Dig-3 інсектицидні cry-токсини

Реферат: Винахід належить до DIG-3 CRY-токсинів, полінуклеотидів, які їх кодують, трансгенних рослин, які продукують такі токсини, та застосування їх для боротьби з комахами-шкідниками. UA 106885 C2 (12) UA 106885 C2 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет Попередньої патентної заявки США № 61/170,189, поданої 17 квітня 2009 р., яка є прямо включеною до цієї заявки шляхом посилання. Галузь винаходу Цей винахід стосується нових інсектицидних CRY токсинів та їх застосування для боротьби з комахами. Рівень техніки Bacillus thuringiensis (B.t.) є бактерією, що передається через ґрунт, яка продукує пестицидні кристалічні білки, відомі як дельта-ендотоксини або Cry білки. Cry білки є інтоксикантами перорального введення, які функціонують шляхом дії на клітини середньої кишки сприйнятливих комах. Широкий перелік дельта-ендотоксинів ведеться й регулярно оновлюється на сайті http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html. Кукурудзяний метелик (ECB), Ostrinia nubilalis (Hübner), є найбільш шкідливою для кукурудзи комахою у Сполучених Штатах Америки та Канаді і за оцінками щороку спричинює недоотримання доходу у розмірі $1 мільярд через втрату врожаю та витрати на боротьбу з комахами (Witkowski et al., 2002). Трансгенна кукурудза, яка експресує гени, що кодують Cry білки, головним чином, Cry1Ab, Cry1Ac або Cry1F, забезпечує ефективність проти ECB на промисловому рівні. Незважаючи на успіхи у культивуванні резистентної до ECB трансгенної кукурудзи, можливість розвитку популяцій резистентних комах загрожує довготривалому застосуванню Cry білків для боротьби з ECB і викликає потребу у виявленні та розробці нових Cry білків для боротьби з ECB та іншими шкідниками. Резистентність комах до B.t. Cry білків може розвиватися через кілька механізмів (Heckel et al., 2007, Pigott and Ellar, 2007). В організмах комах було розпізнано багато класів рецепторних білків для Cry білків, і існує багато прикладів у межах кожного класу рецепторів. Резистентність до конкретного Cry білка може розвиватися, наприклад, через мутацію у межах токсин-зв'язувальної частини домену кадгерину рецепторного білка. Інший засіб резистентності може бути опосередкований протеазою, яка обробляє протоксин. Таким чином, резистентність до CRY токсинів у видів Lepidoptera має складну генетичну основу з принаймні чотирма окремими головними генами резистентності. Серед комах ряду Lepidoptera резистентність до Cry білків у природі розвинулася серед видів Plutella xylostella (Tabashnik, 1994), Trichoplusia ni (Janmaat and Myers 2003, 2005) та Helicoverpa zeae (Tabashnik et al., 2008). Розробка нових високоефективних Cry білків мала б забезпечити додатковий засіб боротьби з ECB та іншими шкідливими комахами. Cry білки з різними механізмами дії, які продукуються у комбінації у трансгенній кукурудзі, мають запобігати розвиткові резистентності у комах ECB і забезпечити довготривале застосування технології B.t. для боротьби з комахами-шкідниками. Короткий опис винаходу Даний винахід забезпечує інсектицидні CRY токсини, включаючи токсин, позначений у цьому описі як DIG-3, а також варіанти DIG-3, нуклеїнові кислоти, які кодують ці токсини, способи боротьби зі шкідниками з застосуванням токсинів, способи продукування токсинів у трансгенних рослинах-хазяях та трансгенні рослини, які продукують токсини. Прогнозовану амінокислотну послідовність DIG-3 токсину дикого типу представлено у SEQ ID NO:2. Як описано у Прикладі 1, нуклеїнову кислоту, яка кодує DIG-3 білок, було виділено зі штаму B.t., який має прийняту у Dow AgroSciences LLC внутрішню назву PS46L. Визначали нуклеїновокислотну послідовність для кодуючої ділянки повної довжини і білкову послідовність повної довжини виводили з нуклеїновокислотної послідовності. DIG-3 токсин має певну подібність з Cry1BII (Genbank Accession No. AAM93496) та іншими білками Cry1B-типу B. thuringiensis (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html). Також описуються інсектицидно активні варіанти DIG-3 токсину, які разом називаються DIG3 токсинами. DIG-3 токсини також можуть застосовуватись у комбінації з методологіями РНКі для боротьби з іншими комахами-шкідниками. Наприклад, DIG-3 може застосовуватись у трансгенних рослинах у комбінації з дсРНК для супресії суттєвого гена у кукурудзяного жука або суттєвого гена у комахи-шкідника. До таких генів-мішеней належать, наприклад, вакуолярна АТФаза, ARF-1, Act42A, CHD3, EF-1α та TFIIB. Прикладом прийнятного гена-мішені є вакуолярна АТФаза, як описано у WO2007/035650. Несподівано було виявлено, що DIG-3 токсини є активними проти популяцій кукурудзяного метелика та капустяної молі, які є резистентними до Cry1F та Cry1A токсинів. Відповідно, DIG-3 токсини є ідеальними кандидатами для застосування у боротьбі проти шкідників ряду Lepidoptera. Токсини можуть застосовуватись окремо або у комбінації з іншими CRY токсинами, 1 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такими, як Cry1F, Cry1Ab та Cry1Ac, для стримання розвитку популяцій резистентних комах. Інсектицидно активні фрагменти SEQ ID NO:2 та нуклеотиди, які кодують такі фрагменти, є ще одним аспектом винаходу. В одному варіанті втілення винахід забезпечує виділений поліпептидний DIG-3 токсин, який включає коровий сегмент токсину, вибраний з групи, до якої належать: (a) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність із залишків з 113 по 643 SEQ ID NO:2; (b) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка має принаймні 90 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю із залишків з 113 по 643 SEQ ID NO:2; (c) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність із залишків з 113 по 643 SEQ ID NO:2, що має до 20 амінокислотних заміщень, делецій або модифікацій, які не мають негативного впливу на експресію або активність токсину, який кодується послідовністю SEQ ID NO:2. В одному варіанті втілення винахід забезпечує виділений поліпептидний DIG-3 токсин, який включає коровий сегмент токсину, вибраний з групи, до якої належать: (a) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність із залишків з 73 по 643 SEQ ID NO:2; (b) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка має принаймні 90 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю із залишків з 73 по 643 SEQ ID NO:2; (c) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність із залишків з 73 по 643 SEQ ID NO:2, що має до 20 амінокислотних заміщень, делецій або модифікацій, які не мають негативного впливу на експресію або активність токсину, який кодується послідовністю SEQ ID NO:2. В іншому варіанті втілення винахід забезпечує виділений поліпептидний DIG-3 токсин, який включає коровий сегмент токсину DIG-3, вибраний з групи, до якої належать (a) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність із залишків з 1 по 643 SEQ ID NO:2; (b) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка має принаймні 90 % ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю із залишків з 1 по 643 SEQ ID NO:2; (c) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність із залишків з 1 по 643 SEQ ID NO:2, що має до 20 амінокислотних заміщень, делецій або модифікацій, які не мають негативного впливу на експресію або активність токсину, який кодується послідовністю SEQ ID NO:2. Під "виділеним" заявники розуміють, що поліпептид або молекули ДНК було видалено з їх природного середовища і поміщено до іншого середовища шляхом людського втручання. В іншому варіанті втілення винахід забезпечує рослину, яка включає DIG-3 токсин. В іншому варіанті втілення винахід забезпечує спосіб стримування популяції шкідників, який включає приведення вищезгаданої популяції у контакт з пестицидно ефективною кількістю DIG3 токсину. В іншому варіанті втілення винахід забезпечує виділену нуклеїнову кислоту, яка кодує DIG-3 токсин. В іншому варіанті втілення винахід забезпечує послідовність ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність, яка кодує DIG-3 токсин, функціонально з'єднаний з промотором, що не походить із Bacillus thuringiensis і може започатковувати експресію у рослині. Винахід також забезпечує трансгенну рослину, яка включає послідовність ДНК, стійко включену в її геном, та спосіб захисту рослини від шкідника, який включає включення послідовності у вищезгадану рослину. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1 Послідовність ДНК, яка кодує DIG-3 токсин повної довжини; 3771 нт. SEQ ID NO:2 Послідовність DIG-3 білка повної довжини; 1256 ак. SEQ ID NO:3 Оптимізована до рослини послідовність ДНК DIG-3 повної довжини; 3771 нт. SEQ ID NO:4 Протоксиновий сегмент Cry1Ab; 545 ак. SEQ ID NO:5 Химерний токсин: коровий сегмент токсину DIG-3 / протоксиновий сегмент Cry1Ab; 1188 ак. SEQ ID NO:6 Оптимізована до дводольних рослин послідовність ДНК, яка кодує протоксиновий сегмент Cry1Ab; 1635 нт. SEQ ID NO:7 Оптимізована до кукурудзи послідовність ДНК, яка кодує протоксиновий сегмент Cry1Ab; 1635 нт. Детальний опис винаходу DIG-3 токсини та інсектицидно активні варіанти. Крім DIG-3 токсину повної довжини з 2 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю SEQ ID NO:2, винахід охоплює інсектицидно активні варіанти. Під терміном "варіант" заявники розуміють фрагменти, певні делеційні та інсерційні мутанти та певні злиті білки. DIG-3 є класичним тридоменним CRY токсином. Для вступу до опису варіантів DIG-3 токсину, які охоплюються винаходом, бажано коротко переглянути будову тридоменних CRY токсинів в цілому та, зокрема, DIG-3 білкового токсину. Більшість кристалічних білкових молекул дельта-ендотоксину Bacillus thuringiensis складаються з двох функціональних сегментів. Протеазостійкий коровий токсин є першим сегментом і відповідає приблизно першій половині молекули білка. Повна ~130 кДа молекула протоксину швидко обробляється до стійкого корового сегмента протеазами у кишечнику комахи. Сегмент, який видаляється через таку обробку, у контексті даного опису називається "протоксиновим сегментом". Вважається, що протоксиновий сегмент бере участь в утворенні кристалів токсину (Arvidson et al., 1989). Таким чином, протоксиновий сегмент може забезпечувати часткову специфічність комахи до токсину через обмеження доступу корової частини до комахи шляхом зменшення протеазної обробки молекули токсину (Haider et al., 1986) або зменшення розчинності токсину (Aronson et al., 1991). B.t. токсини, навіть у межах певного класу, певною мірою відрізняються між собою за довжиною та точним розташуванням переходу від корового сегмента токсину до протоксинового сегмента. Перехід від корового сегмента токсину до протоксинового сегмента зазвичай відбувається на відрізку, який складає від приблизно 50 % до приблизно 60 % повної довжини токсину. У SEQ ID NO:2 показано послідовність з 1256 амінокислот поліпептиду DIG-3 повної довжини, з яких N-кінцеві 643 амінокислоти включають коровий сегмент токсину DIG-3. 5’-кінцеві 1929 нуклеотидів SEQ ID NO:1 включають кодуючу ділянку для корового сегмента токсину. Тривимірні кристалічні структури було визначено для Cry1Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba та Cry8Ea1. Ці структури для корових токсинів є дуже подібними і складаються з трьох окремих доменів з описаними нижче особливостями (огляд у публікації de Maagd et al., 2003). Домен I являє собою пучок з семи альфа-спіралей, у якому α-спіраль 5 оточується шістьма амфіпатичними спіралями. Цей домен залучається до утворення пор і має гомологію з іншими пороутворюючими білками, включаючи гемолізини та коліцини. Домен I DIG-3 білка включає амінокислотні залишки з 56 по 278 послідовності SEQ ID NO:2. Домен II утворюється трьома зустрічно-паралельними бета-шарами, об'єднаними у бетапризму. Петлі цього домену відіграють важливу роль у зв'язуванні з рецепторами середньої кишки комах. У Cry1A білках відкриті на поверхні петлі на верхівках бета-шарів Домену II беруть участь у зв'язуванні з рецепторами кадгерину комах Lepidoptera. Петлі Домену II Cry3Aa зв'язуються з мембранно-асоційованою металопротеазою Leptinotarsa decemlineata (Say) (колорадський жук) у подібний спосіб (Ochoa-Campuzano et al., 2007). Домен II має гомологію з певними вуглевод-зв'язувальними білками, включаючи вітелін та джакалін. Домен II DIG-3 білка включає амінокислотні залишки з 283 по 493 послідовності SEQ ID NO:2. Домен III являє собою бета-сендвіч з двох зустрічно-паралельних бета-шарів. За структурою цей є спорідненим з вуглевод-зв'язувальними доменами білків, таких, як глюканази, галактозоксидаза, сіалідаза та інші. Домен III зв'язує певні класи рецепторних білків і, можливо, бере участь в інсерції пре-пори олігомерного токсину, яка взаємодіє з другим класом рецепторів, прикладами яких є амінопептидаза та лужна фосфатаза у разі Cry1A білків (Pigott and Ellar, 2007). Аналогічні рецептори Cry Домену III ще чекають розпізнавання у комах ряду Coleoptera. Блоки 2 та 3 консервативної послідовності B.t. картуються поблизу від N-кінця та Cкінця Домену 2, відповідно. Отже, ці блоки 2 та 3 консервативної послідовності є приблизно межовими ділянками між трьома функціональними доменами. Ці ділянки консервативної ДНК та гомологію білків використовували для інженерії рекомбінантних токсинів B.t. (Патент США № 6090931, документи WO 91/01087, WO 95/06730, WO 1998022595). Домен III DIG-3 білка включає амінокислотні залишки з 503 по 641 послідовності SEQ ID NO:2. Повідомлялося, що α-спіраль 1 Домену I видаляється після рецепторного зв'язування. Aronson et al. (1999) продемонстрували, що Cry1Ac, зв'язаний з BBMV, був захищений від розщеплення протеїназою K, яке починається у залишку 59, відразу після α-спіралі 1; про подібні результати повідомлялося для Cry1Ab. Gomez et al. (2002) виявили, що Cry1Ab олігомери, утворені після зв'язування з BBMV рецептором, не мали компонента α-спіралі 1 Домену I. Крім того, Soberon et al. (2007) показали, що N-кінцеві делеційні мутанти Cry1Ab та Cry1Ac, у яких бракує приблизно 60 амінокислот, які включають α-спіраль 1 на тривимірній Cry структурі, можуть складати мономери з молекулярною масою приблизно 60 кДа у пре-пори за відсутності зв'язування кадгерину. Повідомлялося, що ці N-кінцеві делеційні мутанти є активними у Cry-резистентних личинках комах. Крім того, Diaz-Mendoza et al. (2007) описували 3 UA 106885 C2 5 10 фрагменти Cry1Ab 43 кДа та 46 кДа, які зберігали активність проти середземноморського кукурудзяного метелика (Sesamia nonagrioides). Було продемонстровано, що ці фрагменти включають амінокислотні залишки з 116 по 423; однак точні амінокислотні послідовності не було з'ясовано, і механізм дії цих протеолітичних фрагментів є невідомим. Результати досліджень Gomez et al. (2002), Soberon et al. (2007) та Diaz-Mendoza et al. (2007) контрастують з результатами, отриманими Hofte et al. (1986), які повідомляли, що делеція 36 амінокислот з Nкінця Cry1Ab призводила до втрати інсектицидної активності. Нами було виведено початок та кінець α-спіралі 1, α-спіралі 2A, α-спіралі 2B та α-спіралі 3 і розташування спейсерних ділянок між ними у Домені I DIG-3 токсину через порівняння послідовності DIG-3 білка з білковою послідовністю для Cry8Ea1, структура якої є відомою. Ці місця розташування описуються у Таблиці 1. Таблиця 1 Координати амінокислот проектних -спіралей DIG-3 білка α-спіраль 1 спейсер Залишки ID NO:2 15 20 25 30 35 40 45 50 SEQ 53-70 71-76 α-спіраль 2A 77-91 спейсер α-спіраль 2B спейсер α-спіраль 3 92-99 100-108 109-113 114-138 Аміно-кінцеві делеційні варіанти DIG-3. В одному з аспектів винахід забезпечує DIG-3 варіанти, у яких α-спіраль 1, α-спіраль 2A та α-спіраль 2B, повністю або частково, є делетованими для поліпшення інсектицидної активності та уникнення розвитку резистентності у комах. Ці модифікації здійснювали для забезпечення варіантів DIG-3 з поліпшеними властивостями, такими, як розширений спектр шкідників-об'єктів, ефективність та контроль над резистентністю комах. У деяких варіантах втілення винаходу модифікації можуть впливати на ефективність активації протоксину та утворенню пор, що веде до інтоксикації комах. Тобто, для забезпечення варіантів DIG-3 з поліпшеними властивостями, описуються поетапні делеції, які видаляють частину нуклеїновокислотної послідовності, яка кодує N-кінець DIG-3 білка. Делеції