Спосіб обробки призначеного для пророщування насіннєвого матеріалу

1. Способ обработки предназначенного для проращивания семенного материала, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в семенной материал добавляют препарат молочнокислых бактерий или препарат, полученный с использованием молочнокислых бактерий, для подавления роста микроорганизмов, причем указанные молочнокислые бактерии выбирают из рода Lactococcus, Leuconostos, Pediococcus или Lactobacillus. 2. Способ по п. ^ о т л и ч а ю щ и й с я тем, что препарат молочнокислых бактерий или препарат, получен ный с использованием молочнокислых бак-і терий, выбирают из видов Lactococcus lactis, Leuconostos mesenteroides, Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus curvatus, Lactobacilius plantarum или из их смеси. 3. Способ по пп. 1 или 2, о т л и ч аю щ и й с я тем, что препарат молочнокислых бактерий или препарат, полученный с использованием молочнокислых бактерий, добавляют к зернам ячменя для подавления роста плесневых грибков Fuzanum moulds. 4. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что препарат молочнокислых бактерий или препарат, полученный с использованием молочнокислых бактерий, добавляют на стадии замачивания или проращивания. 5. Способ по любому из пп. 1-4, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что препарат молочнокислых бактерий или препарат, полученный с использованием молочнокислых бактерий, добавляют к семенному материалу и после проращивания его используют как удобрение. о о со О Изобретение касается способа обработки семенного материала, предназначенного для проращивания. • В контексте настоящего описания под процессом проращивания обычно понимают стадию процесса, необходимую для получения продукта проращивания из се мян, сохраняемых в сухом состоянии. В частности, в пивоварной и спиртоводочной промышленности процесс проращивания, представляющий собой процесс осоложения, используют при получении важного сырья для приготовления пива или других алкогольных напитков, вклю 27008 чая зерновой солод, такой как ячменный солод, ржаной солод или какой бы то ни было солод. Кроме того, указанный процесс? проращивания используют при получении различных коммерческих продуктов, представляющих собой проростки, например, лроростки фасоли или любые проростки, предназначенные для использования в питании человека. Обычно процессы проращивания осуществляют в не-асептических условиях. На семенах, обрабатываемых в этих условиях, встречаются микробы, присутствие которых обусловлено условиями внешней среды в ходе роста растений или хранения семян. Условия, соблюдаемые в течение процесса проращивания, наиболее благоприятны для имеющихся на се•менах микробов, обычно эти микробы обильно размножаются в течение рассматриваемого процесса. Указанные микробы могут оказывать нежелательный эффект на продукт проращивания, либо на производимый из него конечный продукт, при этом они в равной степени могут оказывать полезное воздействие на проращиваемый продукт. Основными стадиями процесса пивоварения являются: осолаживание, получение сусла, первичное и вторичное ферментирование, а также последующая обработка. Назначением осоложения является появление в зерне ферментов, которые на стадии затирания переводят вещества эндосперма зерна в форму, растворимую в получаемом сусле. В частности, хорошо известно, что процесс осоложения семян ячменя включает в себя три стадии: замачивание, проращивание и запаривание. Очищенные и перебранные зерна ячменя замачивают в воде до тех пор, пока не получают желаемую степень влажности, например, в пределах от 43 до 44%. Частично замачивание можно осуществлять, способом так называемого воздушного покоя. Ячменю позволяют прорасти в контролируемых условиях, а полученный пророщенный ячмень запаривают & потоке горячего воздуха до тех пор» пока прорастание не будет закончено. По окончании запаривания из солода удаляют пер.еичные корешки. Регулирование стадий осоложения основано на контроле температуры, воздушного потока и влажности продукта или воздуха. С точке зрения способа и условий осоложения, качество солода зависит также и от микробной флоры семян, используемых для получения солода, указанная форма существенно варьирует в зависи мости от разновидности семян, погодных условий, места выращивания, продолжительности сезона выращивания, а также условий хранения. 5 Ячмень представляет собой зерновую культуру, наиболее часто используемую для осоложекия. Природная, естественная микробная флора ячменя может быть подразделена на полевые грибки, грибки 10 хранения, бактерии и дрожжи. Наиболее обычными полевыми грибками ячменя являются: Fusarium, Alternaria, Ctadosportum, • Cephalosporium, Epicoccum и Helminthosporium. Встречаемость плесневых 15 грибков в разных странах в разные годы различна. Влажные погодные условия в ходе периода роста растений, особенно в течение их уборки, способствуют росту плесневого грибка Fusarium. Вызванное 20 Fusartum заражение может быть по истине тяжелым в дождливые сезоны роста растений. Одним из наиболее обычных видов бактерий, встречающихся на зерновых, является Enterobacter agglomerans. 25 Среди прочих бактерий следует отметить Escherichia coli и бактерии родов Pseudomonas, Micrococcus и Bacillus, a также молочно-кислые бактерии. Бактериальный титр в случае ячменя равен 30 приблизительно 105-108 КОЕ/г (колонии образующих единиц на г). Количество плесневых грибков и бактерий в ячмене увеличивается в течение осоложения, достигая наивысших концент35 раций на стадии проращивания. Наиболее сильное размножение претерпевают в особенности плесневой грибок Fusarium, а также молочно-кислые бактерии. В ходе осоложения увеличивается также ко40 личество дрожжей. На стадии запаривания концентрации плесневых грибков; дрожжей и бактерии, как правило, вновь снижаются. Часть микробов, встречающихся на ячмене, оказывает полезный эффект 45 в плане осоложения, а также в плане продукта, например, пива, производимого из полученного солода. Судя по прове. денным оценкам, вплоть до 4 0 - 5 0 % некоторых ферментов солода имеют бакте5 0 риальное происхождение. С другой стороны, часть микробов оказывает нежелательное действие на ячмень и/или получаемые солоды. Среди нежелательных микробов сле55 дует отметить плесневой грибок Fusarium, который, как было обнаружено, более часто по сравнению с другими плесневыми грибками вызывает особо нежелательное вспенивание пива, в ходе которого продуцируемые указанными плесневыми гриб 27008 ками пептиды образуют ядра пузырьков газа, выделяющихся из бутылки пива в виде интенсивной пены. В том случае, если более 5 0 % сбраживаемых зерен заражено плесневыми грибками Fusarium, опасность пенообразования существенно возрастает. Кроме того, показано, что встречающиеся на ячмене грамотрицательные бактерии, такие как виды, входящие в роды Pseudomonas и Flavobacterium, а также грамположительные бактерии из рода Leuconostoc, затрудняют фильтрацию полученной массы в плане получения сусла. Различные встречающиеся на ячмене микробы могут приводить также к другим нежелательным эффектам, в том числе, подавлять проращивание, вызывать