Спосіб одержання антивірусного препарату із дріжджів

Изобретение относится к технологии получения биологически активных препаратов Ііель изобретения -упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта. Для этого отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5-5%-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают. Экстракт упаривают в вакууме при 50°С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в воде и высушивают сублимацией. 9 табл. ловиях, но и промышленные кормовые дрожжи. Отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5-6%-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают Экстракт упаривают в вакууме при 50°С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в теплой воде и высушивают сублимацией Выделенные данным способом препараты состоят преимущественно из полисахаридов, хорошо растворимы в воде и обладают высокой антивирусной активностью П р и м е р 1.' Дрожжи Candida tropicalis К-41 выращивают в ферментерах на аэрированной жидкой среде следующего состава: 3 г/л, NaCI 0.3 г/л; MgSO4 0.4 л; О1 о о ел со 1659053 KH2PO4 I r/л; КгНРСМО.І і/л- глюкоза 25 г/л; биотин 2 мкг/л. Биомассу отделяют от кул ьтуральной жидкости центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин), высушивают в сублимационной сушке (30°С, давление- 103 н/м2) и используют по мере получения антивирусного препарата. Дрожжевые клетки гомогенизируют с помощью шаровой мельницы, растворимые вещества экстрагируют 6%-ной уксусной кислотой (2 ч при +2°С), осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость доводят до нейтрального значения рН добавлением 5 н NaOH и концентрируют 1.5 упариванием (50°С) в вакууме. К охлажденному концентрату добавляют 2 объема 96%-ного этанола и осаждают целевой продукт при +2°С. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в теплой (50°С) дистиллированной воде. Раствор центрифугируют, осадок отбрасывают, а препарат сушат в сублимационной сушке. В табл. 1 приводятся сведения о составе и активности препаратов, полученных из различных источников, в отношении вируса табачной мозаики на дурмане. 5 П р и м е р 4. Сухие дрожжевые клетки (40 г) обрабатывают 6%-ной уксусной кислотой по предлагаемому способу или водой (по прототипу). Растворимые вещества отделя10 ют центрифугированием и в полученных экстрактах определяют содержание углеводов (0,2%-ным антроном в концентрированной H2SO4} и белков (по микрометоду Бредфорда), а также антивирусную актив15 ность экстрактов (против ВТМ на листьях дурмана). Данные этого опыта приводятся в табл.2,3,4, Целевой продукт, экстрагированный 20 6% ной уксусной кислотой, по антивирусной активности существенно не отличается от продукта, полученного согласно способупрототипу. Тем не менее содержание углеводов, являющихся действующим началом 25 препарата, в этом препарате в 1,5 раза выше, чем в препарате, экстрагированном водой. В то же время большую долю (31%) последнего составляют белки, содержание которых в целевом продукте, экстрагиро30 ванном 6%-ной уксусной кислотой, не превышает 2% Выход очищенного препарата составляет 5,7% сухого веса дрожжей. Препарат имеет вид аморфного белого порошка, хорошо растворим в воде, термостабилен, не гигроскопичен и может длительно храниться в сухом месте без изменения порошковидной консистенции и высокой антивирусной активности. В его составе более 80% углеводов, примесь белков составляет не более 3%, нуклеиновых кислот следы. П р и м е р 2. В качестве исходного материала используют сухие кормовые 35 дрожжи промышленного изготовления. Экстракцию и очистку антивирусного начала проводят по той же схеме, что и в примере 1. Для этого применяют уксусную кислоту в 5%-ной концентрации. Выход препарата 40 несколько ниже (4,9%), однако антивирусная активность его выше, чем при экстракции 6%-ной кислотой. Препарат представляет собой аморфный порошок слабокоричневого цвета, хорошо раство- 45 рим в воде, термостабилен, не гигроскопичен и может долго храниться в сухом месте без потери физических характеристик и антивирусной активности. Состоит преимущественно из полисахаридов, примеси белков 50 не превышают 5%, нуклеиновых кислот 0,4%. П р и м е р з , Исходное сырье-промышленные кормовые дрожжи. Для экстракции и очистки антивирусного препарата исполь- 55 • зуют уксусную кислоту в оптимальной концентрации (5,5%). Выход препарата достаточно высок-5.2%, его антивирусная активность выше, чем при экстракции веществ 6%-ной уксусной кислотой. П р и м е р 5. 