Ферментний біосенсор для визначення концентрацій l-карнітину

Ферментний біосенсор для визначення концентрації L-карнітину, який містить перетворювач на 3 Цей метод широко використовується на практиці та досить простий, але потребує використання радіоактивних ізотопів, які є складними у використанні та потребують спеціальних робочих умов, а також існує ризик для здоров'я людей при їх застосуванні, що пов'язаний з радіацією. Хроматографічні методи дозволяють ідентифікувати та виділити деякі види ацил-карнітинів, але вони потребують використання коштовного та складного обладнання. Крім того, в останнє десятиріччя для визначення L-карнітину та його ефірів стає все більш популярною тандемна мас-спектрометрія завдяки високій чутливості та специфічності [7, 8]. Найбільш поширеним є метод, заснований на ферментативній реакції з використанням ферменту карнітинацилтрансферази (ЕС2.3.1.7). Але із-за високої вартості це устаткування неможливо використовувати у лабораторних умовах, тому поки що цей тип аналізу сфокусований тільки на дослідженні вроджених помилок метаболізму Lкарнітину, ніж на його кількісному визначенні. На даний момент відомий біосенсор, що вміщує п'єзоелектричний та амперометричний сенсорні елементи із застосуванням в якості біологічного елемента карнітин для вимірювання активності холінестераз (бутирил- та ацетилхолінетерази) та ступеню інгібування активності ферменту діізопропілфторосульфатом [9]. Але цей біосенсор використовує карнітин як чутливу молекулу, і за його допомогою неможливо визначати концентрації карнітину в зразках. Недоліком цього біосенсору також є складна процедура підготовчого процесу та застосування одразу двох різних за природою сенсорних перетворювачів, що ускладнює вимірювання та збільшує вірогідність похибки. Авторами під час проведення патентноінформаційних досліджень і підготовки заявки не виявлені конструкції ферментного біосенсору для визначення концентрації L-карнітину на основі іонселективного польового транзистора (ІСПТ) з рНчутливим шаром для визначення L-карнітину. В основу пропонованої корисної моделі покладено задачу створення ферментного біосенсору для визначення L-карнітину, який би дозволив отримати більш високу точність вимірювання концентрації L-карнітину у досліджуваних зразках. Поставлена задача вирішується пропонованим ферментним біосенсором для визначення концентрації L-карнітину, який містить перетворювач на основі двох ідентичних напівпровідникових рН-чутливих польових транзисторів, на один з яких нанесено робочу мембрану на основі ферменту бутирилхолінестераза, що є чутливою до Lкарнітину, на другий нанесено референтну мембрану з сироватковим альбуміном бика, вказаний біосенсор розташований у вимірювальній кюветі для досліджуваного розчину, де встановлений також електрод порівняння, виходи обох рНчутливих польових транзисторів призначені для підключення до відповідних входів приладу для вимірювання сигналів потенціометричних датчиків на основі іон-селективних польових транзисторів, а виходи цього приладу призначені для підключення до відповідних входів комп'ютера. 56857 4 Поставлена задача вирішується за рахунок використання в конструкції приладу диференційної пари напівпровідникових рН-чутливих перетворювачів на основі ІСПТ. Суть запропонованої корисної моделі пояснюється наступними графічними матеріалами: Фіг.1. Схематичний вигляд напівпровідникового перетворювача на основі двох ідентичних рНчутливих польових транзисторів. Фіг.2. Конструкція вимірювальної кювети для ІСПТ-перетворювача. Фіг.3. Блок-схема біосенсорної системи на основі рН-чутливих ІСПТ для визначення L-карнітину у досліджуваних зразках. Фіг.4. Відгуки біосенсора на основі ІСПТ на додавання субстрату та L-карнітину. Фіг.5. Калібрувальна крива визначення Lкарнітину. Пропонований біосенсор для визначення концентрації L-карнітину (Б) складається з перетворювача (Фіг.1) на основі ІСПТ 1 та 2, на один з яких нанесено робочу мембрану 3 на