Експрес-спосіб визначення токсичності наноматеріалів у розчинах in vitro з використанням сперматозоїдів великої рогатої худоби як тест-об’єкта

Реферат: Експрес-спосіб визначення токсичності наноматеріалів у розчинах in vitro з використанням сперматозоїдів великої рогатої худоби як тест-об'єкта включає приготування досліджуваного та контрольного зразків з подальшим визначенням величини індексу токсичності (It) на підставі відношення параметрів рухливості суспензії сперматозоїдів великої рогатої худоби (бика) в досліджуваному та контрольному зразках відповідно до методу оцінки небезпечної дії різних об'єктів у водних витяжках in vitro. Як досліджуваний об'єкт використовують наночастинки металів у розчинах та виключають водне екстрагування на етапі приготування досліджуваного зразка. UA 101308 U (12) UA 101308 U UA 101308 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме токсикології, та може бути використана для оцінки небезпеки наноматеріалів у розчинах, в тому числі, для працюючих в сфері нанотехнологій та населення. Для оцінки небезпеки нових матеріалів все більш широке застосування набувають так звані експрес-способи з використанням економічно доступних тест-об'єктів (культури біологічних тканин, бактерії, водорості на ін.), що дозволяють проводити тестування великого масиву досліджуваних зразків протягом короткого часу. Відомий спосіб оцінки небезпечної дії різних об'єктів у водних витяжках з них за індексом токсичності на сперматозоїдах in vitro, що використовується для тестування широкого спектру матеріалів та виробів, а саме, - для біотестування продукції з полімерних та інших матеріалів [1]; виявлення зон хімічного забруднення [2]; оцінки біологічної дії медичних виробів [3, 4]; експрес-оцінки токсичності відходів виробництва та споживання [5, 6]; оцінки загальнотоксичної та подразнюючої дії парфюмерно-косметичної продукції [7] та гігієнічної оцінки одягу [8]. Найближчим аналогом є спосіб для оцінки токсичності наноматеріалів у розчинах, що базується на використанні стандартного біологічного матеріалу - сперматозоїдів великої рогатої худоби (бика), та реалізується на серійному аналізаторі АТ-05 (Росія), який дозволяє досліджувати об'єкти та отримувати результати за час, що не перевищує 3 години. Недоліком найближчого аналога є занадто низька концентрація наночастинок у дослідному зразку за умов приготування водної витяжки, що негативно відбивається на результатах дослідження. В основу корисної моделі поставлена задача адаптації способу біотестування токсичності продукції з полімерних та інших матеріалів in vitro на моделі сперматозоїдів великої рогатої худоби шляхом використання як досліджуваного об'єкта наночастинки металів у розчинах та виключенням водного екстрагування на етапі приготування досліджуваного зразка. Корисну модель виконують наступним чином. Досліджуваний зразок готують із розрахунку: глюкоза (16 мг), цитрат натрію (4 мг) на 0,4 мл суспензії наночастинок; контрольний розчин - глюкозо-цитратний буфер (глюкоза (4 г), цитрат натрію (1 г) в 100 мл дистильованої води)) - 0,4 мл; розчин для розморожування сперми глюкозо-цитратний буфер (глюкоза (4 г), цитрат натрію (1 г) в 100 мл дистильованої води)) 0,6 мл. Анатомічним пінцетом, кінець якого охолоджено в рідкому азоті, дістають з посудини Дьюара гранулу сперми та опускають в нагрітий (40 °C) буферний розчин для розморожування на 5-7 хв. За допомогою дозатора додають в пробірки з досліджуваним та контрольним зразками по 0,1 мл суспензії сперматозоїдів, після чого вміст пробірки ретельно перемішують. Капіляри наповнюють досліджуваним й контрольним зразками та поміщають в каретку на відповідні місця, після чого накривають каретку з капілярами кришкою, встановлюють в блок аналізатора та починають експеримент на серійному аналізаторі АТ-05. Оцінку