Пептидні токсини як терапевтичні засоби

1. Композиція сполуки за формулою (Х1)a-(F1)d-(Х2)b-(F2)е-(Х3)c або її мультимери, яка відрізняється тим, що: F1 і F2 є частинами молекули, що збільшують час напіввиведення, a d і е кожен незалежно має значення 0 або 1, за умови, що принаймні одне d і е становить 1; X1, X2 і X3 кожен незалежно є -(L)f-P-(L)g-, a f і g кожен незалежно є 0 або 1; Р являє собою ShK пептид або аналог пептиду ShK, що складається не більше ніж з приблизно 80 амінокислотних залишків у довжину, і включає щонайменше два внутрішньопептидні дисульфідні зв'язки; L являє собою лінкер; та а, b і с, кожен незалежно має значення 0 або 1, за умови, що принаймні одне з a, b і с має значення 1; або її фізіологічно прийнятна сіль. 2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що має формулу, вибрану з групи, що складається з P-(L)g-F1, F1-(L)f-P, P-(L)g-F1-(L)f-P, F1-(L)f-P-(L)g-F2, 1 2 F -(L)f-P-(L)g-F -(L)f-P, F1-F2-(L)f-P, P-(L)g-F1-F2 та P-(L)g-F1-F2-(L)f-P. 3. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що F1 або F2, або обидва являють собою поліетиленгліколь, кополімер етиленгліколю, поліпропіленглі UA (21) a200712912 (22) 18.04.2006 (24) 26.04.2011 (86) PCT/US2006/015199, 18.04.2006 (31) 60/674,342 (32) 22.04.2005 (33) US (31) 11/406,454 (32) 17.04.2006 (33) US (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) САЛЛІВАН ДЖОН К., US, МАКГІВЕРН ДЖОЗЕФ Г., US, МІРАНДА ЛЕСЛІ П., US, НГУЄН ХЮНГ КЬЮ, US, ВОЛКЕР КЕННЕТ В., US, ХУ ШО-ФЕН СИЛЬВІЯ, US, ГЕГГ МОЛ., КОЛІН В., US, МАКДОНАУ СТЕФАН І., US (73) АМГЕН ІНК., US (56) WO A 9823639, 04.06.1998. US A 6077680, 20.06.2000. WO A 02098446, 12.12.2002. WO A 2004043396, 27.05.2004. US A1 2003069170, 10.04.2003. WO A2 0069900, 23.11.2000. US B1 6660843, 09.12.2003. WO A 0183525, 08.11.2001. US A1 2005054570, 10.03.2005. US B1 6267964, 31.07.2001. WO A 2006042151, 20.04.2006. BEETON CHRISTINE ET AL: "Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases" MOLECULAR PHARMACOLOGY, vol. 67, no. 4, April 2005 (2005-04), pages 1369-1381 URL, XP002426710 ISSN: 0026-895X. NORTON R S ET AL: "Potassium channel blockade by the sea anemone toxin ShK for the treatment of multiple sclerosis and other autoimmune diseases" CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY 2004 NETHERLANDS, vol. 11, no. 23, 2004, pages 30413052, XP002426887 ISSN: 0929-8673. CALICETI P ET AL: "Pharmacokinetic and Biodistribution Properties of Poly(ethylene glycol) 2 (19) 1 3 коль, кополімер пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, етилен/малеїнового ангідриду кополімер, поліамінокислоту, декстран nвінілпіролідон, полі n-вінілпіролідон, гомополімер пропіленгліколю, полімер пропіленоксиду, полімер етиленоксиду, поліоксіетильваний поліол, полівініловий спирт, лінійний або розгалужений глікозильований ланцюг, поліацеталь, довголанцюгову жирну кислоту, довголанцюгову гідрофобну аліфатичну групу, Fc домен імуноглобуліну або його частину, СН2 домен Fc, петлю Fc домену, альбумін, альбумінзв'язуючий білок, транстиретин, тироксинзв'язуючий глобулін або ліганд, що має спорідненість до білків плазми з тривалим періодом напіввиведення, вказаний ліганд вибирається з групи, що складається з пептидних лігандів і невеликих молекул лігандів; або комбінації будь-якого з цих компонентів. 4. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що F1 або F2, або обидва включають Fc домен імуноглобуліну IgG або його частину. 5. Композиція за п. 4, яка відрізняється тим, що Fc домен імуноглобуліну людини IgG включає Fc домен ІgG1 людини. 6. Композиція за п. 4, яка відрізняється тим, що Fc домен імуноглобуліну людини IgG включає Fc домен ІgG2 людини. 7. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що F1 і F2 являють собою різні частини молекули, що подовжують час напіввиведення. 8. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що F1 або F2, або обидва включають послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NOs: 2, 4, 70, 72, 74, 76, від 1340 до 1342, 1359, 1360, 1362 та 1363. 9. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що F1 або F2, або обидва включають домен сироваткового альбуміну людини або домен білка транстиретину, або біологічно прийнятний полімер або кополімер. 10. Композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що біологічно прийнятний полімер являє собою поліетиленгліколь (ПЕГ) з молекулярною масою від приблизно 1,000 Да до приблизно 100,000 Да. 11. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що ПЕГ вибирається з групи, яка складається з 5 кД і 20 кД ПЕГ. 12. Композиція за п.1, яка відрізняється тим, що має формулу, вибрану з F1-(L)f-P-(L)g-F2, F1-(L)f-P-(L)g-F2-(L)f-P, F1-F2-(L)f-P, P-(L)g-F1-F2 та P-(L)g-F1-F2-(L)f-P, де F1 являє собою Fc домен IgG людини або HSA, а F2 являє собою ПЕГ, або має формулу, вибрану з F1-(L)f-P-(L)g-F2, F1-(L)f-P-(L)g-F2-(L)f-P, F1-F2-(L)f-P, P-(L)g-F1-F2 та P-(L)g-F1-F2-(L)f-P, де F2 являє собою Fc домен IgG людини або HAS, a F1 являє собою ПЕГ. 94226 4 13. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що, крім того, включає одну або більше ПЕГ-частин молекули, кон'югованих з не-ПЕГ F1 або з не-ПЕГ F2, або з Р, або з будь-якою комбінацією будьякого з них. 14. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що пептидний токсин вставляється в петлю Fc домену ІgG1 людини. 15. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що аналог ShK пептиду включає амінокислотну послідовність, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID NOs: 88, 89, 92, від 148 до 200, від 548 до 561, від 884 до 950 і від 1295 до 1300, як представлено в Таблиці 2. 16. ДНК, що кодує композицію сполуки за п. 1. 17. Вектор експресії, що включає ДНК за п. 16. 18. Клітина-хазяїн, яка включає вектор експресії за п. 17. 19. Клітина-хазяїн за п. 18, яка відрізняється тим, що клітина являє собою еукаріотичну клітину. 20. Клітина-хазяїн за п. 18, яка відрізняється тим, що клітина - це клітина, яка належить ссавцям. 21. Клітина-хазяїн за п. 18, яка відрізняється тим, що клітина являє собою СНО клітину. 22. Клітина-хазяїн за п. 18, яка відрізняється тим, що клітина являє собою прокаріотичну клітину. 23. Клітина-хазяїн за п. 18, яка відрізняється тим, що клітина являє собою клітину Е. соlі. 24. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що, крім того, включає додатковий фармакологічно активний, ковалентно зв'язаний пептид. 25. Композиція за п. 24, яка відрізняється тим, що додатковий пептид зв'язується з F1 або F2 або з Р. 26. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що, крім того, включає пептид-агоніст або пептидантагоніст, у зв'язку з активністю пептидного токсину або "прицільний" пептид. 27. Композиція, яка відрізняється тим, що включає аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NOs: 88, 89, 92, від 148 до 200, від 548 до 561, від 884 до 949 і від 1295 до 1300, як представлено в Таблиці 2, або її фізіологічно прийнятну сіль. 28. Фармацевтична композиція, яка відрізняється тим, що включає композицію за будь-яким з пп. 1 або 27 і фармацевтично прийнятний носій. 29. Застосування композиції у виготовленні ліків для попередження або полегшення рецидиву симптомів множинного склерозу у пацієнта, де композицію вибирають з: композиції за п. 1; та композиції, яка містить аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NOs: 88, 89, 92, від 148 до 200, від 548 до 561, від 884 до 949 і від 1295 до 1300, як представлено в Таблиці 2, або її фізіологічно прийнятну сіль. 30. Застосування композиції у виготовленні ліків для лікування у пацієнта аутоімунного розладу, вибраного з групи, до якої входять множинний (розсіяний) склероз, діабет 1 типу, псоріаз, запальна хвороба кишечнику, контактний дерматит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, астма, алергія, рестеноз, системний склероз, фіброз, склеро 5 94226 6 дерма, гломерулонефрит, синдром Шегрена, запальне розрідження кісток, відторгнення трансплантата, реакція "трансплантат проти хазяїна" або люпус, у терапевтично ефективній кількості, внаслідок чого щонайменше один симптом розладу у пацієнта полегшується, де композицію вибирають з: композиції за п. 1; та композиції, яка містить аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NOs: 88, 89, 92, від 148 до 200, від 548 до 561, від 884 до 949 і від 1295 до 1300, як представлено в Таблиці 2, або її фізіологічно прийнятну сіль. 31. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що будь-яке f або будь-яке g має значення 1, a L яв ляє собою пептид-лінкер, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NOs: 79, 84 і від 637 до 656. 32. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що містить аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 914. 33. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що містить аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 915. 34. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що містить аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 916. 35. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що містить аналог ShK пептиду, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 917. Ця заявка проголошує переваги Попередньої заявки США, серійний номер ще відсутній, поданої 17 квітня 2006, яка проголошує переваги Попередньої заявки за № 60/672,342, поданої 22 квітня 2005, обидві з них включені тут як посилання. Ця заявка включає у вигляді посилань всю суть теми, яка міститься на компакт-диску, що позначений назвою файла, A-1006.ST25.txt, створеного 17 квітня 2006 p., розмір файла становить 744 KB. У цій заявці посилання на публікації наведені у круглих або квадратних дужках. Розкриття цих публікацій у повному обсязі наведено в цій заявці шляхом посилань, для того щоб повніше розкрити стан розробки проблеми, якої цей винахід стосується. Передумови винаходу 1. Галузь винаходу Даний винахід стосується досліджень у галузі біохімії, зокрема, терапевтичних пептидів і кон'югатів. 2. Обговорення споріднених заявок Іонні канали являють собою різноманітну групу молекул, які роблять можливим обмін малих неорганічних іонів через мембрани. Всі клітини потребують наявності іонних каналів для функціонування, але це особливо важливо для збудливих клітин нервової системи і серця. Електричні сигнали, які спрямовуються іонними каналами, контролюють процеси мислення у мозку, биття серця і скорочення м'язів. Іонні канали відіграють важливу роль у регулюванні об'єму клітини, оскільки вони регулюють цілу низку сигнальних процесів. Родина іонних каналів включає Na+, K+, і Са2+ катіонні і Сl- аніонні канали. Загалом, розрізняють ліганд-керовані або потенціал-керовані іонні канали. Ліганд-керовані канали включають як екстрацелюлярні, так і інтрацелюлярні ліганд-керовані канали. Екстрацелюлярні ліганд-керовані канали включають нікотиновий холінергічний рецептор (nAChR), рецептори серотоніну (5гідрокситриптамін, 5-НТ), рецептори гліцину і масляної кислоти (GABA) і глутамат-активовані канали, включаючи рецептори kanate -аміно-3гідрокси-5-метил-4-ізоксазол пропіонової кислоти (АМРА) і N-метил -D-аспартатні рецептори (NMDA) (Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 12934). Інтрацелюлярні ліганд-керовані канали включають канали, що активуються циклічними нуклеотидами (напр. cAMP, cGMP), Са2+ і G-білками (Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34). Потенціал-керовані іонні канали розподіляють на категорії за їх селективністю щодо неорганічних іонів, включаючи натрієвий, калієвий, кальцієвий канали і канал хлорид-іону (Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34). Недавно була представлена уніфікована номенклатура для класифікації потенціал-керованих каналів (Catterall et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55: 573-4; Gutman et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55, 583-6; Catterall et al. (2000) Pharmacol. Rev. 55: 579-81; Catterall et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55: 575-8; Hofmann et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55: 587-9; Clapham et al. (2000), Pharmacol Rev. 55: 591-6; Chandy (1991), Nature 352: 26; Goldin et al. (2000), Neuron 28: 365-8; Ertel et al. (2000), Neuron 25: 533-5). K+ канали представляють найбільшу і найкраще охарактеризовану родину йонних каналів, що описані до цього часу. Калієві канали діляться на три загальні групи: 6 трансмембранних (6ТМ) К+ каналів, 2ТМ-2ТМ/проточних К+ каналів і 2ТМ/Kir канали, які спрямовують калій всередину клітини. (Tang et al. (2004), Ann. Rev. Phvsiol. 66, 131-159). Ці три групи далі підрозділяються на родини, виходячи з подібності послідовності. Потенціалкеровані К+ канали, які включають (Kv1-6, Kv8-9), EAG, KQT, і Slo (ВKСа), є членами родини 6ТМ групи. 2ТМ-2ТМ група включає TWIK, TREK, TASK, TRAAK, і ТНІК, в той час як 2ТМ/Kir група включає Kir1-7. Два додаткові класи йонних каналів включають канал, який спрямовує калій всередину клітини (IRK), і АТР-керований пуринергічний (Р2Х) канал (Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34). Пептидні токсини, які утворюються цілою низкою організмів, еволюціонували для того щоб націлюватись на йонні канали. Змії, скорпіони, павуки, бджоли, слимаки і актинії - лише кілька прикладів організмів, які виробляють отруту, що може слугувати цінним джерелом малих біологічно активних пептидних токсинів або "токсинів", які 7 потужно і селективно впливають на йонні канали і рецептори. У більшості випадків, ці пептидні токсини виникли як потужні антагоністи або інгібітори йонних каналів, шляхом зв'язування з отвором каналу і фізичного блокування шляху йонної провідності. У деяких інших випадках, як у випадку з пептидними токсинами тарантула, було встановлено, що пептид протидіє функції каналу за рахунок зв'язування з ділянкою, що знаходиться із зовнішнього боку отвору (напр., потенціалчутливий домен). Пептидні токсини, як правило, мають у довжину від 20 до 80 амінокислот, включають 2-5 дисульфідних зв'язків і утворюють дуже компактну структуру (див., напр., Фігуру 10). Були виділені і детально досліджені пептидні токсини (напр., виділені з отрути скорпіонів, актиній і раковин морських молюсків) щодо їх здатності впливати на йонні канали. Такі пептиди, очевидно, еволюціонували із відносно невеликої кількості основних структурних елементів, що є особливо важливим для підтримання біологічної активності і стійкості. Більшість пептидних токсинів скорпіона і морського молюска з роду Conus, наприклад, утворені 10-40 амінокислотами і з дисульфідними зв'язками, кількість яких може сягати п'яти, утворюють надзвичайно компактні, з обмеженою кількістю варіантів структури (мікропротеїни), які часто є стійкими до протеолізу. Конотоксин і пептидні токсини скорпіона можуть бути розділені на низку надродин, виходячи з наявності дисульфідних зв'язків і конформації пептида. Структура розчину багатьох з них була визначена за допомогою ядерної магнітно-резонансної спектроскопії, внаслідок чого було встановлено їх компактну структуру і підтверджено збереження їх нативної конформації (E.g., Tudor et аl., Ionisation behaviour and solution properties of the potassiumchannel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251 (12): 133-41 (1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999); Jaravine et al., Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. 36(6): 1223-32 (1997); del RioPortillo et al.; NMR solution structure of Cn12, a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxin sequence but with alphalike physiological activity, Eur. J. Biochem. 271(12): 2504-16 (2004); Prochnicka-Chalufour et al., Solution structure of discrepin, a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KT15 subfamily, Biochem. 45(6): 1795-1804 (2006)). Консервативні дисульфідні структури також можуть відображати індивідуальну фармакологічну активність родини токсинів (Nicke et al. (2004), Eur. J. Biochem. 