Спосіб одержання ферментного препарату пероксидази flammulina velutipes (curt.: fr.) sing.

Корисна модель відноситься до мікології та біотехнології і може бути використана на підприємствах мікробіологічної, фармацевтичної та інших галузей промисловості. Розвиток біотехнології відбувається шляхом інтродукції продуцентів біологічно активних речовин в культуру, а також розробки способів отримання екологічно чистих харчових продуктів і лікувально-профілактичних медпрепаратів на основі використання природних запасів лікарської сировини з імуностимулюючою, онкостатичною, радіопротекторною та загальнозміцнюючою дією [2, 9]. Традиційно грибівництво орієнтовано лише на виробництво харчових, а в останні роки і кормових продуктів. В той же час в багатьох країнах світу вищі базидіальні гриби розглядають і як цінну сировину для отримання біологічно активних речовин, що можуть бути використані при створенні лікувально-профілактичних та лікарських засобів широкого спектру дії [3, 7]. Встановлено здатність дереворуйнівних грибів до активного синтезу різноманітних сполук, придатних до застосування у різних галузях промисловості [10, 14]. Висока промислова застосовність та новизна роблять ці препарати і технології їх одержання патентоспроможними, й вони активно захищаються патентами [2]. Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - зимовий опеньок маловідомий їстівний гриб, лігнотроф. З'ясовано, що він виявляє антибактеріальну, противірусну, антифунгальну, протипухлинну, імуномодулюючу, тромболітичну активності в культурі та представляє інтерес для грибівництва, фармакологічної та харчової промисловостей [3, 14]. Пероксидази (1.11.1.7.) каталізують окислення різних поліфенолів, амінів, а також жирних кислот, цитохрому, глютатіону. Ферменти розкладають Н2О2 з звільненням активного атомарного кисню, який йде на окислення. З'ясовано, що пероксидази разом з каталазою відіграють відповідну захисну роль антиоксидантної системи організму на несприятливі умови життєдіяльності і інфекції при утворенні токсичних сполук реакцій перекисного окиснення ліпідів [5, 8, 12, 13]. Відомо спосіб отримання молокозсідального ферментного препарату, який передбачає поверхневе культивування продуцента Hirschioporus laricinus ВКЛМ F-263 на глюкозо-пептонному живильному середовищі до досягнення максимальної молокозсідальної активності культурального фільтрату, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сірчанокислим амонієм при 55-80% насиченні та очистка діалізом проти дистильованої води і методом електрофорезу в паралельних пластинах поліакриламідного гелю [1]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є спосіб отримання ферментних препаратів молокозсідальної дії, за яким вперше отримано та досліджено молокозсідальну і антиокисну активність 13 ферментних препаратів афілофорових грибів. Застосовували поверхневе культивування штамів-продуцентів Corticium laeve Fr.; Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. et Sing.; Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing.; Tyromyces lacteus (Fr.) Murr.; T. revolutus (Bres.) Bond. et Sing.; T. undosus (Peck.) Murr.; Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr.; Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing.; Hydnum ochraceum Pers.; Sparassis crispa (Fr.) Fr., Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. на глюкозо-пептонному живильному середовищі до досягнення максимальної молокозсідальної активності культурального фільтрату, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сірчанокислим амонієм при 40-90% насиченні та очистку діалізом проти дистильованої води [10, 11]. В основу корисної моделі покладено завдання розробки способу одержання ферментного препарату пероксидази Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing., який відрізняється від прототипу визначенням рівня пероксидазної активності культурального фільтрату, ступенем насиченості (NH4)2SO4 та продуцентом. Поставлене завдання вирішується тим, що спосіб одержання ферментного препарату пероксидази Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. передбачає культивування продуценту на глюкозо-пептонному живильному середовищі згідно корисної моделі до досягнення максимальної пероксидазної активності культурального фільтрату, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сульфатом амонію при 40-60% насиченні культурального фільтрату і 40-70% насиченні гомогенату міцелію та очистку фракцій білків діалізом проти дистильованої води. Пропонований спосіб є новим тому, що він не відомий з рівня техніки, ферментного препарату та об'єкту продуцента. Приклад конкретного виконання 1. Штам F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - отримано за методом, який звичайно застосовується для одержання чистих