроксил, галоген, алкіл Терміни алкіл, алкеніл і алкініл включають груз 1-6 атомами вуглецю, три фторалкіл з 1-6 атомапи як з розгалуженим, так і з прямим ланцюгом. ми вуглецю, циклоалкіл з 3-8 атомами вуглецю, Приклади включають метил, етил, пропіл, бутил, алкокси з 1-6 атомами вуглецю, трифторалкокси з ізопропіл, втор-бутил, трет-бутил, вініл, аліл, аце1-6 атомами вуглецю, тіоалкіл з 1-6 атомами вугтилен, 1-метилвініл і тому подібне. Коли групи аллецю, сульфоксоалкіл з 1-6 атомами вуглецю, сукіл- і алкенілзаміщені, вони звичайно можуть бути льфоноалкіл з 1-6 атомами вуглецю, арил з 6-10 моно-, ди-, три- і перзаміщеними. Приклади для атомами вуглецю, 5- або 6-членне гетероциклічне галогензамісника включають 1-бромвініл, 1кільце, що має від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з фторвініл, 1,2-дифторвініл, 2,2-дифторвініл, 1,2,2O, N або S, -NO2, -NR5R6, -N(R5)COR 6, -CN, трифторвініл, 1,2-диброметан, 1,2-дифторетан, 1CHFCN, -CF2CN, алкініл з 2-7 атомами вуглецю фтор-2-брометан, CF2CF3, CF2CF 2CF3 і тому подіабо алкеніл з 2-7 атомами вуглецю, де гр упи алкіл бне. Термін галоген включає бром, хлор, фтор і або алкеніл необов'язково заміщені гідроксилом, йод. Термін арил означає феніл, 1-нафтил або 2CN, галогеном, трифторалкілом з 1-6 атомами нафтил. Переважні 5-6-членні гетероциклічні кільвуглецю, трифторалкокси з 1-6 атомами вуглецю, ця включають фуран, тіофен, пірол, ізопірол, піраCOR5, -CO2R5, -NO2 , CONR5R6, NR5R6 або зол, імідазол, триазол, дитіол, оксатіол, ізоксазол, N(R5)COR 6; оксазол, тіазол, ізотіазолем, оксадіазол, фуразан, R2 і R2a, кожний незалежно, означають водень, оксатриазол, діоксазол, оксатіазол, тетразол, пігідроксил, галоген, алкіл з 1-6 атомами вуглецю, ран, піридин, піридазин, піримідин, піразин, триалкокси з 1-4 атомами вуглецю, алкеніл з 2-7 атоазин, оксазин, оксатіазин або оксадіазин. Більш мами вуглецю або алкініл з 2-7 атомами вуглецю, 13 83620 14 переважно, коли гетероциклічним кільцем є фуВикористовуваний відповідно до даного винаран, тіофен або тіазол. ходу термін "селективний відносно ERb ліганд" Зі сполук за даним винаходом переважна споозначає, що спорідненість зв'язування (яку вимілука формули (І), яка має структур у рюють по IC50, де IC50 17b-естрадіолу дорівнює не більш ніж 3-разовій диференті між ERa і ERb) ліганду з ERb щонайменше приблизно у 10 разів більше ніж його спорідненість зв'язування з ERa у стандартній фармакологічній тест-процедурі, яка служить для вимірювання величин спорідненості зв'язування з ERa і ERb. Переважно, коли селективний відносно ERb ліганд матиме спорідненість зв'язування з ERb, яка щонайменше приблизно у 20 разів більше, ніж його спорідненість зв'язування з ERa. Більш переважно, коли селективний відноде R1 означає алкеніл з 2-7 атомами вуглецю, сно ERb ліганд матиме спорідненість зв'язування з де група алкеніл необов'язково заміщена гідроксиERb, яка щонайменше приблизно у 50 разів більлом, -CN, галогеном, трифторалкілом з 1-6 атомаше, ніж його спорідненість зв'язування з ERa. Доми вуглецю, трифторалкокси з 1-6 атомами вугледатково переважно, коли селективний відносно цю, -COR 5, -CO 2Rs, -NO2, CONR5R6 , NR5R6 або ERb ліганд є неутеротрофічним і немамотрофічN(R5)COR 6; ним. R2 і R2a, кожний незалежно, означають водень, Використовуваний відповідно до даного винагідроксил, галоген, алкіл з 1-6 атомами вуглецю, ходу термін "неутеротрофічний" означає збільалкокси з 1-4 атомами вуглецю, алкеніл з 2-7 атошення маси вологої матки у стандартній фармакомами вуглецю, алкініл