посторонние запахи или нежелательные изменения качественных показателей получаемого сусла и пива. Требования качества, предъявляемые к сбраживаемому ячменю, могут быть оговорены с помощью ежегодно заключаемого контракта о культивировании и поставках. Плесневые грибки представляют собо,й группу микробов* часто упоминаемую в описаниях качества. Более того, для многих используемых для осоложения растений, определен верхний допустимый предел для конкретных плесневых грибков. В том случае, если доля зараженных Fusarium зерен превышает 65%, либо соответствующий показатель для плесневых грибков Aspergiilus и Penieilfum превышает 50%, такого рода ячмень может рассматриваться как низкокачественный или даже непригодный для использования в осоложении. Для предотвращения вызываемого плесневыми грибками пенообразования разработаны подходы, основанные на использовании высококачественного ячменя, либо на смешивании партий ячменя, солода или пива. В дождливые годы почти весь урожай ячменя может быть низкого качества, в этом случае получение хорошего пива может оказаться невозможным. Для снижения количества плесневых грибков можно использовать также микробицидные химические вещества, однако, невозможно найти .безопасные и общепризнанные химические агенты. Процесс проращивания, применяемый для получения проростков, предназначен* ных для использования в целях питания, предполагает некоторые условия, благоприятные для размножения, например, плесневых грибков и бактерий. Такого рода продукты проращивания будут быстропор 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тящимися. Кроме того, в связи с проращиванием может наблюдаться увеличение количества пищевых патогенов, вызывающих пищевое отравление, таких как бактерии Safmoneffa, Yersinia и/или Listeria. Предметом настоящего изобретения является разработка способа, с помощью которого в течение процесса проращивания можно тонко регулировать количество и качество микробной флоры, однако, не оказывая при этом неблагоприятного воздействия на качество продукта проращивания или потенциально производимого из него конечного продукта. Настоящее изобретение базируется на исследованиях, в результате которых было сделано неожиданное наблюдение, свидетельствующее о том, что молочнокислые бактерии можно использовать с целью улучшения качества продукта, предназначенного для проращивания. Вещества, содержащиеся в препарате по изобретению и/или полученные из препарата по изобретению, в том числе, микробицидные агенты, подавляют рост нежелательных микроорганизмов, встречающихся в течение процесса проращивания. Использование молочнокислых бактерий в пищевой и кормовой промышленности - хорошо известно. В ферментативных условиях эти бактерии вырабатывают такие соединения, которые влияют на состав и запах получаемых продуктов, но вместе с тем подавляют рост патогенных микробов, способных испортить указанные продукты. Молочнокислые бактерии обычно использовали в молочных продуктах, мясных продуктах, продуктах ферментации овощей и выпечнш продуктах, а также в хранении фуража. Добавка молочнокислых бактерий или молочной кислоты была введена в практику при производстве определенного типа солода, так называемого Sauerrnalz. Указанную добавку вводят в солод на стадии запаривания перед затиранием или в процессе затирания. Назначение указанной добавки заключается исключительно в снижении рН получаемого сусла таким образом, чтобы оказать влияние на протекание процесса затирания, а также на качество получаемого в итоге пива. Однако, до сих пор не использовали молочнокислые бактерии так, как это предусмотрено настоящим изобретением: с целью подавления роста нежелательных микробов в ходе процесса проращивания. Предусмотренный настоящим изобретением препарат можно добавлять к предназначенному для проращивания продук 27008 ту на любой стадии процесса проращивания. В случае особо предпочтительного варианта воплощения, препарат молочнокислых бактерий, либо препарат, полученный с помощью молочнокислых бактерий, добавляют к веществу семян, такому как зерна ячменя, в течение процесса осоложения. Указанный добавляемый препарат подавляет рост плесневых грибков, в особенности вредных плесневых грибков Fusarium, а также бактерий, в результате чего, в частности, понижается риск вспенивания пива из-за плесневого грибка Fusarium. Вместе с тем, судя по качеству получаемого солода или производимого из него пива, указанный препарат не оказывает существенного эффекта на активность полезной микробной флоры. Кроме того, не обнаружено никаких вредных воздействий указанного добавляемого препарата на качество солода, также как и не выявлено каких бы то ни было содержащихся в препарате или получающихся из него веществ, вредных для производимого солода или пива. В ходе процесса осоложения указанный препарат молочнокислых бактерий или препарат, получаемый с помощью молочнокислых бактерий, можно добавлять к зернам ячменя до замачивания, на стадии замачивания или в течение стадии проращивания. В предпочтительном случае указанную добавку осуществляют на стадии замачивания или проращивания. Другие элементы процесса сбраживания можно осуществлять любым способом, известным в этой области. При желании, например, к предназначенному для сбраживания ячменю могут быть добавлены питательные вещества, либо можно осуществлять регуляцию условий, в том числе с помощью добавления молочной кислоты, с целью оптимизации условий, необходимых для роста молочнокислых бактерий. В настоящем изобретении можно использовать любую широкодоступную молочнокислую бактерию, оказывающую воздействие в плане подавления роста микробов. Можно упомянуть следующие пригодные для использования роды молочнокислых бактерий: Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus и Lactobacillus. В качестве предпочтительных видов можно перечислить следующие: Lactococcifs lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus curvatus и Lactobacillus plantarum, либо их смеси, в которых наиболее предпочти 5 10 !§ 20 25 30 35 40 45 50 55 тельными являются Lactobacillus plantarum и Lactobacillus pentosaceus или их смеси. Также возможно использование генетически измененных молочнокислых бактерий. Препарат молочнокислых бактерий может состоят из культуральнои жидкости, содержащей или не содержащей клетки, либо из концентрированной культуральной жидкости (содержащей клетки). Препарат, получаемый с помощью молочнокислых бактерий, может включать в себя бесклеточный фильтрат культуры, концентрированный фильтрат культуры или фракционированный фильтрат культуры, либо чистый или частично очищенный микробицидный продукт. В соответствии с особо предпочтительным вариантом воплощения, указанную обработку осуществляют с использованием концентрированной или фракционированной культуральнои жидкости, которая может быть бесклеточной или может содержать клетки. Концентрирование может быть достигнуто, например, с помощью лиофилизации или выпаривания. Указанную культурапьную жидкость концентрируют, например, по фактору 2-20-40. Фракционирование, в том числе очистку микробицидных продуктов, можно осуществлять с использованием хорошо