Амперометричний ферментний біосенсор для визначення вмісту гліцерину у алкогольних напоях

1. Амперометричний ферментний біосенсор для визначення вмісту гліцерину в алкогольних напоях, який складається із амперометричного перетворювача, на поверхню робочого електрода 3 24186 вою концентрацією від 1 до 10г/л [D. Compagnone, M. Esti, MLC. Messia, E. Peluso, G. Palleschi. Development of a biosensor for monitoring of glycerol during alcoholic fermentation. Biosensors &Bioelectronics. 13 (1998) 875-880]. Сучасні стандартні методи визначення гліцерину, такі як рідинна хроматографія та спектрофотометричні підходи на основі хімічних та ензиматичних реакцій [Колесников А.Ю., Филиппова P.Л, Володина Е.М. Идентификация и оценка качества вин. Ферментативный анализ этилового спирта, глицерина, лимонной и L-яблочной кислот // Пиво и напитки. 1. (1999). 44-46], зокрема, кіназнодегідрогеназний [Pinter, J., Hayashi, J., and Watson, J. Enzymic Assay of Glycerol, Dihydroxyacetone, and Glyceraldehyde //Arch Biochem Biophys 121 (1967), 404], кіназно-оксидазно-пероксидазний [Buccolo G, David H. Quantitative determination of swrum triglycerides by the use of enzymes. Clin. Chem. 19 (1973) 476; Kaplan L.A., Pesce A.J. in Clinical Chemistry Theory, Analysis, and Correlation, CV Mosby Co. (St. Louis, MO) (1984) 567], оксидазнопероксидазний метод [А. с. №1636773 СССР, МКИ 5 G01N 33/52. Способ определения пероксидазной активности биологических объектов /М.В. Гончар, А.А. Сибирный (СССР); заявка 4 №4363857/14; Заявл. 13.01.88; Опубл. 23.03.91; Бюл. №11. 6с; Гончар М.В. Чутливий метод кількісного визначення пероксиду водню та субстратів оксидаз у біологічних об'єктах // Укр. біохім. журн. 1998. - Т. 70, №5. - С.157-163] потребують кількох дорогих ферментів і коферментів. Ще одним недоліком описаного методу є однократність використання реагентів, що сильно підвищує вартість аналізу. Визначення вмісту гліцерину безреагентним методом дозволило б значно знизити собівартість аналізу і стало б досяжним для використання у повсякденній лабораторній практиці. Відомі ферментативні підходи для визначення гліцерину недостатньо селективні, як у випадку дегідрогеназних реакцій або неекономічні при їх повсякденному використанні у лабораторії, прикладом чого є мультиферментна система [West S.I. Analytical enzymes: diagnostics. - London: Maemillan Press Ltd., 1998. - 63-68p.; Kreutz F.H. Enzymatische Glycerinbestimrmmg // Klin. Wochenschrift. 40 (1962) 362-363], яка включає три ферменти: гліцеролкіназу, піруваткіназу та лактатдегідрогеназу, а також потребує присутності коферменту - NADH і двох косубстратів - АТР, фосфоєнолпірувату: Гліцеролкіназа Гліцеролфосфат + АDP Гліцерин + АТР Піруваткіназа Фосфоєнолпіруват + АDP Піруват + АТР Лактатдегідрогеназа Піруват + NADH(H+) У даному методі концентрацію гліцерину визначають за зменшенням кількості спожитого NADH, який реєструють фотометрично при довжині хвилі 340нм. Іншим методом для визначення вмісту гліце Лактат + NAD+ ролу є двоферментний варіант, у якому використовується гліцеролкіназа і гліцерол-3фосфа тдегідрогеназа, а моніторинг реакції ведеться за утворенням NADH(H+) при 340нм: Гліцеролкіназа Гліцерол + АТР Гліцерол-3-фосфат + NAD+ гліцерол-3-фосфат + ADP Гліцерол-3P-дегідрогеназа В іншому варіанті двоферментного методу гліцерол-3-фосфат-дегідрогеназна реакція замінена на гліцерол-3-фосфат-оксидазну, що лягло в осГліцерол-3-фосфат + O2 Третій метод для визначення вмісту гліцеролу – дегідрогеназний, і грунтується на визначенні