Спосіб витягнення лінійних та суперспіральних молекул днк

Спосіб витягнення лінійних та суперспіральних молекул ДНК, що включає створення амінослюди з низькою поверхневою щільністю протоно 3 17942 4 полімери необхідно приєднувати до поверхонь слюди ультрачистою водою об'ємом 2мл; при зонда та субстрату тільки за їхні кінцеві нуклеотицьому кут між площиною слюди та дозатором доди для того, щоб запобігти можливих артефактів, рівнює 45°; викликаних взаємодією з поверхнею. обдування поверхні слюди потоком інертного Існує також спосіб витягнення молекул ДНК за газу - аргоном або азотом; допомогою методу оптичного пінцету [Bennink М., інкубація зразка ДНК на слюді за тиску Leuba S., Leno G., Zlatanova J., de Grooth В., Greve 30мм.рт.ст. протягом 20 хвилин. J. Unfolding individual nucleosomes by stretching Розроблений нами метод є надзвичайно просsingle chromatin fibers with optical tweezers // Nat. тим та ефективним: тягнені молекули ДНК форStruc Biol. - 2001. - Vol.8. - P.606-610]. Цей спосіб муються у процесі іммобілізації молекул ДНК на базується на тому факті, що світло може чинити поверхні слюди з низькою поверхневою щільністю тиск на кульку з певними оптичними властивостяпротонованих аміногруп під впливом механічної ми таким чином, що кулька тримається у точці, що енергії направленого струму води, а саме, при є близькою до осі лазерного променю. Якщо кульпромиванні слюди ультрачистою водою після екска, що знаходиться у пастці лазерного променю, позиції з розчином ДНК. Зв'язування молекул ДНК виходить з нього, то вона може бути повернена у з субстратом відбувається за рахунок електростарівноважну позицію за допомогою або зовнішньої тичної взаємодії негативно заряджених сайтів ДНК сили, або під впливом променю лазера. Таким з позитивно зарядженими аміногрупами аміносчином, в зазначеному методі вимірюється сила, люди. Через низьку поверхневу щільність аміногщо прикладена до молекули ДНК, яка приєднана руп спосіб дозволяє витягувати всі молекули ДНК, одним кінцем до кульки, що знаходиться в оптичякі знаходяться в кадрі при проведенні АСМній пастці, а іншим кінцем - до іншої кульки, що візуалізації. Важливо, що точно таку процедуру утримується піпеткою. При цьому поверхні шариків підготовки зразка з інтенсивним промиванням навкриті стрептовидіном, який утворює специфічний правленим потоком води поверхні слюди ми викозв'язок з молекулами біотину, ковалентне приєдристовували і для стандартної, і для модифіковананими до кінцевих нуклеотидів ДНК. Недоліком ної амінослюди із збільшеною гідрофобністю та цього способу є те, що він дозволяє витягувати поверхневою щільністю заряду. Проте тягнені мотільки лінійні молекули ДНК, в той час як для сулекули ДНК формувалися тільки на поверхні аміперспіральних ДНК проводити наноманіпулювання нослюди з низькою поверхневою щільністю протонеможливо. нованих аміногруп. Найбільш близьким є спосіб витягнення молеКорисну модель ілюстровано прикладами. кул ДНК за допомогою їхньої іммобілізації на аміПриклад 1. Поверхня слюди, стандартного нослюді, оброблену у розчині похідного аміносисубстрату для іммобілізації біомолекул при АСМлану - 3-амінопропілтриетоксисилану (АПТЕС) дослідженнях, негативно заряджена у буферних [Fang Y., Hoh J. Surface-directed DNA condensation розчинах за нейтральних значень рН та невисокої in the absence of soluble multivalent cations // іонної сили. Тому для іммобілізації за даних умов Nucleic Acids Res. - 1998. - V.26. - P.588-593]. Зана поверхні слюди негативно заряджених молекул значений метод дозволяє безпосередньо отримуДНК використовують декілька підходів, що дозвовати релаксовані молекули ДНК та візуалізувати їх ляють змінити сумарний поверхневий заряд слюди за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ). з негативного на позитивний. Молекули ДНК фага Суттєвим недоліком даного способу є невисока (довжина 48502 пар нуклеотидів), іммобілізовані надійність, оскільки поряд з релаксованими молена стандартній амінослюді (Фіг.1), знаходяться у кулами ДНК були візуалізовані і конденсовані мунаближеній до плектонемічної конформації, в той льтимолекулярні агрегати у вигляді джгутів та точас як зниження поверхневої