видаляють усю α-спіраль 1 та усю α-спіраль 2 або її частину у Домені I, водночас зберігаючи структурну цілісність α-спіралей з 3 по 7. Таким чином, предмет винаходу частково стосується поліпшення ефективності Cry білка шляхом інженерії α-спіральних компонентів Домену 1 для більш ефективного утворення пор. Більш конкретно предмет винаходу частково стосується поліпшених DIG-3 білків, побудованих таким чином, щоб мати N-кінцеві делеції у ділянках з імовірною гомологією вторинної структури з α-спіраллю 1 та α-спіраллю 2 у Домені I Cry1 білків. Делеції для поліпшення інсектицидних властивостей DIG-3 токсинів можуть започатковуватися до початку прогнозованої α-спіралі 2A і можуть закінчуватися після кінця αспіралі 2B, але в оптимальному варіанті не поширюються на α-спіраль 3. При побудові кодуючих послідовностей для варіантів з N-кінцевою делецією старт-кодон ATG, який кодує метіонін, вставляють на 5" кінці нуклеотидної послідовності, призначеної для кодування варіанта з делецією. Для послідовностей, призначених для застосування у трансгенних рослинах, може бути бажаним дотримання "правила N-кінця", описаного у публікації Varshavsky (1997). У ній сказано, що деякі амінокислоти можуть сприяти нестійкості та розпадові білка в еукаріотних клітинах у разі, коли представляють N-кінцевий залишок білка. Наприклад, дані, зібрані у процесі спостережень за клітинами дріжджів та ссавців, свідчать, що N-кінцевими дестабілізуючими амінокислотами є F, L, W, Y, R, K, H, I, N, Q, D, E та, можливо, P. Хоча специфічні особливості механізмів розпаду білків можуть мати певні розбіжності між організмами, консервація конкретних N-кінцевих дестабілізуючих амінокислот, які вказано вище, свідчить, що подібні механізми можуть функціонувати у рослинних клітинах. Наприклад, Worley et al. (1998) виявили, що у рослинах правило N-кінця охоплює основні та ароматичні залишки. Можливо, протеолітичне розщеплення рослинними протеазами поблизу від початку -спіралі 3 даних інсектицидних білків B.t. може відкрити дестабілізуючу N-кінцеву амінокислоту. Така обробка може бути спрямована на розщеплені білки для їх швидкого руйнування та обмеження накопичення інсектицидних білків B.t. до рівнів, недостатніх для ефективної боротьби з комахами. Відповідно, для варіантів з N-кінцевою делецією, які починаються з однієї з дестабілізуючих амінокислот, заявники віддають перевагу додаванню кодону, який вказує на амінокислоту G (гліцин) між метіоніном ініціації трансляції та дестабілізуючою амінокислотою. Приклад 2 представляє конкретні приклади варіантів DIG-3 з аміно-кінцевою делецією згідно з винаходом. Додавання корисних фрагментів, які зберігають токсичність, може бути визначене 4 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом розщеплення трипсином або хімотрипсином солюбілізованого кристалічного білка повної довжини. Інші приклади фрагментів токсичного DIG-3 білка можуть бути кодовані фрагментами кодуючої ділянки DIG-3. Активні стосовно комах варіанти DIG-3 здебільшого мають коротке N-кінцеве зрізання та довге C-кінцеве зрізання. N-кінцевий кінець найменшого токсичного фрагмента легко визначається шляхом визначення N-кінцевої амінокислотної послідовності обробленого трипсином або хімотрипсином розчинного кристалічного білка з застосуванням традиційних для даної галузі способів. Химерні токсини. Раніше повідомлялося про химерні білки, в яких використовується коровий сегмент одного CRY токсину, який є злитим з протоксиновим сегментом іншого CRY токсину. До варіантів DIG-3 належать токсини, які включають N-кінцевий коровий сегмент DIG-3 токсину (який може мати повну довжину або мати N-кінцеві делеції, описані вище), який є злитим з гетерологічним протоксиновим сегментом у певній точці після кінця корового сегмента токсину. Перехід до гетерологічного протоксинового сегмента може відбуватися приблизно у місці з'єднання природного корового токсину / протоксину або, в альтернативному варіанті, частина природного протоксину (яка виходить за межі корового сегмента токсину) може утримуватись у місці переходу до гетерологічного протоксину, який відбувається нижче. Наприклад, химерний токсин згідно з даним винаходом має повний коровий сегмент токсину DIG-3 (амінокислоти 1643) та гетерологічний протоксиновий сегмент (амінокислоти від 643 до C-кінця). В оптимальному варіанті втілення гетерологічний протоксиновий сегмент походить від Cry1Ab дельта-ендотоксину, як показано у SEQ ID NO:5. SEQ ID NO:4 показує послідовність протоксинового сегмента Cry1Ab з 545 амінокислот, яка використовується у варіантах DIG-3 згідно з винаходом. Увага привертається до останніх приблизно 100-150 амінокислот цього протоксинового сегмента, який є найбільш ключовим компонентом, включеним до химерного токсину згідно з даним винаходом. Варіанти чутливості протеази. Протеази кишечника комах зазвичай функціонують для сприяння отриманню комахами потрібних амінокислот з харчового білка. Найбільш дослідженими травними протеазами комах є серин-протеази, які належать до найбільш поширеного типу (Englemann and Geraerts (1980), зокрема, у видах ряду Lepidoptera. Комахи ряду Coleoptera мають кишечник, який є більш нейтральним щодо кислотного середовища, ніж кишечник комах Lepidoptera. Більшість личинок та дорослих комах Coleoptera, наприклад колорадський жук, мають слабокислотне середовище середньої кишки, і цистеїн-протеази забезпечують головну протеолітичну активність (Wolfson and Murdock, 1990). Крім того, Thie and Houseman (1990) розпізнали й охарактеризували цистеїн-протеази, катепсин B-подібну та катепсин H-подібну, та аспартил-протеазу, катепсин D-подібну, у колорадського жука. Gillikin et al. (1992) охарактеризували протеолітичну активність у кишечнику личинок західного кукурудзяного жука і виявили, головним чином, цистеїн-протеази. У Патенті США № 7230167 було описано, що активність протеази, яка пояснювалася присутністю катепсину G, існує у західного кукурудзяного жука. Різноманіття та різний рівень активності протеаз кишечника комах можуть впливати на чутливість комах до конкретного токсину B.t. В іншому варіанті втілення винаходу сайти розщеплення протеази можуть піддаватися інженерії у потрібних місцях для впливу на обробку білка у середній кишці сприйнятливих личинок деяких комах-шкідників. Ці сайти розщеплення протеази можуть включатися такими способами, як хімічний синтез генів або splice overlap PCR (Horton et al., 1989). Послідовності розпізнавання серин-протеази, наприклад, можуть бути необов'язково вставлені у певних місцях структури Cry білка для здійснення обробки білка у потрібних точках делеції у середній кишці сприйнятливих личинок. До серин-протеаз, які можуть використовуватись у такий спосіб, належать серин-протеази середньої кишки Lepidoptera, такі як трипсин або трипсиноподібні ферменти, хімотрипсин, еластаза і т. ін. (Christeller et al., 1992). Крім того, сайти делеції, розпізнані емпірично шляхом секвенування продуктів розщеплення Cry білка, утворених за допомогою препаратів нефракціонованої протеази середньої кишки личинок або шляхом зв'язування з мембранними везикулами щіткової облямівки, можуть піддаватись інженерії для здійснення активації білка. Модифіковані Cry білки, утворені шляхом делеції генів або шляхом включення сайтів розщеплення протеази, мають поліпшену активність проти шкідників ряду Lepidopteran, включаючи Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Helicoverpa zea, Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta та інших шкідників, на яких спрямовується їх дія. Серин-протеази комах Coleoptera, такі як трипсин, хімотрипсин та катепсин G-подібна протеаза, цистеїн-протеази комах Coleoptera, такі як катепсини (B-подібна, L-подібна, O-подібна та K-подібна протеази) (Koiwa et al., (2000) та Bown et al., (2004)], металопротеази комах Coleoptera, такі як ADAM10 [Ochoa-Campuzano et al., (2007)) та протеази аспарагінової кислоти 5 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комах Coleoptera, такі як D-подібні та E-подібні катепсини, пепсин, плазмепсин та хімозин також можуть використовуватися шляхом інженерії відповідних послідовностей розпізнавання у потрібних сайтах обробки для здійснення обробки Cry білка у середній кишці сприйнятливих личинок деяких комах-шкідників. Оптимальним місцем для включення таких сайтів розщеплення протеази може бути місце у межах "спейсерної" ділянки між α-спіраллю 2B та α-спіраллю 3, наприклад, між амінокислотами з 109 по 113 DIG-3 білка повної довжини (SEQ ID NO:2 та Таблиця 1). Модифіковані Cry білки, утворені або шляхом делеції генів, або шляхом включення сайтів розщеплення протеази, мають поліпшену активність проти комах-шкідників, включаючи, крім інших, західного кукурудзяного жука, південного кукурудзяного жука, північного кукурудзяного жука і т. ін. Існують різні технології, які дозволяють визначати послідовність амінокислот, які включають N-кінцеві або C-кінцеві залишки поліпептидів. Наприклад, послідовно може застосовуватись автоматизований спосіб деградації за Едманом для визначення N-кінцевої амінокислотної послідовності, яка включає до 30 амінокислотних залишків, з 98 % точністю для кожного залишку. Крім того, можливим також є визначення послідовностей амінокислот, які включають карбокси-кінець поліпептидів [Bailey et al., (1992); Патент США № 6046053]. Таким чином, у деяких варіантах втілення можуть бути охарактеризовані Cry білки B.t., які були активовані за допомогою протеолітичної обробки, наприклад, протеазами, одержаними з кишечника комах, і можуть бути розпізнані N-кінцеві або C-кінцеві амінокислоти фрагмента активованого токсину. Обсяг винаходу охоплює варіанти DIG-3, утворені шляхом включення або видалення сайтів протеазної обробки у відповідних позиціях кодуючої послідовності, які забезпечують або усувають можливість протеолітичного розщеплення більшого варіантного білка протеазами комахи, рослини або мікроорганізму. Вважається, що кінцевим результатом такої маніпуляції є утворення фрагментів молекул токсину, які мають таку саму або кращу активність, що й інтактний (такий, що має повну довжину) білок токсину. Домени DIG-3 токсину. Передбачається, що окремі домени DIG-3 токсину (та варіанти, які є на 90 %, 95 % або 97 % ідентичними таким доменам) мають бути корисними для утворення комбінацій з доменами з інших CRY токсинів для забезпечення нових токсинів з розширеним спектром токсичності для шкідників, підвищеною ефективністю або підвищеною стійкістю білка. Домен I DIG-3 білка складається з амінокислотних залишків з 56 по 278 послідовності SEQ ID NO:2. Домен II DIG-3 білка складається з амінокислотних залишків з 283 по 493 послідовності SEQ ID NO:2. Домен III DIG-3 білка складається з амінокислотних залишків з 503 по 641 послідовності SEQ ID NO:2. Обмін або тасування доменів є механізмом утворення змінених білків дельта-ендотоксину. Між білками дельта-ендотоксину може відбуватись обмін Доменами II та III, в результаті чого утворюються гібридні або химерні токсини з поліпшеною пестицидною активністю або розширеним спектром спрямованої дії. Домен II є задіяним у зв'язуванні з рецептором, а Домен II DIG-3 є дуже відмінним від інших Cry1B токсинів. Домен III зв'язується з певними класами рецепторних білків і, можливо, бере участь в інсерції пре-пори олігомерного токсину. Було продемонстровано, що деякі заміщення Домену III в інших токсинах забезпечують значно вищу токсичність проти Spodoptera exigua (de Maagd et al., 1996), і існує посібник зі здійснення обміну доменів CRY токсину (Knight et al., 2004). Способи створення рекомбінантних білків та випробування їх пестицидної активності є добре відомими спеціалістам у даній галузі (див., наприклад, Naimov et al., (2001), de Maagd et al., (1996), Ge et al., (1991), Schnepf et al., (1990), Rang et al., (1999)). Домен I з Cry1A та Cry3A білків досліджували на здатність до інсерції та утворення пор у мембранах. α-спіраль 4 та αспіраль 5 Домену I відіграють ключову роль в інсерції у мембрану та утворенні пор [Walters et al., (1993), Gazit et al., (1998); Nunez-Valdez et al., (2001)], причому пропонується, щоб інші альфа-спіралі контактували з поверхнею мембрани на зразок дротів парасольки (Bravo et al., (2007); Gazit et al., (1998)). Варіанти DIG-3, створені шляхом здійснення обмеженої кількості делецій, заміщень або додавань амінокислот. Делеції, заміщення або додавання амінокислот до амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2 може легко здійснюватись у послідовний спосіб, і вплив таких змін на інсектицидну активність може бути випробуваний шляхом біоаналізу. Зважаючи на те, що кількість змін є обмеженою, таке випробування не включає невиправданих експериментів. Даний винахід охоплює інсектицидно активні варіанти корового сегмента токсину (амінокислоти 1-643 послідовності SEQ ID NO:2 або амінокислоти 73-643 послідовності SEQ ID NO:2), у яких було здійснено до 10, до 15 або до 20 незалежних делецій, заміщень або додавань амінокислот. 6 UA 106885 C2 5 10 Винахід охоплює варіанти DIG-3, які включають коровий сегмент токсину, який є на 90 %, 95 % або 97 % ідентичним амінокислотам 1-643 послідовності SEQ ID NO:2 або амінокислотам 73-643 послідовності SEQ ID NO:2. Варіанти можуть бути одержані шляхом здійснення випадкових мутацій, або ж варіанти можуть бути сплановані. У разі спланованих мутантів існує висока ймовірність утворення варіантів з активністю, подібною до активності природного токсину, якщо певна амінокислота утримується у ключових ділянках токсину, які відповідають за біологічну активність або є задіяними у визначенні тривимірної конфігурації, яка зрештою відповідає за біологічну активність. Висока ймовірність збереження активності також існує у разі консервативних заміщень. Амінокислоти можуть розподілятися по таких класах: неполярні, незмінені полярні, основні та кислотні. Консервативні заміщення, завдяки яким амінокислота одного класу замінюється на іншу амінокислоту такого самого типу, з найменшою ймовірністю можуть суттєво змінити біологічну активність варіанта. У Таблиці 2 представлено перелік прикладів амінокислот, які належать до кожного класу. 