культур макроміцетів, а саме вилученням "тканинних" ізолятів із свіжезібраних плодових тіл [6]. Плодові тіла гриба зібрано на деревині ушкодженого листяного дерева Acer hyrcanum Fisch, et Mey. в дендрарії Донецького ботанічного саду НАН України. Чисту міцеліальну культуру штаму підтримують шляхом пересівів через 5-6 місяців на агаризоване знехмілене пивне сусло (4° по Баллінгу) або інші агаризовані живильні середовища [6, 7]. Для визначення пероксидазної активності (ПА), штам F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. вирощують на рідкому глюкозо-пептонному середовищі наступного складу, г/ л: Глюкоза - 10,0 пептон - 3,0 КН2РO4 - 0,6 К2НРO4 - 0,4 MgSO4x7H2O - 0,5 СаСl2 - 0,05 ZnSO4 x 7Н2О - 0,001 дистильована вода до 1л [1], або знехміленому пивному суслі (4° по Баллінгу), яке містить 3г/л ферментативного пептону. Живильне середовище розливають в культиваційні колби та стерилізують в стерилізаторі при тиску 1,1±0,1кгс/см2, температурі 121±1°С протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації становить 5,5–5,8pH. Культуру вирощують поверхнево в колбах Ерленмейера об'ємом 250мл, які містять по 50мл живильного середовища, при температурі 27,5±0,10С. Посівним матеріалом є 10-15–ти денна культура гриба на агаризованому живильному середовищі. Термін культивування - 20 діб. Визначають ПА культурального фільтрату і вегетативного міцелію штаму F-203 Flammulina velutipes за методом, який базується на вимірі за допомогою фотоелектроколориметра (наприклад, приладу КФК-2-УХЛ 4,2) інтенсивності забарвлення продукту окислення о-діанізидину перекисом водню, який утворився при дії пероксидази. Одиниця пероксидази відповідає кількості ферменту, що каталізує перетворення 1мкмоля Н2O2 за одну хвилину в оптимальних умовах. Розрахунки проводять за формулою [6]: E × V1 ×p X= E1 × K × V2 × t , де, Χ - активність ферменту пероксидази; Е - екстинкція; V1 - об'єм забарвленої проби; V2 - об'єм культурального фільтрату (КФ) або гомогенату міцелію (МГ); E1 - коефіцієнт мікромолярної екстинкції (0,0128); К коефіцієнт для перерахунку з міліметрів у літри (1000); t - час інкубації (5хв); p – коефіцієнт розведення культурального фільтрату чи препарату ферменту. Данні з динаміки ростових показників та активності пероксидаз штаму F-203 F. velutipes, що культивували на глюкозо-пептонному середовищі при температурі 27,5 і 30,0°С представлені в таблиці. За її даними, найвищий рівень активності ендогенних пероксидаз зафіксовано у 10-ти і 20-ти денного міцелію, а екзогенних пероксидаз культурального фільтрату - на 10-ту добу культивування при 27,5°С. Таблиця Динаміка росту, pH живильного середовища та пероксидазної активності штаму F-203 Flammulina velutipes в залежності від температури культивування Біомаса, г/л Вік, доба 5 10 15 20 27,5 0,14±0,12 1,40±0,50 3,24±0,10 4,82±0,16 30,0 0,18±0,06 0,92±0,24 1,89±0,10 6,54±0,68 PH ПАМГ, • 10-2 ум.од. Температура культивування, 0С 27,5 30,0 27,5 30,0 5,52 6,46 5,21±0,23 3,30±0,16 5,96 6,38 31,32±0,61 25,01±0,93 6,14 5,85 7,83±0,19 4,68±0,07 6,04 5,96 35,2±1,47 42,27±0,98 ПАКФ, • 10-2yм.од. 27,5 2,79±0,14 31,34±1,01 7,80±0,31 3,82±0,15 30,0 3,62±0,09 3,29±0,12 4,41±0,11 3,02±0,01 Приклад конкретного виконання 2. Спосіб отримання ферментного препарату пероксидази штаму F-203 Flammulina velutipes відповідно до заявленого рішення здійснюють наступним чином. Поверхневе вирощування штаму F-203 F. velutipes проводять в колбах об'ємом 1 або 2 літри. Колби містять 350 чи 700мл, відповідно, стерильного глюкозо-пептонного середовища. Культивування проводять протягом 10 діб в термостаті при температурі 27,5°С. Фракціонування екзогенних ферментів проводять сульфатом амонію. Використовують цей метод завдяки великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу (NH4)2SO4 [4, 6]. Осадження білків по фракціям з культурального фільтрату здійснюють шляхом поступового збільшення концентрації сульфату амонію: 40, 50, ..., 100%. Культуральний фільтрат готують наступним чином. Температуру культуральної рідини доводять до 5±1°С. Міцелій відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування на тришаровій марлі. Відповідно до обраного насичення, у культуральний фільтрат додають сульфат амонію. Фракцію білку, яка утворила осад, відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні 2000g протягом 15 хвилин. Наступним етапом проводять первинну очистку отриманої білкової фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1°С дистильованої води протягом 24 годин. Прилад для діалізу містився в холодильнику. В якості напівпроникної мембрани використовують целофанову плівку з порами, які пропускають речовини молекулярною масою до M=7000-10000. Таким чином, сульфат амонію та низькомолекулярні сполуки переходять в розчинник - дистильовану