271: 2305-19, Table 1; Adams (1999), Drug Develop. Res.46: 219-34). Наприклад, -конотоксини мають чітко виражені структури у формі петлі, які включають чотири залишки цистеїну/дві дисульфідні групи (Loughnan, 2004) і інгібують нікотинові ацетилхолінові рецептори. І, навпаки, ω-конотоксини мають структури у формі петлі, які включають шість цистеїнових залишків/три дисульфідні групи (Nielsen, 2000), і блокують кальцієві канали. Еволюція структурних наборів токсинів 94226 8 відбувалась для того, щоб інгібувати потенціалкеровані або кальцій-керовані калієві канали. Фігура 9 свідчить про те, що обмежене число консервативних дисульфідних конструкцій, які є притаманними для цілої низки отруйних тварин, - від бджіл до молюсків, від скорпіонів до змій, спрямовані на йонні канали. На Фігурі Α-B представлено амінокислотне вирівнювання токсину з родини альфа-скорпіону і показано, що консервативний структурний каркас використовується для похідних токсинів, які спрямовані на величезну групу калієвих каналів. Завдяки потужній і селективній здатності блокувати специфічні йонні канали, пептидні токсини протягом багатьох років використовуються як потужний інструмент для дослідження фармакології йонних каналів. Крім збудливих клітин і тканин, що представлені у серці, м'язах і мозку, йонні канали є також важливими для функціонування незбудливих клітин, якими є імунні клітини. Відповідно, розглядається можливість терапевтичного застосування пептидних токсинів для лікування різноманітних імунних розладів, зокрема, шляхом інгібування калієвих каналів, таких як Kv1.3 і ІKСа1, оскільки ці канали опосередковано контролюють кальцієву сигналізацію у лімфоцитах, [напр., Kern et al., ShK toxin compositions and methods of use, US Patent No. 6,077,680; Lebrun et al., Neuropeptides originating in scorpion, US Patent No. 6,689,749; Beeton et al., Targeting effector memory Τ cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channnels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005); Mouhat et al., K+ channel types targeted by synthetic OSK1, a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. J. 385:95-104 (2005); Mouhat et al., Pharmacological profiling of Orthochirus scrobiculosus toxin 1 analogs with a trimmed N-terminal domain, Molec. Pharmacol. 69:354- 62 (2006); Mouhat et al., OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2; B.S. Jensen et al. 2+ + The Ca -activated K Channel of Intermediate Conductance: A Molecular Target for Novel Treatments?, Current Drug Targets 2:401-422 (2001); Rauer et al., Structure-guided Transformation of Charybdotoxin Yields an Analog That Selectively Targets Ca2+activated over Потенціал-керований K+ Канали, J. Biol. Chem. 275: 1201-1208 (2000); Castle et al., Maurotoxin: A Potent Inhibitor of Intermediate Conductance Ca2+-Activated Potassium Канали, Molecular Pharmacol. 63: 409-418 (2003); Chandy et al., K+ канали as targets for specific Immunomodulation, Trends in Pharmacol. Sciences 25: 280-289 (2004); Lewis & Garcia, Therapeutic Potential of Venom Peptides, Nat. Rev. Drug Discov. 2: 790-802 (2003)]. Низькомолекулярні сполуки, які інгібують Kv1.3 і ІKСа1 калієві канали і канал, через який кальцій потрапляє в Т-клітини, CRAC, також були розроблені для лікування імунних розладів [А. Schmitz et al. (2005) Molecul. Pharmacol. 68, 1254; K.G. Chandy et al. (2004) TIPS 25, 280; H. Wulff et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 32040; С. Zitt et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 12427], однак отримання малих молекул з селективною здатністю щодо цих мішеней пов'язане з труднощами. 9 Відомо, що мобілізація кальцію у лімфоцити має критичне значення при активації запальних реакцій [M.W. Winslow et al. (2003) Current Opinion Immunol. 15, 299]. У порівнянні з іншими клітинами, Т-клітини виявляють виняткову чутливість до підвищених рівнів внутрішньоклітинного кальцію, а йонні канали як прямо, так і опосередковано контролюють цей процес. Інозитол трифосфат (ІРЗ) ще один природний посередник, який активує кальцієвий сигнальний шлях. ІРЗ продукується після ліганд-індукованої активації Т-клітинного рецептора (TCR) і, зв'язуючись з їх інтрацелюлярним рецептором (каналом), обумовлює вивільнення внутрішньоклітинних запасів кальцію. Ендоплазматичний ретикулюм є основним депо кальцію. Тапсигаргін, інгібітор Са2+АТФ-ази ендоплазматичного(саркоплазматичного) ретикулюму (SERCA), також зумовлює вивільнення інтрацелюлярних запасів і активацію кальцієвої сигналізації в лімфоцитах. Відповідно, тапсигаргін може бути використаний як специфічний стимулятор кальцієвої сигналізації в Т-клітинах. Відомо, що вивільнення внутрішньоклітинних запасів кальцію в Тклітинах призводить до активації кальцієвого каналу на поверхні клітини, внаслідок чого відбувається надходження кальцію ззовні клітини. Цей депо-керований кальцієвий канал (store operated calcium channel - SOCC) на Т-клітинах називається "CRAC" (канал кальцій-індукованого викиду Са2+), і відомо, що постійне надходження кальцію через цей канал є надзвичайно важливим для повної активації Т-клітин [S. Feske et al. (2005) J. Exp. Med. 202, 651 and N. Venkatesh et al. (2004) PNAS 101, 8969]. Було з'ясовано, що для того щоб підтримувати постійне надходження кальцію до Тклітин, клітинна мембрана має залишатись у гіперполяризованому стані завдяки відтоку йонів калію. В Т-клітинах, викид калію здійснюється через потенціал-залежний калієвий канал Kv1.3 і кальцій-індукований калієвий канал ІKСа1 [K.G. Chandy et al. (2004) TIPS 25, 280]. Відповідно, ці калієві канали опосередковано контролюють кальцієву сигналізацію, що передбачає обов'язковий викид калію, який забезпечує неперервне надходження кальцію через канал кальцій-індукованого викиду Ca2+(CRAC). Стійке зростання вмісту інтрацелюлярного кальцію активує цілу низку провідних шляхів в Тклітинах, включаючи ті, що призводять до активації NFAT, NF-kB і АР-1 [Quintana-A (2005) Pflugers Arch. - Eur. J. Physiol. 450, 1]. Це призводить до різноманітних реакцій Т-клітини, включаючи зміну розміру клітини і мембранної організації, активації ефекторних молекул на поверхні клітини, продукування цитокінів і проліферації. Кілька кальційчутливих молекул передають кальцієвий сигнал і обумовлюють клітинну відповідь. Кальмодулін є однією з молекул, що зв'язуються з кальцієм, однак було ідентифіковано й багато інших молекул (M.J. Berridge et al. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4,517). Кальцій-кальмодулін залежна фосфатаза кальциневрин активується при стійкому зростанні вмісту інтрацелюлярного кальцію і дефосфорилює цитозольну NFAT. Дефосфорильована NFAT швидко транслокується у ядро і широко приймається 94226 10 як критичний фактор транскрипції для активації Тклітини (F. Масіаn (2005) Nat. Rev. Immunol. 5, 472 and N. Venkatesh et al. (2004) PNAS 101, 8969). Інгібітори кальциневрину, такі як циклоспорин А (Неорал, Сандімун) і FK506 (Такролім), є основними засобами для лікування тяжких імунних розладів, що призводять до відторгнення після трансплантації твердих органів (І.М. Gonzalez-Pinto et al. (2005) Transplant. Proc. 37, 1713 and D.R.J. Kuypers (2005) Transplant International 18, 140). Неорал був апробований для лікування відторгнення трансплантатів, тяжкого ревматоїдного артириту (D.E. Yocum et al. (2000) Rheumatol. 39, 156) і тяжкого псоріазу (J. Коо (1998) British J. Dermatol. 139, 88). Доклінічні і клінічні дані свідчать про можливість використання інгібіторів кальциневрину для лікування запальних захворювань кишечника (IBD; Baumgart DC (2006) Am. J. Gastroenterol. Mar 30; Epub ahead of print), розсіяного склерозу (Ann. Neurol. (1990) 27, 591) і астми (S. Rohatagi et al. (2000) J. Clin. Pharmacol. 40, 1211). Вовчак (люпус) є ще одним прикладом розладу, який можна лікувати за допомогою засобів, що блокують активацію Т-клітин-хелперів. Незважаючи на важливу роль кальциневрину у регулюванні NFAT і Тклітинах, кальциневрин також експресується в інших тканинах (напр., нирках) і циклоспорин А & FK506 може мати обмежене застосування у зв'язку з токсичністю. Ниркова токсичність і гіпертензія є основними побічними ефектами, які обмежують застосування циклоспорину А & FK506. У зв'язку з обмеженнями, пов'язаними з токсичністю, інгібітори кальциневрину застосовуються, головним чином, для лікування тяжких імунних захворювань (Bissonnette-R et al. (2006) J. Am. Acad. Dermatol. 