15 Таблиця 2 Клас амінокислоти Неполярні бічні ланцюги Незмінені полярні бічні ланцюги Кислотні бічні ланцюги Основні бічні ланцюги Бета-розгалужені бічні ланцюги Ароматичні бічні ланцюги 20 25 30 35 40 45 50 Приклади амінокислот Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Met (M), Phe (F), Trp (W) Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) Asp (D), Glu (E) Lys (K), Arg (R), His (H) Thr, Val, Ile Tyr, Phe, Trp, His У деяких випадках також можливі неконсервативні заміщення. Ключовим чинником є те, що ці заміщення не повинні суттєво знижувати біологічну активність токсину. Варіантами є поліпептиди, які відрізняються за амінокислотною послідовністю через мутагенез. Варіантні білки, які охоплюються даним винаходом, є біологічно активними, тобто, вони зберігають потрібну біологічну активність природного білка, а саме – зберігають пестицидну активність. Також можуть бути побудовані варіантні білки, які відрізняються на рівня послідовності, але зберігають таку саму або подібну загальну суттєву тривимірну структуру, розподіл поверхневого заряду і т. ін. Див., наприклад, Патент США № 7058515; Larson et al. (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995); та Crameri et al. (1996a, 1996b, 1997). Нуклеїнові кислоти. Виділені нуклеїнові кислоти, які кодують DIG-3 токсини, є одним аспектом даного винаходу. Він включає нуклеїнові кислоти, які кодують SEQ ID NO:2 та SEQ ID NO:5 та їх комплементи, а також інші нуклеїнові кислоти, які кодують інсектицидні варіанти послідовності SEQ ID NO:2. Завдяки надлишкові генетичного коду, різні послідовності ДНК можуть кодувати описані авторами амінокислотні послідовності. Спеціаліст у даній галузі зможе створити ці альтернативні послідовності ДНК, які кодують однакові або по суті однакові токсини. Синтез генів. Послідовності ДНК, які кодують описані авторами поліпшені Cry білки, можуть бути одержані різними способами, добре відомими спеціалістам у даній галузі. Наприклад, синтетичні сегменти генів та синтетичні гени можуть бути одержані за допомогою фосфітного триестеру та фосфорамідитної хімії (Caruthers et al., 1987), і промислові постачальники можуть здійснювати синтез ДНК на замовлення. Послідовності, які кодують DIG-3 білки повної довжини, можуть складатися різними способами, включаючи, наприклад, лігування рестрикційних фрагментів або складання олігонуклеотидів, що перекриваються, шляхом полімеразної ланцюгової реакції (Stewart and Burgin, 2005). Крім того, послідовності, які кодують термінальні делеції, можуть бути утворені шляхом ПЛР-ампліфікації з застосуванням сайт-специфічних термінальних олігонуклеотидів. Нуклеїнові кислоти, які кодують DIG-3 токсини, можуть бути одержані, наприклад, шляхом синтетичної побудови з застосуванням способів, які у даний час практикуються будь-яким з промислових постачальників (див., наприклад, Патент США № 7482119 B2). Ці нуклеїнові кислоти, або їх частини або варіанти, також можуть бути побудовані синтетичним шляхом, наприклад, з застосуванням синтезатора генів та способів побудови, наприклад, згідно з Патентом США № 5380831. В альтернативному варіанті варіанти синтетичних або природних генів можуть бути легко побудовані з застосуванням стандартних способів молекулярної біології для здійснення точкових мутацій. Фрагменти цих генів також можуть бути одержані з застосуванням екзонуклеаз або ендонуклеаз серійного виробництва згідно зі стандартними процедурами. Наприклад, можуть застосовуватися ферменти, такі як Bal31, або сайт 7 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічний мутагенез для системного відрізання нуклеотидів від кінців цих генів. Крім того, фрагменти генів, які кодують активні фрагменти токсину, можуть бути одержані з застосуванням різних рестрикційних ферментів. За наявності амінокислотної послідовності для DIG-3 токсину кодуюча послідовність може бути побудована шляхом зворотної трансляції кодуючої послідовності з застосуванням кодонів, оптимальних для передбаченого хазяїна, з наступним очищенням послідовності з застосуванням альтернативних кодонів для видалення послідовностей, які можуть викликати проблеми, та забезпечення періодичних стоп-кодонів для видалення довгих відкритих кодуючих послідовностей у некодуючих рамках зчитування. Кількісне визначення ідентичності послідовностей. Для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїновокислотних послідовностей послідовності вирівнюють для оптимального порівняння. Відсоткова ідентичність між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних позицій, спільних для цих послідовностей (тобто, відсоткова ідентичність = кількість ідентичних позицій / загальна кількість позицій (наприклад, позицій, які перекриваються) x100). В одному варіанті втілення дві послідовності мають однакову довжину. Відсоткова ідентичність між двома послідовностями може визначатися з застосуванням способів, подібних до описаних нижче, з допущенням гепів або без нього. При розрахунку відсоткової ідентичності зазвичай враховується точна відповідність. Визначення відсоткової ідентичності між двома послідовностями може здійснюватися з застосуванням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом такого алгоритму є алгоритм Карліна та Альтшуля (1990), модифікований Карліном та Альтшулем (1993) і включений до програм BLASTN та BLASTX. BLAST-пошуки застосовують для визначення послідовностей, гомологічних (подібних) до шуканої послідовності, у базі даних нуклеїнових кислот або білків. BLASTN-пошуки можуть здійснюватися (показник = 100, довжина слова = 12) для розпізнавання нуклеотидних послідовностей, які мають гомологію з заявленими молекулами нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. BLASTX-пошуки можуть здійснюватися (показник = 50, довжина слова = 3) для розпізнавання амінокислотних послідовностей, які мають гомологію з заявленими молекулами інсектицидного білка згідно з винаходом. Gapped BLAST (Altschul et al., 1997) може застосовуватися для одержання вирівняних послідовностей з гепами з метою порівняння. В альтернативному варіанті може застосовуватися PSI-Blast для здійснення повторного пошуку, який виявляє віддалені зв'язки між молекулами (Altschul et al., 1997). При застосуванні програм BLAST, Gapped BLAST та PSIBlast можуть застосовуватися параметри відповідних програм за замовчуванням. Див. www.ncbi.nlm.nih.gov. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, який застосовують для порівняння послідовностей, є алгоритм ClustalW (Thompson et al., 1994). ClustalW порівнює послідовності й вирівнює повну амінокислотну послідовність або послідовність ДНК, а отже, може забезпечувати дані про консервацію повної амінокислотної або нуклеотидної послідовності. Алгоритм ClustalW застосовують у кількох наявних у продажу пакетах програм для аналізу ДНК/амінокислот, таких, як ALIGNX модуль пакета програм Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). При вирівнюванні амінокислотних послідовностей за допомогою ALIGNX можна застосовувати стандартні настройки зі штрафом 10 за відкриття гепа, штрафом 0,1 за продовження гепа та порівняльною матрицею blosum63mt2 для визначення відсотка амінокислотної подібності (консенсусу) або ідентичності між двома послідовностями. При вирівнюванні послідовностей ДНК за допомогою ALIGNX можна застосовувати стандартні настройки зі штрафом 15 за відкриття гепа, штрафом 6,6 за продовження гепа та порівняльною матрицею swgapdnamt для визначення відсоткової ідентичності між двома послідовностями. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, який застосовують для порівняння послідовностей, є алгоритм Майєрса та Міллера (1988). Такий алгоритм включено до програми wSTRETCHER, яка є частиною пакета програм для вирівнювання послідовностей wEMBOSS (доступного на сайті http://emboss.sourceforge.net/). Програма wSTRETCHER розраховує оптимальне загальне вирівнювання двох послідовностей з застосуванням модифікації класичного алгоритму динамічного програмування, в якому використовується лінійний простір. Можуть бути вказані матриця заміщень, штраф за вставлення гепа та штрафи за продовження гепа, які застосовуються для розрахунку вирівнювання. При використанні програми wSTRETCHER для порівняння нуклеотидних послідовностей можуть застосовуватися штраф 16 за відкриття гепа та штраф 4 за продовження гепа з файлом матриці замін EDNAFULL. При застосуванні для порівняння амінокислотних послідовностей можуть застосовуватися штраф 12 за відкриття гепа та штраф 2 за продовження гепа з файлом матриці замін EBLOSUM62. 8 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, який застосовують для порівняння послідовностей, є алгоритм Нідлмана та Вунша (1970), який є включеним до пакетів програм для вирівнювання послідовностей GAP Version 10 та wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). GAP Version 10 може застосовуватися для визначення ідентичності або подібності послідовностей з використанням таких параметрів: для нуклеотидної послідовності % ідентичності та % подібності визначають, застосовуючи значущість гепа 50 та значущість довжини 3 і матрицю замін nwsgapdna. cmp. Для амінокислотної послідовності порівняння, % ідентичності або % подібності визначають, застосовуючи Значущість гепа 8 та значущість довжини 2 і програму BLOSUM62. Програма wNEEDLE зчитує дві введені послідовності, визначає оптимальне вирівнювання (включаючи гепи) по всій їхній довжині і записує їхнє оптимальне загальне вирівнювання у файл. Алгоритм аналізує всі можливі вирівнювання і вибирає найкраще, застосовуючи матрицю замін, яка містить значення для кожної можливої відповідності залишків або нуклеотидів. Програма wNEEDLE знаходить вирівнювання з максимально можливим показником, причому показник вирівнювання дорівнює сумі відповідностей, взятих з матриці замін, мінус штрафи, які виникають через відкриття та продовження гепів у вирівняних послідовностях. Матриця заміщень і штрафи за відкриття та продовження гепів вказуються користувачем. При порівнянні амінокислотних послідовностей застосовують штраф 10 за відкриття гепа, штраф 0,5 за продовження гепа та порівняльну матрицю EBLOSUM62 за замовчуванням. При порівнянні послідовностей ДНК за допомогою wNEEDLE застосовують штраф 10 за відкриття гепа, штраф 0,5 за продовження гепа та порівняльну матрицю EDNAFULL. Також можуть застосовуватися рівноцінні програми. Під "рівноцінною програмою" слід розуміти будь-яку програму порівняння послідовностей, яка для будь-яких двох послідовностей, які розглядаються, створює вирівнювання, що має ідентичні відповідності нуклеотидів або амінокислотних залишків та ідентичний відсоток ідентичності послідовностей порівняно з відповідним вирівнюванням, створеним програмами ALIGNX, wNEEDLE або wSTRETCHER. Відсоток ідентичності є відсотком ідентичних відповідностей між двома послідовностями по даній вирівняній ділянці (включаючи будь-які гепи по довжині), а відсоток подібності є відсотком відповідностей між двома послідовностями по даній вирівняній ділянці (включаючи будь-які гепи по довжині). Вирівнювання також може здійснюватися у ручний спосіб шляхом огляду. Рекомбінантні хазяї. Кодуючі токсин гени згідно з даним винаходом можуть бути включені у різні мікробі або рослинні хазяї. Експресія гена токсину, прямо або непрямо, веде до внутрішньоклітинного продукування та збереження пестицидного білка. З відповідними мікробними хазяями, наприклад, Pseudomonas, мікроби можуть застосовуватись у середовищі, в якому перебуває шкідник, де вони розмножуються і споживаються. В результаті забезпечується стримування шкідника. В альтернативному варіанті мікроб, який є хазяїном для гена токсину, може піддаватись обробці в умовах, які подовжують активність токсину і стабілізують клітину. Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, після цього може застосовуватись у середовищі, в якому перебуває шкідник, проти якого спрямовано її дію. Коли ген токсину B.t. включають через відповідний вектор у мікробний хазяїн, і вищезгаданий хазяїн застосовують у середовищі у живому стані, суттєвим є застосування певних мікробів-хазяїв. Вибирають мікроорганізми-хазяї, про які відомо, що вони поширюються у "фітосфері" (філоплані, філосфері, ризосфері та/або ризосплані) однієї або кількох культур, які потребують захисту. Ці мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони були здатними успішно конкурувати у конкретному середовищі (на культурі або в іншому середовищі проживання комах) з дикими місцевими мікроорганізмами, забезпечувати стійке збереження та експресію гена, який експресує поліпептидний пестицид, та, бажано, забезпечувати поліпшений захист пестициду від руйнування та інактивації під впливом навколишнього середовища. Відомо багато мікроорганізмів, які проживають у філоплані (на поверхні листя рослин) та/або ризосфері (у ґрунті навколо коріння рослини) багатьох важливих культур. До цих мікроорганізмів належать бактерії, водорості та гриби. Особливий інтерес являють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, родів Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc та Alcaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, родів Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula та Aureobasidium. Особливий інтерес являють такі види фітосферних бактерій, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (стара назва Rhizobium meliloti), 9 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Alcaligenes eutrophus та Azotobacter vinelandii; і такі види фітосферних дріжджів, як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae та Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес являють пігментовані мікроорганізми. Способи боротьби з комахами-шкідниками Коли комаха контактує з ефективною кількістю токсину, який надходить до її організму через експресію трансгенної рослини, рецептовану(і) білкову(і) композицію(ї), розбризкувану(і) білкову(і) композицію(ї), принаду або іншу систему доставки, результатом зазвичай є смерть комахи, або ж комахи перестають харчуватися на джерелі, через яке токсини надходять до їх організму. Потрібні білкові токсини можуть бути "нанесені" або приведені у контакт з комахами, проти яких спрямовується їх дія, різними шляхами. Наприклад, можуть застосовуватися трансгенні рослини (у яких білок продукується і є присутнім у рослині), які є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Експресія генів токсинів також може досягатися вибірково у конкретних тканинах рослин, таких, як коріння, листя і т. ін. Це може здійснюватися, наприклад, через застосування тканинноспецифічних промоторів. Нанесення шляхом розпилення є іншим прикладом, який також є відомим спеціалістам у даній галузі. Потрібні білки можуть бути належним чином рецептовані для потрібного кінцевого застосування, а потім розпилені (або нанесені в інший спосіб) на рослину та/або навколо рослини / поблизу від рослини, яка потребує захисту, до виявлення інвазії, після виявлення комах, до та після і т. ін. Наприклад, гранули з принадою також можуть застосовуватися і є відомими спеціалістам у даній галузі. Трансгенні рослини Білки, які є предметом винаходу, можуть застосовуватися для захисту практично будь-якого типу рослин від ураження комахами ряду Lepidoptera. Необмежувальними прикладами таких рослин є кукурудза, соняшник, соя, бавовна, канола, рис, сорго, пшениця, ячмінь, овочеві культури, декоративні рослини, перці (включаючи гострий перець), цукровий буряк, плодові рослини та дерен і т. ін. Способи трансформації рослин є добре відомими спеціалістам у даній галузі, і пояснювальні способи трансформації описуються у Прикладах. Оптимальним втіленням даного винаходу є трансформація рослин генами, які кодують потрібний інсектицидний білок або його варіанти. Трансформовані рослини є резистентними до інвазій комах-шкідників завдяки присутності контролюючої кількості потрібного інсектицидного білка або його варіантів у клітинах трансформованої рослини. Через включення генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів B.t., у геном рослини, яку з'їдає конкретна комаха-шкідник, доросла особина або личинка гине після споживання рослини, якою вона харчується. Багато представників однодольних та дводольних рослин є трансформованими. Трансгенні сільськогосподарські культури, а також плодові та овочеві культури, мають промислове значення. До таких культур, крім інших, належать кукурудза, рис, соя, канола, соняшник, люцерна, сорго, пшениця, бавовна, арахіс, томати, картопля і т. ін. Існує кілька способів включення чужорідного генетичного матеріалу у рослинні клітини та одержання рослин, які стійко зберігають і експресують включений ген. До таких способів належать прискорення включення генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо у клітини (Патент США № 4945050 та Патент США № 5141131). Рослини можуть бути трансформовані з застосуванням технології Agrobacterium; див. Патент США № 5177010, Патент США № 5104310, Європейську патентну заявку № 0131624B1, Європейську патентну заявку № 120516, Європейську патентну заявку № 159418B1, Європейську патентну заявку № 176112, Патент США № 5149645, Патент США № 5469976, Патент США № 5464763, Патент США № 4940838, Патент США № 4693976, Європейську патентну заявку № 116718, Європейську патентну заявку № 290799, Європейську патентну заявку № 320500, Європейську патентну заявку № 604662, Європейську патентну заявку № 627752, Європейську патентну заявку № 0267159, Європейську патентну заявку № 0292435, Патент США № 5231019, Патент США № 5463174, Патент США № 4762785, Патент США № 5004863 та Патент США № 5159135. До інших способів трансформації належить технологія WHISKERS™; див. Патент США № 5302523 та Патент США № 5464765. Технологію електропорації також застосовують для трансформації рослин; див. документ WO 87/06614, Патент США № 5472869, Патент США № 5384253, документи WO 9209696 та WO 9321335. Усі ці патенти та публікації, які стосуються трансформації, є включеними шляхом посилання. Крім численних технологій трансформації рослин, типи тканини, яка контактує з чужорідними генами, також можуть бути різними. До таких тканин, крім інших, належать ембріогенна тканина, тканина калюсу типів I та II, гіпокотиль, меристема і т. ін. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час 10 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дедиференціації шляхом застосування відповідних технологій, відомих спеціалістам у даній галузі. Гени, які кодують DIG-3 токсини, можуть включатися у рослинні клітини за допомогою різних технологій, які є добре відомими спеціалістам у даній галузі і описуються вище. Наприклад, велика кількість клонуючих векторів, які включають маркер, який дозволяє відбирати трансформовані мікробні клітини, та система реплікації, яка функціонує в Escherichia coli, є доступними для одержання та модифікації чужорідних генів для включення у вищі рослини. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, включення мутацій, зрізання, додавання або заміщення, згідно з потребами передбаченого застосування. Вектори включають, наприклад, pBR322, серію pUC, серію M13mp, pACYC184 і т. ін. Відповідно, послідовність, яка кодує Cry білок або варіанти, може бути включена у вектор у відповідному сайті рестрикції. Утворену в результаті плазміду застосовують для трансформації клітин E. coli, клітини якої культивують у відповідному живильному середовищі, потім збирають і піддають лізисові, таким чином, щоб одержати достатню для обробки кількість плазміди. Аналіз послідовності, аналіз рестрикційного фрагмента, електрофорез та інші біохімічно-молекулярні біологічні способи зазвичай застосовують як способи аналізу. Після кожної маніпуляції застосовувана послідовність ДНК може бути розщеплена й приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна послідовність ДНК, яка піддається маніпуляції, може бути клонована у ті самі або інші плазміди. Застосування T-ДНК-вмісних векторів для трансформації рослинних клітин було широко досліджено і достатньо описано в документі EP 120516; Lee and Gelvin (2008), Fraley et al. (1986) та An et al. (1985) і є загальноприйнятим у даній галузі. Після включення інсертованої ДНК у геном рослини вона є відносно стійкою в наступних поколіннях. Вектор, який застосовують для трансформації рослинної клітини зазвичай містить ген селектованого маркера, який кодує білок, який надає трансформованим рослинним клітинам резистентності до гербіцидів або антибіотиків, таких, як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин та ін. Окремо застосовуваний ген селектованого маркера, відповідно, має дозволяти відбір трансформованих клітин, у той час, як ріст клітин, які не містять інсертованої ДНК, пригнічується селективною сполукою. Існує велика кількість способів інсерції ДНК у рослинну клітину-хазяїн. До цих способів належать трансформація T-ДНК, одержаною від Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як від агента трансформації. Крім того, можуть застосовуватися такі способи, як злиття рослинних протопластів з ліпосомами, які містять ДНК, яка має бути доставлена, пряма ін'єкція ДНК, біолістична трансформація (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі способи. В оптимальному варіанті втілення даного винаходу рослини трансформують генами, в яких частоту використання кодону кодуючої ділянки білка було оптимізовано для рослин. Див., наприклад, Патент США № 5380831, який включено до цього опису шляхом посилання. Крім того, застосовують рослини, які кодують зрізаний токсин. Зрізаний токсин зазвичай кодує від приблизно 55 % до приблизно 80 % токсину повної довжини. Способи створення синтетичних генів B.t. для застосування у рослинах є відомими спеціалістам у даній галузі (Stewart, 2007). Незалежно від способу трансформації, ген в оптимальному варіанті включають у вектор перенесення генів, пристосований для експресії генів інсектицидного токсину B.t та їх варіантів у рослинній клітині шляхом включення у вектор рослинного промотора. Додатково до рослинних промоторів, промотори з різних джерел можуть ефективно застосовуватись у рослинних клітинах для експресії чужорідних генів. Наприклад, можна застосовувати промотори бактеріального походження, такі як промотор октопін синтази, промотор нопалін синтази та промотор манопін синтази. Можуть застосовуватися промотори, які походять з рослинних вірусів, наприклад, 35S та 19S промотори вірусу мозаїки цвітної капусти, промотор з вірусу мозаїки прожилок маніоки і т. ін. До рослинних промоторів, крім інших, належать, мала субодиниця (ssu) рибулоза-1,6-бісфосфат (RUBP) карбоксилази, промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор ADF (фактора деполімеризації актину), промотор убіквітину, промотор актину та тканинноспецифічні промотори. Промотори також можуть містити певні елементи енхансерної послідовності, які можуть поліпшувати ефективність транскрипції. До типових енхансерів, крім інших, належать ADH1-інтрон 1 та ADH1-інтрон 6. Можуть застосовуватися конститутивні промотори. Конститутивні промотори спрямовують безперервну експресію генів майже в усіх типах клітин і майже у будь-який час (наприклад, актин, убіквітин, CaMV 35S). Тканинноспецифічні промотори відповідають за експресію генів у конкретних типах клітин або тканин, таких, як листя або насіння (наприклад, промотори зеїну, олеозину, напіну, ACP (білка перенесення ацилу)), і ці промотори також можуть застосовуватися. Також можуть 11 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовуватися промотор, які є активними протягом певної стадії розвитку рослини, а також активними у конкретних тканинах та органах рослин. Прикладами таких промоторів, крім інших, є промотори, які є специфічними до коріння, специфічними до пилку, специфічними до зав'язі, специфічними до шовковистих маточок кукурудзи, специфічними до волокон бавовни, специфічними до ендосперму насіння, специфічними до флоеми і т. ін. За певних обставин може бути бажаним застосування індуцибельного промотора. Індуцибельний промотор відповідає за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий, як: фізичний подразник (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, RUBP карбоксилаза); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; та стрес (наприклад, посуха). Можуть застосовуватись інші бажані елементи транскрипції та трансляції, які функціонують у рослинах, такі як 5' нетрансльовані лідерні послідовності, термінуючі послідовності транскрипції РНК та сигнальні послідовності додавання поліаденілату. Спеціалістам відомо багато специфічних до рослин векторів перенесення. Трансгенні культури, які мають характеристики резистентності до комах (IR), переважають серед злакових культур та бавовни в усій Північній Америці, і використання цих характеристик поширюється по всьому світу. Промислові трансгенні культури, які поєднують характеристики IR та переносимості гербіцидів (HT), розроблялися багатьма компаніями, які займаються виробництвом насіння. До таких характеристик належать комбінації IR, що забезпечується інсектицидними білками B.t. та HT, такої, як переносимість до інгібіторів ацетолактатсинтази (ALS), таких, як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолопіримідин, сульфонаміди та ін., інгібітори глутамінсинтетази (GS), такі як біалафос, глюфосинат та ін., інгібітори 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), такі як мезотріон, ізоксафлутол та ін., інгібітори 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS), такі як гліфосат та ін. та інгібітори ацетилкоензим A карбоксилази (ACCase), такі як галоксифоп, квізалофоп, диклофоп і т. ін. Відомими є інші приклади, в яких одержані трансгенним шляхом білки забезпечують переносимість рослин до гербіцидів таких хімічних класів, як феноксикислотні гербіциди та піридилоксіацетатні ауксинові гербіциди (див. документ WO 2007/053482 A2) або феноксикислотні гербіциди та арилоксифеноксипропіонатні гербіциди (див. документ WO 2005107437 A2, A3). Здатність до боротьби з багатьма шкідниками завдяки характеристикам IR є цінною якістю промислового продукту, і зручність застосування цього продукту підвищується, якщо характеристики боротьби з комахами та характеристики боротьби з бур'янами поєднуються в одній рослині. Крім того, поліпшена цінність може досягатися через поєднання в одній рослині характеристик IR, які забезпечуються інсектицидним білком B.t., наприклад, згідно з даним винаходом, з однією або кількома додатковими характеристиками HT, такими, як згадані вище, плюс одна або кілька додаткових вхідних характеристик (наприклад, резистентність до інших комах, яка забезпечується одержаними з B.t. або іншими інсектицидними білками, резистентність до комах, яка забезпечується такими механізмами, як РНКі та ін., резистентність до нематод, резистентність до хвороб, переносимість стресів, поліпшене використання азоту і т. ін.) або вихідних характеристик (наприклад, високий вміст олій, сприятливий склад олій, поліпшення поживності і т. ін.). Такі комбінації можуть досягатися або шляхом традиційної селекції (селекційний набір), або спільно через нову трансформацію з застосуванням одночасного включення багатьох генів (молекулярний набір). До переваг належать здатність культурної рослини до боротьби з комахами-шкідниками та поліпшена боротьба з бур'янами, що забезпечує вторинні переваги для виробника та/або споживача. Таким чином, даний винахід може застосовуватись у комбінації з іншими характеристиками для забезпечення повного агрономічного набору з поліпшеної якості культури та здатності до гнучкого й економічно вигідного контролю над будь-якою кількістю агрономічних проблем. Шкідники як об'єкти дії інсектицидів DIG-3 токсини згідно з винаходом є особливо придатними для застосування у боротьбі з комахами ряду Lepidoptera. Комахи Lepidoptera складають значну групу сільськогосподарських, садівницьких та побутових шкідників, які спричинюють дуже багато збитків щороку. Цей ряд комах включає личинок та дорослих особин, які живляться листям та корінням. До комахшкідників ряду Lepidoptera, крім інших, належать: Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon (совки-іпсилон), Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella (південно-західний кукурудзяний метелик), Diatraea saccharalis (точильник цукрової тростини), Ennomos subsignaria, 12 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea (совка бавовняна), Heliothis virescens (тютюнова листовійка), Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum (соняшникова міль), Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxagrotis albicosta (західна бобова совка), Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata (совка bertha), Manduca quinquemaculata, Manduca sexta (тютюновий бражник), Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis (кукурудзяний метелик), Paleacrita vernata, Papiapema nebris (довгоносик звичайний), Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella (міль капустяна), Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta (совка), Pseudoplasia includens, Rachiplusia nu (аргентинський п'ядун), Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera frugiperda (совка трав'яна), Spodoptera exigua (совка бурякова), Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella, Trichoplusia hi, Udea rubigalis, Xylomyges curiails та Yponomeuta padella. Також передбачається застосування DIG-3 токсинів для боротьби зі шкідниками ряду Coleoptera на культурних рослинах. У деяких варіантах втілення Cry білки можуть в економічний спосіб застосовуватися для боротьби з комахами-шкідниками, до яких, крім інших, належать, наприклад, личинки, які пошкоджують коріння, такі як Diabrotica undecimpunctata howardi (південний кукурудзяний жук), Diabrotica longicornis barberi (північний кукурудзяний жук) та Diabrotica virgifera (західний кукурудзяний жук) та гусінь, наприклад, личинки Cyclocephala borealis (північний дупляк), Cyclocephala immaculate (південний дупляк) та Popillia japonica (хрущик японський). Також передбачається застосування DIG-3 токсинів для боротьби з паразитичними нематодами, включаючи, крім інших, нематоду кореневих наростів (Meloidogyne icognita) та соєва цистоутворююча нематода (Heterodera glycines). Виявлення DIG-3 токсинів за допомогою антитіл Антитіла проти токсинів. Антитіла проти токсинів, описаних авторами, або проти рівноцінних токсинів, або фрагментів цих токсинів, можуть бути легко одержані з застосуванням стандартних процедур, прийнятих у даній галузі. Такі антитіла застосовують для виявлення присутності DIG-3 токсинів. Після виділення інсектицидного токсину B.t. антитіла, специфічні до цього токсину можуть бути вироблені традиційними способами, які є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Багаторазові ін'єкції у вибраний організм-хазяїн протягом періоду у кілька тижнів або місяців викликають імунну реакцію і в результаті забезпечують значні титри сироватки проти токсину B.t. Оптимальними хазяями є види ссавців, серед яких більшу перевагу віддають кролям, козам, вівцям та мишам. Кров, взяту у таких імунізованих ссавців, піддають обробці традиційними способами для одержання антисироватки (поліклональних антитіл), яка реагує з інсектицидним токсином B.t… Антисироватку після цього піддають афінному очищенню шляхом адсорбції токсину згідно зі способами, відомими спеціалістам у даній галузі. Піддану афінному очищенню антисироватку піддають подальшому очищенню шляхом виділення імуноглобулінової фракції у межах антисироватки з застосуванням процедур, відомих спеціалістам у даній галузі. Одержаний в результаті матеріал є гетерогенною популяцією імуноглобулінів, які реагують з інсектицидним токсином B.t. Антитіла проти токсину B.t. також можуть вироблятися шляхом приготування напівсинтетичного імуногену, який складається з синтетичного пептидного фрагмента інсектицидного токсину B.t., кон'югованого з імуногенним носієм. Численні схеми та засоби, які застосовують для утворення пептидних фрагментів, є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Багато прийнятних імуногенних носіїв, такі як альбумін сироватки великої рогатої худоби або гемоціанін лімфи равлика, також є добре відомими спеціалістам у даній галузі, так само, як і способи з'єднання імуногенного білка та білка-носія. Після побудови напівсинтетичного імуногену процедура утворення антитіл, специфічних до фрагмента інсектицидного токсину B.t. є ідентичною тим, які застосовуються для одержання антитіл, які реагують з природним токсином B.t. Моноклональні антитіла (MAb) проти токсину B.t. легко одержують, застосовуючи очищений інсектицидний токсин B.t. Способи одержання MAb практикуються понад 20 років і є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Періодичні внутрішньочеревинні або підшкірні ін'єкції очищеного інсектицидного токсину B.t. в ад'юванті викликають імунну реакцію у більшості 13 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тварин. Гіперімунізовані B-лімфоцити видаляють з організму тварин і зливають з відповідною лінією клітин, здатною до необмеженого культивування. Оптимальними тваринами, Bлімфоцити яких можуть бути гіперімунізованими і можуть застосовуватися для продукування Mab, є ссавці. Більшу перевагу серед тварин віддають щурам та мишам, а найкращою вважається лінія мишей BALB/c. Багато клітинних ліній ссавців є придатними як партнери для злиття з метою створення гібридом. Багато таких ліній можна одержати в Американській колекції типових культур (ATCC, Manassas, VA) та від комерційних постачальників. Оптимальні як партнери для злиття клітинні лінії одержують з мієлом мишей, і найбільшу перевагу віддають клітинній лінії HL-1® Friendly myeloma-653 (Ventrex, Portland, ME). Після злиття утворені в результаті гібридоми культивують у селективному середовищі росту протягом одного-двох тижнів. Існують дві відомі системи відбору для видалення незлитих клітин мієломи або злитих клітин мієломи від змішаної культури гібридоми. Вибір системи відбору залежить від лінії імунізованих мишей та застосовуваного партнера для злиття мієломи. Може бути застосована система відбору AAT, описана у публікації Taggart and Samloff, (1983); однак перевагу віддають системі відбору HAT (гіпоксантин, аміноптерин, тимідин), описаній у публікації Littlefield (1964), через її сумісність з оптимальною лінією мишей та вищезгаданим партнером для злиття. Використане середовище росту перевіряють на секрецію імуноспецифічного MAb. Процедури твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) є найбільш придатними для цієї мети; хоча радіоімуноаналізи, пристосовані для перевірки у великих обсягах, також є прийнятними. Може здійснюватися багатопрофільний скринінг для послідовного зменшення