кількості NADHC(H+), генерованого в результаті . нову діагностичного набору для визначення гліцеролу [Sigma Catalogue, Prod. Code FG0100-1KT 2006p.] Гліцерол-3P-оксидаза H2O2 + хромоген (-2H) Дигідроксиацетонфосфат + NADH(H+) Пероксидаза Дигідроксиацетонфосфат + H2O2 Барвник + 2H 2O ферментативної реакції, каталізованої гліцеролдегідрогеназою: 5 24186 6 Гліцеролдегідрогеназа Гліцерол + NAD + Використання цього методу в аналітичній практиці є ускладненим, оскільки реакція окислення гліцеролу гліцеролдегідрогеназою є оборотною, а фермент - недостатньо селективний. Тому сьогодні постає актуальне питання створення більш зручного, точного, селективного, швидкого та дешевого методу визначення вмісту гліцерину в різноманітних напоях. На сьогодні розробка та створення ферментних біосенсорів як безреагентних аналітичних засобів для визначення гліцерину може вирішити проблеми, пов'язані з перерахованими вище недоліками, та задовольнити усі вищезгадані вимоги. На даний момент розроблено і досліджено ряд біосенсорів, призначених для аналізу гліцерину. Вони були створені на основі ферментів гліцеролдегідрогенази [N. Kiba, N. Azuma, M. Furusawa. Chemilummometric method for the determination of glycerol in wine by flow-injection analysis with coimmobilized glycerol dehydrogenase/NADH oxidase. Talanta. 43 (1996) 1761-1766, V. Laurinavicius, B. Kurtinaitiene, V. Gureiviciene, L. Boguslavsky, L. Geng, T. Skotheim. Amperometric glyceride biosensor. Analytica Chimica Acta. 330 (1996) 159166]. Найбільш близьким до пропонованого пристрою за кількістю суттєви х ознак є амперометричний ферментний біосенсор для визначення вмісту гліцерину у алкогольних напоях, який складається із амперометричного перетворювача, на поверхню робочого електроду якого нанесена селективна до гліцерину ферментна мембрана, допоміжного електроду та електроду порівняння, а кожний електрод забезпечений контактними площадками, призначеними для його підключення до відповідного входу амперометричної установки [D. Compagnone, M. Esti, MC. Messia, E. Peluso, G. Palleschi. Development of a biosensor for monitoring of glycerol during alcoholic fermentation. Biosensors &Bioelectronics. 13 (1998) 875-880]. Згаданий амперометричний ферментний біосенсор призначений для визначення вмісту гліцерину під час ферментації на основі гліцеролдегідрогенази. Головним недоліком згаданого біосенсора є його недостатня стабільність - вже після трьох днів зберігання в робочому буфері залишалось 10% активності ферментів. При використанні гліцеролдегідрогенази значним недоліком створеного біосенсора є також те, що цей фермент не містить у своєму складі кофактору (N AD), який необхідно вводити в систему додатково, що суттєво підвищує собівартість аналізу. При цьому NAD може легко дифундувати з ферментативної мембрани в аналізовані зразки, що спричиняє значне зниження чутливості біосенсора [V. Laurinavicius, B. Kurtinaitiene, V. Gureiviciene, L. Boguslavsky, L. Geng, T. Skotheim. Amperometric glyceride biosensor. Analytica Chimica Acta. 330(1996)159166]. В основу запропонованої корисної моделі поставлено завдання створення такого амперомет Гліцеральдегід + NADH(H + ) ричного ферментного біосенсора для визначення вмісту гліцерину у алкогольних напоях, який би був більш стабільним та дозволив би підвищити точність визначення гліцерину за рахунок створення умов для селективної оцінки вмісту гліцерину у досліджуваному зразку, а також був би більш простим та швидшим за відомий пристрій. Поставлена задача вирішується за допомогою