известных способов, например, с помощью методов хроматографии или ультрафильтрации. В соответствии со способом, предусмотренным настоящим изобретением, предназначенным для добавления к семенам активность, подавляющая рост микробов и входящая в состав препарата, содержащего молочнокислые бактерии или полученного с помощью молочнокислых бактерий, соответствует, например, указанной культуральнои жидкости в количестве приблизительно от 10 до 10000 мл/кг обрабатываемых семян, в приемлемом случае - от 30 до 7000 мл/кг обрабатываемых семян, в том числе от 40 до 5000 мл/кг обрабатываемых семян. Получение указанной культуральнои жидкости описано в разделе Примеры. Следует отметить, что непосредственные параметры использования активности указанного препарата определяют в зависимости от цели применения вышеупомянутой культуральной жидкости. Для специалиста очевидно, что предусмотренные настоящим изобретением препараты, обладающие эквивалентной активностью в плане подавления роста микробов, могут быть в равной мере получены с использованием 27008 иных культуральных жидкостей и/или способов. В соответствии с настоящим изобретением, указанный препарат включает в себя микробицидные соединения и/или производит микробицидные соединения в течение процесса проращивания. В том случае, если используют препарат клеток, клеточный рост может быть при необходимости индуцирован, например, с помощью регуляции условий в течение процесса проращивания, либо с использованием питательных добавок. Указанный препарат также может усиливать рост других молочнокислых бактерий, встречающихся на предназначенных для проращивания семенах. Так как использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности разрешено и широко распространено, указанный препарат, полученный из растущих молочнокислых бактерий, также безопасен в своем использовании. Молочнокислые бактерии обычно принадлежат к естественной микробной флоре проращиваемых семян, таких как зерна ячменя. Таким образом, предусмотренный настоящим изобретением способ является максимально естественным. Кроме того, в качестве штамма молочнокислых бактерий можно использовать штамм, естественным образом встречающийся на соответствующих семенах. Благодаря настоящему изобретению, в ходе сбраживания становится возможным уменьшать нежелательные эффекты, возникающие вследствие заражения Fusarium, такие как вспенивание пива. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что предлагаемый способ улучшает показатели фильтруемости в процессе производства пива. Как было установлено, указанный эффект обусловлен тем, что предусмотренный настоящим изобретением препарат также ограничивает число вредных видов, встречающихся в ходе сбраживания и препятствующих фильтрации получаемой массы, в том числе относящихся к родам Leuconostoc, Pseudomonas и Flavobacterium. В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом воплощения, препарат молочнокислых бактерий или препарат, полученный из молочнокислых бактерий, добавляют к семенам в том случае, если образующиеся проростки используют в пищу. Благодаря настоящему изобретению, можно ограничивать рост вредных микробов в течение процесса проращивания. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 Это первый случай, когда изобретение предусматривает использование биологических средств для предотвращения роста нежелательных бактерий, встречающихся на предназначенных для проращивания семенах, в течение промышленного процесса проращивания. Предусмотренный настоящим изобретением способ улучшает общий гигиенический стандарт указанного процесса проращивания в целом. В дальнейшем настоящее изобретение будет проиллюстрировано примерами воплощения, единственной целью которых является иллюстрирование настоящего изобретения, не сводя его к приведенным примерам. Предусмотренная настоящим изобретением обработка также применима по отношению к другим процессам проращивания. На фиг. 1 представлен график, показывающий микробицидную активность, содержащуюся в фильтрате культуры молочнокислой бактерии и определенную с помощью турбидометрического метода. Нормальная кривая роста тестерного организма Е. agglomerans E-396, а также ингибирующий эффект, оказываемый на рост вышеупомянутого тестерного организма фильтратами культуры продуцирующих штаммов L. plantarum E-76 и Р. pentosaceus E-390. На фиг. 2 схематически представлено влияние культуральной жидкости Р. pentosaceus E-390, добавленной на разных стадиях осоложения, на полный титр бактерий в ходе осоложения. На фиг. 3 представлено влияние клеток P. pentosaceus E-390, добавленных на разных стадиях осоложения, на полный титр бактерий в ходе осоложения. На фиг. 4 представлен полный титр бактерий в течение различных стадий лабораторного осоложения при добавлении к воде, используемой для замачивания ячменя, культуральных жидкостей Р. pentosaceus E-390 и L. plantarum E-76, либо концентрированных культуральных жидкостей. На фиг. 5 представлен полный титр бактерий в течение различных стадий лабораторного осоложения при добавлении к воде, используемой для замачивания ячменя, культуральных жидкостей Р„ pentosaceus Е-390 и L plantarum E-76, либо концентрированных и фракционированных культуральных жидкостей. Фиг. 6 демонстрирует влияние культур молочнокислых бактерий, добавленных на стадии осоложения, на фильтра 11 12 27008 цию получаемой массы (ТергаІ-фильтрацию). П р и м е р 1. Микробицидное действие» оказываемое'различными штаммами молочнокислых бактерий на микробы, встречающиеся в ходе осоложения. В эксперименте исследовали микробицидный эффект, оказываемый препаратами, продуцированными разными штам 10 Lactobacillus lactis ssp. lactis ssp. diacitilactis Leuconostoc mesenteroides і ssp. mesenteroides ssp. mesenteroides ssp. mesenteroides Pediococcus damnosus Pediococcus parvulus Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus \ЛТ-Е-90414 (E-414) VTT-E-90423 .(E-423) (E-389) (E-415) (E-466) (E-65) (E-315) (E-67) (E-68) (Є-317) (E-390) (DSM 7389) VTT-E-90391 (E-391) VTT-E-78076 (E-76) (DSM 7388) VTT-E-79098 (E-98) VTT-E-90389 VTT-E-90415 VTT-E-90466 VTT-E-76065 vTT-E-88315 VTT-E-76067 VTT-E-76068 VTT-E-88317 VTT-E-90390 Lactobacillus curvatus Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum Вышеперечисленные штаммы были получены из VTT, Collection of Industrial Microorganisms (Biotechnical Laboratory, Finland). Штамм Lactobacillus plantarum (E76) был депонирован в DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen) под номером 7388 Штамм Е76 (DSM 7388) был выделен из пива с использованием техники, известной для жидких продуктов, и проанализирован/ идентифицирован с помощью хорошо известных методов анализа. Штамм Pediococcus pentosaceus (E-390) был депонирован в DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen) под номером 7389. Штамм E-390 (DSM 7389) был выделен из гомогенизированных образцов растрескавшихся зерен ячменя и проанализирован/идентифицирован с помощью хорошо известных методов [1]. Депозитарии соответствуют условиям Будапештского договора. 