суттєвої кількості непотрібних або менш бажаних культур. Культури, які секретують Mab, які реагують з інсектицидним токсином B.t., перевіряють на перехресну реактивність з відомим інсектицидними токсинами B.t. Mab, які селективно зв'язуються з потрібним інсектицидним токсином B.t., можуть розподілятися по ізотипах з застосуванням проб серійного виробництва. Оптимальні Mab належать до класу IgG, причому більшу перевагу віддають Mab субізотипів IgG1 та IgG2a. Культури гібридоми, які секретують оптимальні Mab, можуть бути субклоновані кілька разів для забезпечення моноклональності та стійкості. До загальновідомих способів субклонування культур еукаріотних, несуміжних клітин належать серійні розведення, клонування у м'якій агарозі та сортування флуоресцентно активованих клітин. Після кожного субклонування одержані в результаті культури в оптимальному варіанті піддають повторному аналізові на секрецію антитіл та ізотип для того, щоб пересвідчитись у створенні стійкої культури, яка секретує потрібне MAb. Антитіла проти токсину B.t. застосовують у різних способах виявлення заявленого інсектицидного токсину B.t. згідно з даним винаходом і його варіантів або фрагментів. Відомо, що антитіла, мічені репортерними групами, можуть використовуватися для виявлення присутності антигенів у різних середовищах. Антитіла, мічені радіоізотопами, вже протягом кількох десятиліть застосовуються в радіоімуноаналізах для виявлення присутності антигенів у різних біологічних рідинах з великою точністю та чутливістю. Останнім часом мічені ферментами антитіла застосовують як заміну радіоактивно мічених антитіла в ELISA-аналізі. Крім того, антитіла, які імунологічно реагують з інсектицидним токсином B.t. згідно з даним винаходом, можуть зв'язуватися з іммобілізуючою речовиною, такою, як полістиролова лунка або частинка, і застосовуватися в імуноаналізах для визначення присутності токсину B.t. у випробуваному зразку. Виявлення з застосуванням нуклеїновокислотних зондів Інший спосіб розпізнавання токсинів та генів згідно з даним винаходом здійснюють через застосування олігонуклеотидних зондів. Ці зонди є нуклеотидними послідовностями, які піддаються виявленню. Можливість виявлення цих послідовностей забезпечується через відповідну радіоактивну мітку, або ж вони можуть бути флуоресцентними за своєю природою, як описано, наприклад, у Патенті США № 6268132. Як відомо спеціалістам у даній галузі, якщо молекула зонда та зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються, утворюючи сильні зв'язки зі спарюванням основ між двома молекулами, є підстави припускати, що зонд та зразок мають суттєву гомологію послідовності. В оптимальному варіанті гібридизацію здійснюють за жорстких умов з застосуванням способів, добре відомих спеціалістам у даній галузі, як описано, наприклад, у публікації Keller and Manak (1993). Виявлення зонда дозволяє у відомий спосіб визначити, чи відбулася гібридизація. Такий аналіз зондів забезпечує швидкий спосіб розпізнавання генів, які кодують токсини, згідно з даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які застосовують як зонди згідно з винаходом, можуть бути синтезовані за допомогою синтезатора ДНК та стандартних процедур. Ці нуклеотидні послідовності також можуть застосовуватись як праймери ПЛР для ампліфікації генів згідно з даним винаходом. 14 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Гібридизація нуклеїнових кислот Спеціалістам у галузі молекулярної біології добре відомо, що подібність двох нуклеїнових кислот може характеризуватися їхньою схильністю до гібридизації. У контексті даного опису терміни "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" стосуються умов, за яких зонд гібридизується з послідовністю-мішенню з помітно більшим ступенем порівняно з іншими послідовностями (наприклад, принаймні вдвічі порівняно з фоном). Жорсткі умови залежать від послідовності і є різними за різних обставин. Завдяки регулюванню жорсткості умов гібридизації та/або промивання, можуть бути розпізнані послідовності-мішені, які на 100 % є комплементарними зондам (гомологічне зондування). В альтернативному варіанті умови жорсткості можуть регулюватися таким чином, щоб допускалися деякі невідповідності у послідовностях і можна було виявити подібність більш низького ступеня (гетерологічне зондування). Зазвичай зонд має довжину, меншу, ніж приблизно 1000 нуклеотидів, в оптимальному варіанті – меншу, ніж 500 нуклеотидів. Як правило, жорсткими умовами є ті, за яких концентрація солі є меншою, ніж приблизно 1,5 M іона Na, зазвичай приблизно від 0,01 до 1,0 M іона Na (або інших солей) при pH від 7,0 до 8,3, і температура становить принаймні приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і принаймні приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, більших за 50 нуклеотидів). Жорсткі умови також можуть досягатися через додавання дестабілізуючих агентів, таких, як формамід. До типових нежорстких умов належать гібридизація з буферним розчином від 30 % до 35 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % SDS (додецилсульфат натрію) при 37 °C та промивання у 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрійцитрат) при 50-55 °C. До типових умов помірної жорсткості належать гібридизація у 40-45 % формаміді, 1,0 M NaCl, 1 % SDS при 37 °C та промивання у 0,5X-1X SSC при 55-60 °C. До типових умов високої жорсткості належать гібридизація у 50 % формаміді, 1 M NaCl, 1 % SDS при 37 °C та промивання у 0,1X SSC при 6065 °C. Необов'язково промивальні буфери можуть включати від приблизно 0,1 % до приблизно 1 % SDS. Тривалість гібридизації зазвичай становить менше, ніж приблизно 24 години, зазвичай від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Специфічність зазвичай залежить від післягібридизаційного промивання, причому ключовими чинниками є іонна сила та температура розчину для остаточного промивання. Для гібридів ДНК/ДНК термічною точкою плавлення (T m) є температура (при визначеній іонній силі та pH), при якій 50 % комплементарної послідовності-мішені гібридизується з ідеально придатним зондом. Tm знижують приблизно на 1 °C для кожного 1 % невідповідності; таким чином, Tm, умови гібридизації та/або умови промивання можуть регулюватися для сприяння гібридизації послідовностей потрібної ідентичності. Наприклад, якщо здійснюють пошук послідовностей з >90 % ідентичністю, то Tm може бути знижено на 10 °C. Як правило, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб ця температура була приблизно на 5 °C нижчою за Tm для конкретної послідовності та її комплемента при визначених іонній силі та pH. Однак умови високої жорсткості можуть передбачати гібридизацію та/або промивання при температурі, на 1 °C, 2 °C, 3 °C або 4 °C нижчій за Tm; умови помірної жорсткості можуть передбачати гібридизацію та/або промивання при температурі, на 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C або 10 °C нижчій за Tm, і нежорсткі умови можуть передбачати гібридизацію та/або промивання при температурі, на 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C або 20 °C нижчій за Tm. Tm (у°C) може бути визначена експериментально або приблизно визначена шляхом розрахунків. Для гібридів ДНК-ДНК Tm приблизно визначають за рівнянням Meinkoth and Wahl (1984): Tm(°C) = 81,5 °C+16,6(log M) + 0,41(%GC) − 0,61(% формамід) - 500/L; де M означає молярність однозарядних катіонів, %GC означає відсоток нуклеотидів гуанозину та цитозину у ДНК, % формаміду означає відсоток формаміду у гібридизаційному розчині, і L означає довжину гібриду у парах нуклеотидів. В альтернативному варіанті Tm описується представленою нижче формулою (Beltz et al., 1983). Tm(°C) = 81,5 °C+16,6(log[Na+]) + 0,41(%GC) – 0,61(% формамід) - 600/L де [Na+] означає молярність іонів натрію, %GC означає відсоток нуклеотидів гуанозину та цитозину у ДНК, % формамід означає відсоток формаміду у гібридизаційному розчині, і L означає довжину гібриду у парах нуклеотидів. На основі цих рівнянь, композицій для гібридизації та промивання і потрібної T m, спеціалістам у даній галузі стане зрозуміло, що опис передбачає коливання жорсткості умов гібридизації та/або розчинів для промивання. Якщо потрібний ступінь невідповідності в результаті передбачає Tm, нижчу за 45 °C (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), то бажаним є підвищення концентрації SSC таким чином, щоб могла застосовуватися більш 15 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 висока температура. Докладні інструкції з гібридизації нуклеїнових кислот містяться у публікаціях Tijssen (1993) та Ausubel et al. (1995). Також див. публікацію Sambrook et al. (1989). Гібридизацію іммобілізованої ДНК на саузерн-блотах з радіоактивно міченими генспецифічними зондами здійснюють стандартними способами (Sambrook et al., див. вище). До радіоактивних ізотопів, які застосовують для мічення полінуклеотидних зондів, можуть належати 32P, 33P, 14C або 3H. Включення радіоактивних ізотопів у молекули полінуклеотидних зондів може здійснюватись у будь-який з кількох способів, добре відомих спеціалістам у галузі молекулярної біології (див., наприклад, Sambrook et al. вище). Як правило, гібридизацію та наступні промивання здійснюють за жорстких умов, які дозволяють виявляти послідовностімішені, що мають гомологію з генами, які кодують заявлений токсин. Для генетичних зондів з дволанцюгових ДНК гібридизацію здійснюють протягом доби при температурі, яка на 20°-25 °C є нижчою за Tm гібриду ДНК у 6X SSPE, 5X розчину Денхардта, 0,1 % SDS, 0,1 мг/мл денатурованої ДНК [20X SSPE означає 3M NaCl, 0,2 M NaHPO4 та 0,02M EDTA (натрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти); 100X розчину Денхардта означає 20 г/л полівінілпіролідону, 20 г/л фіколлу типу 400 та 20 г/л альбуміну сироватки великої рогатої худоби (фракція V)]. Промивання зазвичай здійснюють таким чином: Двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин у 1X SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах низької жорсткості). Один раз при Tm-20 °C протягом 15 хвилин у 0,2X SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах помірної жорсткості). Для олігонуклеотидних зондів гібридизацію здійснюють протягом доби при температурі, на 10°-20 °C нижчій за Tm гібриду, у 6X SSPE, 5X розчину Денхардта, 0,1 % SDS, 0,1 мг/мл денатурованої ДНК. Tm для олігонуклеотидних зондів визначають за такою формулою (Suggs et al., 1981). Tm(°C) = 2 (кількість пар нуклеотидів T/A) + 4 (кількість пар нуклеотидів G/C) Промивання зазвичай здійснюють таким чином: Двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин 1X SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах низької жорсткості). Один раз при температурі гібридизації протягом 15 хвилин у 1X SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах помірної жорсткості). Молекули зондів для гібридизації та гібриді молекули, утворені між зондами та молекуламимішенями, можуть бути виявлені способами, відмінними від радіоактивного мічення. Такі альтернативні способи охоплюються обсягом цього винаходу. Усі наведені патенти, патентні заявки, попередні заявки та публікації є включеними шляхом посилання в повному обсязі тією мірою, якою вони не суперечать прямим вказівкам, які містяться в цьому описі. Якщо спеціально не вказується й не передбачається іншого, терміни, вжиті в однині, означають "принаймні один". Під терміном "генетичний матеріал" слід розуміти всі гени, нуклеїнові кислоти, ДНК та РНК. Для позначення нуклеотидних залишків полінуклеотидів, ДНК, РНК, олігонуклеотидів та праймерів і для позначення амінокислотних залишків білків в усьому тексті цього документа вжито стандартні скорочення IUPAC. Нуклеїновокислотні послідовності представлено у стандартному напрямку від 5' до 3', а білкові послідовності представлено у стандартному напрямку від аміно (N) кінця до карбокси (C) кінця. Нижче наведено приклади, які пояснюють процедуру практичного втілення винаходу. Слід розуміти, що описані авторами приклади та варіанти втілення наводяться лише з метою пояснення, і що можливість різних їх модифікацій або змін стане зрозумілою спеціалістам у даній галузі, і вони охоплюються сутністю та змістом цієї заявки та обсягом супровідної формули винаходу. Ці приклади не слід розуміти як обмежувальні. Усі відсоткові значення стосуються значень за масою, і всі пропорції у сумішах розчинників стосуються пропорцій за об'ємом, якщо не зазначено іншого. Усі значення температури вказано у градусах за Цельсієм. ПРИКЛАД 1 Виділення гена, який кодує DIG-3 токсин Нуклеїнову кислоту, яка кодує інсектицидний Cry білок, позначений у цьому описі як DIG-3, було виділено з геномної ДНК штаму B.t. PS46L шляхом ПЛР з застосуванням виродженого прямого праймера, який гібридизується з основами з 1286 по 1311 послідовності SEQ ID NO:1, та некомплементарного зворотного праймера, який гібридизується з комплементом основ з 2480 по 2499 послідовності SEQ ID NO:1. Цю пару праймерів використовували для ампліфікації фрагмента з 1214 п. н., який відповідав нуклеотидам з 1286 по 2499 послідовності SEQ ID NO:1. Цю послідовність застосовували як опорну точку для початку прогулянки по геному з застосуванням способів, пристосованих для універсального набору GenomeWalker™ Universal 16 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Kit (Clontech, Palo Alto, CA). Визначали нуклеїновокислотну послідовність фрагмента, який обмежує кодуючу ділянку DIG-3. SEQ ID NO:1 є нуклеотидною послідовністю з 3771 п. н., яка кодує повну довжину DIG-3 білка. SEQ ID NO:2 є амінокислотною послідовністю DIG-3 білка повної довжини, виведеною з SEQ ID NO:1. Слід зазначити, що у видах Bacillus кодуючі ділянки білка, такі як ділянки послідовності SEQ ID NO:1, можуть починатися з TTG кодону, який трансляційно представляє амінокислоту метіонін. ПРИКЛАД 2 Делеція α-спіралей домену I з DIG-3 Для поліпшення інсектицидних властивостей DIG-3 токсину здійснюють серійні поетапні делеції, кожна з яких видаляє частину N-кінця DIG-3 білка. Делеції видаляють частину або всю α-спіраль 1 та частину або всю α-спіраль 2 у Домені I, водночас зберігаючи структурну цілісність від α-спіралі 3 до α-спіралі 7. Делеції планують, як вказано нижче. У цьому прикладі застосовують химерну послідовність ДНК повної довжини, яка кодує DIG-3 білок повної довжини, наприклад, SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2, відповідно) для пояснення принципів побудови з 67 специфічними варіантами. У ньому застосовують химерну послідовність SEQ ID NO:5 (ДНК, яка кодує коровий сегмент токсину DIG3, злитий з протоксиновим сегментом Cry1Ab) для забезпечення додаткових 67 специфічних варіантів. Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що інші послідовності ДНК, які кодують DIG-3 білок, повністю або його N-кінцеву частину, можуть піддаватися подібним маніпуляціям для досягнення бажаного результату. Для утворення першої делетованої варіантної кодуючої послідовності усі основи, які кодують α-спіраль 1 до кодону для пролінового залишку поблизу від початку α-спіралі 2A (тобто, P73 для DIG-3 білка повної довжини послідовності SEQ ID NO:2), видаляють. Таким чином, видалення основ з 1 по 216 послідовності SEQ ID NO:1 видаляє кодуючу послідовність для амінокислот з 1 по 72 послідовності SEQ ID NO:2. Повторне включення кодону ініціації трансляції ATG (метіоніну) на початку (тобто, перед кодоном, який відповідає амінокислоті 73 білка повної довжини) забезпечує делетовану варіантну кодуючу послідовність, яка включає відкриту рамку зчитування з 3555 основ, яка кодує делетований варіантний DIG-3 білок, який включає 1185 амінокислот (тобто, метіонін плюс амінокислоти з 73 по 1256 DIG-3 білка повної довжини). Серійні поетапні делеції, які видаляють додаткові кодони для єдиної амінокислоти, що відповідає залишкам з 73 по 112 DIG-3 білка повної довжини послідовності SEQ ID NO:2, забезпечують варіанти, у яких частково або повністю відсутні αспіраль 2A та α-спіраль 2B. Таким чином, друга побудована делетована варіантна кодуюча послідовність вимагає видалення основ з 1 по 219 послідовності SEQ ID NO:1, що, таким чином, видаляє кодуючу послідовність для амінокислот 1-73. Відновлення функціональної відкритої рамки зчитування також здійснюють шляхом повторного включення метіонінового кодону ініціації трансляції на початку решти кодуючої послідовності, таким чином, забезпечуючи другу делетовану варіантну кодуючу послідовність, яка має відкриту рамку зчитування з 3552 основ, яка кодує делетований варіантний DIG-3 білок, який включає 1184 амінокислот (тобто, метіонін плюс амінокислоти з 74 по 1256 DIG-3 білка повної довжини). Остання побудована делетована варіантна кодуюча послідовність вимагає видалення основ з 1 по 336 послідовності SEQ ID NO:1, що, таким чином, видаляє кодуючу послідовність для амінокислот з 1 по 112 і, після повторного включення метіонінового кодону ініціації трансляції, забезпечує делетовану варіантну кодуючу послідовність, яка має відкриту рамку зчитування з 3435 основ, яка кодує делетований варіантний DIG-3 білок з 1145 амінокислот (тобто, метіонін плюс амінокислоти з 113 по 1256 DIG-3 білка повної довжини). Як наведено у прикладі, після видалення делетованої послідовності ініціюючий метіоніновий кодон додають до початку решти кодуючої послідовності для відновлення функціональної відкритої рамки зчитування. Також, як описано, додатковий гліциновий кодон має додаватися між метіоніновим кодоном та кодоном для амінокислоти для визначення нестійкості у випадку, коли видалення делетованої послідовності залишає відкриту на N-кінці решти білка повної довжини одну з амінокислот для визначення нестійкості, як передбачено вище. У Таблиці 3 описуються конкретні варіанти, розроблені згідно з описаною вище методикою. 