основі ферменту бутирилхолінестерази, що є чутливою до L-карнітину, на другий нанесено референтну мембрану (4) з сироватковим альбуміном бика та контактних виводів 5; вимірювальної кювети (ВК) з буферним розчином (Фіг.2), що містить металеву основу 6, на яку встановлюється монтажна плата 7 з перетворювачем на основі ІСПТ з нанесеними мембранами, фторопластової кришки 8 з силоксановим ущільненням 9, пробоприймача 10 та електродом порівняння 11. Також система складається з потенціометричного приладу (ПП) 12 (Фіг.3), та персонального комп'ютера (ПК) 13. Перетворювач на основі ІСПТ 1 та 2 з нанесеними ферментною - 3 та референтною - 4 мембранами змонтований на друкованій монтажній платі 7 та розташований у вимірювальній кюветі 6, за допомогою вихідних контактів 5 підключений до відповідних входів потенціометричного приладу 12, до якого також підключений електрод порівняння 11. Виходи приладу підключені до комп'ютера 13, який призначений для керування процесом вимірювання сигналів ІСПТ приладу та перерахунку отриманих даних у значення концентрацій L-карнітину. Необхідна чутливість визначення L-карнітину забезпечується застосуванням диференційного методу вимірювання та можливістю підключення до портативного потенціометричного приладу, розробленого та виготовленого в Інституті фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України [10], що працює по схемі прямого вимірювання струму в каналі польового транзистора з активним навантаженням. До входу приладу підключається двохелементний потенціометричний ферментний біосенсор, а також електрод порівняння. Вихід приладу підключається до комп'ютера через послідовний порт. Застосування потенціометричного методу вимірювання з використанням пари диференційних рН-чутливих польових транзисторів та створення оптимальних умов для визначення L-карнітину за рахунок використання ферменту бутирилхолінестерази в складі біосенсора дозволило проводити 5 56857 більш точну оцінку вмісту L-карнітину у досліджуваному зразку. В основі роботи потенціометричного біосенсора для визначення концентрації L-карнітину ле 6 жить ефект інгібування наступної ферментативної реакції: БуХЕ Бутирилхолінхлорид + H2O Під час ферментативної реакції бутирилхолінестераза розщеплює бутирилхолін, при цьому збільшується концентрація протонів в робочій мембрані, відповідно, відбувається зміна рН, яку і можна реєструвати за допомогою рН-ІСПТ [11]. За допомогою ІСПТ з рН-чутливим шаром відбувається перетворення біохімічного сигналу в електричний, що дозволяє реєструвати відгуки біосенсора на додавання субстрату. Для аналізу концентрації L-карнітину необхідно додати досліджуваний зразок у кювету з ІСПТ, на який нанесено фермент, при цьому в ході контакту з Lкарнітином відбувається інгібування ферменту. Оптимальне співвідношення компонентів у ферментній мембрані було отримано авторами експериментально за умов оцінки оптимальних аналітичних характеристик. Пропонований біосенсор для визначення Lкарнітину працює наступним чином. Виготовлення ферментної та референтної мембран на поверхні перетворювачів проводили наступним чином: готували суміш для ферментної мембрани - 5 мг ферменту бутирилхоліноксидази (БуХЕ) та 5 мг сироваткового альбуміна бика (БСА) розчиняли у 100 мкл 20 мМ фосфатного буфера, рН 7.4 з додаванням 10% гліцерину. Референтну мембрану готували додаванням до 10 мг БСА 100 мкл 20 мМ фосфатного буфера, рН 7.4 з додаванням 10% гліцерину. Потім проводили іммобілізацію: ферментні (3) та референтні (4) мембрани формували на зигзагоподібних областях затворів ІСПТ (1, 2) крапельним методом. Біосенсор з нанесеними розчинами розташовували у ексикаторі з насиченими парами глутарового альдегіду (ГА) на 30 хвилин. Після інкубації в парах Г А мембрани ретельно висушували на повітрі протягом 15-20 хв. Потім мембрани відмивали від залишків ГА потрійною зміною 5 мМ буферного розчину (рН 7,4). Вимірювання проводили за допомогою портативного вимірювального