250 мг дрожжевых клеток Candida troplcalls К-41- высушенных лиофильно, гомогенизируют и целевой продукт из них экстрагируют 3%-, 5%-, 6%-, 8%-, !0%- или 15%-ной уксусной кислотой. Далее экстракт концентрируют упариванием в вакууме, осаждают спиртом. Определяют суммарное содержание белков и полисахаридов в препаратах и их способность ингибировэть инфекционность ВТМ на листьях дурмана. Данные этого опыта, приведенные в табл.5, показывают, что по мере увеличения концентрации уксусной кислоты с 3 до 10% выход полисахаридов повышается, а выход белков, наоборот, снижается (с 3,4 до 1,4%). Дальнейшее увеличение концентрации кислоты (до 15%) сопровождается снижением выхода полисахаридов. Антивирусной активностью обладают все препараты. Однако наиболее высокую активность отмечают у препаратов, экстрагированных 5-6%-ноЙ уксусной кислотой. Препараты, выделенные при более высокой концентрации кислоты (8-15%) в сравнимо низких (1 мкг/мл) концентрациях, не обладают активностью либо эта активность непостоянна. Намного мень•ией оказалась и активность препарата, экс 1659053 трагированного 3%-ной уксусной кислотой, вероятно, из-за присутствия примесей, снижающих активность ингибиторов, либо стимулирующих инфекционность вируса. При испытании действия различных 5 концентраций уксусной кислоты в качестве экстрагента целевого продукта в данном опыте нейтрализация ее щелочью сознательно не проводилась. Это дало возможность определить, насколько высокие 10 концентрации водородных ионов могут отрицательно повлиять на активность антивирусного начала. Измерения показывают, что заданные определенной концентрацией кислоты значения рН существенно не повы- 15 шаются в процессе концентрирования экстракта в вакууме благодаря испарению кислоты. Так, при концентрации кислоты 56% значение рН экстракта после концентрирования продукта в вакууме не выходит 20 за пределы 1-2, при этом антивирусная активность целевого продукта (по сравнению с более низкой концентрацией экстрагента 3%) не уменьшалась. ют центрифугированием и подвергают диализу (24 ч) против воды. Целевой продукт из диализата осаждают 5 объемами этилового спирта, осадок растворяют в воде и лиофилиаируют. На всех стадиях получения препарата определяют содержание белков и углеводов в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ. Данные сравнительной оценки предлагаемого способа и его прототипа приводятся ь табл.6. Выход препарата, полученного по предлагаемому способу, в условиях этого опыта достигает 2,5% В то время кзк, используя способ - прототип, удается получить лишь около 0,7% препарата от веса исходного сырья П р и м е р 7 Листья дурмана обрабатывают препаратом (1 мг/мл) за 48 ч до или сразу после заражения Х-вирусом картофеля (ХВК) путем погружения их в раствор испытуемого препарата Контрольные листья аналогичным образом обрабатывают водой. Инфекционный т'-їтр вируса определяют через 5 дней посредстеом инокуляции экс-' трактами из листьев дурмана растении Gomphrena globosa и подсчетом образовавшихся в опыте и контроле местных вирусных поражений. Данные, приведенные в табл.7, свидетельствуют о существенном профилактическом эффекте в отношении ХВК. Отмечено снижение титра вируса (на 31%) под влиянием препарата. В системе табак - вирус бронзовости томатов (ВБТ) полученный антивирусный препарат (АВП) применяют путем трехкратного опрыскивания растений до (профилактика) или