Спосіб одержання гранульованих бактеріальних препаратів

1 Спосіб одержання гранульованих бактеріальних препаратів, що включає вирощування культур мікроорганізмів, змішування їх суспензій з наповнювачем, в якості якого застосовують глинисті мінерали та наступне гранулювання маси, який відрізняється тим, що глинисті мінерали Винахід відноситься до біотехнологм, а саме до виробництва бактеріальних препаратів для підвищення врожайності рослин та інших цілей Гранульовані бактеріальні препарати мають ряд переваг перед суспензіями мікроорганізмів та іншими формами готового продукту Вони полягають у стабільності складу, зручності зберігання гранульованих препаратів, транспортування, а також їх дозування і використання Широко поширеним способом одержання сипких бактеріальних препаратів є їх виготовлення на основі торфу (А с СССР №540852, МКИ С05 F11/8, опубл 3012 1976) Однак враховуючи ВІДМІННОСТІ у походженні торфів, ступені їх метаморфізму і властивостях, застосування даних субстратів для виготовлення бактеріальних препаратів часто не дозволяє отримувати ефективні препарати До того ж, дуже часто виникають великі ускладнення в стерилізації торфу, оскільки термічна його обробка може призвести до непрогнозованого погіршення якості, а радіаційна стерилізація цього матеріалу є дорогою і трудомісткою Достатньо поширеним способом отримання сипких бактеріальних препаратів є розпилювальне висушування мікробних суспензій після їх змішування з захисним середовищем Відомий спосіб отримання бактеріальних препаратів шляхом розпилювального висушування (А с СРСР задають у суспензію бактерій в масовому співвідношенні 1,2-2,0 1,0 в два прийоми, при чому на першому етапі їх вносять у межах 0,1-20 % від маси суспензії мікроорганізмів, а потім основну КІЛЬКІСТЬ мінералу 2 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що на першому етапі глинисті мінерали задають у живильне середовище для культивування бактерій, або в культуральну рідину, на основі якої виготовляється гранульований препарат 3 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що в якості глинистих мінералів для виготовлення препаратів використовують переважно монтморилоніт чи бентоніт № 1616990, МКИ С12 N1/05, опубл ЗО 12 90), який відрізняється тим, що з метою збільшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин, мікроорганізми перед висушуванням їх суспензії спочатку змішують з глинистим мінералом палигорскітом, а потім з сухим молоком Однак застосування сухого молока як захисного середовища, а також енергоємного розпилювального висушування значно підвищує вартість бактеріальних препаратів Запропоновано спосіб захисту і консервування мікроорганізмів у глинистих мінералах, що передбачає змішування водних суспензій мікроорганізмів і глин і наступне видалення зайвої вологи до отримання композиту, в якому клітини вкриті шаром глини (Заявка Франції №2394606, МКИ С12 К1/08, А01 15/00, опубл 17 07 87) Недоліком цього способу є необхідність багаторазового відмивання клітин мікроорганізмів перед їх змішуванням з глинистими мінералами Описаний спосіб отримання бактеріального препарату, в якому суспензію мікроорганізмів змішують з прожареним глинистим мінералом, а потім отриману суміш висушують під вакуумом (Заявка Франції №2592892, МКИ С12 N1/20, опубл 17 07 87) Такий ПІДХІД забезпечує високий вихід життєздатних клітин в сипкому препараті Однак вакуумне висушування препарату значно подовжує час його отримання і збільшує вартість готово (О 1 ю 57269 го продукту в основному монтморилонітом з домішками палиВідомий спосіб виготовлення препаратів бульгорскіту В три останні колби глинисті мінерали не бочкових бактерій на основі змішування суспензій вносили Вміст ВСІХ колб інокулювали шляхом внецих мікроорганізмів з ХІМІЧНО інертним і пористим сення в них по Змл суспензії A vmelandn 7, отриматеріалом при співвідношенні 0,5 1,0 і наступноманої після змиву клітин бактерій зі скошеного в му висушування на повітрі в асептичних умовах на мікробіологічній пробірці агаризованого живильнопротязі 2-Ю днів (Пат ЕПВ № 0203708 1986) Одго середовища Культури шкубували при 28°С на нак порошкоподібний препарат не завжди є зручпротязі двох діб ним у використанні, а тривале його висушування 1 1 В 150мл культуральної рідини отриманої в значно ускладнює технологію