17 UA 106885 C2 Таблиця 3 Делетовані варіантні білкові послідовності DIG-3 білка повної довжини послідовності SEQ ID NO:2 та злита білкова послідовність SEQ ID NO:5. Делетований варіант DIG-3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Залишки, Залишки додані на NH2 SEQ ID NO:2 кінці M 73-1256 MG 73-1256 M 74-1256 MG 74-1256 M 75-1256 M 76-1256 M 77-1256 M 78-1256 MG 78-1256 M 79-1256 M 80-1256 M 81-1256 MG 81-1256 M 82-1256 MG 82-1256 M 83-1256 M 84-1256 MG 84-1256 M 85-1256 MG 85-1256 M 86-1256 M 87-1256 M 88-1256 M 89-1256 MG 89-1256 M 90-1256 MG 90-1256 M 91-1256 MG 91-1256 M 92-1256 M 93-1256 M 94-1256 M 95-1256 MG 95-1256 M 96-1256 MG 96-1256 M 97-1256 MG 97-1256 M 98-1256 MG 98-1256 M 99-1256 MG 99-1256 M 100-1256 MG 100-1256 M 101-1256 MG 101-1256 M 102-1256 MG 102-1256 M 103-1256 Делетований варіант DIG-3 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 18 Залишки, додані на NH2 кінці M MG M MG M M M M MG M M M MG M MG M M MG M MG M M M M MG M MG M MG M M M M MG M MG M MG M MG M MG M MG M MG M MG M Залишки SEQ ID NO:5 73-1188 73-1188 74-1188 74-1188 75-1188 76-1188 77-1188 78-1188 78-1188 79-1188 80-1188 81-1188 81-1188 82-1188 82-1188 83-1188 84-1188 84-1188 85-1188 85-1188 86-1188 87-1188 88-1188 89-1188 89-1188 90-1188 90-1188 91-1188 91-1188 92-1188 93-1188 94-1188 95-1188 95-1188 96-1188 96-1188 97-1188 97-1188 98-1188 98-1188 99-1188 99-1188 100-1188 100-1188 101-1188 101-1188 102-1188 102-1188 103-1188 UA 106885 C2 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 5 10 15 20 25 30 35 40 MG M M MG M MG M MG M MG M MG M MG M MG M M 103-1256 104-1256 105-1256 105-1256 106-1256 106-1256 107-1256 107-1256 108-1256 108-1256 109-1256 109-1256 110-1256 110-1256 111-1256 111-1256 112-1356 113-1256 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 MG M M MG M MG M MG M MG M MG M MG M MG M M 103-1188 104-1188 105-1188 105-1188 106-1188 106-1188 107-1188 107-1188 108-1188 108-1188 109-1188 109-1188 110-1188 110-1188 111-1188 111-1188 112-1356 113-1188 Нуклеїнові кислоти, які кодують токсини, описані у Таблиці 3, є побудованими згідно з загальними принципами для синтетичних генів, призначених для експресії у рослинах, як обговорюється вище. ПРИКЛАД 3 Побудова оптимізованого до рослини варіанта кодуючої послідовності для інсектицидного DIG-3 білка B.t. Послідовність ДНК, яка має зміщення рослинного кодону, було спроектовано й синтезовано для продукування DIG-3 білка у трансгенних однодольних та дводольних рослинах. Таблицю частоти використання кодону для кукурудзи (Zea mays L.) розраховували за 706 кодуючими послідовностями (CD) білка, одержаними з послідовностях, які зберігаються у банку генів GenBank. Таблиці частоти використання кодону для тютюну (Nicotiana tabacum, 1268 CD), каноли (Brassica napus, 530 CD), бавовни (Gossypium hirsutum, 197 CD) та сої (Glycine max; приблизно 1000 CD) були скачані з даних на веб-сайті http://www.kazusa.or.jp/codon/. Набір зміщених кодонів, який включає часто використовувані кодони, спільний для кукурудзи та наборів даних дводольних рослин, у відповідній середньозваженій відносній кількості, розраховували після пропущення будь-якого надлишкового кодону, який використовувався рідше, ніж у приблизно 10 % від загальної кількості випадків використання кодону для цієї амінокислоти у будь-якому типі рослин. Для виведення оптимізованої для рослини послідовності, яка кодує DIG-3 білок, здійснювали заміщення кодонів для експериментально визначеної послідовності ДНК DIG-3, таким чином, щоб утворена в результаті послідовність ДНК мала загальний склад кодону оптимізованої до рослини таблиці зміщення кодону. Подальші очищення послідовності здійснювали для видалення небажаних сайтів розпізнавання рестрикційного ферменту, потенційних сайтів сплайсингу інтронів у рослині, стійких залишків A/T або C/G та інших мотивів, які можуть перешкоджати стійкості РНК, транскрипції або трансляції кодуючої ділянки у рослинних клітинах. Інші зміни здійснювали для включення потрібних сайтів розпізнавання рестрикційного ферменту та видалення довгих внутрішніх відкритих рамок зчитування (рамок, відмінних від +1). Усі ці зміни здійснювали з врахуванням обмежень щодо збереження складу зміщеного у рослині кодону. Синтез спроектованої послідовності здійснювався комерційним постачальником (DNA2.0, Menlo Park, CA). Додаткові інструкції стосовно продукування синтетичних генів містяться, наприклад, у документі WO 97/13402 та Патенті США № 5380831. Оптимізовану до рослини послідовність ДНК, яка кодує DIG-3 токсин повної довжини, представлено у SEQ ID NO:3. Оптимізовану до дводольних рослин послідовність ДНК, яка кодує протоксиновий сегмент Cry1Ab, представлено як SEQ ID NO:6. Оптимізовану до кукурудзи послідовність ДНК, яка кодує протоксиновий сегмент Cry1Ab, представлено як SEQ ID NO:7. ПРИКЛАД 4 Побудова експресійних плазмід, які кодують інсектицидний токсин DIG-3, та експресія у бактеріальних хазяях Стандартні способи клонування застосовували для побудови експресійних плазмід Pseudomonas fluorescens (Pf), підданих інженерії для продукування DIG-3 білків повної довжини, кодованими оптимізованими до рослин кодуючими ділянками. Рестрикційні ендонуклеази 19 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержували від New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA), а T4 ДНК лігазу (Invitrogen) застосовували для лігування ДНК. Приготування плазміди здійснювали, застосовуючи комплекти NucleoBond® Xtra Kit (Macherey-Nagel Inc, Bethlehem, PA) або Plasmid Midi Kit® (Qiagen) з дотриманням інструкцій виробників. Фрагменти ДНК очищували, застосовуючи картридж Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA) після електрофорезу на агарозному гелі з Trisацетатним буфером. Основна методика клонування викликала субклонування кодуючої послідовності (CDS)DIG-3 токсину у pDOW1169 у сайтах рестрикції SpeI та XhoI, завдяки чому вона поміщається під контроль експресії Ptac промотора та rrnBT1T2 термінатора з плазміди pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pDOW1169 є плазмідою з середньою кількістю копій з точкою початку реплікації RSF1010, pyrF геном та сайтом зв'язування рибосом перед сайтами розпізнавання рестрикційного ферменту, у які можуть включатися фрагменти ДНК, які містять кодуючі ділянки білка (Заявка США 20080193974). Експресійну плазміду, позначену як pDAB4171, трансформували шляхом електропорації у DC454 (наближений до дикого типу штам P. QI fluorescens, який має мутації ΔpyrF та lsc:lacI ) або його похідні, відновлювали у гідролізатному середовищі SOC-Soy і поміщали на селективне середовище (M9-глюкозний агар без урацилу, Sambrook et al., див. вище). Деталі мікробіологічних маніпуляцій повідомляються у публікації Squires et al., (2004), Патентній заявці США 20060008877, Патентній заявці США 20080193974 та Патентній заявці США 20080058262, які є включеними до цього опису шляхом посилання. Колонії спочатку відбирали шляхом ПЛР, а потім позитивні клони аналізували шляхом рестрикційного розщеплення плазмідної ДНК miniprep. Плазмідну ДНК вибраних клонів, які містили інсерції, секвенували, або шляхом застосування Big Dye® Terminator version 3.1, згідно з рекомендаціями постачальника (Applied Biosystems/Invitrogen), або зв'язавшись з комерційним постачальником програм для секвенування (MWG Biotech, Huntsville, AL). Дані про послідовність збирали й аналізували, застосовуючи програму Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI). Аналіз росту та експресії у колбах для струшування. Продукування DIG-3 токсину для характеризації та біоаналізу на комахах здійснювали за допомогою вирощуваних у колбах для струшування штамів P. fluorescens, які містили експресійні послідовності (наприклад, клон DP2826). Висіяні культури, які вирощували у середовищі M9 з додаванням 1 % глюкози та мікроелементів, використовували для інокуляції 50 мл визначеного мінімального середовища з 5 % гліцерину (Teknova Catalog No. 3D7426, Hollister, CA). Експресію DIG-3 гена токсину через промотор Ptac викликали шляхом додавання ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) після первісної інкубації протягом 24 годин при 30° зі струшуванням. Зразки культур відбирали під час викликання експресії та у різні моменти часу після нього. Густину клітин вимірювали за оптичною густиною при 600 нм (OD600). Також можуть застосовуватись інші культуральні середовища, придатні для вирощування Pseudomonas fluorescens, наприклад, як описано у публікації Huang et al. (2007) та Патентній заявці США 20060008877. Фракціонування клітин та SDS-PAGE аналіз зразків у колбах для струшування. Щоразу при забиранні зразків густину клітин у зразках доводили до OD 600=20 і 1 мл аліквоти центрифугували при 14000 x g протягом п'яти хвилин. Клітинну масу заморожували при -80°. Розчинні та нерозчинні фракції з заморожених зразків клітинної маси у колбі для струшування утворювали з застосуванням розчину екстракту бактеріального білка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Кожен зразок клітинної маси ресуспендували в 1 мл розчину EasyLyse™ і піддавали подальшому розведенню 1:4 у буфері для лізису і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14 000 об/хв протягом 20 хвилин при 4° і супернатант видобували як розчинну фракцію. Клітинну масу (нерозчинну фракцію) потім ресуспендували у рівному об'ємі фосфатно-буферного розчину (PBS; 11,9 мM Na2HPO4, 137 мM NaCl, 2,7 мM KCl, pH 7,4). Зразки змішували 1:1 з 2X буфера для зразка Laemmli, який містив β-меркаптоетанол (Sambrook et al., див. вище) і кип'ятили протягом 5 хвилин перед поміщенням на 12 % гелі Criterion XT® Bis-Tris (Bio-Rad Inc., Hercules, CA.) Електрофорез здійснювали у рекомендованому буфері XT MOPS. Гелі забарвлювали барвником Кумасі Bio-Safe згідно з протоколом виробника (Bio-Rad) і візуалізували, застосовуючи систему візуалізації Alpha Innotech (San Leandro, CA). Препарати включених тіл. Препарати включених тіл (IB) Cry білка одержували на ферментованих клітинах P. fluorescens, які утворювали нерозчинний інсектицидний білок B.t., як продемонстровано за допомогою SDS-PAGE та MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry). Зразки ферментованої клітинної маси P. fluorescens розтоплювали у водяній ванні при 37º. Клітини ресуспендували до 25 % (маса/об'єм) у буфері для лізису (50 мM Tris, pH 7,5, 200 мM NaCl, 20 мM динатрієвої солі EDTA 20 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 1 % Triton X-100 та 5 мM дитіотреїтолу (DTT); 5 мл/л коктейлю інгібітора бактеріальної протеази (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) додавали безпосередньо перед використанням). Клітини суспендували, застосовуючи переносний гомогенізатор при найнижчих настройках (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). До суспензії клітин додавали лізоцим (25 мг Sigma L7651, з білка курячих яєць) шляхом перемішування металевим шпателем і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім руйнували ультразвуком за допомогою ультразвукового дезінтегратора Branson 250 (два 1-хвилинні сеанси при 50 % робочому циклі, 30 % вихід). Лізис клітин перевіряли шляхом мікроскопії. У разі необхідності додавати ще 25 мг лізоциму і інкубацію та ультразвукову обробку повторювали. Коли лізис клітин підтверджувався через мікроскопію, лізат центрифугували при 11 500 x g протягом 25 хвилин (4°) для утворення згустку IB і супернатант зливали. Згусток IB ресуспендували, застосовуючи 100 мл лізисного буфера, гомогенізували переносним міксером і центрифугували, як вказано вище. Згусток IB повторно промивали шляхом ресуспендування (у 50 мл лізисного буфера), гомогенізації, ультразвукової обробки та центрифугування, доки супернатант не ставав безбарвним, а згусток IB не набував твердості та білуватого кольору. Для остаточного промивання згусток IB ресуспендували у стерильно фільтрованій (0,22 мкм) дистильованій воді, яка містила 2 мM EDTA, і центрифугували. Кінцевий згусток ресуспендували у стерильно фільтрованій дистильованій воді, яка містила 2 мM EDTA, і зберігали в 1 мл аліквотах при -80º. SDS-PAGE-аналіз та кількісне визначення білка у препаратах IB здійснювали шляхом розтоплення 1 мл аліквоти згустку IB та розведення 1:20 стерильно фільтрованою дистильованою водою. Розведений зразок після цього кип'ятили з 4X відновним буфером для зразка [250 мM Tris, pH 6,8, 40 % гліцерину (об'єм/об'єм), 0,4 % бромофеноловим синім (маса/об'єм), 8 % SDS (маса/об'єм) та 8 % β-меркаптоетанолом (об'єм/об'єм)] і поміщали на Novex® 4-20 % трис-гліцину, 12+2 лунок гелю (Invitrogen) пропускали з 1X трис/гліцин/SDSбуфером (BioRad). Гель пропускали протягом 60 хв при 200 В, потім забарвлювали кумасі синім (50 % G-250/50 % R-250 у 45 % метанолі, 10 % оцтової кислоти) і знебарвлювали 7 % оцтовою кислотою, 5 % метанолом у дистильованій воді. Кількісне визначення потрібних смуг здійснювали шляхом порівняння денситометричних значень для смуг відносно зразків альбуміну сироватки великої рогатої худоби (BSA), які пропускали на тому ж самому гелі для одержання стандартної кривої. Солюбілізація включених тіл. 6 мл суспензії включених тіл з Pf клона DP2826 (яка містила 32 мг/мл DIG-3 білка) центрифугували при найвищих настройках мікроцентрифуги Eppendorf моделі 5415C (приблизно 14 000 x g) для утворення згустку включень. Супернатант буфера для зберігання видаляли й замінювали на 25 мл 100 мM буфера з карбонату натрію, pH 11, у 50 мл конічній пробірці. Включення ресуспендували, застосовуючи піпетку і вихрували для ретельного перемішування. Пробірку поміщали на обережно розгойдуваній платформі при 4° протягом доби для екстрагування потрібного білка. Екстракт центрифугували при 30 000 x g протягом 30 хв при 4° і одержаний в результаті супернатант концентрували у 5 разів, застосовуючи фільтруючу центрифугу Amicon Ultra-15 з регенерованою целюлозою (30 000 відсікання за молекулярною масою; Millipore). Буфер для зразка потім замінювали на 10 мM CAPS [3(циклогексаміно)1-пропансульфонової кислоти] pH 10, застосовуючи одноразові колонки PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Гель-електрофорез. Концентрований екстракт приготовляли для електрофорезу шляхом розведення 1:50 у буфері для зразка NuPAGE® LDS (Invitrogen), який містив 5 мM дитіотреїтолу як відновного агента і нагрівали при 95° протягом 4 хвилин. Зразок поміщали у подвійні смуги 412 % NuPAGE® гелю паралельно з п'ятьма BSA-стандартами від 0,2 до 2 мкг/смугу (для побудови стандартної кривої). Подавали напругу 200 В, використовуючи рухомий буфер MOPS SDS (Invitrogen), доки барвник-“свідок" не досягав дна гелю. Гель забарвлювали 0,2 % кумасі синього G-250 у 45 % метанолі, 10 % оцтовій кислоті і знебарвлювали, спочатку швидко 45 % метанолом, 10 % оцтовою кислотою, а потім довго 7 % оцтовою кислотою, 5 % метанолом, доки