54, 472). Інгібітори Kv1.3 є безпечною альтернативою застосуванню інгібіторів кальциневрину для лікування імунних розладів. Це можливе, тому що Kv1.3 також контролює кальцієву сигналізацію в Тклітинах, але механізм цієї дії інший, ніж у інгібіторів кальциневрину, і дані щодо експресії і функції Κν1.3 свідчить, що Κν1.3 має більш обмежену роль в біології Τ клітини у порівнянні з кальциневрином, який функціонує у цілій низці нелімфоїдних клітин і тканин. Мобілізація кальцію в імунні клітини активує також утворення цитокинів інтерлейкіну 2 (IL-2) і гама-інтерферону (IFNg), які є важливими медіаторами запальних процесів. IL-2 індукує різноманітні біологічні реакції, від розвитку і диференціації CD4+ і CD8+ Т-клітин, до посилення проліферації і секреції антитіла B-клітинами, до активізації NKклітин [S.L. Gaffen & K.D. Liu (2004) Cytokine 28, 109]. Секреція IL-2 наступає відразу після активації Т-клітини, і Т-клітини являють собою основне джерело цитокіну. Одразу ж після активації, рецептори, що мають високу афінність до IL-2 (IL2-R), надрегулюються на Т-клітинах, що надає їм здатності до проліферації у відповідь на IL-2. Т-клітини, NK-клітини, B-клітини і професійні антигенпредставляючі клітини (APCs) у активованому стані можуть секретувати IFNg. Т-клітини є основним джерелом утворення IFNg у проміжних адаптивних імунних реакціях, тоді як природні клітини-кілери (NK) & APCs, очевидно, є важливим джерелом у 11 захисті хазяїна проти інфекції [К. Schroder et al. (2004) J. Leukoc. Biol. 75, 163]. IFNg, який спочатку називали фактором активації факрофагів, надрегулює процесинг і презентацію антигена моноцитами, макрофагами і дендритними клітини. IFNg є посередником великої сукупності різноманітних типів біологічної активності в багатьох типах клітин [U. Boehm et al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 749], включаючи ріст і диференціацію, посилення активності природних клітин-кілерів і регуляцію продукування імуноглобуліну в B-клітинах і "перемикання" класу антитіл. CD40L є ще одним цитокіном, який експресується на активованих Т-клітинах у відповідь на мобілізацію кальцію і до зв'язування з його рецептором на B-клітинах бере активну участь в утворенні зародкового центру B-клітин, диференціації В клітин і «перемиканні» ізотипу антитіла. CD40Lопосередкована активація CD40 на В клітинах може індукувати глибоку диференціацію і клональну експансію B-клітин, що продукують імуноглобулін (lg) [S. Quezada et al. (2004) Annu. Rev. Immunol. 22, 307]. Рецептор CD40 може також знаходитись на дендроцитах і CD40L сигналізація може опосередковувати активацію і диференціацію дендроцитів. Антигенпрезентуюча здатність B-клітин і дендроцитів забезпечується зв'язуванням CD40L, що свідчить про важливу роль цього цитокіну у розвитку штучного (набутого) імунітету. Беручи до уваги важливу роль CD40 сигналізації в біології Bклітини, нейтралізуючі антитіла до CD40L вивчали у доклінічних і клінічних дослідженнях щодо можливості використання у лікуванні системного червоного вовчака (СЧВ), - розладу, який характеризується відкладанням комплексів антитіла у тканинах, запаленням або ураженням органу [J. Yazdany and J Davis (2004) Lupus 13, 377]. Вироблення пептидних токсинів є складним процесом, який відбувається у отруйних організмів, а відтворення цього процесу синтетичним способом є ще складнішим. Через наявність консервативних дисульфідних структур і необхідність ефективного окиснювального фолдингу - «упаковки», актуальним є синтез пептидних токсинів. Незважаючи на те, що пептидні токсини протягом багатьох років використовуються як селективні фармакологічні інгібітори йонних каналів, висока вартість синтезу і укладки (упаковки) пептидних токсинів і короткий час напіврозпаду in vivo стримують застосування цих пептидів з терапевтичною метою. Значно більше зусиль було спрямовано на ідентифікацію невеликих молекул інгібіторів як терапевтичних антагоністів йонних каналів, у порівнянні з власне пептидними токсинами. Одним з винятків є нещодавнє впровадження невеликого MVIIA пептиду ω-конотоксину (Зиконотид™) для лікування болю, що не піддається блокуванню. Однак, синтетичний процес отримання і укладки Зиконотиду™, є дорогим і призводить до отримання продукту, що має дуже короткий час напівжиття in vivo (приблизно, 4 години). Рентабельний процес для виготовлення терапевтичних засобів, які не обмежуються лише інгібіторами йонних каналів, забезпечується даним 94226 12 винаходом, який включає гібридні пептидні токсини, або у інший спосіб кон'юговані з носієм. Стислий опис винаходу Даний винахід пов'язаний з композицією речо1 1 2 2 3 вини за формулою: (X )a-(F )d-(X )b-(F )e-(Х )с (І) і її 1 2 мультимерами, де: F і F є частини молекули, що збільшують період напіввиведення, a d і e кожен незалежно має значення 0 або 1, за умови, що, принаймні, одне d і e становить 1; X1, X2, і X3 кожен незалежно є -(L)f-P-(L-)g-, a f і g кожен незалежно є 0 або 1; Ρ являє собою пептидний токсин, що складається не більше, ніж з, приблизно, 80 амінокислотних залишків у довжину, і включає, щонайменше, два міжпептидні дисульфідні зв'язки; L являє собою необов'язковий лінкер (присутній, якщо f=1 і/або g =1); та а, b, і с, кожен незалежно має значення 0 або 1, за умови, що, принаймні, одне з a, b і с має значення 1. Таким чином, цей винахід стосується молекул, які мають різні варіанти Формули 1, такі як формули: (II) P-(L)g-F1 (тобто, b, с, і e дорівнюють 0); (III) F1-(L)f-P (тобто, а, с, і e дорівнюють 0); (IV) P-(L)g-F1-(L)f-P або (X1)a-F1-(X2)b (тобто, с і e дорівнюють 0); (V) F1-(L)f-(L)g-F2 (тобто, а і с дорівнюють 0); (VI) F1-(L)f-(L)g-F2-(L)f-P (тобто, а дорівнює 0); (VII) F1-F2-(L)f-P (тобто, а і b дорівнюють 0); (VIII) P-(L)g-F1-F2 (тобто, b і с дорівнюють 0); (IX) P-(L)g-F1-F2-(L)f-P (тобто, b дорівнює 0); І будь-які мультимери будь-якої з них, якщо традиційно рахувати з N-термінального кінця пептиду (ів) зліва. Всі такі молекули за Формулами llIX знаходяться в межах значення структурної Формули І. В межах значення Формули І, пептидний токсин (Р), якщо більше, ніж один має місце, може незалежно бути той же або інший, ніж будь-який інший пептидний токсин (и), також присутній в композиції винаходу, і лінкерна частина ((L)f і/або (L)g), якщо має місце, може незалежно бути та ж або інша, ніж будь-який інший лінкер, або лінкери, що можуть бути присутні в композиції винаходу. Кон'югація пептидного токсину (нів) з компонентом, що подовжує період напіврозпаду, або з компонентами, може здійснюватись через Nтермінальну і/або С-термінальну частину пептидного токсину, або може бути «вставлена» в її первинну амінокислотну послідовність, F1 зв'язується ближче з N-термінальною частиною пептидного токсину, ніж F2. Приклади компонентів молекули, що подовжують час напіввиведення (F1 або F2), включають Fc домен імуноглобуліну, альбумін сироватки людини (HSA), або полі(етиленгліколь) (ПЕГ). Ці та інші складові молекули, які подовжують період напіввиведення, що тут описуються, застосовуються окремо або у комбінації. Цей винахід пов'язаний також з композицією винаходу, яка включає, у кон'югованому або некон'югованому вигляді, аналог пептидного токсину ShK, OSK1, ChTx, або Мауротоксин, модифікований з природних послідовностей за одним або більше амінокислотним залишком, який має вищу активність антагоніста щодо Kv1.3 або ІKСа1, і/або селективність щодо мішені у порівнянні з ShK, OSK1, або пептид Мауротоксин (МТХ), що має 13 природну послідовність. Аналоги пептидного токсину включають амінокислотні послідовності, обрані з будь-якої з наступних послідовностей: SEQ ID NOS: 88, 89, 92, від 148 до 200, від 548 до 561, від 884 до 949, або від 1295 до 1300, як наведено в Таблиці 2; або SEQ ID NOS: від 980 до 1274, 1303, або 1308, як наведено в Таблиці 7; або SEQ ID NOS: від 330 до 337, 341, 1301, 1302, від 1304 до 1307, 1309, 1311, 1312, і від 1315 до 1336, як наведено в Таблиці 13; або SEQ ID NOS: 36, 59, 344-346, або від 1369 до 1390, як наведено в Таблиці 14. Цей винахід пов'язаний також з іншими аналогами пептидного токсину, які включають амінокислотну послідовність, обрану з будь-якої з наступних: SEQ ID NOS: від 201 до 225, як наведено в Таблиці 3; або SEQ ID NOS: від 242 до 248 або від 250 до 260, як наведено в Таблиці 4; або SEQ ID NOS: від 261 до 275, як наведено в Таблиці 5; або SEQ ID NOS: від 276 до 293, як наведено в Таблиці 6; або SEQ ID NOS: від 299 до 315, як наведено в Таблиці 8; або SEQ ID NOS: від 316 до 318, як наведено в Таблиці 9; або SEQ ID NO: від 319, як наведено в Таблиці 10; або SEQ ID NO: 327 або 328, як наведено в Таблиці 11; або SEQ ID NOS: від 330 до 337, 341, 1301, 1302, 1304 до 1307, 1309, 1311, 1312, або від 1315 до 1336, як наведено в Таблиці 13; SEQ ID NOS: від 1369 до 1390, як наведено в Таблиці 14; або SEQ ID NOS: від 348 до 353, як наведено в Таблиці 16; або SEQ ID NOS: від 357 до 362, від 364 до 368, 370, від 372 до 385, або від 387 до 398, як наведено в Таблиці 19; або SEQ ID NOS: від 399 до 408, як наведено в Таблиці 20; або SEQ ID NOS: від 410 до 421, як наведено в Таблиці 22; або SEQ ID NOS: 422, 424, 426, або 428, як наведено в Таблиці 23; або SEQ ID NOS: від 430 до 437, як наведено в Таблиці 24; або SEQ ID NOS: від 438 до 445, як наведено в Таблиці 25; або SEQ ID NOS: 447, 449, 451, 453, 455 або 457, як наведено в Таблиці 26; або SEQ ID NOS: від 470 до 482 або від 484 до 493, як наведено в Таблиці 28; або SEQ ID NOS: від 495 до 506, як наведено в Таблиці 29; або SEQ ID NOS: від 507 до 518, як наведено в Таблиці 30. Цей винахід також спрямований на фармацевтичну композицію, яка включає композицію винаходу речовини і фармацевтично прийнятного носія. 