отримання біопререзультаті вирощування Avmelandn 7 в середопарату вищі з палигорскітом вносили 254г стерильного сухого порошкоподібного палигорскіту Одержану Найбільш близьким за технічним рішенням до суміш перемішували і гранулювали відомим метозапропонованого є спосіб одержання гранульовадом, постійно припудрюючи поверхню гранул стених препаратів бульбочкових бактерій, який базурильним глинистим мінералом палигорскітом для ється на тому, що глинистий мінерал вносять в відбору вологи Гранули досушували на повітрі на культуральну рідину у співвідношенні 1,2-2,0 1,0 в протязі 1 години, відсівали від пиловидних частодва прийоми На першому етапі його задають в чок і асептично розфасовували Отримано 401г межах 0,1-2,0% від маси суспензії, а потім основну гранульованого препарату вологістю 32,9% КІЛЬКІСТЬ мінералу Отриманий композит гранулю(табл 1) ють, гранули підсушують на повітрі на протязі однієї години і відсівають від пилових часточок ТаЧисельність життєздатних бактерій в зразках ким способом отримано гранульований препарат визначали методом десятикратних розведень з бульбочкових бактерій Про можливість застосунаступним висівом 0,1 мл зразка ВІДПОВІДНОГО розвання такого способу для отримання гранульоваведення на поверхню агаризованого середовища них препаратів інших таксономічних груп відомосЕшбі в чашках Петрі і підрахунком КІЛЬКОСТІ КОЛОтей немає НІЙ, що виросли після інкубування при 28°С на протязі 3-5 діб Для приготування десятикратних В основу винаходу поставлено завдання створозведень гранульованого препарату 10г цього рення способу виготовлення гранульованих препрепарату вносили в 90мл стерильної водопровідпаратів бактерій різних таксономічних груп В якосної води, реактивували шляхом перемішування на ті наповнювача використовують стерильний качалці на протязі двох годин 3 отриманої суспенбентоніт чи монтморилоніт, чим забезпечується зії готували десятикратні розведення у яких визнаможливість гранулювання композиту, що містить чали КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин вищеописаним клітини бактерій За рахунок їх взаємодії з даним методом (табл 1) мінералом забезпечується підвищення життєздатності бактерій в зручному для застосування грануВміст життєздатних клітин в 1г гранульованого льованому препараті препарату становив 3,8x108клітин Вихід життєздатних клітин у гранульованому препараті вираховуПоставлене завдання вирішується тим, що в вали за формулою процесі отримання гранульованих препаратів різних видів бактерій, який включає вирощування N 1 -п., -100 культур мікроорганізмів, їх змішування з наповнюY = вачем і гранулювання отриманого композиту у N 0"n0 ВІДПОВІДНОСТІ до винаходу в культуральну рідину, Y - вихід життєздатних клітин у гранульованощо містить клітини мікроорганізму, вносять стериму бактеріальному препараті, %, льні глинисті мінерали, які задають у два прийоми Ni - чисельність життєздатних бактерій в 1г в кінцевому масовому відношенні до суспензії бакпрепарату, терій 1,2-2,0 1,0 На першому етапі глини вносять No - чисельність життєздатних бактерій в 1мл в межах 0,1-20% від маси суспензії в живильне вихідної суспензії, середовище для культивування бактерій, або в їх пі - маса отриманого препарату, г, культуральну рідину за 15-20 хвилин до внесення основної КІЛЬКОСТІ глинистого мінералу Отримапо - об'єм суспензії бактерій, взятої для вигоний композит перемішують, гранулюють одним з товлення препарату відомих методів Гранули підсушують шляхом наОдержані результати свідчать, що застосунесення на них порошкоподібного глинистого мівання палигорскіту для виготовлення гранульованералу, а потім - на повітрі протягом однієї-двох ного препарату Avmelandii 7 забезпечує вихід у годин Отриманий препарат розфасовують ньому життєздатних клітин на рівні 87,4 % (табл 1) 1 2 В 150мл культуральної рідини, отриманої Сутність винаходу підтверджується наступнипри вирощуванні A vmelandn 7 в середовищі з монми прикладами тморилонітом вносили 254г стерильного сухого Приклад І Культуру бактерій Azotobacter vmeмонтморилоніту Одержану суміш перемішували, landii штам 7 вирощували в середовищі Ешбі награнулювали, підсушували і розфасовували вищеступного складу (г/л) К2НРО4 ЗН2О - 0,2, описаним методом Отримано 404г гранульованоMgSO4 7Н2О - 0,2, K2SO4 - 0,1, NaCI - 0,2, СаСО3 го