2. Тестерные штаммы. В качестве тестерных штаммов среди прочих были использованы различные виды вредных микробов, встречающиеся в течение осоложения, а также штаммы молочнокислых бактерий, служившие продуцирующими штаммами. Вредные плесневые грибки были представлены в тестах плесневыми гриб мами молочнокислых бактерий, на микробы, встречающиеся в ходе осоложения. В качестве указанного препарата использовали культуральную жидкость, полученную методом стерильной фильтрации. 1. Продуцирующие штаммы. В качестве продуцирующих штаммов использовали следующие штаммы молочнокислых бактерий: ЗО ками Fusarium [Gibberella avenacea (бывший Fusarium avenaceum) VTT-D-80141 (D141) и VTT-D-80147 (D-147), а также Fusarium culmorum VTT-D-80148 (D-148) и VTT-D-80149 (D-149), Collection of Industrial 35* Microorganisms, Biotechnical Laboratory of VTT] и одним видом Aspergillus. Вредные грамотрицательные бактерии были представлены двумя штаммами из рода Enterobacter, а также одним видом 40 из рода Flavobacterium и одним - из рода Pseudomonas. Штаммы молочнокислых бактерий включали в себя штаммы, использованные в качестве продуцирующих штаммов, а также штамм Lactococcus sp. 45 Е-416. 3. Культивирование продуцирующих штаммов и получение стерильно профильтрованной культуральной жидкости. 50 Молочнокислые бактерии культивировали в среде MRS (MRS BROTH, Oxoid). Штаммы Pediococcus E-65, E-67 и E-68 культивировали в аэробных условиях при температуре 25°С, все остальные проду55 цирующие штаммы - в анаэробных условиях при температуре 30°С, период культивирования составлял от 2 до 5 дней. В , дальнейшем клетки осаждали с помощью центрифугирования, а полученный супернатант стерильно фильтровали. 13 27008 14 4. Культивирование тестерных штамличины, соответствующей стерильно промов. фильтрованному препарату. Суспензию спор плесневого грибка В случае каждого тестерного штамма Fusarium получали, культивируя штамм укаростовая среда представляла собой срезанного грибка в растворе КМЦ (карбок- 5 ду, используемую для культивирования симетилцеллюлозы) при температуре 25°С • соответствующего тестерного штамма. в течение 5-6 дней в виде интенсивно Культивирование плесневых грибков перемешиваемой культуры, суспензируя Fusarium и Aspergillus осуществляли в образующиеся споровые частицы в расттечение 5 дней, при температуре 25°С и воре TWEEN, фильтруя полученную сус- 10 интенсивном перемешивании. Соответстпензию и отбирая фильтрат. вующие условия для грамотрицательных бактерий были: в случае штамма Суспензию спор плесневого грибка Enterobacter - 30°С, в остальных случаях Aspergillus получали непосредственно на - 25°С, при перемешивании в течение 2 PD-агаре (Potato Dextrose, Difco) при тем- 15 дней. Выращивание молочнокислых бакпературе 25°С в течение 3 дней. терий проводили в течение 3 дней при Грамотрицательные бактерии культитемпературе 30°С и перемешивании. вировали в аэробных условиях в среде С помощью вышеупомянутого прибоNB (Nutnent broth, Difco) в течение 1 дня, ра определяли способность исследуемых штамм Enterobacter - при температуре 20 проб поглощать видимый свет с длиной 30°С, а штаммы Flavobactenum и волны 420-580 нм. После культивироваPseudomonas - при 25°С. ния выстраивали кривую роста для каждой пробы и рассчитывали площадь под Молочнокислые бактерии культивирополученной кривой. вали в соответствии с пунктом 3 (см. вы25 Микробицидный эффект продуцируюше). щего штамма, сказывающийся на росте 5. Определение микробицидного тестерного штамма, выражали в виде проэффекта молочнокислых бактерий. цента подавления, определяемого путем Микробицидную активность полученсравнения величин площадей под кривыной культуральной жидкости оценивали с помощью метода дисков, либо турбидо- 30 ми роста в контроле и при использовании метрически. стерильно профильтрованного препарата продуцирующего штамма, соответственно. 5.1. Метод дисков для определения микробицидной активности. 6. Определение фунгицидного эффекта конкретных молочнокислых бактерий. Стерильно профильтрованную культуральную жидкость или ее разведение рас- 35 Изучали фунгицидный эффект, произкапывали по 100 мкл на диски фильтроводимый шестью штаммами молочнокисвальной бумаги (диаметр 12,7 мм). Укалых бактерий: Е-76, Е-98, Е-315, Е-317, Езанные диски помещали на чашки с ага414 и Е-415 по отдельности на все плесром для подсчета бляшек, засеянные жидневые грибки Fusanum, используемые в кой культурой тестерного организма (0,3 40 качестве тестерных штаммов. В указанмл разведения 10 г ). Полученные образцы ном эксперименте проводили визуальную культивировали в течение 24 ч при темоценку помутнения культур плесневых пературе 30°С, после чего измеряли диагрибков, к которым были добавлены разметр (в мм) образовавшейся зоны подавные разведения стерильно профильтроления. 45 ванного препарата, полученного при куль5 2. Турбидометрический метод для тивировании каждого из штаммов молочопределения микробиологической активнокислых бактерий (табл. 3). ности. В контрольных исследованиях вместо В указанном методе использовали авкультуральной жидкости использовали вотоматический турбидометр (Bioscreen, 50 ду Milli-Q, либо воду Milli-Q, доведенную Labsystems). молочной кислотой до рН 3,6. Исследуемая проба состояла из 10% Культивирование проводили в тестерпо объему культуры тестерного организных пробирках со средой КМЦ при темма, 10% по объему стерильно профильтпературе 25°С в течение 5 дней. Резуль-рованной культуральной жидкости (расс- 55 таты учитывали визуально. читаны по отношению к объему пробы) и 7. Результаты. ростовой среды. В случае контролей, стеВ табл. 1 и 2, а также на фиг.° 1 рильно профильтрованный препарат запредставлены микробицидные активносменяли дистиллированной водой, рН коти, выявленные для разных штаммов моторой доводили молочной кислотой до велочнокислых бактерий методом дисков или 15 27003 16 щевых патогенов, а также микробов, нес помощью турбидометрического спосожелательных для пищевых продуктов. ба, соответственно. П р и м е р 3. Влияние препаратов В табл. 3 представлены визуально опмолочнокислых бактерий, а также препаределяемые фунгицидные активности. Полученные результаты свидетельст- 5 ратов, полученных с помощью молочнокислых бактерий, на микрофлору осоловуют о том, что вышеупомянутые штаммы жения и качество солода. молочнокислых бактерий подавляют рост вредных плесневых грибков Fusarium и 1. Используемые штаммы. других нежелательных микробов, встреВ эксперименте использовали штамм чающихся в ходе процесса сбраживания, 10 молочнокислой бактерии Pediococcus не оказывая при этом практически никаpentosaceus VTT-E-90390 (E-390). кого влияния на полезные микробы. ПоРостовой средой для инокулята слулученные результаты показывают возможжила среда MRS. Указанные бактерии ность использования молочнокислых баккультивировали в течение 2 дней в 10 мл терий в способе, предусмотренном нас- tS~ среды MRS при температуре 30°С. Объем тоящим изобретением инокулята был равен 1% от объема ростового раствора. 2. Ячмень. П р и м е р 2. Микробицидное дейстИспользовали ячмень сорта Kymppi вие, оказываемое определенными штаммами молочнокислых бактерий на пище- 20 урожая 1990 г., в котором доля зерен, зараженных плесневым грибком Fusarium, вые патогены, а также на микробы, нежесоставляла 55%. лательные для пищевых продуктов. 