94226 14 Композиція цього винаходу може бути приготовлена за допомогою способів синтезу, методик рекомбінантних ДНК, або за допомогою будь-яких інших методів приготування пептидів і гібридних білків, які є загальновідомими. Композиція цього винаходу, яка має не пептидну частину, може бути синтезована за допомогою традиційних реакцій органічної хімії, в доповнення до традиційних реакцій хімії пептидів, якщо вони є прийнятними. Первинне застосування передбачалось як терапевтичних і/або профілактичних засобів. Композиція винаходу, яка включає пептидний токсин, може мати активність і/або селективність щодо йонного каналу-мішені, яку можна порівняти або яка навіть більша, ніж активність некон'югованого пептиду. Відповідно, цей винахід включає спосіб лікування аутоімунних розладів, який полягає у введенні пацієнту, у якого було діагностовано аутоімунний розлад, такий як множинний (розсіяний) склероз, діабет І типу, псоріаз, запальна хвороба кишечника, контактний дерматит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, астма, алергія, рестеноз, системний склероз, фіброз, склеродерма, гломерулонефрит, синдром Шегрена, запальне розрідження кісток, відторгнення трансплантату, реакція «трансплантат проти хазяїна» або люпус, терапевтично ефективної кількості композиції сполуки винаходу (яка переважно, включає Kv1.3 антагоніст-пептид або ІKСа1 антагоніст-пептид), внаслідок чого, щонайменше, один симптом розладу у пацієнта полегшується. Крім того, цей винахід спрямований на спосіб попередження або полегшення рецидиву симптомів множинного склерозу, який включає введення пацієнтові, у якого раніше відмічався, принаймні, один симптом множинного склерозу, профілактично ефективної кількості сполуки винаходу (яка, переважно, включає пептид-антагоніст Kv1.3 або пептид-антагоніст ІKСа1), внаслідок чого попереджується рецидив, щонайменше, одного симптому множинного склерозу або полегшується його прояв. Не зважаючи на те, що сполуки винаходу передбачались, головним чином, як терапевтичні засоби, композиція цього винаходу також може бути використана для скринінгу терапевтичних чи діагностичних засобів. Наприклад, Fc-пептид можна використовувати у аналізах, що основані на застосуванні мікропланшетів для титрування, покритих анти-Fc. Частини молекули, які продовжують період напіврозпаду, такі як Fc, можуть робити нерозчинні пептиди розчинними і, таким чином, знаходять застосування у цілій низці досліджень. Численні додаткові аспекти і переваги цього винаходу стануть очевидними при розгляді фігур і докладному описі винаходу. Короткий опис фігур Фігура 1 схематично зображує структуру деяких типових Fc димерів, які можуть бути похідними від антитіла lgG1. "Fc" на Фігурі представляє будь-який з варіантів Fc в межах значення "Fc домен", що тут використовується. "Х1 і "Х2" представляють пептиди або комбінації лінкер-пептид, як 15 буде далі визначено. Конкретні димери наведено нижче: Фігура 1А і Фігура 1D: димери з простим (ординарним) дисульфідним зв'язком; Фігура 1В і Фігура 1Е: димери з подвійним дисульфідним зв'язком; Фігура 1С і Фігура 1F: нековалентні димери. Фігура 2 схематично зображує структуру деяких втілень композиції винаходу, що являє собою окрему одиницю фармакологічно активного пептидного токсину. Фігура 2А зображує одноланцюгову молекулу і може також представляти ДНК-конструкцію для молекули. Фігура 2В зображує димер, в якому частина лінкер-пептид представлена лише на одному ланцюзі димера. Фігура 2С зображує димер, що має пептидну частину на обох ланцюгах. Димер на Фігурі 2С утворюється спонтанно в певних типах клітинхазяїнів після експресії ДНК-конструкції, що кодує єдиний ланцюг, показаний на Фігурі 2А. В інших клітинах-хазяїнах, клітини можна помістити в умови, сприятливі для утворення димерів або димери можуть утворюватись in vitro. Фігура Α-B зображує типові нуклеотидні і амінокислотні послідовності (SEQ ID NOS: 1 і 2, відповідно) Fc імуноглобуліну людини lgG1, який оптимізується для експресії в клітинах ссавців, і може бути використаний у цьому винаході. Фігура Α-B зображує типові нуклеотидні і амінокислотні послідовності (SEQ ID NOS: 3 і 4, відповідно) Fc імуноглобуліну людини lgG1, який оптимізується для експресії в бактеріальних клітинах, і може бути використаний у цьому винаході. Фігура 5А зображує амінокислотну послідовність зрілого ShK пептиду (SEQ ID NO: 5), який може бути закодований послідовністю нуклеїнової кислоти, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в клітинах ссавців, бактерій або дріжджів. Фігура 5В зображує три дисульфідні зв'язки (—S—S—), утворені шістьма цистеїновими залишками всередині ShK пептиду (SEQ ID NO: 10). Фігура 6 зображує амінокислотне вирівнювання інгібітора потенціал-залежного калієвого каналу Stichodactyla helianthus (ShK) з іншими близькоспорідненими представниками родини токсинів актиній. Послідовність з 35 амінокислот повного токсину ShK (Accession #P29187), ізольованого з отрути Stichodactyla helianthus, порівнюється з іншими близькоспорідненими представниками родини токсинів актиній. Показані консенсусна послідовність і передбачувані дисульфідні зв'язки; висококонсервативні залишки затушовані. Представлена послідовність пептидного токсину HmK (Swiss-Protein Accession #097436) являє собою "недозрілий" попередник з актиній (Radianthus magnifica; Heteractis magnifica), передбачуваний сигнальний пептид підкреслений. Можна було б передбачити, що повний пептидний токсин HmK матиме 35 амінокислотних залишків у довжину з розмахом залишків від 40 до 74. АеK являє собою "зрілий" пептидний токсин, виділений з отрути актинії Actinia equine (Accession #P81897). Послідов 94226 16 ність повного пептидного токсину AsKS (Accession #Q9TWG1) і BgK (Accession #P29186), виділених з отрути актинії Anemonia sulcata і Bunodosoma qranulifera, відповідно, також представлені. Фігура 6А зображує амінокислотне вирівнювання (SEQ ID NO: 10) ShK з іншими представниками родини токсинів актиній, HmK (SEQ ID NO: 6 (повний пептид), (SEQ ID NO: 542, частини сигнального і повного пептиду)), АеK (SEQ ID NO: 7), AsKs (SEQ ID NO: 8), і BgK (SEQ ID NO: 9). Показані передбачувані дисульфідні зв'язки, консервативні залишки виділені (HmK, SEQ ID NO: 543; ShK, SEQ ID NO: 10; AeK, SEQ ID NO: 544; AsKS, SEQ ID NO: 545). Фігура 6В зображує карту дисульфідних зв'язків для цієї родини, яка має три дисульфідні зв'язки (С1С6, С2-С4, С3-С5). Фігура 7 зображує амінокислотне вирівнювання токсину з родини альфа-скорпіона інгібіторів калієвого каналу (BmKK1, SEQ ID NO: 11; BmKK4, SEQ ID NO: 12; PBTx1, SEQ ID NO: 14; Tc32, SEQ ID NO: 13; BmKK6, SEQ ID NO: 15; P01, SEQ ID NO: 16; Рi2, SEQ ID NO: 17; Рi3, SEQ ID NO: 18; Рi4, SEQ ID NO: 19; MTX, SEQ ID NO: 20; Pi1, SEQ ID NO: 21; HsTxi, SEQ ID NO: 61; AgTx2, SEQ ID NO: 23; KTX1, SEQ ID NO: 24; OSK1, SEQ ID NO: 25; BmKTX, SEQ ID NO: 22; HgTX1, SEQ ID NO: 27; MgTx, SEQ ID NO: 28; C11Tx1, SEQ ID NO: 29; NTX, SEQ ID NO: 30; Тс30, SEQ ID NO: 31; TsTXKa, SEQ ID NO: 32; РВТхЗ, SEQ ID NO: 33; Lqh 151, SEQ ID NO: 34; MartenTx, SEQ ID NO: 37; ChTx, SEQ ID NO:36; ChTx-Lq2, SEQ ID NO: 42; IbTx, SEQ ID NO: 38; SloTx, SEQ ID NO: 39; BmTx1; SEQ ID NO: 43; BuTx, SEQ ID NO: 41; АmmТх3, SEQ ID NO: 44; AaTX1, SEQ ID NO: 45; ВmТХ3, SEQ ID NO: 46; Tc1, SEQ ID NO: 48; OSK2, SEQ ID NO: 49; TsK, SEQ ID NO: 54; CoTx1, SEQ ID NO:55; CoTx2, SEQ ID NO: 871; BmPo5, SEQ ID NO: 60; ScyTx, SEQ ID NO: 51; P05, SEQ ID NO: 52; Тамапін, SEQ ID NO: 53; і TmTx, SEQ ID NO: 691. Висококонсервативні залишки затушовані, консенсусна послідовність обведена лінією. Підродини -KТх обведені і запозичені з Rodriguez de la Vega, R.C. et al. (2003) TIPS 24: 222-227. Перелік деяких йонних каналів, що, як повідомляли, можуть бути антагоністами, наведено (ІK = ІKСа, ВK=ВKСа, SK=SKCa, Kv=потенціал-індуковані К+ канали). Хоча більшість членів родини у цьому вирівнюванні представляють повний пептидний продукт, деякі представляють неповні або модифіковані форми пептиду і включають: BmKK1, BmKK4, BmKK6, BmKТХ, MartenTx, ChTx, ChTx-Lq2, BmTx1, АаТх1, ВmТХ3, TsK, СоТх1, BmP05. Фігура 8 зображує вирівнювання пептидних токсинів, які були перетворені на пептитіла цього винаходу (Апамін, SEQ ID NO: 68; НаТх1, SEQ ID NO: 494; ProTx1, SEQ ID NO: 56; PaTx2, SEQ ID NO: 57; ShK[2-35], SEQ ID NO: 92; ShK[1-35], SEQ ID NO: 5; HmK, SEQ ID NO: 6; ChTx (K32E), SEQ ID NO: 59; ChTx, SEQ ID NO: 36; IbTx, SEQ ID NO: 38; OSK1 (E16K, K20D), SEQ ID NO: 296; OSK1, SEQ ID NO: 25; AgTx2, SEQ ID NO: 23; KTX1, SEQ ID NO: 24; MgTx, SEQ ID NO: 28; NTX, SEQ ID NO: 30; MTX, SEQ ID NO: 20; Рi2, SEQ ID NO: 17; HsTx1, SEQ ID NO: 61; Ануроктоксин [AnTx], SEQ ID NO: 62; BeKm1, SEQ ID NO: 63; ScyTx, SEQ ID NO: 51; 17 ωGVIA, SEQ ID NO: 64; ωMVIIa, SEQ ID NO: 65; Ptu1, SEQ ID NO: 66; і CTX, SEQ ID NO: 67). Вказані оригінальні джерела цих токсинів, а також кількість цистеїнових залишків у кожному. Наведено перелік основних йонних каналів-"мішеней". Вирівнювання показує, що пептидні токсини утворюють кластери, грунтуючись на їх походженні і впливі на йонний канал-мішень. Фігура 9 зображує вирівнювання дисульфідних груп в межах родини токсину. Число дисульфідних груп і порядок дисульфідних зв'язків визначається для кожної родини. Представлений частковий перелік токсинів, які потрапляють до кожної категорії дисульфідного зв'язку. Фігура 10 демонструє, що розчини токсинів виявляють компактну структуру. Структурні розчини природних токсинів актинії (ShK), скорпіона (MgTx, MTX, HsTx1), морського конуса (wGVIA) і тарантула (НаТх1) свідчать, що всі пептиди, які складаються з від 28 до 39 амінокислот, утворюють компактну структуру. Наведені токсини мають 3 або 4 дисульфідні зв'язки і потрапляють до 4 з 6 підродин, показаних на Фігурі 9. Структури розчинів природних токсинів з актинії (ShK), скорпіона (MgTx, MTX, HsTx1), морського конуса (wGVIA) і тарантула (НаТх1) були отримані з Protein Data Bank (PDB), номер доступу 1ROO (mmdbld:5247), 1MTX (mmdbld:4064), 1TXM (mmdbld:6201), 1QUZ (mmdbld:36904), 1OMZ (mmdbld:1816) і 1D1H (mmdbld: 14344), за допомогою бази даних MMDB Entrez 3D-structure [J. Chen et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 474] і оглядача. Фігура 11А-С зображує нуклеїнову кислоту (SEQ ID NO: 69 і SEQ ID NO: 1358) і закодовані амінокислотні (SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:1359 і SEQ ID NO: 1360) послідовності залишків 51316660 pAMG21ampR-Fc-pep. Послідовності Fc домену (SEQ ID NOS: 71 і 72) виключають п'ять Стермінальних залишків гліцину. Цей вектор робить можливим утворення пептитіл, в яких частина пептид-лінкер знаходиться в С-термінусі Fc домена. Фігура 11D зображує кругову діаграму вектора бактеріальної експресії пептитіла pAMG21ampRFc-pep, який має ген хлорамфеніколацетилтрансферази (cat; сайт "CmR"), який заміщується пептидною лінкерною послідовністю. Фігура 12А-С зображує нуклеотидні послідовності (SEQ ID NO: 73 і SEQ ID NO: 1361) і послідовності закодованої амінокислоти (SEQ ID NO:74, SEQ ID NO: 1362 і SEQ ID NO: 1363), утворені залишками 5131-6319 pAMG21ampR-Pep-Fc. Послідовності Fc домену (SEQ ID NOS: 75 і 76) виключають п'ять N-термінальних залишків гліцину. Цей вектор робить можливим утворення пептитіл, в яких частина пептид-лінкер знаходиться у Nтермінусі Fc домену. Фігура 12D зображує кругову діаграму вектора бактеріальної експресії пептитіла, що має сайт резистентності до зеоцину (ble; "ZeoR"), який заміщується пептидною лінкерною послідовністю. Фігура 12E-F зображує нуклеїнову кислоту (SEQ ID NO:1339) і закодовану амінокислотну послідовність pAMG21ampR-Pep-Fc (SEQ ID NO:1340, SEQ ID NO: 1341, і SEQ ID NO:1342). Послідовності Fc домену (SEQ ID NOS: 75 і 76) виключають 94226 18 п'ять N-термінальних залишків гліцину. Цей вектор запускає утворення пептитіл, в яких частина пептид-лінкер знаходиться в N-термінусі Fc домену. Фігура 13А являє собою кругову діаграму вектора експресії у ссавців pCDNA3.1(+) CMVi. Фігура 13В являє собою кругову діаграму вектора експресії у ссавців pCДHК3.1(+)CMVi-Fc2G4S-Activin Rllb, який включає Fc область з імуноглобуліну lgG1 людини, лінкер, утворений 10 амінокислотними залишками, і активін ген Rllb. Фігура 13С являє собою кругову діаграму СНО вектора експресії pDSRa22, який включає кодуючу послідовність Fc-L10-ShK[2-35]. Фігура 14 зображує нуклеотидну і закодовану амінокислотну послідовності (SEQ. ID. NOS: 77 і 78, відповідно) молекули, ідентифікованої далі як "Fc-L10-ShK[1-35]" в Прикладі 1. Амінокислотна послідовність лінкера L10 (SEQ ID NO: 79) підкреслена. Фігура 15 зображує нуклеотидну і закодовану амінокислотну послідовності (SEQ. ID. NOS: 80 і 81, відповідно) молекули, ідентифікованої далі як "Fc-L10-ShK[2-35]" в Прикладі 2. Лінкерна послідовність L10 (SEQ ID NO: 79), що використовується в Fc-L10-ShK[1-35] (Фігура 14), підкреслена. Фігура 16 зображує нуклеотидну і закодовану амінокислотну послідовності (SEQ. ID. NOS: 82 і 83, відповідно) молекули, ідентифікованої далі як "Fc-L25-ShK[2-35]" в Прикладі 2. Лінкерна амінокислотна послідовність L25 (SEQ ID NO: 84) підкреслена. Фігура 17 зображує схему для Nтермінального ПЕГілювання пептиду ShK (SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO:10) шляхом гідроамінування, яке також описано далі в Прикладі 32. Фігура 18 зображує схему N-термінального ПЕГілювання пептиду ShK (SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO:10) шляхом утворення аміду, який також описаний далі в Прикладі 34. Фігура 19 зображує схему N-термінального ПЕГілювання пептиду ShK (SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO:10) шляхом хемоселективного оксимування, який також описаний далі в Прикладі 33. Фігура 20А зображує хроматограму, отриману внаслідок ВЕРХ-аналізу зі зворотною фазою, при 214 нм, а Фігура 20В зображує масспектрометричний аналіз з джерелом іонів типу «електроспрей», упакованого ShK[2-35], що описується також як упакований-''Des-Arg1-ShK" (Пептид 2). Фігура 21 зображує хроматограму, отриману внаслідок ВЕРХ-аналізу зі зворотною фазою, при 214 нм N-термінально ПЕГільованого ShK[2-35], що також називається як N-термінально ПЕГільований-''Des-Arg1-ShK". Фігура 22А зображує хроматограму, отриману внаслідок ВЕРХ-аналізу зі зворотною фазою, при 214 нм упакованого ShK[1-35], що також називається як "ShK". Фігура 22В зображує мас-спектрометричний аналіз з джерелом іонів типу електроспрей упакованого ShK[1-35], який також називається як "ShK". Фігура 23 є схематичним зображенням Nтермінального ПЕГілювання ShK[2-35] (SEQ ID NO: 92 і SEQ ID NO: 58, який також називається як 19 "Des-Arg1-ShK" або "ShK d1") шляхом гідроамінування, який далі описаний в Прикладі 31. Фігура 24А зображує результати Вестерн-блот аналізу кондиційного середовища з НЕК 293 клітин, тимчасово трансфікованого Fc-L10-ShK[1-35]. Доріжка 1: маркери молекулярної ваги; Доріжка 2: 15 мкл Fc-L10-ShK; Доріжка 3: 10 мкл Fc-L10-ShK; Доріжка 4: 5 мкл Fc-L10-ShK; Доріжка 5; маркери молекулярної ваги; Доріжка 6: контроль; Доріжка 7: 15 мкл контролю, що не містить ДНК; Доріжка 8: 10 мкл контролю, що не містить ДНК; Доріжка 9: 5 мкл контролю, що не містить ДНК; Доріжка 10; маркери молекулярної ваги. Фігура 24В зображує результати Вестерн-блот аналізу з 15 мкл кондиційного середовища від клону клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО), трансфікованих Fc-L-ShK[1-35]. Доріжки 1-15 були завантажені таким чином: контроль, ВВ6, маркери молекулярної ваги, ВВ5, ВВ4, ВВ3, ВВ2, ВВ1, контроль, BD6, BD5, маркери молекулярної ваги, BD4, BD3, BD2. Фігура 25А зображує результати Вестерн-блот аналізу невідновлюючого SDS-PAGE гелю, що містить кондиційне середовище з 293Т клітин, тимчасово трансфікованих Fc-L-SmIIIA. Фігура 25В зображує результати Вестерн-блот аналізу невідновлюючого SDS-PAGE гелю, що містить кондиційне середовище з 293Т клітин, тимчасово трансфікованих Fc-L-SmIIIA. Фігура 26А представляє спектральну сканограму 10 мкл очищеного Fc-L10-ShK[1-35] продукту з стійко трансфікованих клітин СНО, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 26В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-ShK[1-35]. Доріжки 112 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг невідновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 26С зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 20 мкг кінцевого продукту Fc-L10-ShK[1-35], введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 26D представляє графік лазерної десорбційно-іонізаційної мас-спектроскопії з участю матриці (MALDI) кінцевого зразка Fc-L10-ShK[135], проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з  200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. 