Спосіб модифікованого хроматографічного очищення субстанції інсуліну людини та готова лікарська форма пролонгованої дії на її основі

1. Спосіб модифікованого хроматографічного очищення субстанції інсуліну людини шляхом розчинення субстанції інсуліну у буферному розчині, врівноваження колонки, нанесення розчину субстанції інсуліну на хроматографічну колонку, наступного елюювання субстанції інсуліну градієнтом та оцінки отриманих ліків методом аналітичної ВЕРХ, C2 2 55303 1 3 55303 4 інсуліну", 1997р.; Geoffrey В. Сох, Іnfluence of ліну людини або аналоги цієї субстанції [наприОреrating Раrameters оn thе Рreparative Gradient клад, патент США №5547930, 1996 року "Кристали В28 Еlution Сhromatography of Insulin, 3. Сhromat., 1992, інсуліну АSР "]. Відомо, що якість готової лікар195-203]. Гель-проникаючу хроматографію зазвиської форми визначається якістю очищення діючої чай використовують для очищення субстанції інречовини - субстанції інсуліну. Ця операція очисуліну від високомолекулярних домішок. Недоліщення також у значному ступені визначає витрати ками способу являються невеликі питомі на виробництво та вихід готового продукту. Тому навантаження на колонку та низькі швидкості їй приділяється велика увага. Найбільш близькою елюювання, що робить процес очищення неефекдо готової лікарської форми інсуліну людини противним. Іонообмінну хроматографію використовулонгованої дії, що заявляється, є готова лікарська ють для очищення субстанцій інсуліну від інсулінформа інсуліну людини патентом України №50679. споріднених домішок, зокрема від дезамідоінсуліВона містить як діючу речовину високоочищену нів. Недоліками цього способу є ті ж низькі питомі традиційною хроматографією високого тиску субснавантаженні на сорбент та незадовільний відсотанцію інсуліну людини, пролонгатори - протамінток виходу продукту. Обернено-фазову хроматогсульфат та цинку хлорид, ізотонічні агенти - гліцерафію використовують для очищення субстанцій рин та натрію хлорид, консерванти - м-крезол та інсулінів від проінсулінів, інсулін-споріднених фенол, агент з буферною ємністю - натрій дигідродомiшок, дериватів білків клітин хазяїна для біосигенфосфат дигідрат або динатрійгідрогенфосфат нтетичних інсулінів, залишкових кількостей протегептагідрат і воду. Використання очищеної традиолітичних ферментів, які використовуються для ційною хроматографією високого тиску субстанції виробництва напівсинтетичних та біосинтетичних інсуліну людини дозволило одержати препарат субстанцій інсуліну людини. Головні домішки в високої якості з вмістом високомолекулярних білсубстанціях інсуліну - це інсулін-споріднені сполуків 0,2 % та інсулін-споріднених сполук менше 2%, ки, які мають мінімальні структурні відміни, і тому але при цьому понести значні витрати на сорбент для їх відокремлення від головного продукту необта органічний модифікатор. хідно використовувати високоефективні сорбенти, Завданням винаходу є поліпшення ефектива отже хроматографічні системи високого тиску. ності виробничого процесу, підвищення якості кінТільки це дає можливість використовувати високі цевого продукту за рахунок отримання більш чиспитомі навантаження на сорбент, забезпечує відтої субстанції інсуліну і зниження витрат на повідну якість і вихід продукту та робить процес виробництво. економічно ефективним. Поставлене завдання вирішується тим, що у Прототипом даного винаходу є спосіб очиспособі модифікованого хроматографічного очищення субстанції інсуліну людини оберненощення субстанції інсуліну людини шляхом розчифазовою хроматографією [Е.Р. Kroeff, R.