3. Процесс соложения. В настоящем эксперименте исследоПорции ячменя весом 1000 г ополасвали микробицидный эффект, проявляемый препаратами, полученными с помощ- 25 кивали в водяной бане при температуре ьк> штаммов Pediococcus pentosaceum VTT12°С в течение 1 ч. Используемую для Е-90390 (Е-390) и Lactobacillus plantarum ополаскивания воду заменяли на первую VTT-E-78076 (£-76), по отношению к пиводу для замачивания, которую через 5 ч щевым патогенам, а также к микробам, заменяли на вторую воду для замачиванежелательным для пищевых продуктов. 30 ния. Через 16 ч после этого проводили В качестве тестерных организмов испольстадию воздушного покоя. Назначением зовали штаммы, относящиеся к родам стадии воздушного покоя являлось удалеBacillus, Yersinia, Listeria, Pseudomonas, ние воды с поверхности зерен. ПродолSalmonella и Staphylococcus. жительность этой стадии была равна 8 ч. В качестве препарата использовали 35 В ходе замачивания влажность ячменя досстерильную культуральную жидкость мотигала 44%. В течение стадии замачивалочнокислых бактерий, полученную в соотния ячмень подвергали аэрации. ветствии с примером 1. Все остальные Вслед за замачиванием осуществлятестерные штаммы культивировали в тели проращивание. Ячмень проращивали в чение 16-18 ч в среде Iso-Sensitest (Oxoid), 40 ящиках для проращивания в течение 6 за исключением штамма Listeria, который дней при температуре 14°С. Для того, чтобы выращивали в триптозо-фосфатной среподдерживать влажность на уровне 44%, де. Температура культивирования была указанные порции ячменя ежедневно увравна 30°С, за исключением штаммов лажняли и ворошили. Полученный таким Salmonella, Listeria и Staphylococcus, в слу- 4S образом зеленый сопод подсушивали по чае которых она равнялась 37°С. 21-часовой температурной программе. В Микробицидную активность определятечение 4,5 ч температура равнялась 50°С. ли с помощью турбидометрического споВ течение следующих 4,5 ч ее повышали соба, описанного в примере 1. Условия до 60°С, после чего поддерживали на этом проведения эксперимента в плане росто- 50 уровне в течение 4 ч. На протяжении посвого субстрата и температуры соответстледующих 5 ч температуру равномерно вуют вышеописанным. Длительность инповышали до 85°С и выдерживали на этом кубирования была равна 24 ч, за исклюуровне в течение оставшихся 3 ч. Конеччением штаммов Bacillus и Yersinia, для ное содержание влаги в солоде становикоторых она составляла 48 ч. 55 лось равным 4%. По окончании указанноПолученные результаты, представленго процесса механически отделяли перные в табл. 4, свидетельствуют о том, что вичные корешки. добавление предусмотренного настоящим Осоложение, осуществленное в отизобретением препарата молочнокислых сутствие каких бы то ни было добавок, бактерий вызывает подавление роста пирассматривали в качестве контроля. 17 27008 4. Препарат молочнокислых бактерий и препарат, полученный с помощью молочнокислых бактерий. Для получения указанных препаратов использовали клетки молочнокислых бактерий, выделенные из соответствующих культуральных жидкостей, а также культуральные жидкости, содержащие токсичные для микробов вещества, как в комбинации друг с другом, так и по отдельности. Содержащую клетки культуральную жидкость добавляли в количестве 120 мл на кг ячменя, либо проводили добавление клеток, выделенных из 120 мл культуральной жидкости. Указанное выделение осуществляли с помощью центрифугирования соответствующей культуральной жидкости, после чего выделенные клетки суспендировали в воде. В тех случаях, если проводили добавление культуральной жидкости, указанную культуральную жидкость использовали как таковую. Клеточные титры добавляемых препаратов находились в пределах приблизительно от 10° до 109 КОН/мл. 5. Добавки препаратов молочнокислых бактерий. Препараты молочнокислых бактерий добавляли либо к ячменю, либо в начале I стадии замачивания, либо в начале I и И стадий замачивания, либо в начале проращивания. 6. Проводимые анализы. Пробы отбирали на каждой стадии осоложения. 6.1. Учет плесневых грибков осуществляли следующим образом. Процент зерен, зараженных плесневым грибком Fusarium, определяли с помощью агара Czapek iprodion dtdoral (агара Czip), который является селективным для плесневых грибков Fusanum, а также влажной фильтровальной бумаги [2]. Идентификацию плесневых грибков Fusanum проводили на основании типичной морфологии их колоний и спор, а также на основании красной окраски. Учет плесневых грибков Aspergillus и Penicillum осуществляли с использованием селективного солодового солевого агара [2]. Учет других наиболее обычных плесневых грибков проводили на влажной фильтровальной бумаге. 6.2. Учет молочнокислых бактерий осуществляли на агаре MRS как в случае добавляемых культур, так и при анализе проб осоложения. 6.3. Учет полных бактериальных титров проводили на агаре для подсчета бляшек (Dtfco). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6.4. Химические показатели солода определяли с использованием методов, известных применительно к осоложению [3]. 7. Результаты. В табл. 5 приведены титры плесневых грибков Fusarium и молочнокислых бактерий на различных стадиях осоложения при добавлении культуральной жидкости Е-390. На фиг. 2 и 3 представлены полные бактериальные титры на различных стадиях осоложения в случае добавления культуральной жидкости штамма Е-390 и клеток Е-390. В табл. 6 приведены результаты анализа солода при добавлении культуральной жидкости штамма Е-390 или клеток Е-390. Данные результаты показывают, что обработка согласно изобретению уменьшает, в частности, количество плесневого грибка Fusarium и общий бактериальный титр на различных этапах осоложения. Добавка препарата не оказывает нежелательного эффекта на качество солода. Обратное же верно: обработка по изобретению улучшает фильтрацию затира, полученного из сусла, и снижает содержание р-глюкана в солоде. П р и м е р 4. Получение препаратов, производимых с помощью молочнокислых бактерий. 1. Получение концентрированной культуральной жидкости. Продуцирующие штаммы Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (Е-390) и LactobacitJus plantarurn VTT-E-78076 (E-76) культивировали в ферментере в объеме 15 л. Объем инокулята составлял от 6 до 7%, культивирование осуществляли в среде MRS при температуре 30°С в течение 2 дней при микроаэрофильных условиях. Полученные культуральные жидкости концентрировали в десять раз и в двадцать раз с помощью лиофилизации и выпаривания. Микробицидную активность полученных концентратов оценивали с использованием метода дисков. 2. Получение очищенного раствора, содержащего микробицидные соединения. Культуральную жидкость молочнокислых бактерий подвергали очистке с помощью гель-хроматографического фракционирования в соответствии с размером молекул. Фракции, обнаружившие активность в исследовании методом дисков или с помощью турбидометрического способа, объединяли и еще раз прогоняли через гелевую колонку. П р и м е р 5. Влияние препаратов молочнокислых бактерий и препаратов, по 19 27008 лученных с помощью молочнокислых бактерий, на микрофлору осоложения и на качество солода. 