94226 20 Фігура 27А зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому очищеному продукті Fc-L10-ShK[235J із стійко трансфікованих клітин СНО. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг невідновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 27В зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг очищеного Fc-L10-ShK[2-35], введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 27С зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE Fc-L5-ShK[2-35], очищеному від стійко трансфікованих клітин СНО. Доріжки 1 -12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг невідновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 27D зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE Fc-L25-ShK[2-35], очищений від стійко трансфікованих клітин СНО. Доріжки 1 -12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг невідновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 27Е представляє спектральну сканограму 10 мкл продукту Fc-L10-ShK[2-35], розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 27F зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL10-ShK[2-35], проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DERP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 27G зображує спектральну сканограму 10 мкл Fc-L5-ShK[2-35] продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. 21 Фігура 27Н зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого FcL5-ShK[2-35] продукту, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 27І зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL5-ShK[2-35], проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DERP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 27J зображує спектральну сканограму 20 мкл продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 27K зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого продукту Fc-L25-ShK[2-35], введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 27L зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL25-ShK[2-35], проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DERP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нc). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 28А зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE FC-L10-KTX1 очищений і упакований з бактеріальних клітин. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг невідновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 28В зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 45 мкг очищеного FC-L10-KTX1, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 28С зображує спектральну сканограму 20 мкл продукту FC-L10-KTX1, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 28D зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка Fc 94226 22 L10-KTX1, проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нc). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 29А зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE Fc-L-AgTx2, виділеного і упакованого з бактеріальних клітин. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 29В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE Fc-L10-HaTx1, виділеного і упакованого з бактеріальних клітин. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 29С зображує спектральну сканограму 20 мкл продукту Fc-L10-AgTx2, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 29D зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 20 мкг кінцевого продукту Fc-L10-AgTx2, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 29Е зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL10-AgTx2, проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нc). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з  200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 29F зображує спектральну сканограму 20 мкл продукту Fc-L10-HaTx1, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриманого за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 29G зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 20 мкг кінцевого продукту Fc-L10-HaTx1, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. 23 Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 29Н зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL10-HaTx1, проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нc). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 30А свідчить, що Fc-L10-ShK[1-35], очищений від СНО клітин, викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, зареєстроване на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1.3. Фігура 30В зображує період дії блокування калієвого потоку Fc-L10-ShK[1-35] при різних концентраціях. Було встановлено, що ІС50 становить 15 ± 2 пМ (n = 4 клітини). Фігура 30С свідчить, що синтетичний ShK[1-35] (який також називається "ShK") викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, зареєстроване на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1.3. Фігура 30D зображує період дії блокування калієвого потоку ShK[1-35] при різних концентраціях. Було встановлено, що ІС50 для ShK становить 12 ± 1 пМ (n =4 клітини). Фігура 31А показує, що синтетичний аналог пептиду ShK[2-35] викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, зареєстроване на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1.3, з ІС50, що становить 49 ± 5 пМ (n = 3 клітини). Фігура 31В показує, що СНО-похідне Fc-L10ShK[2-35] пептитіло викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, зареєстроване на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1.3, з ІС50, що становить 115 ± 18 пМ (n = 3 клітини). Фігура 31С показує, що Fc-L5-ShK[2-35] пептитіло викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, зареєстроване на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1.3, з ІС50, що становить 100 пМ (n = 3 клітини). Фігура 32А показує, що пептитіло Fc-L-KTXI, очищене від бактеріальних клітин, викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, зареєстроване на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1.3. Фігура 32В зображує період дії блокування калієвого потоку Fc-L10-KTX1 при різних концентраціях. Фігура 33 представляє результати імуногістохімічних досліджень, які свідчать, що СНО-похідне пептитіло Fc-L10-ShK[1-35] забарвлює НЕK293 клітини, які стабільно трасфіковані Kv1.3 людини (Фігура 33А), тоді як нетрансфіковані HEK293 клітини не забарвлюються пептитілом (Фігура 33В). Фігура 34 представляє результати імуноферментного аналізу, проведеного з використанням 94226 24 фіксованих HEK293 клітин, які стабільно трансфіковані Κν1.3 людини. Фігура 34А свідчить, що СНО-похідне пептитіло Fc-L10-ShK[1-35] (яке називається тут просто як "Fc-L10-ShK") викликає залежне від дози зростання відповіді, тоді як CHO-Fc контроль ("Fc контроль") - не викликає. Фігура 34В показує, що Fc-L10-ShK[1-35] пептитіло (яке тут називається як "Fc-ShK") не викликає відповіді у нетрансфікованих НЕK293 клітин за подібних умов і також представляє інший негативний контроль. Фігура 35 свідчить, що СНО-похідне пептитіло Fc-L10-ShK[1-35] викликає залежне від дози інгібування IL-2 (Фігура 35А) і утворення IFN (Фігура 35В) РМА і CD3 антитілом, які стимулюються РВМС людини. Пептитіло представляє новий фармакологічний препарат, що виявляє повне інгібування відповіді, тоді як окремо синтетичний пептид ShK[1-35] виявляє лише часткове інгібування. Фігура 36 свідчить, що пептитіло Fc-L10-ShK[135], похідне від ссавців, інгібує Т-клітинну проліферацію (включення 3Н-тимідину) у РВМС людини від двох здорових донорів, стимульоване за допомогою антитіл до CD3 і CD28. Фігура 36А зображує відповідь донора 1, а Фігура 36В - відповідь донора 2. Попереднє інкубування з анти-CD32 (FcgRII), що блокує антитіло, не змінювало чутливості до пептитіла. Фігура 37 показує, що очищене СНО-похідне пептитіло Fc-L10-ShK[1-35] викликає залежне від дози інгібування IL-2 (Фігура 37А) і утворення IFN (Фігура 37В) з CD3 і CD28 антитіл, стимульованих РВМС людини. Фігура 38А показує, що ПЕГільований синтетичний пептид ShK[2-35] викликає залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку на НЕK293 клітинах, що стабільно експресують канал людини Kv1.3, час дії блокування калієвого потоку при різних концентраціях представлено на Фігурі 38В. Фігура 39А зображує спектральну сканограму 50 мкл продукту Fc-L10-ShK(1-35), розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 39В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-ShK(1-35). Доріжки 112 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 39С зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого продукту Fc-L10-ShK(1-35), введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. 