запропонованого амперометричного ферментного біосенсора для визначення вмісту гліцерину у алкогольних напоях, який, як і відомий, складається із амперометричного перетворювача, на поверхню робочого електрода якого нанесена селективна до гліцерину ферментна мембрана, допоміжного електроду та електроду порівняння, а кожний електрод забезпечений контактними площадками, призначеними для його підключення до відповідного входу амперометричної установки, а, відповідно до пропозиції, селективна до гліцерину ферментна мембрана виготовлена на основі гліцеролоксидази (ГО), сформована і зафіксована на поверхні робочого електроду методом електрополімеризації із застосуванням 3,4-етилендиокситіафену (ЕДТ). Ще одною особливістю пропонованого амперометричного ферментного біосенсора є і те, що у якості селективної до гліцерину ферментної мембрани використаний фермент ГО, отриманий з плісеневого гриба Botrytis allii. Іммобілізація ферменту в біоселективній мембрані досягається електрополімеризацією, зокрема, в присутності 3,4етилендиоксітіафену (ЕДТ), що дозволяє вибирати та підтримувати розмір, форму та товщину матриці та забезпечує чіткий контроль за процесом полімеризації. Використання ГО у пропонованій конструкції забезпечує підвищення стабільності і точності вимірювань за рахунок того, що ферментативна реакція не потребує екзогенного фактора, є необоротною, і число аналітичних реакцій, які необхідні для отримання сенсорного відгуку, різко скорочується.. Пропонований амперометричний гліцериновий біосенсор на основі гліцеролоксидази (ГО) може стати привабливою альтернативою вищезазначеним аналогам, оскільки не потребує екзогенного фактора, окcидазна реакція є необоротною, і число аналітичних реакцій, які необхідні для отримання сенсорного відгук у, різко скорочується. Сьогодні на ринку ферментів ГО відсутня, а тому актуальною проблемою залишається пошук продуцентів ферменту і розробка ефективних методів очищення ГО. ГО виявлена у низки плісеневих грибів роду Aspergillus, Penicillium [Uwajima Т., Akita Н., Ito К., Mihara A., Aisaka k., Terada О. Some characteristics of new enzyme "Glycerol Oxidase" // Agric. Biol. Chem. 1979. Vol. 43. P.2633-2634], Neurospora [Hill P., Martin S.M. Cellular proteolytic enzymes of Neurospora crassa. Purification and some properties of five intracellular proteinases // Eur. J. Biochem. 1975. Vol.56. N1. P.271-281], Botrytis [Куплетская 7 24186 М.Б., Ли хачев А.Н. Глицериноксидазная активность грибов рода Botrytis micheli // Микология и фитопатология. 1996. Т. 30. Вып. 5-6. С.55-58], а також актиноміцетів. У високоочищеному стані фермент виділено тільки із трьох видів - Aspergillus japonicus [Uwajiraa Т., Shimizu Y., Terada O. Glycerol oxidase, a novel copper hemoprotein from Aspergillus japonicus. Molecular and catalytic properties of the enzyme and its application to the analysis of serum triglycerides //J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P.2748 2753], Penicillium sp. [Lin S.F., Chiou СМ., Tsai Y.C. Purification and characterization of a glycerol oxidase from Penicillum sp. TS - 622 //J. Enzyme Microb. Technol. 1996. Vol. 18. P.383-387] і Botrytis allii [Патент 2117702С1, Россия, МПК6 C12N 9/04//(C12N9/04, C12R1:645). Способ получения глицеролоксидазы /ООО «Импакт» (Россия); №95115005/13; Заявл. 22.08.95; Опубл. 