з 2-7 атомами вуглецю, логічній тест-процедурі на менш ніж близько 50% трифторалкіл з 1-6 атомами вуглецю або трифтовід збільшення маси матки, що спостерігається ралкокси з 1-6 атомами вуглецю, де групи алкіл, для максимально ефективної дози 17b-естрадіолу алкеніл або алкініл необов'язково заміщені гідроабо 17a-етиніл-17b-естрадіолу у такій же процедуксилом, -CN, галогеном, трифторалкілом з 1-6 рі. Переважно, щоб збільшення маси вологої мататомами вуглецю, три фторалкокси з 1-6 атомами ки було менше ніж близько 25% від того, що сповуглецю, -COR5, -CO 2R5, -NO 2, CONR5R6, NR5R6 стерігається для естрадіолу і більш переважно, або N(R5)COR 6; щоб збільшення маси вологої матки було менше R3 і R3a, кожний незалежно, означають водень, ніж близько 10% від того, що спостерігається для алкіл з 1-6 атомами вуглецю, алкеніл з 2-7 атомаестрадіолу. Найбільш переважно, щоб неутеротми вуглецю, алкініл з 2-7 атомами вуглецю, галорофічний селективний відносно ERb ліганд не збіген, алкокси з 1-4 атомами вуглецю, трифторалкіл льшував помітно вологу масу матки (р>0,05) у поз 1-6 атомами вуглецю або трифторалкокси з 1-6 рівнянні з контролем, який не має утеротрофічної атомами вуглецю, де групи алкіл, алкеніл або алактивності (наприклад носій). кініл необов'язково заміщені гідроксилом, -CN, Використовуваний відповідно до даного винагалогеном, трифторалкілом з 1-6 атомами вуглеходу термін "немамотрофічний" означає формуцю, трифторалкокси з 1-6 атомами вуглецю, вання збільшення mRNA казеїн-кінази II у стандаCOR5, -CO2R5, -NO2 , CONR5R6, NR5R6 або ртній фармакологічній тест-процедурі менш ніж N(R5)COR 6; близько 50% від збільшення mRNA казеїн-кінази II, R5, R6, кожний незалежно, означають водень, що спостерігається для максимально ефективної алкіл з 1-6 атомами вуглецю, арил з 6-10 атомами дози 17b-естрадіолу або 17a-етиніл-17bвуглецю; естрадіолу у такій же процедурі. Переважно, щоб X означає О, S або NR7; збільшення mRNA казеїн-кінази II було менше ніж R7 означає водень, алкіл з 1-6 атомами вуглеблизько 25% від того, що спостерігається для естцю, арил з 6-10 атомами вуглецю, -COR5, -CO2R5 радіолу і більш переважно, щоб збільшення mRNA або -SO2R5; казеїн-кінази II було менше ніж близько 10% від або її фармацевтично прийнятна сіль. того, що спостерігається для естрадіолу. Найбільш Більш переважно, коли X означає O, і ще переважно, щоб немамотрофічний селективний більш переважно, коли X означає O і R1 означає відносно ERb ліганд не збільшував помітно mRNA алкеніл з 2-3 атомами вуглецю, який необов'язкоказеїн-кінази II (р>0,05) у порівнянні з контролем, во заміщений гідроксилом, -CN, галогеном, триякий позбавлений мамотрофічної активності (нафторалкілом з 1-6 атомами вуглецю, трифторалприклад носій).) кокси з 1-6 атомами вуглецю, -COR5, -CO2R5, -NO2, Винахід також відноситься до застосування CONR5R6, NR5R6 або -N(R5)COR 6. селективного відносно ERb ліганду у лікуванні або Використовуваний відповідно до даного винапригніченні артриту, запальної хвороби кишечнику ходу термін "забезпечення" по відношенню до зата ендометріозу. Більш конкретно, селективні відбезпечення сполуки або речовини, що охоплюєтьносно ERb ліганди застосовні у лікуванні або прися даним винаходом, означає або безпосередньо гніченні ревматоїдного артриту, остеоартриту або введення такої сполуки або речовини, або ввеспондилоартропатій і хвороби Крона, виразкового дення проліків, похідного або аналога, які будуть коліту, недетермінантного коліту, інфекційного утворювати ефективну кількість сполуки або