1. Используемые штаммы и препараты, получаемые с помощью этих штаммов. Использовали следующие штаммы бактерий: Lactobacillus pfantarum VTT-E78076 (Е-76) и Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E-390). Указанные штаммы были получены из \?ТТ, Collection of Industrial Microorganisms (Biotechnical Laboratory, Finland). Получение препаратов осуществляли так, как это описано в примере 1, п. 3; примере 3, п. 1; и примере 4, п. 1 и 2. 2. Ячмень. Использовали ячмень сорта Kymppi урожая 1991 года. 3. Процесс осоложения. Осоложение проводили так, как это описано в примере 3» за исключением того, что продолжительность стадии проращивания была равна 8 дням. Конечное содержание влаги в получаемом солоде становилось меньше 5%. 4. Осоложение. Осоложение осуществляли в лабораторных условиях. Осоложение, проведенное в отсутствие каких бы то ни было добавок, рассматривали в качестве контроля. 4.1. Первый вариант осоложения. Препаратами, используемыми в лабораторном осоложении, служили бесклеточные культуральные жидкости, концентрированные в десять раз, а также необработанные культуральные жидкости, содержащие клетки. Указанные препараты добавляли в начале стадии замачивания I, либо в начале стадий замачивания I и И. Исследования осоложения 1-8 проводили следующим образом. Тест № 1: Контроль, ячмень Kymppi 1991; Тест № 2: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл содержащей клетки культуральнои жидкости штамма Е-76; Тест № 3: В начале стадии замачивания I добавляют 120 мл концентрированного в 10 раз фильтрата культуральнои жидкости штамма Е-76; Тест № 4: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл концентрированного в 10 раз фильтрата культуральнои жидкости штамма Е-76; Тест № 5: В начале стадий замачивания і и II добавляют 120 мл культуральнои жидкости штамма Е-390; 5 10 15 20 25 '30 35 40 45 50 55 20 Тест № 6: В начале стадии замачивания I добавляют 120 мл концентрированного в 10 раз фильтрата культуральнои жидкости штамма Е-390; Тест № 7: В начале стадий замачивания I и Н добавляют 120 мл концентрированного в 10 раз фильтрата культуральнои жидкости штамма Е-390; Тест № 8: В начале стадий замачивания I и II добавляют 60 мл содержащей клетки культуральнои жидкости штамма Е-76 и 60 мл содержащей клетки культуральнои жидкости штамма Е-390. 4.2. Второй вариант осоложения. Препаратами, используемыми в лабо-, раторном осоложении, служили бесклеточны§, концентрированные в 20 раз фильтраты культур, их бесклеточные очищенные фракции, содержащие микробицидную активность, а также необработанные, содержащие клетки культуральные жидкости. Осуществляли контроль рН воды для замачивания. Препараты добавляпи в начале стадий замачивания I и II. Исследования осоложения 9-16 проводили следующим образом. Тест № 9: Контроль, ячмень Kymppi 1991; Тест № 10: В начале стадий замачиванич I и II добавляют 120 мл воды, рН 3,8; Тест № 11: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл содержащей клетки культуральнои жидкости штамма Е-76; Тест № 12: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл фракционированного концентрата штамма Е-76, рН 3,8; Тест № 13: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл концентрированного в 20 раз фильтрата культуральнои жидкости штамма Е-76; Тест № 14: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл содержащей клетки культуральнои жидкости штамма Е-390; Тест № 15: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл фракционированного концентрата штамма Е-390, рН 3,8; Тест № 16: В начале стадий замачивания I и II добавляют 120 мл концентрированного в 20 раз фильтрата культуральной жидкости штамма Е-390. 5. Проводимые анализы. Отбор проб осуществляли на каждой стадии осоложения. Титры плесневых грибков и молочнокислых бактерий, полные бактериальные 21 27008 титры, а также физические и химические показатели качества получаемого солода определяли так, как это описано в примере 3. 5 6. Результаты. На фиг. 4 и 5 представлены полные бактериальные титры на разных стадиях процесса осоложения при использовании в воде для замачивания культуральных жидкостей молочнокислых бактерий с 10 клетками, либо концентрированных или фракционированных фильтратов культуральных жидкостей. В табл. 7-10 приведены концентрации плесневых грибков Fusarium и других плес- 15 невых грибков, а также молочнокислых бактерий на разных стадиях осоложения для обоих вариантов осоложения. В табл. 11 и 12 представлены результаты исследования солода для обоих ва- 20 риантов осоложения. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что предусмотренные настоящим изобретением обработки снижают, в частности, содержание бакте- 25 риальных грибков Fusarium, а также полный бактериальный титр на различных стадиях осоложения. Кроме того, отмечено, что не только культуральные жидкости, но, в частности, и концентрированные и 30 фракционированные культуральные фильтраты оказывают благоприятный эффект по отношению к плесневым грибкам Fusarium. На основании проведенных анализов солода можно сделать вывод о том, что 35 добавки культуральной жидкости штаммов Е-76 и Е-390 способствуют улучшению фильтруемости сусла, получаемого из соответствующего солода; также содержание р-глюкана в указанном солоде 40 ниже, чем в контрольном. П р и м е р 6. Влияние препаратов, полученных с помощью молочнокислых бактерий и используемых в качестве добавок в процессе осоложения, на фильт- 45 рацию получаемой массы. Представленная на фиг. 6 диаграмма показывает влияние предусмотренной настоящим изобретением обработки препаратами, полученными с помощью штам- 50 мов молочнокислых бактерий (120 мл культуральной жидкости на кг ячменя), на фильтрацию массы, производимой из соответствующим образом обработанного солода. 55 В этом эксперименте используют штаммы, перечисленные в примере 1: Е390; Е-416; Е-98, Е-317, Е-390, Е-76 \л Е315. Анализ проводили, используя метод Terpal фильтрации [4]. 22 Из полученных результатов видно, что предусмотренная настоящим изобретением обработка улучшает фильтрацию производимой массы. В следующих примерах показано действие молочнокислой бактерии на концентрацию микотоксинов, дезоксинивапенола и зеараленона, продуцируемых плесенями Fusarium при осоложении ячменя. П р и м е р 7. Действие молочнокислой бактерии на концентрацию дезоксиниваленола (DON) при осоложении ячменя, зараженного плесенью F. culmorum D148. 1. Использованные штаммы. В данном тесте были использованы штаммы молочнокислых бактерий Lactobacttlus plantarum (Е-76) и Pediococcus pentasaceus (Е-390). Эти бактерии культивировали в анаэробных условиях в MRS питательном растворе при 30°С в течение 3-4 дней. Между тестами бактериальные штаммы хранили в их питательном растворе в анаэробных условиях при 4°С. 2. Ячмень. Использовали сорт ячменя Kymppi урожая 1994 года, к которому было добавлено 2 мл культурального раствора Fusarium на 100 г ячменя. Штамм Fusarium был выращен на качалке в растворе CMC в течение около 7 дней до образования спор. Плотность спор культурального раствора F. culmorum VTT D-80148 (D148) составляла около 106 спор/мл раствора. Зараженный ячмень инкубировали при 25°С в течение 3 дней. Ячмень ежедневно перемешивали и в течение ночи высушили при 30°С до его первоначальной влажности. 