после (терапия) инокуляции их инфекционным соком с интервалом 2-3 дня между смежными обработками Учитывают количество местных некрозов на инокулированных листьях а также число системно пораженных растений, отмечают одновременно характер и степень проявления внешних симптомов заболевания Данные этого опыта приведены в таблицах 8 и 9 Как следует из приведенных результатов, полученный АВП обладает высоким профилактическим и существенным терапевтическим (снижение гибели растений на 50% при 100%-ной гибели их в контроле) действием в отношении болезни табака, вызываемой ВБТ Таким образом, оптимальная концент- 25 рация уксусной кислоты, обеспечивающая достаточно высокий выход препарата, отсутствие в нем существенных примесей сопутствующих белков и хорошую сохранность антивирусной активности целевого 30 продукта, находится в пределах 5-6%. П р и м е р 6. В опыте используют сухие клетки дрожжей Candida troplcalis К—41. Получение антивирусного препарата по предлагаемому способу, 35 40 г дрожжевых клеток гомогенизируют и целевой продукт экстрагируют 400 мл 6%ной уксусной кислоты (2 ч при температуре + 20°С), экстракт отделяют от гомогената клеток центрифугированием и упаривают 40 до 100 мл в вакууме. Целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами спирта, осадок растворяют в воде и лиофилизируют. На всех стадиях получения препарата определяют содержание углеводов, 45 белков в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ. Получение антивирусного препарата по способу-прототипу. 40 г дрожжевых клеток гомогенизиру- 50 ют, целевой продукт экстрагируют 400 мл воды (2 ч при температуре +20°С), экстракт от гомогената клеток отделяют центрифугированием, а затем обрабатывают его РНКазой в концентрации 20 мкг/мл (2 ч, 55 +25°С в 0,001 М NaCI). Экстракт концентриФормула изобретения руют в вакууме до 100 мл, а затем эмульгиСпособ получения антивирусного преруют в смеси фенола и хлороформа (9:1) в парата из дрожжей, включающий культивитечение 30 мин при комнатной темпераї уре, рование клеток их отделение от водную фазу с целеаым продуктом отделякультуральной жидкости, экстракцию очи 1659053 стку, и концентрирование экстракта в вакууме с последующим осаждением целевого продукта и его сублимационным высушиванием, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью 8 упрощения технологического процесса и повышения выхода биомассы продукта, экстракцию и очистку проводят уксусной кислотой в концентрации 5-6% Таблица 1 Выход, состав и антивирусная активность препаратов, выделенных их дрожжей Исходный материал Состав препарата, % Выход препара- углеводы белки РНК та, % Концентрация препарата, мкг/мл ' Клетки дрожжей Candida troplcalts К-41, выращенные в лабораторных условиях Кормовые дрожжи, полученные в производственных условиях 82,5 5,7 3,0 следы 1000 100 10 1 35,0 4,9 04 50 1000 100 10 1 Характеристика целевого продукта, экстрагированного из 40 г сухих дрожжей различными способами Ингибирование инфекционности вируса табачной мозаики на листьях дурмзна, % 100 97 76 53 100 91 76 71 Таблица 2 Экстракция Содержание биополимеров в экстрак- % белков от Антивирусная активность тах, мг суммы биополимеров используе- ингибировабелков углеводов сумма мая концент- ние ВТМ на рация, листьях дурмкг/мл мана, % 6 %-ной ук21,4 Т141 4 1120 1,9 75 93 ± 6 сусной кис15 80 ± 8 лоты 3 41 ± 7 Водой (по прототипу) 378 Примечание 840 1218 31,0 75 98 ± 5 15 90 ± 4 3 33 ±12 Концентрация расчитывалась по содержанию углеводов в препарате 9 10 1659053 Таблица 3 Моносахаридный состав антивирусных препаратов полученных с помощью известного и предлагаемого способа Способ Содержание моносахарида, % галактоза рамноза манноза глюкоза Предлагаемый 96,4 0.7 2.3 2,6 следы Прототип 97,0 2.2 08 П р и м е ч а н и е . Содержание моносахаридов в препаратах определяют с помощью газо-жидкостной хроматографии. Препараты для ГЖХ получают путем гидролиза антивирусного препарата в 2 н серной