А. Оwens, нення субстанції інсуліну у буферному розчині, аt аl. "Рrodaction Sсаlе Рurification of Biosynthetic врівноваження колонки, нанесення розчину субсНuman Insulin by Resersed-Phase High-Performance танції інсуліну на хроматографічну колонку, настуLiquid Сhromatography"], який включає розчинення пного елюювання градієнтом субстанції інсуліну та субстанції інсуліну, врівноваження колонки, нанеоцінки отриманих піків методом аналітичної ВЕРХ, сення розчину субстанції інсуліну на хроматограу відповідності з винаходом як органічний модифіфічну колонку, наступного елюювання субстанції катор буферного розчину використовують пропаінсуліну градієнтом та оцінки отриманих піків менол або пропанол-2, рН розчину доводять до 2,4тодом аналітичної ВЕРХ (високоефективної рідин2,6 і для розчинення субстанції інсуліну викорисної хроматографії). Як органічний модифікатор у товують концентрацію органічного модифікатора рухомій фазі використовують ацетонітрил з граді13-14% об'ємних, а в готовій лікарській формі інсуєнтом концентрації 15-30% та рН 3. Даний спосіб ліну людини пролонгованої дії, яка містить діючу дозволяє одержати субстанцію інсуліну високої речовину, пролонгатори, ізотонічні агенти, консерякості з виходом більш, ніж 75%, та з чистотою ванти, агент з буферною ємністю і воду, у відповібільш, ніж 97%. Але недоліками способу є низькі дності з винаходом як діючу речовину використопитомі навантаження на колонку (від 13 до 15мг на вують субстанцію інсуліну людини, наприклад, 1мл сорбенту), що робить процес очищення нееочищену модифікованим хроматографічним спофективним, та використання в якості органічного собом, при наступному співвідношенні компоненмодифікатора у рухомій фазі ацетонітрилу, який тів, г/л: високоочищена субстанція інсуліну людини має високу токсичність і дорого коштує. - 1,35-1,64; протамінсульфат - 0,086-0,139; цинку Відомі препарати інсуліну пролонгованої дії, в хлорид - 0,0057-0,0084; гліцерин - 14,4-17,6; мяких як діюча речовина використовувалась субскрезол - 1,26-1,54; фенол - 0,54-0,66; натрій дигідтанція свинячого інсуліну, як пролонгатори іони рогенфосфат дигідрат - 1,35-1,65; натрію хлорид цинку та протамінсульфат, як ізотонічний агент 0,54-0,66; вода - решта. гліцерин, як консерванти м-крезол та фенол, як Внесені зміни, що заявляються, тобто: викориречовина з буферною ємністю натрій фосфорностання пропанолу або пропанолу-2 замість ацетокислий або оцтовокислий ["Современньїе гормонітрилу, збільшення концентрації органічного мональние средства", Киев, "Здоровье", 1994]. Але дифікатора до 13-14% об'ємних та зниження такі препарати містили велику кількість шкідливих значення рН розчину субстанції інсуліну у буфері для здоров'я людини домішок, які викликали недо 2,4-2,6, зсувають рівновагу димер - мономер бажані алергічні реакції та ускладнення. Більш субстанції інсуліну в бік мономера, зменшують досконалими та менш шкідливими були препараасоціацію субстанції інсуліну з інсулінти, які як діючу речовину містили субстанцію інсуспорідненими домішками, знижують імовірність 5 55303 6 багатоточкової (необоротної) адсорбції субстанції фільтрацією через мембрану Ultipor N66 фірми інсуліну, механізм адсорбції в рамках конкуренція Раll з розміром пор 0,8мкм. Кристали промивають синергізм зміщується в бік конкуренції. Внаслідок 5,0мл очищеної води і ліофільно висушують. Одецього при нанесенні розчину субстанції інсуліну на ржують 363,5мг субстанції інсуліну (334,4мг в пехроматографічну колонку реалізується механізм рерахунку на суху речовину) наступного складу: фронтально-витискувальної хроматографії і фор98,8% головної речовини, 0,4% дезамідо(Амується первинний хроматографічний розподіл 21)інсуліну, 0,8% інсулін-споріднених домішок. субстанції інсуліну по довжині колонки. Вихід продукту складає 80,8%. Вирішення поставленого авторами завдання Приклад 2. Процес очищення проводять анаілюструється прикладами конкретного виконання. логічно прикладу 1, але збільшують навантаження Приклад 1. Процес модифікованого хроматогпо субстанції інсуліну: беруть 750мг по технічній рафічного очищення субстанції інсуліну проводять масі субстанції інсуліну, яка містить 96,1% головза кімнатної температури. 