фон не ставав прозорим. Після знебарвлювання гель сканували за допомогою пристрою Biorad Fluor-S MultiImager. Програму пристрою Quantity One v.4.5.2 застосовували для одержання об'ємів без фонових значень смуг забарвленого білка і для побудови стандартної кривої BSA, яку використовували для розрахунку концентрації DIG-3 білка у вихідному розчині. ПРИКЛАД 5 Інсектицидна активність модифікованого DIG-3 білка, який продукується у Pseudomonas fluorescens Інсектицидний DIG-3 токсин B.t. продемонстрував свою активність проти видів ряду 21 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Lepidoptera, включаючи кукурудзяного метелика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)), cry1Fрезистентного ECB (rECB), молі капустяної (DBM; Plutella xylostella (Linnaeus)), cry1Aрезистентного DBM (rDBM), совки бавовняної (CEW; Helicoverpa zea (Boddie)), совки-іпсилон (BCW; Agrotis ipsilon (Hufnagel)), тютюнової листовійки (TBW; Heliothis virescens (Fabricius)) та совки капустяної (CL; Trichoplusia ni (Hübner)). DIG-3 білок також випробували на активність проти совки трав'яної (FAW, Spodoptera frugiperda), Cry1F-резистентного FAW (rFAW) та західного кукурудзяного жука (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte). Приготування зразків та біопроб. Препарати включень у 10 мM CAPS, pH 10, розводили відповідним чином у 10 мM CAPS, pH 10, і всі біопроби включали контрольну обробку, яка складалася з цього буфера і служила як фонова перевірка смертності або інгібування росту. Значення концентрації у буфері біопроби визначали шляхом гель-електрофорезу з застосуванням BSA для створення стандартної кривої для гель-денситометрії, яку вимірювали, застосовуючи систему візуалізації BioRad (Fluor-S MultiImager з програмою Quantity One, версія 4.5.2). Білки у гелевому матриксі забарвлювали барвником на основі кумасі синього і знебарвлювали перед зчитуванням. Очищені білки випробували на інсектицидну активність у біопробах, які здійснювали з новонародженими личинками Lepidoptera на штучному раціоні для комах. Личинки BCW, CEW, CL, DBM, rDBM, ECB, FAW та TBW виводилися з яєць, одержаних від колонії, яку тримали у промисловому інсектарії (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Яйця WCR одержувати від Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN). Личинки rECB та rFAW виводилися з яєць, зібраних з приватних колоній (Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, IN). Біопроби здійснювали у 128-лункових пластикових планшетах, спеціально розроблених для біопроб на комахах (C-D International, Pitman, NJ). Кожна лунка містила 1,0 мл раціону для багатьох видів Lepidoptera (Southland Products, Lake Village, AR). Аліквоту 40 мкл зразка білка за 2 2 допомогою піпетки наносили на 1,5 см поверхні раціону у кожній лунці (26,7 мкл/см ). 2 Концентрацію раціону розраховували як кількість (нг) DIG-3 білка на квадратний сантиметр (см ) площі поверхні у лунці. Оброблені планшети тримали у газоуловлювачі, доки рідина на поверхні раціону не випаровувалася або не вбиралася у раціон. Протягом кількох годин вилуплення окремі личинки збирали зволоженим пензлем з верблюжої шерсті й наносили на оброблений раціон, по одній личинці на лунку. Інвазовані лунки потім щільно закривали клейкими листами прозорого пластика, в яких робили отвори для можливості газообміну (C-D International, Pitman, NJ). Планшети з біопробами тримали у контрольованих умовах середовища (28 °C, ~40 % відносної вологості, 16:8 [світло:темрява]) протягом 5 днів, після чого записували загальну кількість комах, підданих дії кожного зразка білка, кількість мертвих комах та масу комах, які вижили. Відсоток смертності та відсоток інгібування росту розраховували для кожної обробки. Інгібування росту (GI) розраховували таким чином: GI = [1 – (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] де TWIT є загальною масою комах у даній обробці, TNIT є загальною кількістю комах у даній обробці TWIBC є загальною масою комах у фоновій перевірці (буферний контроль), і TNIBC є загальною кількістю комах у фоновій перевірці (буферний контроль). GI50 визначали як концентрацію DIG-3 білка у раціоні, при якій значення GI становило 50 %. LC50 (50 % летальної концентрації) записували як концентрацію DIG-3 білка у раціоні, при якій 50 % випробуваних комах гинули. Статистичний аналіз (однофакторний ANOVA) здійснювали з застосуванням програми JMP (SAS, Cary, NC) У Таблиці 6 представлено результати випробувань біопроби DIG-3 білка на кукурудзяному метелику та cry1F-резистентному кукурудзяному метелику (rECB). Несподівано було виявлено, що випробувані комахи rECB були так само сприйнятливими до дії DIG-3 білка, що й дикі комахи ECB. Таблиця 6 Значення LC50 та GI50, розраховані для ECB та rECB, з довірчими інтервалами (CI) 95 % Комаха ECB rECB 2 LC50 (нг/см ) 591,9 953,6 95 % CI 308,1-1315,3 534,1-1953,6 2 GI50 (нг/см ) 122,6 270,9 95 % CI 45,6-328,4 53,0-1382,2 У Таблиці 7 представлено результати біопроб на широкому спектрі шкідників Lepidoptera та 22 UA 106885 C2 Coleoptera (WCR). DIG-3 білок мав несподівану активність проти молі капустяної, а також rDBM. Крім того, DIG-3 Cry білок є ефективним для стримування росту кількох інших комах Lepidoptera. Таблиця 7 Інсектицидний та інгібуючий ріст вплив DIG-3 білка, спожитого випробуваними комахами Випробувана комаха DBM rDBM CL CEW TBW BCW FAW rFAW WCR Реакція при 9000 нг/см 100 % смертності 100 % смертності 75 % смертності, значне GI Значне GI Видиме GI, певна смертність Видиме GI Активність не спостерігалася Активність не спостерігалася Активність не спостерігалася 2 Статистичний аналіз* (GI) P < 0,001, df=1, α = 0,05 (GI) P=0,02, df=1, α = 0,05 Немає даних Немає даних *GI = Інгібування росту. P-значення = статистика критерію. df = Ступінь свободи, α ( рівень 0,05 = рівень значущості критерію. 5 10 15 20 25 30 35 40 альфа) ПРИКЛАД 6 Трансформація Agrobacterium Застосовують стандартні способи клонування для побудови бінарної плазміди трансформації рослин та експресійної плазміди. Рестрикційні ендонуклеази та T4 ДНК лігазу одержують від NEB. Приготування плазміди здійснюють, застосовуючи комплект NucleoSpin® Plasmid Preparation або комплект NucleoBond® AX Xtra Midi (обидва від Macherey-Nagel) згідно з інструкціями виробника. Фрагменти ДНК очищують, застосовуючи комплект для ПЛР-очищення QIAquick® або комплект для гелевої екстракції QIAEX II® (обидва від Qiagen) після відокремлення гелю. Фрагменти ДНК, які включають нуклеотидні послідовності, які кодують DIG-3 білок у природній або модифікованій формах або його фрагменти, можуть бути синтезовані комерційним постачальником (наприклад, DNA2.0, Menlo Park, CA) і можуть постачатись як клоновані фрагменти у стандартних плазмідних векторах, або ж можуть бути одержані шляхом застосовуваних у молекулярній біології стандартних маніпуляцій інших послідовностей, які містять відповідні нуклеотидні послідовності. Розпізнають унікальні сайти рестрикції у межах кодуючої ділянки DIG-3 і синтезують фрагменти ДНК, які включають послідовності між сайтами рестрикції кодуючої ділянки DIG-3, причому кожен такий фрагмент кодує конкретну делецію, інсерцію або інший варіант DIG-3. Фрагменти ДНК, які кодують модифіковані фрагменти DIG-3, можуть приєднуватися до інших фрагментів кодуючої ділянки DIG-3 або інших фрагментів кодуючої ділянки Cry у відповідних сайтах рестрикції для одержання кодуючої ділянки, яка кодує потрібний DIG-3 білок повної довжини, делетований або варіантний DIG-3 білок або злитий білок. Наприклад, може бути ідентифікований відповідний сайт розпізнавання рестрикції на початку першої кодуючої ділянки DIG-3 та другий сайт рестрикції у межах кодуючої ділянки DIG3. Розщеплення цієї першої кодуючої ділянки DIG-3 у цих сайтах рестрикції утворює фрагмент ДНК, який включає частину першої кодуючої ділянки DIG-3. Другий фрагмент ДНК, до якого збоку приєднуються аналогічно розташовані сумісні сайти рестрикції, специфічні до іншої кодуючої ділянки DIG-3 або іншої кодуючої ділянки Cry, може використовуватись у комбінації з першим рестрикційним фрагментом ДНК для побудови варіанта злитого клону. У необмежувальному прикладі основна методика клонування може полягати у субклонуванні повних або модифікованих кодуючих послідовностей (CDS) DIG-3 у рослинну експресійну плазміду у сайтах рестрикції NcoI та SacI. Утворені в результаті рослинні експресійні касети, які містять відповідну кодуючу ділянку DIG-3 під контролем елементів експресії у рослинах (наприклад, експресованих у рослинах промоторів, детермінант 3'-кінцевої термінації транскрипції та додавання поліаденілату і т. ін.), субклонують у бінарну векторну ® плазміду з застосуванням, наприклад, технології Gateway або стандартних процедур клонування фрагмента рестрикційного ферменту. Наприклад, LR Clonase™ (Invitrogen) може застосовуватися для рекомбінації повних або модифікованих касет експресії генів у рослинах у 23 UA 106885 C2 ® 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бінарну рослинну плазміду трансформації, якщо застосовується технологія Gateway . Зручним є застосування бінарного рослинного вектора трансформації, який включає бактеріальний ген, який забезпечує резистентність до антибіотика стрептоміцину, коли плазміда є присутньою у клітинах E. coli та Agrobacterium. Також зручним є застосування бінарної векторної плазміди, яка містить експресований у рослинах ген селектованого маркера, який є функціональним у потрібних рослинах-хазяях. Прикладами експресованих у рослинах генів селектованого маркера, крім інших, є ті, які кодують ген аміноглікозидфосфотрансферази (aphII) транспонзону Tn5, який забезпечує резистентність до антибіотиків канаміцину, неоміцину та G418, а також гени, які, кодують резистентність або переносимість гліфосату; гігроміцину; метотрексату; фосфінотрицину (біалафосу), імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазолопіримідинових гербіцидів, таких, як хлоросульфурон, бромоксиніл, діалапон і т. ін. Електрокомпетентні клітини штаму Agrobacterium tumefaciens Z707S (резистентна до стрептоміцину похідна Z707; Hepburn et al., 1985) приготовляють і трансформують, застосовуючи електропорацію (Weigel and Glazebrook, 2002). Після електропорації у кювету додають 1 мл бульйону YEP (г/л: екстракт дріжджів - 10; пептон - 10; NaCl-5) і суспензію клітинYEP переносять у 15 мл культуральну пробірку для інкубації при 28° у водяній ванні з безперервним перемішуванням протягом 4 годин. Клітини поміщують на YEP плюс агар (25 г/л) зі спектиноміцином (200 мкг/мл) та стрептоміцином (250 мкг/мл) і планшети інкубують протягом 2-4 днів при 28°. Належно відокремлені окремі колонії відбирають і наносять смугами на планшети зі свіжою сумішшю YEP + агар зі спектиноміцином та стрептоміцином, як вказано вище, і інкубують при 28° протягом 1-3 днів. Присутність інсерції DIG-3 гена у бінарному рослинному векторі трансформації визначають шляхом ПЛР-аналізу з застосуванням вектор-специфічних праймерів з матричною плазмідною ДНК, приготовленою з відібраних колоній Agrobacterium. Клітинну масу з 4 мл аліквоти 15 мл добової культури, яку вирощували у YEP зі спектиноміцином та стрептоміцином, як вказано вище, екстрагують, застосовуючи Qiagen Spin® Mini Preps згідно з інструкціями виробника. Плазмідну ДНК з бінарного вектора, який використовують в електропораційній трансформації Agrobacterium, включають як контроль. ПЛР-реакцію здійснюють, застосовуючи Taq ДНКполімеразу від Invitrogen згідно з інструкціями виробника у концентрації 0,5X. ПЛР-реакції здійснюють у термоциклі MJ Research Peltier, запрограмованому на такі умови: Етап 1) 94° протягом 3 хвилин; Етап 2) 94° протягом 45 секунд; Етап 3) 55° протягом 30 секунд; Етап 4) 72° протягом 1 хвилини на т. н. очікуваної довжини продукту; Етап 5) 29 разів до Етапу 2; Етап 6) 72° протягом 10 хвилин. Реакцію підтримують при 4° після циклування. Продукти ампліфікації аналізують шляхом електрофорезу на агарозному гелі (наприклад, від 0,7 % до 1 % агарози (маса/об'єм)) і візуалізують шляхом забарвлення бромідом етидію. Відбирають колонію, продукт ПЛР якої є ідентичним контрольній плазміді. В альтернативному варіанті плазмідну структуру бінарного рослинного вектора трансформації, який містить інсерцію DIG-3 гена, будують шляхом фінгерпринтного картування фрагментів рестрикції плазмідної ДНК, приготовлених з відповідних ізолятів Agrobacterium стандартними способами молекулярної біології, добре відомими спеціалістам у галузі маніпуляцій з Agrobacterium. Спеціалістам у галузі одержання трансформованих рослин з застосуванням способів Agrobacterium-опосередкованої трансформації стане зрозуміло, що можуть бути вигідно використані інші штами Agrobacterium, крім Z707S, і вибір штаму може залежати від видів рослин-хазяїв, які мають бути трансформовані. ПРИКЛАД 7 Продукування DIG-3 інсектицидних білків B.t. та їх варіантів у дводольних рослинах Трансформація Arabidopsis. Arabidopsis thaliana Col-01 трансформують, застосовуючи спосіб занурення квіток (Weigel and Glazebrook, 2002). Відібрану колонію Agrobacterium використовують для інокуляції від 1 мл до 15 мл культур у YEP-бульйоні, що містить відповідні антибіотики для відбору. Культуру інкубують протягом доби при 28° з постійним перемішуванням при 220 об/хв. Кожну культуру використовують для інокуляції двох 500 мл культур у YEP-бульйоні, які містять відповідні антибіотики для відбору, і нові культури інкубують протягом доби при 28° з постійним перемішуванням. Клітини осаджують центрифугуванням при приблизно 8700 x g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і утворений в результаті супернатант зливають. Клітинну масу обережно ресуспендують у 500 мл інфільтраційних середовищ, які містять: 1/2x солей Мурасіге та Скуга (Sigma-Aldrich) / вітаміни B5 для середовища Гамборга (Gold BioTechnology, St. Louis, MO), 10 % (маса/об'єм) цукрози, 0,044 мкM бензиламінопурину (10 мкл/л 1 мг/мл вихідного розчину у DMSO) та 300 мкл/л Silwet L-77. Рослини приблизно 1-місячного віку занурюють у середовище на 15 секунд, стежачи за тим, 24 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щоб обов'язково були занурені найновіші суцвіття. Потім рослини кладуть на бік і вкривають (прозорим або непрозорим матеріалом) на 24 години, промивають водою і ставлять у вертикальну позицію. Рослини вирощують при 22°, з фотоперіодом 16 годин світла / 8 годин темряви. Приблизно через 4 тижні після занурення збирають насіння. Вирощування та відбір Arabidopsis. Щойно зібране насіння T1 висушують протягом принаймні 7 днів при кімнатній температурі у присутності сикативу. Насіння суспендують у 0,1 % розчині агару/води (Sigma-Aldrich), а потім розшаровують при 4° протягом 2 днів. Для підготування до висівання суміш Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) у планшетах для пророщування по 10,5 дюйма x 21 дюйм (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) вкривають тонко подрібненим вермікулітом, піддають субіригації розчином Хогланда (Hoagland and Arnon, 1950) до намокання, потім залишають для дренажу на 24 години. Розшароване насіння висівають на вермікуліт і накривають зволожувальними ковпаками (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) на 7 днів. Насіння пророщують і рослини вирощують у камері Conviron (моделі CMP4030 або CMP3244; Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) в умовах довгого дня (16 годин світла /8 годин темряви) з інтенсивністю світла 120-150 2 мкмоль/м сек при незмінній температурі (22°) та вологості (40-50 %). Спочатку рослини поливають розчином Хогланда, а потім деіонізованою водою для підтримання у вологому, але не мокрому стані. Ковпаки знімають через 5-6 днів після висівання і рослини збризкують засобом хімічного відбору для знищення рослин, пророщених з нетрансформованого насіння. Наприклад, якщо експресований у рослинах ген селектованого маркера, який забезпечується бінарним рослинним вектором трансформації, є pat або bar геном (Wehrmann et al., 1996), трансформовані рослини можуть відбиратися шляхом розбризкування 1000X розчину Finale (5,78 % глюфосинат амонію, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ.). Два послідовні розбризкування здійснюють з 5-7-денними інтервалами. Рослини, які вижили (активно ростуть) визначають