приладу, розробленого та виготовленого в Інституті фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України [10], що працює по схемі прямого вимірювання струму в каналі польового транзистора з активним навантаженням. Чутливість приладу становила близько 25 мкА/рН. До входу приладу підключали двохелементний потенціометричний ферментний біосенсор, а також електрод порівняння. Вихід приладу підключали до комп'ютера через послідовний СОМ або USB порт. Пропоновану систему використовували таким чином. Попередньо виготовляли та іммобілізували біоселективні та референтні мембрани. Холін + CH3(CH2)2COO- + H+ Перед початком вимірювань з нанесеними мембранами біосенсор встановлювали у вимірювальній кюветі (Фіг.2) та додавали 1 мл 5 мМ буферного розчину, рН 7.4, витримували півгодини для отримання стабільного базового сигналу. Далі в комірку додавали 1 мМ бутирил холін хлориду і отримували сигнал (Фіг.4), величину відгуку якого приймали за 100%. Потім додавали модельний розчин L-карнітину певної концентрації та отримували зменшення відгуку сенсора. Рівень інгібування визначали по співвідношенню відгуків біосенсора до та після інгібування. Після цього отримували залежність рівня інгібування іммобілізованої бутрилхолінестерази при додаванні в розчин різних концентрацій L-карнітину - одержували калібрувальний графік (Фіг.5), за допомогою якого визначали концентрацію L-карнітину в досліджуваних зразках. Таким чином, отримана калібрувальна крива демонструє, що запропонований ферментний біосенсор для визначення L-карнітину є функціонально придатним і дозволяє одержувати більш точні результати із визначення L-карнітину у досліджуваних зразках у порівнянні з відомими пристроями. Джерела інформації: 1. Ceberblad G., Lindstedt S. A method for the determination of carnotone in the picomole range // Clin.Chem. Acta. - 1972. V.37, P. 235-243. 2. McGarry J., Foster D. An improved and simplified radioisotopic assay for the determination of free and esterified carnitine // J. Lipid Res. - 1976. V. 22, P. 1589-1592. 3. Borum P.R. Carnitine: determination of total carnitine using radioenzymatic assay // J. Nutr. Biochem.-1990. V.1. P. 111-114. 4. McEntire C.J., Lever M., Storer M.K. A high performance liquid chromatographic method for the measurement of total carnitinein human plasma and urine // Clin. Chim. Acta. - 2004, V.344, P. 123-130. 5. Minkler P.E., Hopper C.L. Determination of free carnitine and total carnitine in human urine: derivation with 4'-bromophenacyl trifluoromethanesulfonate and high // Clin Chim. Acta. - 1992, V.212. P. 55-64. 6. Minkler P.E., Hopper C.L. Quantification of free carnitine, individual short - and medium-chain acylcarnitines, and total carnitine in plasma by highperformance liquid chromatography // Anal. Biochem. - 1993. - V. 212, P. 510-518. 7. Ho C.S., Cheng B.S., Lam CW. Rapid liquid chromatography-electroesprey tandem mass spectrometry method for the serum free and total carnitine // Clin Chem. - 2003, V. 49, P. 1189-1191. 8. Osorio J.H., Pourfarzam M. Plazma free and total carnitine measured in children by tandem mass 7 56857 spectrometry // Br.J. Med. Biol. Res. - 2002, V. 35, P. 1171-1265. 9. Zeravik J., Teller C, Scheller F.W. Analysis of cholinesterase binding to a carnitine-modified EQCM sensor // Biosensors and Bioelectronics. - 2007. V. 22, P. 2244-2249. 10. Кукла О.Л., Павлюченко О.С., Бушма О.В., Голтвянський Ю.В., Дзядевич С.В., Солдаткін О.П. Патент України на корисну модель "Аналого Комп’ютерна верстка А. Рябко 8 цифровий іонно-сенсорний вимірювач параметрів рідких середовищ", UA №48359 МПК G01N 27/26, 27/27, заявл. 26.10.2009, опубл. 10.03.2010, Бюл. №5. 11. S.V. Dzyadevych, A.P. Soldatkin, A.V. El'skaya, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault. Enzyme biosensors based on ion-selective field-effect transistors // Analytica Chimica Acta. - 2006, 568. P.248-258. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601