450мг по технічній масі ної речовини, 1,8% дезамідо(А-21)інсуліну та 2,1% (414мг в перерахунку на суху речовину) субстанції інсулін-споріднених домішок, та розчинять у 42мл інсуліну, яка містить 96,1% головної речовини, буферного розчину. Одержують 592,5мг субстанції 1,8% дезамідо(А-21)інсуліну та 2,1% інсулінінсуліну по технічній масі наступного складу: 97,9% споріднених домішок розчинюють в 25мл буферголовної речовини, 0,8% дезамідо(А-21)інсуліну, ного розчину, який містить 0,25моль/л оцтової кис1,3% інсулін-споріднених домішок. Вихід продукту лоти, 13,5 об'ємних відсотків пропанола-2. Знаскладає 79,0%. чення рН розчину субстанції інсуліну у рухомій Приклад 3. Процес очищення проводять анафазі доводять розчином соляної кислоти з масологічно прикладу 1, але беруть 450мг по технічній вою долею 10% до 2,5. Отриманий розчин субстамасі субстанції інсуліну-сирцю, яка містить 90,4% нції інсуліну фільтрують через мембранний фільтр головної речовини, 3,5% дезамідо(А-21)інсуліну та Віо-Іnert NRLG фірми Раll зі здатністю утримання 6,1% інсулін-споріднених домішок, та розчинять у 0,2мкм. 42мл буферного розчину, який містить як органічХроматографічну колонку з внутрішнім діаметний модифікатор пропанол. Одержують 334,0мг ром 0,8см і довжиною 30,0см, яка упакована сфесубстанції інсуліну по технічній масі наступного ричним силікагелем С-18 з розміром часток 15мкм, складу: 98,5% головної речовини, 0,6% дезаміз розміром пор 12нм врівноважують 45мл буфердо(А-21)інсуліну, 0,0% інсулін-споріднених доміного розчину А наступного складу: 0,25моль/л кисшок. Вихід продукту складає 74,2%. лоти оцтової, 10,0 об'ємних відсотків пропанолу-2. Приклад 4. Процес очищення проводять анаПроцес очищення субстанції інсуліну ведуть на логічно прикладу 1, але змінюють склад буфернорідинному хроматографі високого тиску Gilson. го розчину. Субстанцію інсуліну розчинюють в Розчин інсуліну подають в хроматографічну колон25мл буферного розчину, який містить 0,25моль/л ку зі швидкістю потоку 1,0мл/хв. Потім колонку кислоти оцтової та 15 об'ємних відсотків пропанопромивають 15мл буферного розчину А. Елююлу-2. Внаслідок цього при введенні розчину субсвання субстанції інсуліну ведуть зі швидкістю потанції інсуліну на колонку спостерігають динамічтоку 1,0мл/хв. у лінійному градієнті концентрації ний проскок, який містить 63,0мг субстанції пропанолу-2 від 12 до 18 об'ємних відсотків протяінсуліну. Одержують 298,5мг субстанції інсуліну по гом 120 хвилин. Формування градієнту виконують технічній масі наступного складу: 98,9% головної автоматично шляхом змішування буферного розречовини, 1,1% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,9% інсучину А та буферного розчину Б, який містить лін-споріднених домішок. Вихід продукту складає 0,25моль/л кислоти оцтової та 50,0 об'ємних відсо66,3%. тків пропанолу-2. Після закінчення градієнту сорПриклад 5. Процес очищення проводять анабент у колонці регенерують 45мл буферного розлогічно прикладу 1, але змінюють склад буферночину Б. Елюат, який містить субстанцію інсуліну, го розчину. Субстанцію інсуліну розчинюють в розбивають на фракції об'ємом 3,0мл. Фракції 25мл буферного розчину, який містить 0,25моль/л аналізують за допомогою високоефективної рідинкислоти оцтової та 12 об'ємних відсотків пропаноної хроматографії на вміст домішок. За результалу. Одержують 360,5мг субстанції інсуліну по техтами аналізів формують головну фракцію, яка міснічній масі наступного складу: 98,1% головної ретить 339,5мг субстанції інсуліну (35,0мл елюату з човини, 0,7% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,2% інсулінконцентрацією інсуліну 9,7мг/мл) наступного скласпоріднених домішок. Вихід продукту складає ду: 98,9% головної речовини, 0,3% дезамідо(А77,8%. 