через 7-10 днів після кінцевого розбризкування і пересаджують у підготовлені горщики з сумішшю Sunshine Mix LP5. Пересаджені рослини накривають зволожувальним ковпаком на 3-4 дні й поміщують у камеру Conviron з вищезгаданими умовами для вирощування. Спеціалістам у галузі трансформації дводольних рослин стане зрозуміло, що існують інші способи відбору трансформованих рослин, якщо застосовуються інші експресовані у рослинах гени селектованих маркерів (наприклад, гени переносимості гербіцидів). Біоаналізи з трансгенним Arabidopsis на комахах. Було продемонстровано, що трансгенні лінії Arabidopsis, які експресують модифіковані Cry білки, є активними проти чутливих видів комах в аналізах з вкриванням штучним раціоном. Кількість білка, взятого з трансгенних та нетрансгенних ліній Arabidopsis, визначають відповідними способами, і об'єми зразків регулюють для нормалізації концентрації білка. Біоаналізи здійснюють на штучному раціоні, як описано вище. Нетрансгенні рослини Arabidopsis та/або буфер та воду включають в аналізи як для фонової перевірки. ПРИКЛАД 8 Трансформація Agrobacterium для створення супербінарних векторів Супербінарна система Agrobacterium є зручною для застосування у трансформації дводольних рослин-хазяїв. Методологія побудови та підтвердження супербінарних векторів є достатньо описаною і включається до цього опису шляхом посилання (Operating Manual for Plasmid pSB1, Version 3.1, від Japan Tobacco, Inc., Токіо, Японія). Застосовують стандартні біологічні та мікробіологічні способи для утворення супербінарних плазмід. Перевірку/підтвердження структури супербінарної плазміди здійснюють, застосовуючи методології, описані вище для бінарних векторів, і вони можуть бути модифіковані згідно з рекомендаціями Інструкції з користування для плазміди pSB1. ПРИКЛАД 9 Продукування інсектицидних білків DIG-3 B.t. та їх варіантів в однодольних рослинах Agrobacterium-опосередкована трансформація кукурудзи. Насіння схрещеного сорту High II F1 (Armstrong et al., 1991) висівають у 5-галонні горщики, які містять суміш 95 % безґрунтового середовища для вирощування Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) та 5 % глинисто-суглинистого ґрунту. Рослини вирощують у теплиці, застосовуючи комбінацію натрієвих ламп високого тиску та металогалогенідних ламп з фотоперіодом 16:8 год. світла:темряви. Для одержання незрілих зав'язей F 2 для трансформації здійснюють споріднене запилення. Незрілі зав'язі відокремлюють на 8-10 дні після запилення, коли зав'язі мають розмір приблизно від 1,0 до 2,0 мм. Інфікування та спільне культивування. Початки кукурудзи піддають поверхневій стерилізації 25 UA 106885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 шляхом промивання рідким милом, занурення у 70 % етанол на 2 хвилини, з наступним зануренням у 20 % відбілювальний засіб промислового виробництва (0,1 % гіпохлорит натрію) на 30 хвилин перед промиванням стерильною водою. Суспензію клітин Agrobacterium, яка містить супербінарний вектор, приготовляють шляхом перенесення 1-2 петель бактерій, вирощуваних на твердому середовищі YEP, яке містило 100 мг/л спектиноміцину, 10 мг/л тетрацикліну та 250 мг/л стрептоміцину, при 28° протягом 2-3 днів у 5 мл рідкого інфекційного середовища (базальне середовище LS (Linsmaier and Skoog, 1965), вітаміни N6 (Chu et al., 1975), 1,5 мг/л 2,4-дихлорофеноксіоцтової кислоти (2,4-D), 68,5 г/л цукрози, 36,0 г/л глюкози, 6 мM L-проліну, pH 5,2), яка містило 100 мкM ацетосирінгону. Розчин піддавали вихровому перемішуванню до досягнення однорідної суспензії і концентрацію регулюють до кінцевої густини приблизно 200 одиниць Клетта, застосовуючи колориметр Клетта-Саммерсона з пурпуровим фільтром, або оптичної густини приблизно 0,4 при 550 нм. Незрілі зав'язі відокремлюють безпосередньо у пробірку для мікроцентрифугування, яка містить 2 мл інфекційного середовища. Середовище видаляють і замінюють на 1 мл розчину Agrobacterium з густиною 200 одиниць Клетта і Agrobacterium та розчин зав'язей інкубують протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, а потім переносять до середовища для спільного культивування (базальне середовище LS, вітаміни N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 30,0 г/л цукрози, 6 мM L-проліну, 0,85 мг/л AgNO3, 100 мкM ацетосирінгону, 3,0 г/л геланової камеді (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5.,) протягом 5 днів при 25° у темних умовах. Після спільного культивування зав'язі переносять до селективного середовища, після чого трансформовані ізоляти одержують протягом періоду у приблизно 8 тижнів. Для відбору тканин кукурудзи, трансформованих супербінарною плазмідою, яка містить експресований у рослинах pat або bar ген селектованого маркера, застосовують середовище на основі LS (базальне середовище LS, вітаміни N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 0,5 г/л MES моногідрату (2-(Nморфоліно)етансульфонової кислоти; PhytoTechnologies Labr.), 30,0 г/л цукрози, 6 мM L-проліну, 1,0 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксиму, 2,5 г/л геланової камеді, pH 5,7) з біалафосом (Gold BioTechnology). Зав'язі переносять до селективного середовища, яке містить 3 мг/л біалафосу, до одержання ембріогенних ізолятів. Видобуті ізоляти збільшують в об'ємі шляхом перенесення до свіжого селективного середовища з 2-тижневими інтервалами для регенерації та подальшого аналізу. Спеціалістам у галузі трансформації кукурудзи стане зрозуміло, що існують інші способи відбору трансформованих рослин, якщо застосовуються інші експресовані у рослинах гени селектованих маркерів (наприклад, гени переносимості гербіцидів). Регенерація та вироблення насіння. Для регенерації культури переносять до індукційного середовища "28" (солі MS та вітаміни, 30 г/л цукрози, 5 мг/л бензиламінопурину, 0,25 мг/л 2, 4-D, 3 мг/л біалафосу, 250 мг/л цефотаксиму, 2,5 г/л геланової камеді, pH 5,7) протягом 1 тижня в -2 -1 умовах низького освітлення (14 µEm s ), а потім протягом 1 тижня в умовах високого -2 -1 освітлення (приблизно 89 µEm s ). Потім тканини переносять до регенераційного середовища "36" (такого, як індукційне середовище, за винятком відсутності регуляторів росту рослин). Потім рослини підрощують до довжини 3-5 см, переносять до скляних культуральних пробірок, які містять середовище SHGA (солі та вітаміни Шенка та Гільдебрандта (1972); PhytoTechnologies Labr.), 1,0 г/л міо-інозиту, 10 г/л цукрози та 2,0 г/л геланової камеді, pH 5,8) для забезпечення можливості подальшого росту та розвитку паростків та коріння. Рослини пересаджують у таку саму суміш ґрунтів, як описано вище, і вирощують до цвітіння у теплиці. Здійснюють контрольоване запилення для вироблення насіння. ПРИКЛАД 10 Біопроба трансгенної кукурудзи Біологічну активність DIG-3 білка та його варіантів, які продукуються у рослинних клітинах, демонструють за допомогою традиційних способів біопроб (див., наприклад, Huang et al., 2006). Ефективність може бути продемонстрована, наприклад, шляхом годування різними рослинними тканинами або частинами тканин, взятими з рослини, яка продукує DIG-3 токсин, комах, проти яких спрямовано його дію, у контрольованому середовищі живлення. В альтернативному варіанті приготовляють екстракти білків з різних рослинних тканин, взятих з рослини, яка продукує DIG-3 токсин, і екстраговані білки включають у біопробі штучного раціону, як описано вище. Також слід розуміти, що результати таких аналізів годування мають порівнюватися з результатами здійснюваних подібним чином біопроб, у яких застосовують відповідні контрольні тканини з рослин-хазяїв, які не продукують DIG-3 білок або його варіанти, або з іншими контрольними зразками. Бібліографія: 1. An, G., Watson, B. D., Stachel, S., Gordon, M. P., Nester, E. W. (1985) New cloning vehicles 26 UA 106885 C2 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. for transformation of higher plants. EMBO J. 4:277–284. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Armstrong, C. L., Green, C. E., Phillips, R. L. (1991) Development and availability of germplasm with high TypeII culture formation response. Maize Genet. Coop. Newslett. 65:9293. Aronson, A.I., Han, E.-S., McGaughey, W., Johnson, D. (1991) The solubility of inclusion proteins from Bacillus thuringiensis is dependent upon protoxin composition and is a factor in toxicity to insects. Appl. Environ. Microbiol. 57:981-986. Aronson, A. I., Geng, C., Wu. L. (1999) Aggregation of Bacillus thuringiensis Cry1A toxins upon binding to target insect larval midgut vesicles. Appl. Environ. Microbiol. 65:2503-2507. Arvidson, H., Dunn, P. E., Strand, S., Aronson, A. I. (1989) Specificity of Bacillis thuringiensis for lepidopteran larvae: factors involved in vivo and in the structure of a purified toxin. Molec. Microbiol. 3:1533-1543. Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Bailey, J. M., Shenov, N. R., Ronk, M., and Shively, J. E., (1992) Automated carboxy-terminal sequence analysis of peptides. Protein Sci. 1:68–80. Beltz, G.A., Jacobs, K. A., Eickbush, T. H., Cherbas, P. T., Kafatos, F. C. (1983) Isolation of multigene families and determination of homologies by filter hybridization methods. In Wu, R., Grossman, L., Moldave, K. (eds.) Methods of Enzymology, Vol. 100 Academic Press, New York pp.266-285. Bown, D. P., Wilkinson, H. S., Jongsma, M. A., Gatehouse, J. A. (2004) Characterisation of cysteine proteinases responsible for digestive proteolysis in guts of larval western corn rootworm (Diabrotica virgifera) by expression in the yeast Pichia pastoris. Insect Biochem. Molec. Biol. 34,:305-320. Bravo, A., Gill, S. S., Soberon, M. (2007) Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon 49:423-435. Caruthers, M. H., Kierzek, R., Tang, J. Y. (1987) Synthesis of oligonucleotides using the phosphoramidite method. Bioactive Molecules (Biophosphates Their Analogues) 3:3-21. Christeller, J. T., Laing, W. A., Markwick, N. P., Burgess, E. P. J. (1992) Midgut protease activities in 12 phytophagous lepidopteran larvae: dietary and protease inhibitor interactions. Insect Biochem. Molec. Biol. 22:735-746. Chu, C. C., Wand, C. C., Sun, C. S., Hsu, C., Yin, K. C., Chu, C. Y., Bi, F. Y. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Scientia Sinica 18:659-668. Crameri, A., Cwirla, S., Stemmer, W. P. C. (1996a) Construction and evolution of antibodyphage libraries by DNA shuffling. Nat. Med. 2:100-103. Crameri, A., Dawes, G., Rodriguez, E., Silver, S., Stemmer, W.P.C. (1997) Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling. Nat. Biotech. 15:436-438. Crameri, A., Whitehom, E.A., Tate, E., Stemmer, W. P. C. (1996b) Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat. Biotech. 14:315-319. de Maagd, R. A., Kwa, M. S., van der Klei, H., Yamamoto, T., Schipper, B., Vlak, J. M., Stiekema, W. J., Bosch, D. (1996) Domain III substitution in Bacillus thuringiensis deltaendotoxin CryIA(b) results in superior toxicity for Spodoptera exigua and altered membrane protein recognition. Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543. de Maagd, R. A., Bravo, A., Berry, C., Crickmore, N., Schnepf, E. (2003) Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Annu. Rev. Genet. 37:409-433. Diaz-Mendoza, M., Farinos, G. P., Castanera, P., Hernandez-Crespo, P., Ortego, F. (2007) Proteolytic processing of native Cry1Ab toxin by midgut extracts and purified trypsins from the Mediterranean corn borer Sesamia nonagrioide. J. Insect Physiol. 53:428-435.Englemann, F., Geraerts, W. P. M., (1980) The proteases and the protease inhibitor in the midgut of Leucophaea maderae. J. Insect Physiol. 261:703-710. Fraley, R. T., Rogers, S. G., Horsch, R. B. (1986) Genetic transformation in higher plants. Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46. Gazit, E., La Rocca, P., Sansom, M. S. P., Shai, Y. (1998) The structure and organization 27 UA 106885 C2 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. within the membrane of the helices composing the pore-forming domain of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin are consistent with an "umbrella-like" structure of the pore. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:12289-12294. Ge, A., Rivers, D., Milne, R., Dean, D. H. (1991) Functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins. Refinement of Heliothis virescens and Trichoplusia ni specificity domains on CryIA(c). J. Biol. Chem. 266:17954-17958. Gillikin, J. W., Bevilacqua, S., Graham, J. S. (1992) Partial characterization of digestive tract proteinases from western corn rootworm larvae, Diabrotica virgifera. Arch. Insect Biochem. Physiol. 19:285-298. Gomez, I., Sanchez, J., Miranda, R., Bravo, A., Soberon, M. (2002) Cadherin-like receptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix alpha-1 in domain I and oligomer pre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin. FEBS Lett. 513:242-246. Haider, M. Z., Knowles, B. H., Ellar, D. J. (1986) Specificity of Bacillus thuringiensis var. colmeri insecticidal δ-endotoxin is determined by differential proteolytic processing of the protoxin by larval gut proteases. Eur. J. Biochem. 156:531-540. Heckel, D. G., Gahan, L. J., Baxter, S. W., Zhao, J-Z., Shelton, A. M., Gould, F., Tabashnik, B. E. (2007) The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J. Invert. Pathol. 95:192-197. Hepburn, A. G., White, J., Pearson, L., Maunders, M. J., Clarke, L. E., Prescott, A. G. Blundy, K. S. (1985) The use of pNJ5000 as an intermediate vector for the genetic manipulation of Agrobacterium Ti-plasmids. J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. (1950) The water-culture method of growing plants without soil. Calif. Agr. Expt. Sta. Circ. 347. Hofte, H., de Greve, H., Seurinck, J., Jansens, S., Mahillon, J., Ampe, C., Vandekerckhove, J., Vanderbruggen, H., van Montagu, M., Zabeau, M., Vaeck, M. (1986) "Structural and functional analysis of a cloned delta endotoxin of Bacillus thuringiensis berliner 1715.” Eur. J. Biochem. 161:273-280. Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K., Pease, L.R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77:61–68. Huang, F., Rogers, L. B., Rhett, G. H. (2006) Comparative susceptibility of European corn borer, southwestern corn borer, and sugarcane borer (Lepidoptera: Crambidae) to Cry1Ab protein in a commercial Bacillus thuringiensis corn hybrid. J. Econ. Entomol. 99:194-202. Huang, K-X., Badger, M., Haney, K., Evans, S. L. (2007) Large scale production of Bacillus thuringiensis PS149B1 insecticidal proteins Cry34Ab1 and Cry35Ab1 from Pseudomonas fluorescens. Prot. Express. Purific. 53:325-330. Janmaat, A. F., Myers, A. H. (2003) Rapid evolution and the cost of resistance to Bacillus thuringiensis in greenhouse populations of cabbage loopers, Trichoplusia ni. Proc. Royal Soc. London. Ser. B, Biolog. Sci. 270:2263-2270. Janmaat, A. F., Myers, A. H. (2005) The cost of resistance to Bacillus thuringiensis varies with the host plant of Trichoplusia ni. Proc. Royal Soc. London. Ser. B, Biolog. Sci. 272:1031-1038. Karlin, S., Altschul, S. F. (1990) Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22642268. Karlin, S., Altschul, S. F. (1993) Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Keller, G.H., Manak, M. M. (1993) DNA Probes, Background, Applications, Procedures. Stockton Press, New York, NY. Knight, J. S., Broadwell, A. H., Grant, W. N., Shoemaker, C. B. (2004) A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. J. Econ. Entomol. 97:1805-1813. Koiwa, H., Shade, R. E., Zhu-Salzman, K., D'Urzo, M. P., Murdock, L. L., Bressan, R. A., Hasegawa, P. M. (2000) A plant defensive cystatin (soyacystatin) targets cathepsin L-like digestive cysteine proteinases (DvCALs) in the larval midgut of western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera. FEBS Letters 471:67-70. Larson, S. M., England, J. L., Desjarlais, J. R., Pande, V. S. (2002) Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles. Protein Sci. 11:28042813. Lee, L.-Y., Gelvin, S. B. (2008) T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146: 325332. Linsmaier, E.M., Skoog, F. (1965) Organic growth factor requirements of tobacco tissue. Physiologia Plantarum 18:100-127. 28