20.08.98]. В літературі описано метод електрополімеризації ферментів з використанням (3,4етилендиокситіафен) (ЕДТ) для утворення електропровідних полімерів з відносно новими та корисними для практичного використання властивостями. Дослідження таких полімерів [Ghosh S., Rasmusson J. R, Inganаs O. Supra molecular selfassembly for enhanced conductivity in conjugated polymer blends: ionic crosslinking in blends of poly(3,4-ethylenedioxythiophene)polystyrenesulfonate and poly(vinylp yrrolidone) //Ad v. Mater. - 1998. - Vol. 10, №14. - P.1097-1099.] виявили слабку провідність, невелику зміну заряду, підвищену стабільність та дуже виражену властивість формування плівки. Гомогенна плівка ПЕДТ формується на поверхні робочого електроду в процесі електрохімічної полімеризації 3,4-етилендиокситіафену за умов нейтрального рН та кімнатної температури. Формування плівки відбувається краще у водних розчинах та, при можливості, в присутності гідрофільних полімерів, зокрема, полівінілпіролідону (ПВП) або поліетиленгліколю (ПЕГ). При цьому підвищується гідрофільність полімерного шару. Окислення та відновлення залежить від потенціалу, що прикладається, який контролює формування позитивного заряду в структурі полімеру. Для ПЕДТ є докази, що поліаніони, зокрема, олігонуклеотиди можуть бути ефективно утримані в полімерній сітці, що працює за умов низької іонної сили [Ріrо В., Pham M-C, Ledoan T. Electrochemical method for entrapment of oligonucleotides in polymer-coated electrodes //J. Biom. Mat, Res. - 1999, - Vol. 46, M 4. - P.566-572]. Суть пропонованої конструкції пояснюється за допомогою графічних матеріалів. На Фіг.1 схематично показано конструкцію пропонованого пристрою. На Фіг.2 показано калібрувальний графік для визначення гліцерину за допомогою амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої гліцеролоксидази. На Фіг.3 показано графік залежності відгуку амперметричного біосенсора від концентрації буферного розчину. Концентрації гліцерину - 0,1мМ (1), 0,2мМ (2), 0,4мМ (3), 0,8мМ (4), 1,6мМ (5). 8 Запропонований амперометричний ферментний біосенсор для визначення вмісту гліцерину у алкогольних напоях складається з амперометричного перетворювача, на поверхню робочого електроду 1 якого нанесена селективна до гліцерину ферментна мембрана 2, допоміжного електроду 3 та електроду порівняння 4. Кожний електрод 1, 3, 4 забезпечений контактною площадкою 5, призначеною для його підключення до відповідного входу амперометричної установки 6 (потенціостат ПИ50). Селективна до гліцерину ферментна мембрана 2 складається з гліцеролокеидази, яка сформована і зафіксована на поверхні робочого електроду 1 методом електрополімеризації в присутності полі-3,4-етилендиокситіафену. У якості електроду порівняння 4 використаний Ag/AgCl електрод. Біосенсор на основі гліцеролокеидази, призначений для його підключення до амперометричної установки 6 (ПИ-50), у якості якої використаний потенціостат марки ПИ-50 виробництва Росії. Гліцерин-розпізнаючим елементом селективної до гліцерину ферментної мембрани 2 служить фермент ГО, одержаний з плісеневого гриба Botrytis allii. В основі роботи амперометричної системи для визначення гліцерину лежить наступна ферментативна реакція: ГО Гліцерин + О2 Гліцеральдегід + H2O 2 (1) Процес ферментативного перетворення гліцерину супроводжується утворенням електрохімічно активної речовини - перекису водню, який окислюється з утворенням електронів які, в свою чергу, можна реєструвати за допомогою амперометричного перетворювача: H2O 2 O2 +2H+ + 2e (2) . Виготовлення амперометричного біосенсора на основі гліцеролоксидази із плісеневого гриба Botrytis allii для визначення гліцерину в алкогольних напоях Фермент ГО отримано із клітин гриба