21)інсуліну, 0,8% інсулін-споріднених домішок. У Приклад 6. Процес очищення проводять анарозчин головної фракції за перемішування додалогічно прикладу 1, але значення рН буферного ють 30,0мл очищеної води, 0,34мл розчину цинку розчину доводять до 3,0. Одержують 336,0мг субхлористого з масовою долею 10%, 2,3мл розчину станції інсуліну по технічній масі наступного склакислоти лимонної з молярною концентрацією ду: 97,0% головної речовини, 0,8% дезамідо(А1,5моль/л. За перемішування у розчин субстанції 21)інсуліну, 1,8% інсулін-споріднених домішок. інсуліну додають розчин гидроокису натрію з маВихід продукту 74,7%. совою долею 10,0% до значення рН 6,6. Розчин Приклад 7. 1,493г субстанції інсуліну людини, перемішують 90 хвилин. Потім розчином кислоти очищеної модифікованим хроматографічним спосоляної з масовою долею 5,0% доводять значення собом, суспендували в 150мл води, потім за дорН до 5,9 і продовжують перемішування ще 240 помогою 1М НСІ рН суспензії довели до 3,1 для хвилин, після чого одержані кристали субстанції розчинення кристалів субстанції. 0,3127г протаміінсуліну відокремлюють від маточного розчину нсульфату розчинили в 25мл води і довели рН 7 55303 8 розчину до 3,1, додаючи 1М НСІ. 0,008г цинку хловали буферний розчин, який містив 0,875г натрій риду додали до розчину протамінсульфату. Потім дигідрогенфосфату дигідрату, 0,35г м-крезолу, змішали розчин субстанції інсуліну людини та роз0,15г фенолу, 4г гліцерину та 0,15г натрію хлоричин, який містив протамінсульфат і цинку хлорид. ду. Буферний розчин змішали з розчином субстаПісля цього приготували буферний розчин, нції інсуліну, відкоригували рН одержаного розчиякий містив 1,5г натрійдигідрогенфосфату дигідрану до 7,3 і провели стерилізуючу фільтрацію в ту, 1,4г м-крезолу, 0,6г фенолу, 16г гліцерину та ємність з кристалічною частиною готової лікарсь0,6г натрію хлориду в об'ємі 800мл та довели рН кої форми. Суміш перемішували протягом 1 годибуферного розчину до 7,8, провели стерилізуючу ни і потім в асептичних умовах провели розлив. фільтрацію і профільтрували туди суміш кислих Аналіз готового препарату таким же методом, розчинів субстанції інсуліну людини, протамінсуяк в прикладі 7, показав загальний вміст інсуліну льфату та цинку хлориду. Отриману суміш витрилюдини 39,4МО/мл, вміст інсуліну в супернатанті мали при перемішуванні 18 годин за температури 10МО/мл. Вміст високомолекулярних білків склав 18°С для одержання кристалічної суспензії готово0,13%, вміст інсулін-споріднених сполук 0,67%, го лікарського препарату. Готовий препарат розвміст А-21 дезамідоінсуліну - 0,2%. лили в асептичних умовах у флакони ємністю Аналіз наведених прикладів показує, що вико10мл. Готовий препарат проаналізували методом ристання рішення, яке заявляється, дозволяє поаналітичної високоефективної рідинної хроматогліпшити ефективність хроматографічного роздірафії (методом ВЕРХ). Аналіз показав практичну лення субстанції інсуліну та досягти виходу відсутність інсуліну в супернатанті при загальному продукту 80%, тобто збільшити його на 5-6%, вмісті інсуліну 39,5МО/мл. Вміст високомолекуляотримати чистоту субстанції інсуліну кращу за рних білків склав 0,15%, вміст інсулін-споріднених 98%, тобто поліпшити її якість, а за рахунок викосполук 0,8%, А-21 дезамідоінсуліну 0,4%. ристання у якості органічного модифікатора проПриклад 8. 75% кристалічної долі готової ліпанолу-2 або пропанолу замість ацетонітрилу збікарської форми готували, як в прикладі 7. 25% льшити питомі навантаження на 1мл сорбенту розчинної частини лікарської форми готували тапрактично в два рази (до 25-30), а отже у два рази ким чином: 0,77г субстанції інсуліну людини, очизнизити витрати на сорбент та на 30% на органічщеної модифікованим хроматографічним спосоний модифікатор, що безумовно позначається на бом, суспендували в 100мл води, за допомогою собівартості готової лікарської форми інсуліну лю1М НСІ довели рН до 3,1. В 230мл води приготудини. Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601