3. Процесс осоложения. Программа замачивания для 1000 г порции ячменя была следующей: промывание 1 ч, первое замачивание 7 ч, первый перерыв для проветривания 16 ч, второе замачивание 8 ч, второй перерыв для проветривания 15 ч, погружение. Температура замачивания была 12°С, а желаемая влажность ячменя составляла 46% к концу замачивания. Для того, чтобы убедиться в дыхании и метаболизме ячменя, между стадиями замачивания делали перерывы для проветривания и образцы ячменя во время перерывов переносили в аэрируемую область. Обеспечивалось также проветривание сосудов для замачивания. После второго перерыва для проветривания образцы ячменя взвешивали для определения содержания влаги. Если влажность была ниже 46%, образцы 23 27008 ячменя погружали в воду на короткий промежуток времени. Соотношение ячменя и воды при замачивании составляло 1:1,5. После чего пробы ячменя помещали в боксы для проращивания. Образцы ячменя проращивали 8 аэрируемых боксах для проращивания в течение б дней при 14°С. Для доведения влажности до желаемого уровня 46%, образцы ячменя ежедневно увлажняли и ворошили. Полученный таким образом зеленый солод высушивали, используя 21-часовую температурную программу, как на стадии 3 примера 3. И наконец, механически удаляли из солода проростки. Осолаживание, осуществляемое без добавления молочнокислой бактерии, использовали как контрольный тест. 4. Препарат молочнокислой бактерии. В табл. 13 представлены рН, клеточный титр и микробицидная активность (дисковый метод, пример 1, пункт 5) культуры молочнокислой бактерии, добавляемой при осолаживании. 5. Добавление-препарата молочнокислой бактерии. Препарат молочнокислой бактерии добавляли в начале стадии первого и второго замачивания. Соотношение культуры молочнокислой бактерии к воде при осолаживании поддерживали на уровне 8%. 6. Осуществленные анализы. Концентрацию дезоксиниваленола в каждом образце ячменя определяли с помощью газовой хроматографии. Для узнавания и количественного определения дезоксиниваленола использовали массспектрометр. 7. Результаты. На фиг. 7 показано влияние добавления молочнокислой бактерии на содержание дезоксиниваленола при осоложении ячменя, зараженного штаммом F. culmorum D148. Из полученных результатов видно, что под действием штамма L plantarum Е-76 в солоде оказывается на 5 0 % меньше дезоксиниваленола по сравнению с необработанным солодом, а под действием штамма P. pentosaceus E-390 в солоде оказывается на 2 5 % меньше дезоксиниваленола по сравнению с необработанным солодом. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 П р и м е р 8. Влияние молочнокис- 55 лой бактерии на образование дезоксиниваленола (DON) при осоложении ячменя, естественным образом загрязненного де° косиниваленолом и плесенями Fusanum. 1, Использованные штаммы. 24 В данном тесте были использованы штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum (Е-76) и Lactobacillus aadophilus VTT E-87276 (E-276). Штамм Lactobacillus plantarum культивировали в примере 7. Температура культивирования для штамма Lactobacillus acidophilus была 37°С. 2. Ячмень. • ' Использовали сорта ячменя низкого качества Kustaa, loviisa и Jo 1599 урожая 1993 года. 3. Процесс осоложения. Осолаживание осуществляли так же, как в примере 7, за исключением порций ячменя (100 г) и соотношения ячмень:вода при замачивании (1:4,0). Осолаживание, осуществляемое без добавления молочнокислой бактерии, использовали как контрольный тест. 4. Препарат молочнокислой бактерии. В табл. 14 представлены рН, клеточный титр и микробицидная активность (дисковый метод, пример 1, пункт 5.1) культуры молочнокислой бактерии, добавляемой при осолаживании. Б. Иностранный ячмень. 1. Использованные штаммы соответствуют пункту А 1. 2. Ячмень. Использованный ячмень состоял из сортов 1-3 иностранного ячменя низкого качества. Осолаживание осуществляли так же, как в примере 7, за исключением порций ячменя (20 г) и соотношения ячмень.вода при замачивании (1:17,0). Ячмень проращивали 6 дней в пластиковых пакетах, помещенных в пластиковый бокс на металлической рамке до желаемой влажности 46%. Пакеты ежедневно поворачивали. Для сохранения влажности некоторое количество воды выливали на дно бокса для проращивания. Зеленый солод высушивали в инкубаторе при 50°С в течение 17 ч, после чего температуру поднимали до 85°С и ячмень сушили еще в течение 4 ч. Проростки удаляли механически. 4. Препарат молочнокислой бактерии, В табл. 15 представлены рН, клеточный титр и микробицидная активность (дисковый метод, пример 1, пункт 5.1) культуры молочнокислой бактерии, добавляемой при осолаживании. 5. Добавление препарата молочнокислой бактерии. Препарат молочнокислой бактерии добавляли в начале стадии первого и второго замачивания. Соотношение культуры 25 27008 молочнокислой бактерии к воде при осолаживании поддерживали на уровне 8%. 6. Осуществленные анализы. Концентрацию дезоксиниваленола в каждом образце ячменя определяли с помощью теста Elisa (Ridascreen). 7. Результаты. В табл. 16 и на фиг. 8 и 9 показаны концентрация дезоксиниваленола при осоложении порций финского и иностранного ячменя, а также влияние молочнокислой бактерии на образование дезоксиниваленола (DON) при осоложении ячменя, естественным образом загрязненного дезоксиниваленолом и плесенью Fusarium. На фиг. 10 показаны средние значения концентрации дезоксиниваленола трех домашних и трех иностранных образцов ячменя, то есть влияние культур молочнокислой бактерии, добавленных к воде для первого и второго замачивания на концентрацию дезоксиниваленола (DON) при осоложении финского и иностранного ячменя, определенного с помощью теста Elisa (Ridascreen). Результаты даны в виде средних величин. Из полученных результатов видно, когда добавлен культуральный раствор L. plantarum E-76, особенно при осолаживании образцов иностранного ячменя, концентрация дезоксиниваленола выше в необработанном солоде, чем в присутствии молочнокислой бактерии. Под действием штамма L. plantarum концентрация дезоксиниваленола (средняя для трех образцов) оказывается на 68% ниже, чем в необработанном солоде, а под действием штамма Lactobacillus acldophilus (E-276) концентрация дезоксиниваленола оказывается на 75% ниже, чем в необработанном солоде. Порции финского ячменя имеют низкие концентрации дезоксиниваленола, которые могут быть далее при осолаживании еще снижены. П р и м е р 9. Влияние молочнокислой бактерии на содержание зеараленона (ZEN) в солоде при осолаживании ячменя, зараженного штаммами Fusarium culmorum D-148 и F. graminearum D-470. A:1. Был использован штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum (E-76). Этот штамм, ячмень (время заражения 7 дней), процесс осолаживания, препарат молочнокислых бактерий и добавки препарата молочнокислых бактерий, ис 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 26 пользованные в этом примере были такими же как в пунктах 1-5 примера 7. 6. Осуществленные анализы. Содержание зеараленона в каждом образце ячменя определяли с помощью жидкостной хроматографии. 