бактеріального препарату вологістю 32,3% Ви- 5,0, сахароза - 20,0, рН середовища - 6,8-7,0 хід життєздатних клітин у гранульованому Для цього в ряд колб Ерленмейєра об'ємом 750 препарату складав 95,6% (табл 1) мл вносили по 1 г стерильного глинистого мінера1 3 В 150мл культуральної рідини, отриманої лу палигорскіту, в 3 наступні - по 1г монтморилопри вирощуванні A vmelandn 7 в середовищі з бенніту, а ще в 3 - по 1г бентоніту, що представлений тонітом вносили 254г стерильного бентоніту Одержану суміш перемішували, гранулювали, підсушували і розфасовували вищеописаним методом Отримано 403г гранульованого баїсгеріального препарату вологістю 32,1% Вихід життєздатних клітин у гранульованому препараті складає 91,8% (табл 1) 14 Отримано 150мл суспензії Avmelandii 7 при культивуванні цих бактерій за відсутності у живильному середовищі глинистих мінералів, в 9 1мл якої містилось 1,02x10 життєздатних клітин Це на 12% менше КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин у суспензії з палигорскітом і на 30% менше, ніж з бентонітом В 150мл культуральної рідини, отриманої при вирощуванні A vmelandn 7 у середовищі без глинистих мінералів, вносили 255г бентоніту 57269 Отриману суміш перемішували і розфасовували, як описано в 1 1 Одержано 400г гранульованого препарату вологістю 33,1% Чисельність життєзда8 тних бактерій у 1 г препарату складала 3,3x10 клітин Вихід життєздатних бактерій у такому препараті становить 86,2% від їх чисельності у суспензії (табл 1) Таким чином, внесення глинистих мінералів у живильне середовище забезпечує накопичення більшої КІЛЬКОСТІ клітин бактерій у суспензії, значно вищий вихід життєздатних клітин у готовому препараті у порівнянні з варіантом, де глинистий мінерал вносили однократно перед гранулюванням маси Найбільш високі виходи життєздатних клітин отримані при двостадійному внесенні глинистих мінералів монтморилоніту чи бентоніту Таблиця 1 Властивості гранульованих препаратів Azotobacter vmelandii 7, отриманих при взаємодії з різними типами глинистих мінералів Досліджуваний показник палигор-скіт 1/254 150 1,1610у Глинистий мінерал монтморилоніт бентоніт 1/254 1/254 0/255 150 150 150 1,52 10у 1,46 10у 1,02 10у Об'єм суспензії, мл Чисельність бактерій в суспензії,кл/мл Загальний вміст життєздатних бактерій в 174 109 228 109 219 109 153 109 150мл суспензії, кл Маса отриманого грунту, г 401,0 404,0 403,0 400,0 Чисельність життєздатних бактерій в препаs s s 3,8 10 5,4 10 5,0 10 3,3 10s раті, кл/г Загальний вміст життєздатних бактерій у 152 109 218 109 201 109 132 109 препараті, кл Вихід життєздатних клітин у препараті, % 87,4 95,6 91,8 86,2 Примітка Глинисті мінерали вносили у суспензію бактерій в два прийоми спочатку по 1 г (крім останньої колонки), у живильне середовище, (чисельник), а після вирощування в ньому бактерій - додатково по 254г мінералу (знаменник) Приклад 2 Культуру бактерій Bacillus subtihs 5 вирощували в середовищі наступного складу (г/л) (NH4)2SO4 - 0,5, MgSO4 7H2O - 0,3, NaCI - 0,3, КСІ - 0,3, MnSO4 5H2O - 0,001, FeSO4 - 0,001, СаСО3 - 5,0, глюкоза - 10,0, гліцерофосфат кальцію - 1,0 в перерахунку на 4 Для цього у 3 колби Ерленмейєра, об'ємом 0,7л вносили по ЮОмл середовища вищенаведеного складу Середовище інокулювали суспензією цих бактерій, отриманою шляхом змиву клітин з поверхні скошеного агаризованого середовища в мікробіологічних пробірках Культуру мікроорганізмів вирощували при 28°С на протязі 3-х діб В 150мл суспензії бактерій, в 1мл якої містилось 3,7x10s життєздатних клітин, вносили 7,5г монтморилоніту (табл 2), суміш повільно перемішували на протязі 15 хвилин для забезпечення контакту бактерій з часточками глинистого мінералу Після цього у суміш вносили 230г порошковидного стерильного монтморилоніту і перемішували до отримання густої маси Отриману суміш гранулювали, припудрювали сухим палигорскітом, досушували на повітрі при кімнатній температурі на протязі 2 годин, відсівали від пиловидних часточок і асептично розфасовували Одержано 380г гранульованого препарату вологістю 32,4%, в 1г якого містилось 1,41x10s життєздатних клітин Bacillus subtihs 5 Вихід бактерій в препараті становив 97,6% (табл 2) В другу частину тієї ж суспензії (150мл) одноразово вносили 237,5г монтморилоніту Суміш перемішували, гранулювали, припудрювали, досушували на протязі 