воду, а білки - в водорозчинну фазу. Для прискорення дифузії, розчинник декілька раз замінюють до повного очищення розчину білків від сульфату амонію. Завдяки осмосу, молекули розчинника призводять до частковогорозведення дослідного розчину білків. Операції проводять окремо для кожної фракції білків. Отримані розчини фракцій білків піддають подальшим дослідженням. Зокрема - ліофільній сушці, наприклад на приладі "Иней-3-2" та визначають пероксидазну активність ферментних препаратів, які мають вид порошку від світло-кремового до світло-коричневого забарвлення, добре розчинні у воді. Не виявлена пероксидазна активність в білках, що були виділені при концентрації сульфату амонію до 40% та вище 60%. Активність пероксидаз наявна у фракції білків ферментного препарату, що був виділений при 40-60% насиченні культурального фільтрату сульфатом амонію. Пероксидазна активність ферментного препарату дорівнює ХКФ = 2,4 · 10-2од/г. Приклад конкретного виконання 3. Здійснюють як приклад 2, але ферментний препарат пероксидази виділяють з вегетативного міцелію штаму F-203 Flammulina velutipes. Фракціонування ендогенних ферментів проводять сульфатом амонію. Гомогенат міцелію готують наступним чином. Температуру культуральної рідини доводять до 5±1°С. Міцелій відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування на тришаровій марлі. Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 0±1°С. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання з абразивним порошком у ступці за допомогою товкачика, суспендірують охолодженою дистильованою водою в співвідношенні 1:20. Осад відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні 2000g протягом 15 хвилин. Фракціонування білків у супернатанті проводять за прикладом 2. Отримані розчини фракцій білків піддають ліофільній сушці та визначають їх пероксидазну активність. Одержані ферментні препарати мають вид порошку від світло-сірого до світло-кремового забарвлення, добре розчинні у воді. Не виявлено пероксидазну активність у фракціях білків, що були осаджені з супернатанту при концентрації сульфату амонію до 40% і вище 70%. Встановлено активність пероксидаз у фракції білків ферментного препарату, що був виділений при 40-70% насиченні гомогенату міцелію (NH4 )2SО4. Пероксидазна активність ферментного препарату дорівнює Хмг= 4,6 · 10-2од/г. Таким чином, отримані результати показали, що спосіб одержання ферментного препарату пероксидази зимового гриба Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. як з культуральної рідини так і з вегетативного міцелію є новим та придатним для застосування в лабораторних дослідженнях та промисловому виробництві. Джерела інформації, які використані при укладанні заявки 1. Авторське свідоцтво СРСР Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата / Бойко М.И., Негруцкий С.Ф., Мирошниченко T.B. №1395672 від 29.08.1986, м.кл. A01C12N9/58, публ.15.05.1988, бюл. №18 2. Белова H.B., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. - 26, вып.4. - С.321-324. 3. Бухало A.C., Соломко Е.Φ., Митропольская Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, №3. - С.192-201. 4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. - 290с. 5. Дубова О.В., Фендюр Л.М. Антиоксидантна система генеративних органів Catalpa bignonoides в умовах промислового забруднення викидами електрометалургійного підприємства // Питання біоіндикації та екології. Т.5, №2. - Запоріжжя, 2000. - С.33-39. 6. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. - Киев: Наук. думка, 1982. - 550с. 7. Дудка И.А., Бисько H.A., Билай В.Г. Культивирование съедобных грибов. - Киев: Урожай, 1992. - 160с. 8. Савич И.М. Пероксидазы - стрессовые белки растений // Успехи современной биологии. - 1989. - Т.107, вып.3. - С.406-417. 9. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности// ВНИСЭТИ: Обзорная информация, сер.3. - М., 1985. - 48с. 10. Федотов О.В. Активні продуценти молокозгортаючих ферментів серед гіменоміцетів, їх біологічні особливості та перспективи застосування: Автореф. дис. ... к-та біол. наук. - Київ, 1995, - 20с. 11.Федотов O.B. Молокозсідальна і антиокисна активність ферментних препаратів штамів афілофорових грибів // Збірник наукових праць Луганського державного аграрного університету. - Луганськ: ЛДАУ, 2001. - №9 (21). Сер. "Біологічні науки". - С.136-141. (прототип) 12. Eriksson K.-E., Blanchette R.A., Ander P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. Berlin, Heidelberg: Springier-Verlag, 1990. 13. Sgherri C.L.M., Maffei M., Navari - Izzo F. Antioxidative enzymes in wheat subjected to increasing water deficit and rewatering // J. Plant Physiol. - 2000. - 157,N 3. - P.273-279. 14. Tardif A. La Mycotherapie ου Les proprietes Medicinales des Champignons. - Paris, 2000. - 167p.