щільності протонороїдів, доля яких дорівнює понад 70%. ваних аміногруп веде до суттєвого витягнення моВ основу корисної моделі поставлено задачу лекул ДНК (Фіг.2, 3). Фіг.1, 2, 3 АСМ-зображення витягнення лінійних та суперспіральних молекул молекули ДНК фага на стандартній амінослюді з ДНК шляхом іммобілізації молекул ДНК на повервідносно високою поверхневою щільністю протохню амінослюди з низькою поверхневою щільністю нованих аміногруп (А) та амінослюді з низькою протонованих аміногруп забезпечити збільшення поверхневою щільністю протонованих аміногруп контурної довжини молекул ДНК, а отже, і відстані (Б, В). Розмір кадру: (А) - 1,8мкмх1,8мкм; (Б) між основами уздовж осі суперспіралі порівняно з 7,5мкмх7,5мкм; (В) - 5мкмх5мкм. канонічною В-формою ДНК. Приклад 2. Вимірювання контурної довжини Задача, яку поставлено в основу корисної мопоодинокої нативної молекули ДНК з субнанометделі, вирішується тим, що у відомому способі вировою роздільною здатністю, що є відмітною осотягнення молекул ДНК на амінослюді шляхом бливістю АСМ, дозволяє визначити, знаючи кільстворення амінослюди з низькою поверхневою кість пар нуклеотидів в даній молекулі, відстань щільністю протонованих аміногруп, згідно з корисміж нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі ною моделлю, проводять іммобілізацію молекул ДНК. Відстань між основами (R), або райз (від ангДНК на амінослюді, оброблену в газовій фазі нелійського слова rise), - це відстань між площинами дистильованим 3-амінопропілтриетоксисиланом основ, а відстань між нуклеотидами вздовж осі (АПТЕС), та використовують такий протокол витяспіралі (Н) - проекція відстані між основами на вісь гнення молекул ДНК: подвійної спіралі ДНК. Збільшення контурної довекспозиція краплі об'ємом 10мкл з розчином жини тягнених суперспіральних молекул ДНК ДНК на поверхні амінослюди площею 1см2 - 2 хвиpGEMEX від 1216нм (Фіг.4) до 1943нм (Фіг.5) та лини; двократне помірне промивання поверхні 2140нм (Фіг.6) означає, що витягування ссДНК у 5 17942 6 1,56 раза та у 1,72 раза веде до зростання міжнукронегативними сайгами ДНК та позитивно зарялеотидної відстані до Н=4,87Å та Н=5,36Å відповідженими аміногрупами слюди. Тому під впливом дно. Отримані дані для тягнених молекул ДНК струму води молекули ДНК витягуються паралеpGEMEX добре узгоджуються з раніше опублікольно напрямку, в якому проводиться промивання ваними результатами дослідження тягнених ДНК поверхні слюди. різними методами, в тому числі і за допомогою Фіг.7. Витягування молекул ДНК досягається методу оптичного пінцета. промиванням амінослюди (3) після двохвилинної Фіг.4. (А) АСМ-зображення суперспіральної експозиції розчину ДНК струмом ультрачистої вомолекули ДНК pGEMEX (довжина 3993пн), іммобіди (2) за допомогою дозатора з пластиковим наколізованої на стандартній амінослюді. Контурна нечником (3) об'ємом 1мл. Вісь дозатора утворює довжина ДНК L=1216нм, що відповідає відстані кут =45° з площиною аміно-слюди. між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі Таким чином, у даній корисній моделі предН=3,04Å. Розмір кадру - 294нмх294нм. ставлено схему отримання витягнутих лінійних та (Фіг.5, 6) АСМ-зображення витягнутих суперссуперспіральних молекул ДНК, контурна довжина піральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізованих яких приблизно у 1,7 раза більше порівняно з кана амінослюді з низькою щільністю аміногруп. Фіг.5 нонічною В-формою ДНК. Іммобілізація витягнутих - контурна довжина ДНК L=1943нм, що відповідає молекул ДНК на амінослюді може бути використавідстані між нуклеотидами вздовж осі подвійної на для фундаментальних досліджень мікромеханіспіралі Н=4,87Å. Розмір кадру - 1,13мкм х 1,13мкм. чних властивостей ДНК, наноманіпулювання пооФіг.6 - контурна довжина ДНК L=2140нм, Н=5,36Å. динокими молекулами ДНК, а також при створенні Розмір кадру - 1,07мкмх1,07мкм. ДНК-чипів для позбавлення впливу компактизації Приклад 3. Через використання амінослюди з молекул ДНК. низькою щільністю поверхневих аміногруп різко зменшується число утворених зв'язків між елект 7 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 17942 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601