кислоте (2 ч, 100°С). Таблица 4 Действие гидролаз на антивирусную активность антивирусного препарата, выделенного из дрожжей с помощью заявленного способа Ферментная обработка Интактный препарат (контроль) Препарат обработан ДНКазой РНКазой трипсином глюкэназой маннаназой смесью маннаназа +глюкэназа Инфекционность ВТМ (некрозов на 1 лист дурмана) в опыте в контроле 78 0,8 1,2 1.4 0.9 21 32 86 Ингибирование вируса, % 99 ± 3 98 ± 5 81 92 72 88 84 98 ^ 4 99 ± 2 76 ± 9 65 ± 1 1 0 Таблица Z 85 Выход и антивирусная активность целевого продукта, экстрагированного из дрожжевых клеток уксусной кислотой различной концентрации Концентра- Содержание биополимеров в препа- % содержа- Испытуемая С н и ж е н и е ция кислоты, рате, мкг ния белков концентра- инфекционция, мкг/мл ности ВТМ, % белков полисахасумма ридов 3 160 4550 3,4 1 1,41 ±0.54* 4710 10 22 ± 3 0 !00 80 ± 7 5 154 5000 5154 31 1 10 100 38 ± 4 70 ± 1 0 75 ± 6 э 6 128 5300 5428 2,4 1 10 100 40 ± 1 8 70 ± 11 89 ± 7 8 118 6850 6968 1.7 1 10 100 12 ±23 78 ± 1 6 93 ± 1 6 10 112 8050 8162 1,4 1 10 100 40 ± 13 49 ± 8 53 ± 2 1 11 12 1659053 Продолжение табл 5 Концентра- Содержание биополимеров а препарате, мкг ция кислоты, полисахабелков • сумма % ридов 500 5108 108 15 % содержа- Испытуемая С н и ж е н и е ния белков концентра- инфекционция, мкг/мл ности ВТМ, % 1 24 ±20 10 79 ± 10 100 94 ± 3 П р и м е ч а н и е. Для экстракции в каждом варианте используют 250 мг сухих клеток * стимуляция инфекционности ВТМ 26 Т а б л и ц а 6 Сравнительная эффективность двух способов получения антивирусного препарата из клеток дрожжей Candida t r o p i c a l i s К-41 .1 . Способ Вцделено из 40 г клеток, X белков ИспользуСтадия получения препамг емые конот обрата центрации щего кол ж е - (по углебелков yi левоводам) , ства дов биополи- мкт/мл меров Предлага Экстракция 6%-ноЙ ук• сусноЙ кислотой 2 U* "20 1.9 75 I IX 378,0 Упаривание в вакууме 234,0 ° 00 840 1700 1007,2 218 934 0,7 31,0 12,1 62 І 12 75 95* 3 62 t 12 60 1 12 75 97+5 90* 4 3 Экстракция водой, обработанной РНКа^ой (20 мкг/мл в 0,001 М NaCl) 1 0,5 78 1 7 15 > 2 1809,2 94 1 3 3 Прототип спиртом 7 1800 42 І 7 15 I I I Осаждение 9,2 75 3 . I I Упаривание в вакууме 93+6 81 і 8 15 1 15 3 е м ы й m>4 Ингнбирование инфекционности ВТМ на листьях дурмана, Z 33 і 12 75 96 1 2 15 III Обработка фенольнохлороформной смесью, диализ, осаждение спиртом 13,6 290 303,6 4,5 67 1 10 3 75 * 16 75 98 ї 3 15 911 4 3 6 2 * 24 1659053 ' Т а б л и ц а Действие антивирусного преперлтл {ЛВП) из дрсжже/і на накопление Х-нирусі клртоЛеля в изолированных почовннках листьев дурмана 7 Инфекциокносгь экстрактов пз листьев через 5 дней после заражения (некрозов) лист Время инкубации половинок листьев Вода АВП, 1 мг/мл 48 ч до инокуляции 35 24 48 ч после инокуляции 39 + ++ т* ЧХ . Т а б л и ц а Профилактическое действие антивирусного препарата из дрожжей на поражаемосі ь табака сорта Иммунный 580 ВРТ*. Вариант Количество местных поражений/лист Количество растений с системными гимптомами болезни, Z Вода (контроль) 11,0+ 1,4 100 АВП, 0,02% 1,7* 0 0,03 • трехкраное опрыскивание растений с интервалом 3 дин до инокуляции растений 55Т. Т а б л и ц а Терапевтическое антивирусное дейстийе антивирусного препарата нэ дрожжей в системе табак сорта Иммунный 580 - BUT* _ Вариант _ _ „ _ _ j _ _——___ 9 «. _ _ _ _ _ ___________^ Колисество растений, % 10 дней п . и . 1 П Вода V (контроль) АВП, 0,02Z 2 1 3 100 0 0 37,5 62,5 0 30 дней п . и . 2 ' J "J 0 37, 5 0 62, 5 50 дней п.и . 3 1 Т 2 1 3 J00 0 0 100 0 12, 5 37, 5 50,0 трехкратное опрыскивание с интервалом 2 дня, начатое сразу после заражения растений ВІЇГ: 1 - с суровыми симптомами; 2 - е мягкими симптомами; 2 - погибшие. Редактор В.Ковтун Составитель С.Пылова Техред М.Моргентал Корректор Т Колб Заказ 1799 Тираж 464 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб , 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г Ужгород, ул.Гагарина, 101