7. Результаты.4 На фиг. 11 показано влияние добавления молочнокислой бактерии на содержание зеараленона при осоложении ячменя, зараженного штаммом F. culmorum D 148. Из полученных результатов видно, что под действием штамма L plantarum E-76 в солоде оказывается на 46% меньше зеараленона по сравнению с необработанным солодом. Б: 1. Использованные штаммы. В данном тесте были использованы штаммы молочнокислых бактерий LactobaciHus plantarum (E-76), Lactobacillus acidophilus VTT E-87276 (E-276) и Pediococcus pentsaceus (E-390). Культивирование осуществляли, как описано в примере 7. 2. Ячмень. Использовали сорт ячменя Kymppi урожая 1994 года, который был заражен культуральным раствором F. graminearum VTT D95470 (D-470), как описано в п. 2 примера 7. Процесе осолаживания, препарат молочнокислых бактерий VJ добавки препарата молочнокислых бактерий, использованные в этом примере, были такими же как в пп. 3-5 примера 7. Дополнительно культура молочнокислой бактерии L. acidophilus E-276, добавленная при осолаживании, имела рН 4,05, титр клеток 5.8Е+08 PMY/мл и зону ингибирования 14 м (дисковый метод, пример 1, п. 5.1). 6. Осуществленные анализы. Содержание зеараленона в каждом образце ячменя определяли с помощью теста Ehsa (Rtdascreen). 7. Результаты. На фиг. 12 показано влияние добавления молочнокислой бактерии на содержание зеараленона при осоложении ячменя, зараженного штаммом F. graminearium VTT O-95470 (D-148). Из полученных результатов видно, что под действием молочнокислой бактерии в солоде оказывается на 37-55% меньше зеараленона по сравнению с необработанным солодом. 27 28 27008 Т а б л и ц а Микробицидные активности, присутствующие в культуральных жидкостях молочнокислых бактерий, выявленные методом дисков молочнокислая бактерия Е-76 Е-98 Е-315 Е-317 Е-390 клет. титр* ХОЕ/мл ш 3,2 1,2 1,6 1,0 1,9 х х х х х 10» 10 ее 108 . 1 0е 10 рН культ. жидкости диаметр зоны подавления, мм 3,70 3,72 3,90 3,86 3,92 19 17 16 16 15 * Клеточный титр тестерного организма Е-396 - 4,0xt0 7 КОЕ/мл; на чашке 1,2x105 КОЕ/мл. T a 6 Jп и ц а 2 Микробицидный эффект, оказываемый молочнокислыми (бактериями на рост различных микробов Продуцирующи?і штамм Конц. tectoooccus I-eUCODOStCX • Pedіcoccus Lactobacillus клеток см . .. at. _ .. E-414 E-423 Ё-389 E-466 E-65 E-315 E-67 E-68 E-317J E-390 E-391 E-76 E-98 КОЕ/мл Тестерный штамм Плесневые грибки -28 Aspergilltis iiiger D-5 -36 - 3 8 -16 -33 -21 -20 -24 -28 -44 -39 - 4 1 2,0хЮ 4 -39 1 FUsarium avenaceum D-Hl * -36 -36 -49 - 5 5 - 3 3 -59 -42 -44 -52 -47 -42 -79 -74 6 Ох1О3 # I>_j47l) -12 -20 -36 -8 -66 -63 «27 - 4 3 -50 -53 -37 -70 - 6 7 2,OxlO 4 1 " culmonin D-148 * -5 -17 -29 -26 -9 -25 -10 -16 - 2 0 -24 -21 -35 - 3 0 2,$xlO3 1 -6 3 -20 - 3 0 -10 -26 -18 -20 -23 -9 -39 - 3 2 6,0xl0 2 D-149 * Грам-отрицательные бактерии -92 Enterobaclcr agglonerans E-396 - 8 9 -94 HO -96 -92 -93 -96 - 9 1 -93 -93 -93 - 9 3 6,0xl04 Flavobacteritin sp. E-399^ - 9 8 -99 -99 -98 -99 -97 -98 -98 -98 -98 -99 -96 -97 Pseukitcxtas fluoresceiis £-397^) - 9 8 -98 -97 - 9 8 -97 -97 -98 -98 -97 -97 -97 -98 -97 1 # 0 x l ? ^ «Молочнокислые бактерии Lac tec occi is l a c t i s _ ... -57 -39 -48 -53 - 4 4 -41 -56 ssp. l a c t i s Е-4І4 - 3 7 -56 5^х1О 4 -33 -24 -47 - 4 6 • • s s p . d i a c i t i i a c t i s E-423 - 1 5 -28 - 4 3 -29 -34 -43 - 4 2 4,0xl0 4 -35 -52 -39 -87 - 3 7 - 3 3 -61 -37 Lactococctts spc E-416 - 1 5 -23 -16 -41 -31 -35 « 3 6 - 4 1 -31 -57 -58 2,OxlO4 lauconostoc mesenteroides o) -30 -26 - 5 0 -39 -45 -11 -38 - 4 7 -41 - 3 8 -57 -58 4.OxlO4 pspf n«2spn^eroiciesf F-189^' - 1 9 Ped і coccus parvulus E-315 -6 6 -7 -8 -7 -7 -7 -12 - 1 2 l.OxlO 5 -8 -6 " pentosaceus E-68 10 19 21 4 20 І0 9 17 15 8 3 18 5 6,0xl0 4 5 i. « _ с -6 0 -1 -7 -3 -5 -8 -3 -6 -5 -7 -? 2tQKl0 factobacilltis plantanan E-76 -2 -6 -5 -12 -9 -14 -12 -10 - 1 6 -14 -10 -22 -22 2,0xl05 " " E-98 -1 -3 •6 • -8 -3 -9 -6 -6 -10 -4 -8 «41 І^Охії 5 л E 3 9 0 HO - не определено; отрицательное значение - подавление роста; положительное значение - стимуляция роста. >55% - сильное подавление; 35-55% - относительно сильное подавление; 15-34% - относительно слабое подавление; 15% слабое подавление или его отсутствие. , 1 ) вызывает вспенивание пива; 2)затрудняет фильтрацию массы. N3 (О і 00 со О 31 32 27008 Т а б л и ц а 3 Влияние культуральной жидкости молочнокислых бактерий на плесневые грибки Fusanum, вызывающие вспенивание пива Разведение культуральной жидхости D-141 Штамм молочнокислых 5:6 3:6 4:6 б: б бахтерий 1:6 2:6 S-76 4 Е-98 Е-315 + + Е-317 • + Б-414 • + Е-415 * + Контроль * + + + + Контроль рН Разведение культуральной жидкости D-147 Штамм молочнокислых бактерий 1:6 2:6 3:6 4:6 5:6 6:6 Е-76 + Е-98 + + S-317 + Б-414 4 + Е-415 + Е-315 + Контроль Контроль рН + + 27008 33 34 Продолжение табл. 3 Разведение культуральной жидкости D-148 Штамм молочнокислых 3:6 4:6 2:6 бактерий 1:6 6:6 5:6 + • S-76 + Е-98 S-315 Е-317 4 Е-414 + + S-415 • Контроль Контроль рН Разведение культуральной жидхости молочнокислых 2:6 3:6 бактерий 1:6 4:6 5:6 6:6 D-149 Штамм Е-76 + Е-98 + Е-315 + Е-317 + Е-414 + S-415 + Контроль Контроль рН Примечание: + и +" - четкий рост; "-" - отсутствие роста. 35 36 27008 Т а б л и ц а 4 Подавление роста, вызванное штаммами P. pensaceus Е-390 и L plantarum Е-76 E-390 Продуцирующие штаммы E-76 Твстерный организм Подавление зоны роста, % Bacillus csreus АТСС91339» 93 80 Yersinia enterclitiica ELI351* 85 54 Listeria monocytogenes KTL4126* 41. 49 Pseudcmonas fluorescans ELI97 59 Pseudcmonas fragi ATCC4973 34 93 Salmonella infantis ELI5* 90 98 Staphylccoccu3 aureus ELI200* 73 86 *Латогены, встречающиеся в пищевых продуктах. АТСС: American Type Culture Collection ELI: VTT, Food Research Laboratory KTL: National Public Health Institute. , 97 37 38 27008 Т а б л и ц а 5 Влияние культуральной жидкости P. pentosaceus, добавленной на различных стадиях осоложения, на титры Fusarium и молочнокислых бактерий в процессе осоложения Плесневые грибхи Fusarium ( зараженных зерен) % Ячмень Замач. Проращ. 55 72 96 25 3 б 77 3 120 мл КЖ*, вода для замач. I 55 62 98 14 120 мл КЖ*, вода для замач. I+II 55 42 90 9 120 мл О * , проращивание 55 78 91 3 Стадия добавления Контроль 120 мл КЖ*, ячмень Солод Молочнокислые бактерии (концентрация клеток, КОЕ/г), Контроль б ,0::101 3,4x102 2,2x10* 3 ,0хЮ 120 мл КЖ*, ячмень 1 ,2х10 8 1,1x10" 2,2x10* 1 Р 8х10° 120 мл КЖ*, вода для замач. I б ,0хЮ 1 ЗДхЮ7 2,8х107 1,4х10 г 120 мл КЖ*, вода для замач. I+II б,0x10! 7,4x10* 8,Зх107 5, ЗхЮ 120 мл КЖ*, проращивание б ,0x101 1,5х10в 2,7х108 2, 6х10 * КЖ - культуральная жидкость. 3 7 7 8 Таблица 6 Влияние культуральной жидкости или клеток P. pentosacues E-390, добавленных на разных стадиях осоложения, на качество солода Образец Влаж- Экст- Гру- ДифПроз- Филь- Время Вяз- FAN, глю- ность, ракт, бый фер. рач- трация оса- кость, каны, помол, экст- ность тонн. хариракт, помола, вания, хс.м. ХС.М. Хс.м. мл/ч мин сП мг/л X мг/л Моди- Гомо- Активфика- ген- ность ция, ность, йамилазы X X Ед/г' Актив- Перв. ность ко0ГЛЮ- решки, каназц Ед/кг г/кг Контроль 604 4,1 80,1 77,8 2,3 Прозр. 300