токсичності здійснюють на підставі величини індексу токсичності (I t), що дорівнює відношенню параметрів рухливості суспензії індикаторних клітин в досліджуваному зразку до параметрів рухливості індикаторних клітин в контрольному зразку. При значенні індексу токсичності від 1 до 70 % та більше 120 % досліджуваний зразок вважається токсичним. Приклад 1. При оцінці токсичності різних концентрацій наночастинок срібла розміром 30 нм (Ag 30) в деоінізованій воді при приготуванні досліджуваного зразка було проведено екстрагування з подальшим дослідженням водних витяжок. Було встановлено, що концентрації Ag 30 0,005 мг/л, 0,05 мг/л, 0,5 мг/л, 25 мг/л, 50 мг/л, 75 мг/л, 150 мг/л не проявили токсичного впливу (значення It коливалось в межах 85-112,8 %). Натомість в концентраціях 500 мг/л, 1000 мг/л було виявлено токсичну дію Ag 30 (значення It знаходилось в межах 30,2-38,2 %). Приклад 2. При оцінці токсичності різних концентрацій наночастинок срібла розміром 30 нм (Ag 30) в деоінізованій воді при приготуванні досліджуваного зразка не проводилось водне екстрагування. Було встановлено, що концентрації Ag 30 0,005 мг/л, 0,05 мг/л, 0,5 мг/л, 25 мг/л, не проявили токсичного впливу (значення коливалось в межах 85-112,8 %). Натомість в концентраціях 50 мг/л, 75 мг/л, 150 мг/л, 500 мг/л, 1000 мг/л було виявлено токсичну дію Ag 30 (значення It знаходилось в межах 30,2-61,1 %). Таким чином, використання корисної моделі дозволяє забезпечити більш високу достовірність результатів токсикологічних досліджень в порівнянні з найближчим аналогом та може бути застосована в науці та практиці для оцінки небезпеки продуктів нанотехнологій. Джерело інформації: 1 UA 101308 U 5 10 15 1. Биотестирование продукции из полимерных и других материалов: Методические указания. - М.: Инофрмационно-издательский центр Госкомэпидназора России, 1996. - 11 с. 2. Еськов А.П., Каюмов Р.И., Лисиченко Г.В. Патент № 1804482 "Способ выявления зон химического загрязнения". - Госкомизобретений. - 1990. 3. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5.Исследование на цитотоксичность: методы in vitro. - M.: Госстандарт Росси, 2000. - 10 с. 4. Каюмов Р.И, Еськов А.П., Лаппо В.Г, Тимохина В.И., Кравец B.C., Загоруйко И.В. Экспресс-контроль серийно выпускаемых шприцев однократного применения. //Гигиена и санитария № 9, 1991, с. 76-77. 5. Экспресс-оценка токсичности отходов производства и потребелния на культуре клеток млекопитающих.-М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 12 с. 6. Определение класса опасности токсичних отходов производства и потребления. СП 2.1.7.1386-03. - М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2003. - 28 с. 7. Экспресс-метод оценки общетоксического и кожно-раздражающего действия парфюмерно-косметической продукции in vitro (на культуре подвижных клеток). Методические рекомендации. - М.: Минздрав России, 2002. - 10 с. 8. Гигиеническая оценка одежды для детей, подростков и взрослых: Методические указания. - М: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. - 15 с. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Експрес-спосіб визначення токсичності наноматеріалів у розчинах in vitro з використанням сперматозоїдів великої рогатої худоби як тест-об'єкта, що включає приготування досліджуваного та контрольного зразків з подальшим визначенням величини індексу токсичності (It) на підставі відношення параметрів рухливості суспензії сперматозоїдів великої рогатої худоби (бика) в досліджуваному та контрольному зразках відповідно до методу оцінки небезпечної дії різних об'єктів у водних витяжках in vitro, який відрізняється тим, що як досліджуваний об'єкт використовують наночастинки металів у розчинах та виключають водне екстрагування на етапі приготування досліджуваного зразка. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2