речоколіту або виразкового проктиту. Даний винахід вини всередині організму. додатково відноситься до застосування селектив 15 83620 16 тним холодильником. Амід 3 перетворюють у феного відносно ERb ліганду у лікуванні або пригнінольний бензоксазол 5 шляхом обробки гідрохлоченні опухання або ерозії суглобів, або у лікуванні або пригніченні ураження суглоба після артроскоридом піридину при високій температурі (200°C). пічних або хірургічних процедур. Переважно, щоб селективний відносно ERb ліганд був би неутеротрофічним і немамотрофічним. Реагенти, що використовуються для одержання сполук за даним винаходом, можуть бути або комерційно доступні, або можуть бути одержані стандартними процедурами, описаними у літературі. В іншому аспекті даний винахід відноситься до способу одержання сполуки за винаходом, що містить одне з наступного: a) взаємодію сполуки формули де R1, R2 , R2S і X є такими, як визначено вище, зі сполукою формули де R3 і R3a є такими, як визначено вище, і Y означає галоген, -OH або алкокси з 1-6 атомами вуглецю; або b) перетворення сполуки формули (II), як визначено вище, в її фармацевтично прийнятну сіль; або c) розділення ізомерної суміші сполук формули (II), щоб ізолювати енантіомер сполуки формули (II) або її фармацевтично прийнятної солі. Сполуки за даним винаходом можуть бути одержані, наприклад відповідно до наступних схем синтезу (І-VIII) На схемі I, комерційно доступний диметоксіанілін 1 обробляють комерційно доступним бензоїлхлоридом 2 у присутності триетиламіну, щоб одержати амід 3. Необхідний бензоїлхлорид 2 також одержують з комерційно доступної бензойної кислоти 4 при кип'ятінні з тіонілхлоридом зі зворо На схемі II, комерційно доступний нітрофенол 6 піддають бромуванню Br2/NaOAc в оцтовій кислоті, щоб одержати бромфенол 7. Каталітичне гідрування бромфенолу 7 з використанням Ra-Ni в EtOAc дає анілін 8. Сполука аніліну 8 з бензоїлхлоридом 9 (комерційно доступним або одержаним з відповідної бензойної кислоти і тіонілхлориду) у присутності піридину дає амід-складний ефір 10. Перетворення сполуки 10 у бензоксазол 11 здійснюють у кислотних умовах (п-толуолсульфонова кислота) при високій температурі (150°C). Деметилування сполуки 11 трибромідом бору у ди хлорметані дає фенольний бензоксазол 12. На схемі III, анілін 8 перетворюють у бензоксазол 14 при обробці бензойною кислотою 13 і борною кислотою у п-ксилолі при високій температурі (150°C). Деметилування сполуки 14 трибромідом бору у дихлорметані дає фенольний бензоксазол 15. 17 83620 18 рметані або гідрохлориду піридину при високій На схемі IV, нітрування сполуки 16 азотною температурі (200°C), щоб одержати бензоксазол кислотою в оцтовій кислоті дає сполуку 17, яку 24. відновлюють воднем у присутності Ra-Ni, щоб одержати анілін 18. Анілін 18 перетворюють у бензоксазол 19 подібно до того, як описано на схемі II, за винятком того, що стадію деметилування здійснюють з гідрохлоридом піридину при високій температурі (200°C). На схемі V, гідроксильні групи бензоксазолу 20 захищають або як прості силіл-ефіри 21 (R3=Me3C(CH3)2Si), використовуючи третбутилдиметил-силілхлорид/імідазол/4диметиламінопіридин в N,N-диметилформаміді, або як складні ефіри 21 (R3=CH3CO), використовуючи оцтовий ангідрид/4-диметиламінопіридин у дихлорметані. Бензоксазоли 20 і 21 з'єднують з різними реагентами олова (такими як трибутил(вініл)олово, трибутил(аліл)олово, трибутил(2фурил)олово), бороновими кислотами або хлоридами цинку у присутності паладієвого каталізатора [наприклад, дихлор-біс(три-отолілфосфін)паладію(ll) або тетракіс(трифенілфосфін)паладію(0)] у п-ксилолі, толуолі, тетрагідрофурані, диметоксиметані або 1,2диметоксіетані у присутності основи (наприклад Na2CO3) Для реакції сполуки з борною кислотою при температурах у межах від 20°C до 150°C, щоб одержати бензоксазоли 22 і 23. Видалення захисних груп простого силілового ефіру зі сполуки 22 (R3=Me3C(CH3)2Si) за допомогою фтористоводневої кислоти (48мас.