2-х годин, відсівали від пиловидних часточок і асептично розфасовували Отримано 383г гранульованого препарату В subtihs 5 вологістю 32,2% В 1г препарату містилось 1,24x10s життєздатних клітин бактерій, їх вихід у препараті складав 85,6% від чисельності клітин у суспензії Таким чином, внесення глинистого мінералу монтморилоніту в два прийоми на першому етапі 5%, а на другому - маси, необхідної для отримання композиту, придатного для гранулювання, забезпечує контактну взаємодію бактерій з часточкам глинистого мінералу, захищає клітини від дії неблагоприємних факторів навколишнього середовища і підвищує вихід життєздатних мікроорганізмів у гранульованому препараті спорових бактерій 57269 Таблиця 2 Деякі властивості гранульованих препаратів В subtihs 5, отриманих при різних режимах внесення монтморилоніту Монтморилоніт вносили в 2 прийоми Одноразово 150 150 3,7 10" 3,7 10" іи іи 5,55 10 5,55 10 380 383 1,46 10" 1,24 10" 96,4 85,6 Досліджуваний показник Об'єм суспензії, мл Чисельність життєздатних бактерій в суспензії,кл/мл Загальний вміст життєздатних в 150мл суспензії, кл Маса отриманого препарату, г Чисельність бактерій у 1г препарату, кл Вихід життєздатних клітин у препараті, % Приклад 3 Культуру Methylocystis parvus ОВВР вирощували в мінеральному живильному середовищі наступного складу (г/л) К2НРО4 ЗНгО - 0,25, КН2РО4 - 0,25, MgSO4 7Н2О - 0,3, NaCI 3,0, СаСІ2 - 0,02, KNO3 - 0,5, а також розчин мікроелементів у пропису Leadbetter, Foster, 1958 Для цього в ряд флаконів об'ємом 500мл вносили по 50мл живильного середовища вище приведеного складу, яке інокулювали по 1мл суспензії цих бактерій, отриманої шляхом змиву клітин з поверхні агаризованого середовища вище приведеного складу в мікробіологічній пробірці Флакони закривали резиновими пробками, їх фіксували металіч ними фіксаторами Вміст флаконів вакуумували на О.Затм і вакуумований об'єм заповнювали метаном, створюючи в колбах метаноповітряну суміш у співвідношенні ЗО 70 Культури шкубували при 30°С на круговій качалці (240об/хв) на протязі 2-х діб Отриману суспензію М parvus ОВВР, в 1мл якої містилось 5,7x108 клітин, розливали у колби по 150мл В першу колбу вносили 0,15г порошкоподібного бентоніту, в другу - Зг, в третю - 7,5г, а у четверту - 30г цього мінералу В останню колбу, що містила 150мл суспензії бактерій, глинистий мінерал на першому етапі не вносили (табл 3) Таблиця З Залежність якості препарату Methylocytris parvus ОВВР від КІЛЬКОСТІ бентоніту, що вносили на першому і другому етапі підготовки композиту для гранулювання Досліджуваний показник КІЛЬКІСТЬ бентоніту (г), що вносився на першому (чисельник) і другому (знаменник) етапах підготовки композиту 0,15/239,80 3,0/237,0 7,5/232,5 30,0/210,0 0/240 Чисельність життєздатних 1,52 10s 1,65 10s 1,63 10s 1,2 10s 1,10 108 бактерій в препараті, кл/г Маса отриманого препарату, 384 387 385 386 387 г Загальна чисельність життє5,38 10 10 5,89 10 10 6,35 10 10 6,29 10 10 4,56 10 10 здатних клітин у препараті, кл Вихід життєздатних клітин у 62,9 68,9 74,3 73,6 53,3 препараті, % Примітка 1 В кожному варіанті об'єм суспензії бактерій складав 150мл 2 Чисельність життєздатних бактерій у суспензії становила 5,7x10s в 1мл 3 Загальна чисельність життєздатних бактерій в 150мл суспензії складала 8,55x1010 клітин Отриману суміш повільно струшували на протязі 20хв Для забезпечення контрактної взаємодії бактерій з часточками глинистого мінералу Після цього у кожну з колб вносили бентоніт до його кінцевого вмісту 240г на 150мл суспензії Отриману суміш перемішували, гранулювали, припудрювали сухим палигорскітом, підсушували на протязі 1 години, відсівали від пиловидних часточок і асептично розфасовували Результати виготовлення гранульованого препарату приведені у таблиці З, свідчать, що внесення бентоніту в два прийоми на Комп'ютерна верстка Н Кураєва першому етапі 0,1-20,0%, а на другому - 20,0% основної частини глинистого мінералу бентоніту, що забезпечує можливість гранулювання композиту, є основною контактної взаємодії бактерій з глинистим мінералом, захищає клітини від дії неблагоприємних факторів навколишнього середовища і значно підвищує вихід життєздатних клітин у гранульованому препараті Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа,8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна