Спосіб визначення каталітичної ефективності препарату трансглютамінази

Реферат: Спосіб визначення каталітичної ефективності препарату трансглютамінази передбачає, що до розчину дипептиду N-CZ-GLN-GLY у суміші з рН в інтервалі 6,00-6,10, що містить NaOH, гідроксиламіну і відновленого глутатіоту у співвідношенні 1:2:2 загальним обсягом 15 мл, додають 0,1 мг зразка трасглутамінази. Суміш термостатують при 37° С протягом 10 хвилин, охолоджують і додають 15 мл суміші 3 % розчину в 0,1 N НСl, 12 % розчину трихлороцтової кислоти і НСІ у співвідношенні у рівній кількості, центрифугують. У рідкій частині визначають величину оптичної пильності при 525нм, використовуючи як порівняння аналогічний розчин без транеглутамінази, розраховують величини активності щодо калібрувального графіка, побудованого з використанням хімічно чистої транеглутамінази. Каталітичну активність визначають за величиною пенетрації гелю стандартизованого 10 %-вого розчину харчового желатину з рН 7,4. Оцінювання в широкому діапазоні значень показника масова частка ферментного препарату в фермент-субстратній системі становить 0,5 %, тривалість ферментування за температури 50 °C - 24 години, а тривалість формування гелю за температури 25 °C - 12 годин. UA 90939 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ КАТАЛІТИЧНОЇ ЕФЕКТИВНОСТІ ПРЕПАРАТУ ТРАНСГЛЮТАМІНАЗИ UA 90939 U UA 90939 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана у харчовій промисловості. Відомий спосіб визначення протеазної активності ферменту трансглютамінази (патент № WO2007026921А1 "Method for determination of protease activity in transglutaminase-containing matter and adhesive transglutaminase preparation", Rikiya Ishida, Hiroyuki Nakagoshi, від 05.1 1.2008), який передбачає, що до розчину дипептиду N-CZ-GLN-GLY у суміші з рН в інтервалі 6,00-6,10, що складається з NaOH, гідроксиламіну, і відновленого глутатіоту у співвідношенні 1:2:2 загальним обсягом 15 мл, додають 0,1 мг зразка трасглютамінази, суміш термостатують при 37 °C протягом 10 хвилин, охолоджують і додають 15 мл суміші 3 % розчину в 0,1 N НСl, 12 % розчину трихлороцтової кислоти і НСl у співвідношенні у рівній кількості, центрифугують, у рідкій частині визначають величину оптичної щільності при 525нм, використовуючи як порівняння аналогічний розчин без транcглюамінази, розраховують величини активності щодо калібрувального графіка, побудованого з використанням хімічно чистої трансглютамінази. Недоліком відомого способу є необхідність застосування стандартизованого ферменту протеази високого ступеня очищення, внаслідок чого можлива взаємна інактивація протеази і трансглютамінази в процесі ферментації В основу корисної моделі поставлена задача розробка простого у використанні способу визначення каталітичної ефективності трансглютамінази, як індикатору якості продукту, та обґрунтування оптимальних умов експерименту. Поставлена задача вирішується тим, що каталітичну ефективність визначають за величиною пенетрації гелю стандартизованого 10 %-ого розчину харчового желатину з рН 7,4, при цьому оцінювання в широкому діапазоні значень показника масова частка ферментного препарату в фермент-субстратній системі становить 0,5 %, тривалість ферментування за температури 50 °C-24 години, а тривалість формування гелю за температури 25 °C-12 годин. Приклад. Експериментальні розчини готують з урахуванням масової частки вологи в желатині і препараті транглутамінази. Наважки зважують з точністю до 0,01 г. Желатин розчиняють в 75 % маси необхідного для приготування буферного розчину, попереднього розігрітого до 50 °C з інтенсивним перемішуванням. Препарат трансглютамізу розчиняють в 10-15 % буферного розчину тієї ж температури. Отримані розчини змішують і доводять буферним розчином до необхідної маси. Для всіх експериментів як зразки порівняння використовують розчини желатину без введення препарату трансглютамінази. Одержанні розчини дозують до повного заповнення у бюкси алюмінієві розміром 50 × 38 мм. Підготовлені зразки для розвитку реакції термостатують при температурі 50 °C. Кожні 2 години визначають пенетрацію. Зразки розігрівають до температури 90 °C і витримують 30 хвилин для інактивації трансглютамінази. Інактивовані розчини поміщають в ексикатор і термостатують при температурі 25 °C для формування гелю. Всі експерименти виконують в п'ятикратній повторності з п'ятикратним повторенням кожного вимірювання. Таким чином, кожній експериментальній точці відповідало 25 вимірювань значення величини пенетрації. Значення ефективності каталізу препарату трансглютамінази (ЕКТ), для усунення впливу технічних особливостей вимірювального приладу (пенетрометра), доцільно розраховувати за рівнянням: Пс  Пф 1 EKT  ,г , Пс m де Пс - величина пенетрації 10 % гелю желатину без додавання препарату тансглутамінази (зразок порівняння), од. пенетрації; Пф - величина пенетрації 10 % гелю ферментованого желатину, од. пенетрації; m - маса препарату трансглютамінази прийнятого для ферментації 100 г 10 % розчину желатину. 1 UA 90939 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб визначення каталітичної ефективності препарату трансглютамінази, який передбачає, що до розчину дипептиду N-CZ-GLN-GLY у суміші з рН в інтервалі 6,00-6,10, що складається з NaOH, гідроксиламіну і відновленого глутатіоту у співвідношенні 1:2:2 загальним обсягом 15 мл, додають 0,1 мг зразка трасглутамінази, суміш термостатують при 37° С протягом 10 хвилин, охолоджують і додають 15 мл суміші 3 % розчину в 0,1 N НСl, 12 % розчину трихлороцтової кислоти і НСІ у співвідношенні у рівній кількості, центрифугують, у рідкій частині визначають величину оптичної пильності при 525нм, використовуючи як порівняння аналогічний розчин без транеглутамінази, розраховують величини активності щодо калібрувального графіка, побудованого з використанням хімічно чистої транеглутамінази, який відрізняється тим, що каталітичну активність визначають за величиною пенетрації гелю стандартизованого 10 % розчину харчового желатину з рН 7,4, при цьому оцінювання в широкому діапазоні значень показника масова частка ферментного препарату в фермент - субстратній системі становить 0,5 %, тривалість ферментування за температури 50 °C - 24 години, а тривалість формування гелю за температури 25 °C - 12 годин. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2