% у воді) або фториду тетрабутиламонію дає бензоксазол 24. Омилення сполуки 22 (R3=CH3CO) з використанням карбонату калію у діоксані дає бензоксазол 24. Бензоксазол 23 (R=CH 3) піддають деметилуванню з використанням триброміду бору у ди хло На схемі VI, бензоксазол 24 обробляють нбутиллітієм при низьких температурах (-78°C) з подальшим додаванням електрофілу (наприклад, CNCO2Et, Ph(CH3)NCHO, EtI і т.п.), щоб одержати сполуку 25. Видалення захисних груп сполуки 25 трибромідом бору (R=CH3) або фторидом тетрабутиламонію (R=Me 3C(CH3)2Si) дає бензоксазол 26 [R=CHO, CO2Et, CH 2CH3, С(СН3)2ОН]. Третинний спирт 25 (R=C(CH 3)OH) обробляють гідрохлоридом піридину при високій температурі (200°C), щоб одержати 1-метил-вінілбензоксазол 27. Відновлення сполуки 27 H2/Pd-C дає аналог ізопропілу 28. На схемі VII, відновлення бензоксазолу 29 боргідридом натрію у метанолі дає спирт 30. Обробка спирту 30 трибромідом бору в CH2Cl2 протягом 1 години дає бензоксазол 31, тоді як тривала (18 годин) обробка дає бромід 32. Бромід 32 перетворюють в ацетонітрил 33 при обробці ціанідом ка 19 лію і 18-краун-6-простим диметилформаміді. 83620 20 ного ліганду. Дана тест-процедура забезпечує методологію визначення відносних величин спорідненості зв'язування для рецепторів ERa і ERb. Використовувана процедура стисло описана нижче. Одержання екстрактів рецептора для характеристики селективності зв'язування. Домени зв'язування ліганду, що звичайно визначаються тут як вся послідовність нижче по потоку від домену зв'язування DNA, одержують PCR, використовуючи cDNA повної довжини як матриці і праймери, що містять відповідні сайти рестрикції для субклонування, забезпечуючи у той же час відповідну рамку зчитування для експресії. Вказані матриці містять амінокислоти M250-V595 ERa людини [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)] і M214-O530 ERb людини [Ogawa, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 243: 122-6 (1998)]. ERb людини клонують в pET15b (Novagen, Madison WI) як фрагмент Ncol-BamH1, що несе С-кінцевий Flag tag. ERa людини клонують як ERb за винятком того, що додають N-кінцевий His tag. ПослідовносНа схемі VIII, бромбензоксазол 35 (R=CH3) ті всіх використовуваних конструктів перевіряють спочатку обробляють ціанідом міді(І) у ДМФ, щоб встановленням повної послідовності обох ниток. одержати відповідний арил-нітрил, який при оброКлітини BL21(DE3) використовують для ексбці трибромідом бору дає бензоксазол 36. Бензопресії протеїнів людини. Звичайно 10мл культури, ксазол 36 також одержують по другому шляху синвитриманої протягом ночі, використовують для тезу, де бромбензоксазол 35 обробляють ціанідом інокуляції 1л культури середовища LB, що містить цинку у присутності паладієвого каталізатора [на100мкг/мл ампіциліну. Після інкубації протягом приклад тетракіс(трифеніл-фосфін)паладію(0)], ночі при 37°С додають IPTG до кінцевої концентщоб одержати відповідний арил-нітрил, який при рації 1мМ і продовжують інкубацію при 25°С продеметилуванні трибромідом бору дає бензоксазол тягом 2 годин. Клітини збирають центрифугуван36. Бензоксазол 35 (R=H) обробляють бромідом ням (1500хg) і осади промивають і повторно міді(І) і свіжоприготованим метоксидом натрію у суспендують в 100мл 50мМ Tris-Cl (pH 7,4), 150мМ ДМФ, щоб одержати метоксибензоксазол 37. БроNaCl. Клітини піддають лізису пропускання двічі мування бензоксазолу 37 N-бромсукцинімідом в через French прес при 12000фунтах на кв. дюйм. ацетонітрилі дає монобром-бензоксазол 38 (голоЛізат освітлюють центрифугуванням при 12000хg вний продукт) і дибромбензоксазол 39 (малий протягом 30 хвилин при 4°С і зберігають при продукт). 70°C. Стандартні фармакологічні тест-процедури Оцінка екстрактів відносно специфічного зв'ялегко доступні для визначення профілю активності зування [3Н]-естрадіолу. Фізіологічний розчин з даної випробовуваної сполуки. Наступне стисло фосфа тним буфером Dulbecco (Gibco, I х кінцева підсумовує деякі приклади тест-процедур і може концентрація), збагачений 1мМ EDTA використовключати дані для прикладів сполук за винаходом. вують як буфер для аналізу. Щоб оптимізувати Всі аналізи, за винятком аналізу зв'язування ракількість рецептора для використання в аналізі, діоактивного ліганду, можуть бути використані для [3Н]-17b-естрадіол (New England Nuclear; кінцева визначення активності сполук як агоністів або анконцентрація = 2нМ) ±0,6мкМ діетилстилбестролу і тагоністів естрогенного рецептора. Як правило, 100мкл різних розведень лізату E. coli додають у активність агоніста естрогенного рецептора вимікожну ямку високо зв'язувального маскованого рюють, порівнюючи активність сполуки з естрогетитраційного мікропланшету (EG&G Wallac). Кінном, вибраним для порівняння (наприклад таким цевий об'єм для аналізу дорівнює 120мкл, і концеяк 17b-естрадіол, 17a-етиніл, 17b-естрадіол, естнтрація DMSO£1%. Після інкубації при кімнатній рон, діетилстилбестерол і т.п.). Активність антаготемпературі протягом 5-18 годин незв'язаний маніста естрогенного рецептора звичайно вимірюють теріал відсмоктують і планшет промивають три шляхом спільної обробки випробовуваною сполурази приблизно 300мкл буфер у для аналізу. Після кою з естрогеном порівняння і порівняння резульпромивання в ямки додають 135мкл суміші для тату з результатом, одержаним тільки з естрогесцинтиляції (Optiphase Supermix, EG&G Wallac) і ном порівняння. Стандартні фармакологічні тестпланшет герметизують і стр ушують щонайменше 5 процедури для SERMS також наведені у [патентах хвилин, щоб змішати сцинтилянт з залишковим США 4418068 і 5998402, які таким чином залучені промивальним буфером. Зв'язану радіоактивність до цього за допомогою посилання]. оцінюють шляхом сцинтиляційного відліку рідини Оцінка величин спорідненості зв'язування з (EG&G Wallac Microbeta Plus). ERa і ERb Після визначення розведення кожного препаПриклади зразків за винаходом оцінюють за їх рату рецептора, яке забезпечує максимальне спездатністю конкурувати з 17b-естрадіолом за ERa і цифічне зв'язування, аналіз далі оптимізують виERb у звичайному аналізі зв'язування радіоактивефіром в N,N 21 83620 значенням IC50 неміченого 17b-естрадіолу, використовуючи різні розведення препарату рецептора. Кінцеве робоче розведення для кожного препарату рецептора вибирають таке, де IC50 неміченого 17b-естрадіолу дорівнює 2-4нМ. Процедура випробовування конкуренції при зв'язуванні ліганду. Випробовувані сполуки спочатку солюбілізують у DMSO, і кінцева концентрація DMSO в аналізі зв'язування дорівнює £1%. Вісім розведень кожної випробовуваної сполуки використовують як немічений конкурент для [3Н]-17bестрадіолу. Звичайно набір розведень сполуки випробовують одночасно на ERa і ERb людини. Результати наносять на графік як виміряний DPM проти концентрації випробовуваної сполуки. Для підбору кривої для реакції на дозу підбирають чотирипараметричну логістичну модель на перетворених вагових даних і визначають IC50 як концентрацію сполуки, що знижує максимальне зв'язування [3Н]-естрадіолу на 50%. Величини спорідненості зв'язування для ERa і ERb (які вимірюють за ІС50) для типових прикладів за винаходом показані у таблиці (1). Таблиця 1 Величини спорідненості зв'язування ER для типових сполук за винаходом Приклад 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 ERb IC50 (нМ) 140 963 66 239 59 39 1600 181 440 105 703 49 25 50 3 64 42 16 157 2 3 1 3 6 2 4 4 25 155 134 31 16 31 ERa IC50 (нМ) 720 5110 1570 5280 139 843 5000 2353 1500 2040 >5000 1227 190 902 82 1813 1210 464 2765 155 260 47 113 1217 227 474 409 1036 803 3080 352 196 352 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 22 14 15 11 79 102 190 235 6 95 59 13 84 59 1340 40 1042 399 142 82 166 135 313 97 366 26 52 64 93 201 1 3 1101 481 390 498 1010 7827 1300 411 9620 2557 537 655 2638 Не визначено 2975 5230 >5000 775 1200 1870 809 1980 1030 1340 1435 2668 559 1180 >10000 44 376 Результати, одержані у стандартній фармакологічній тест-процедурі, описаній вище, показують, що сполуки за даним винаходом зв'язують обидва підтипи естрогенного рецептора. Величини IC50 звичайно нижче для ERb, що вказує на те, що дані сполуки є лігандами селективними переважно відносно ERb, але все ще вважаються активними відносно ERa. Сполуки за даним винаходом будуть виявляти діапазон активності на підставі, щонайменше частково, їх профілів селективності спорідненості до рецептора. Оскільки сполуки за винаходом зв'язують ERb з більш високою спорідненістю, ніж ERa, вони можуть бути корисні при лікуванні або пригніченні хвороб, які можуть бути регульованими за допомогою ERb. Додатково, оскільки кожний комплекс рецептора з лігандом є унікальним і, отже, його взаємодія з різними корегуляторними протеїнами є унікальною, сполуки за даним винаходом будуть виявляти різні і непередбачувані активності в залежності від клітинного контексту. Наприклад, у деяких типах клітин можливо, що сполука буде поводитися як агоніст естрогенного рецептора, тоді як в інших тканинах як антагоніст естрогенного рецептора. Сполуки з такою активністю іноді можна віднести до SERM (селективних модуляторів естрогенного рецептора). На відміну від багатьох естрогенів, однак, багато SERM не викликають збільшень маси вологої матки. Дані сполуки є антиестрогенними у матці і можуть повністю антагонізувати трофічні ефекти агоністів естрогенного рецептора у тканині матки. 23 83620 24 Дані сполуки, однак, діють як агоністи естрогенноної 5-ЕКЕ-tk-люциферази в експериментальному го рецептора у кістковій, серцево-судинній і середовищі [середовище D-MEM/F без фенольноцентральній нервовій системах. Завдяки селектиго червоного, що містить 10% (об./об.) інактивовавному характеру даних сполук відносно тканин, ної теплом, десорбованої вугіллям фетальної тевони застосовні для лікування або пригнічення лячої сироватки, 1% (об./об.) пеніцилінухворобливих станів або синдромів у ссавців, які стрептоміцину, 2мМ glutaMax-1, 1мМ пірува ту навикликаються або асоціюються з недостатністю трію]. Ямки потім промивають один раз 150мкл естрогену (у конкретних тканинах, таких як кісткова експериментального середовища. І нарешті, клітиабо серцево-судинна) або з надлишком естрогену ни обробляють протягом 24 годин при 