Botrytis allii (штам 100(5)) [Павлішко Г., Гайда Г., Гончар М. Скринінг штамів продуцентів, очищення та первинна характеристика гліцеролоксидази із плісеневих грибів //Вісник Львів. Ун-ту. - Сер. Біол. 2004. - Вип. 38. - С.67-73]. Клітини гриба руйнували шляхом механічного розтирання у ступці, при охолодженні, в присутності інгібіторів протеаз 2мМ ЕДТА, 0,5мМ фенілметилсульфонілфториду, 0,1мМ м-амінофенілборної кислоти та 10мкМ лейпептину для гальмування дії протеаз на ГО. Безклітинні екстракти відокремлювали від уламків клітин центрифугуванням (15000об/хв, rc ep=8см, 30хв, 4°С) та фракціонували ацетоном (до 10 і 55%) з подальшим хроматографічним очищенням фермента на DEAE-Toyopearl 650М (TSK-Gel, Японія). Препарат ГО в 50мМ боратному буфері, рН 9,18 (концентрація - 0,28мг/мл, питома активність - 5мкмоль×хв-1×мг-1 білка), стабілізований до 9 24186 бавками ЕДТА (1мМ), МnСl2 (5мМ) та поліетиленіміну (0,05%), осаджували сульфа том амонію до 70% насичення і зберігали при -10°С. Гомогенна плівка полі-3,4етилендиокситіафену (ПЕДТ) формується на поверхні робочого електроду за допомогою електрохімічної полімеризації 3,4-етилендиокситіафену (ЕДТ). Формування плівки відбувається краще у водних та в присутності гідрофільних полімерів: полівінілпіролідону (ПВП) або поліетиленгліколю (ПЕГ). Полімеризацію ЕДТ здійснювали, прикладаючи потенціал від +0,2В до +1,5В зі швидкістю 0,1В/с протягом 15 циклів. Суміш, з якої формується робоча мембрана, складається з 20мм фосфатного буфера, рН 6,2, та з наступних інгредієнтів з кінцевою концентрацією: - 10-2 М 3,4-етилендиокситіафену; - 10-3 М поліетиленгліколю в перерахунку на мономер; - 10-15од. активності гліцеролоксидази на 1мл розчину (питома активність 5од./мг). Таке співвідношення компонентів було отримано експериментально для забезпечення найкращих аналітичних характеристик біосенсора: максимальної чутливості, швидкодії, підвищеної операційної стабільності та ін. Пропонований амперометричний ферментний біосенсор для визначення вмісту гліцерину у алкогольних напоях працює таким чином. 10 Біосенсор на основі гліцеролоксидази, підключають до амперометричної установки 6 в режимі амперометричних вимірювань, поміщають до вимірювальної комірки об'ємом 5,0мл, заповненої 100мм фосфатним буфером, рН 7,2 /на схемі не показана/ та витримують декілька хвилин до отримання стабільної базової лінії. Потім додають певні аліквоти модельних розчинів гліцерину або реальних зразків та отримують амперометричний сигнал з робочого електрода 1 біосенсора. Концентрацію гліцерину у реальних зразках визначають за калібрувальною кривою, побудованою на основі модельних водних розчинів гліцерину (Фіг.2). За рахунок використання у якості селективної мембрани 2 ГО із клітин гриба Botrytis allii стабільність і точність пропонованого пристрою є суттєво вищою за прилад-прототип. На Фіг.3 показано залежності величин відгуку біосенсора на гліцерин від концентрації буферного розчину. Видно, що при зміні молярності буферного розчину величини відгуків біосенсора змінюються несуттєво. Отриманий біосенсор показав лінійну залежність величини відгуку від концентрації гліцерину в діапазоні 0,001-25мМ, незалежність величини відгук у від параметрів вимірювального середовища та достатню стабільність при зберіганні. Після 40 діб зберігання сенсор зберігав свої основні аналітичні характеристики, що дозволяло проводити повторні виміри. 11 Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 24186 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601