37°С у реп(у матці або молочних залозах). На додаток, сполікатах з 8ямок/обробка 150мкл/ямка носія (£0,1% луки за даним винаходом також мають можливість об./об. DMSO) або сполукою, яку розводять у поводитися як агоністи естрогенного рецептора на ³1000 разів в експериментальному середовищі. одному типі рецептора, у той же час виявляючи Початковий скринінг випробовуваних сполук себе як антагоністи естрогенного рецептора на здійснюють при разовій дозі 1мкМ, тобто випробоіншому. Наприклад, продемонстровано, що сполувують окремо (спосіб дії агоніста естрогенного ки можуть антагонізувати дію 17b-естрадіолу через рецептора) або у поєднанні з 0,1нМ 17bERb, виявляючи у той же час активність агоніста естрадіолом (EC80; спосіб дії антагоніста естрогенестрогенного рецептора з ERa [Sun, et al., ного рецептора). Кожний 96-ямковий планшет таEndocrinology 140: 800-804 (1999)]. Така активність кож містить контрольну гр упу носія (0,1% об./об. ERSAA (селективного агоніста-антагоніста естроDMSO) і контрольну групу агоніста естрогенного генного рецептора) забезпечує різну естрогенну рецептора (або 0,1, або 1нМ 17b-естрадіол). Ексактивність у даних серіях сполук. перименти реакції на дозу здійснюють у способах Регуляція mRNA металотіонеїну II дії або агоніста естрогенного рецептора і/або антаЕстрогени, діючи через ERb, але не ERa, могоніста естрогенного рецептора на активні сполуки жуть ап-регулювати рівні mRNA металотіонеїну II у при log збільшеннях від 10-14 до 10-5M. З цих криклітинах Saos-2, як описано Harris [Endocrinology вих реакції на дозу виробляють величини EC50 і 142: 645-652 (2001)]. Результати цієї тестIC50, відповідно. Остання ямка у кожній групі обропроцедури можуть бути об'єднані з результатами бки містить 5мкл 3х10-5M ICI-182780 (кінцева контест-процедури, описаної нижче (ERE-репортерна центрація 10-6M) як контроль антагоніста естротест-процедура), щоб створити профіль селективгенного рецептора. ності для сполук за даним винаходом [дивись таПісля обробки клітини піддають лізису на шейкож WO 00/37681]. Дані для типових сполук за викері протягом 15хв. з 25мкл/ямка IX реагенту лізинаходом показані у таблиці (2). су клітинної культури (Promega Corporation). Лізати клітин (20мкл) переносять на 96-ямковий планшет Таблиця 2 люмінометра і активність люциферази вимірюють у люмінометрі MicroLumat LB 96 P (EG & G Регуляція Berthold), використовуючи 100мкл/ямка субстрату mRNA металотіонеїну-ІІ у клітинах Saos-2 люциферази (Promega Corporation). За 1 секунду перед уприскуванням субстрату здійснюють вихідне вимірювання для кожної ямки. Після уприскуСполука Кратна регуляція вання субстрату активність люциферази вимірюПриклад 12 9,6 ють через 10 секунд після 1-секундної відстрочки. Приклад 14 12,4 Дані переносять з люмінометра у персональний Приклад 13 9,7 комп'ютер Macintosh і аналізують за допомогою програмного забезпечення JMP (Інститут SAS); Оцінка випробовуваної сполуки у ракових клідана програма віднімає вихідне зчитування з вимітинах молочної залози MCF-7 з використанням рювання люциферази для кожної ямки і потім виERE-репортерної тест-процедури значає середнє і стандартне відхилення для кожВихідні розчини випробовуваних сполук (звиної обробки. чайно 0,1M) готують в DMSO і потім розводять Дані по люциферазі піддають логарифмічному DMSO у 10-100 разів, щоб одержати робочі розчиперетворенню і оператор оцінки Huber M викорисни 1 або 10мМ. Ви хідні розчини в DMSO зберігатовують, щоб відсікти перетворені спостереження, ють або при 4°C (0,1M), або при -20°C (