25 Фігура 40А представляє спектральну сканограму 20 мкл Fc-L10-ShK(2-35) продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 40В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-ShK(2-35). Доріжки 112 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 40С зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого продукту Fc-L10-ShK(2-35), введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, i pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 40D зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL10-ShK(2-35), проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DERP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 41А зображує спектральну сканограму 50 мкл Fc-L10-OSK1 продукту, розведеного в 700 мкл контрольного буферу, отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 41В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті FC-L10-OSK1. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 41С зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 123 мкг кінцевого продукту FC-L10-OSK1, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, і pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 41D зображує результати рідиннохроматографічного і мас-спектрального аналізу близько 4 мкг кінцевого зразка FC-L10-OSK1 з використанням колонки Vydac C4 з частиною витоку, спрямованою в мас-спектрометр LCQ з детектором типу "іонної ловушки". Мас-спектри були відновлені за допомогою програмного забезпечення Bioworks, наданого виробником мас-спектрометра. 94226 26 Фігура 42А-В представляє нуклеотидну і амінокислотну послідовності (SEQ ID NO: 1040 і SEQ ID NO: 1041, відповідно) Fc-L10-OSK1. Фігура 43А-В представляє нуклеотидну і амінокислотну послідовності (SEQ ID NO: 1042 і SEQ ID NO: 1043, відповідно) Fc-L10-OSK1[K7S]. Фігура 44А-В представляє нуклеотидну і амінокислотну послідовності (SEQ ID NO: 1044 і SEQ ID NO: 1045, відповідно) Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]. Фігура 45А-В представляє нуклеотидну і амінокислотну послідовності (SEQ ID NO: 1046 і SEQ ID NO: 1047, відповідно) Fc-L10OSK1[K7S,E16K,K20D]. Фігура 46 зображує Вестерн-блот (з трисгліцином 4-20% SDS-PAGE) з Fc антитілами, спрямованими проти людини. Доріжки 1 - 6 завантажували таким чином: 15 мкл Fc-L10OSK1[K7S,E16K,K20D]; 15 мкл Fc-L10OSK1[E16K,K20D]; 15 мкл Fc-L10-OSK1[K7S]; 15 мкл Fc-L10-OSK1; 15 мкл контролю "без ДНК"; маркери молекулярної ваги. Фігура 47 зображує результати Вестерн-блот (з трис-гліцину 4-20% SDS-PAGE) з Fc антитілами, спрямованими проти людини. Доріжки 1-5 завантажували таким чином: 2 мкл FC-L10-OSK1; 5 мкл Fc-L10-OSK1;10 мкл FC-L10-OSK1; 20 нг стандарту імуноглобуліну людини IgG; маркери молекулярної ваги. Фігура 48 зображує результати Вестерн-блот аналізу (з трис-гліцину 4-20% SDS-PAGE) з Fc антитілами, спрямованими проти людини. Доріжки 113 були завантажені таким чином: 20 нг стандарту імуноглобуліну людини IgG; D1; С3; С2; В6; В5; В2; В1; А6; А5; A4; A3; А2 (5 мкл кондиційного середовища, завантаженого в Доріжки 2-13). Фігура 49А зображує спектральну сканограму 50 мкл Fc-L10-OsK1 продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 49В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-OSK1. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. На Фігурі 49С наведено результати гельпроникаючої хроматографії на 149 мкг кінцевого продукту Fc-L10-OsK1, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, pH 6.9 при швидкості 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 49D зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка Fc10-OsK1, проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337 нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен 27 спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 50А зображує спектральну сканограму 50 мкл продукту Fc-L10-OsK1(K7S), розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 50В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-OsK1(K7S). Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 50С зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого продукту Fc-L10-OsK1(K7S), введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, pH 6.9 при швидкості 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 50D зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого зразка FcL10-OsK1(K7S), проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DERP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 51А зображує спектральну сканограму 50 мкл Fc-L10-OsK1(E16K, K20D) продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер) отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 51В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-OsK1(E16K, K20D). Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 51С - наведено результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого продукту Fc-L10-OsK1(E16K, K20D), введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, pH 6.9 при швидкості 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 51D зображує результати масспектрального аналізу MALDI кінцевого продукту Fc-L10-OsK1(E16K, K20D), проаналізованого за 94226 28 допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з  200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 52А зображує спектральну сканограму 50 мкл Fc-L10-OsK1(K7S, E16K, K20D) продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 52В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті Fc-L10-OsK1(K7S, E16K, K20D). Доріжки 1-12 були завантажені таким чином стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0 5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2 0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0 5 мкг відновленого продукту, контроль, 2 0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 52С - наведено результати гельпроникаючої хроматографії на 50 мкг кінцевого FcL10-OsK1(K7S, Е16К, K20D) продукту, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7 8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, pH 6 9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 52D представляє графік масспектрального аналізу (MALDI) кінцевого продукту Fc-L10-OsK1(K7S, E16K, K20D), проаналізованого за допомогою "времяпролетного" масспектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337 нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з  200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Фігура 53 зображує інгібування вихідного калієвого потоку, відміченого на НЕK293 клітинах, які стабільно експресують канал людини Kv1 3, синтетичним Osk1, пептидним токсином із отрути азійського скорпіона Orthochirus scrobiculosus, який складається з 38 залишків. Фігура 53А демонструє залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, відмічене на НЕK293 клітинах, що стабільно експресують канал людини Kv1 3, синтетичним пептидним токсином Osk1. Фігура 53В зображує період дії блокування синтетичного пептидного токсину Osk1 при різних концентраціях. Було встановлено, що значення константи ІС50 для синтетичного пептидного токсину Osk1 становило 39 ± 12 пМ (n =4 клітини)/ Фігура 54 свідчить, що модифікація синтетичного пептидного токсину OSK1 шляхом злиття з Fc-фрагментом антитіла (OSK1-пептитіло) збері 29 гає інгібуючу активність щодо каналу людини Kv1 3. Фігура 54А демонструє залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, відмічене на НЕK293 клітинах, що стабільно експресують канал людини Κν1 3, OSK1, зв'язаним з Fcфрагментом імуноглобуліну людини lgG1 за допомогою лінкерного ланцюга, що складається з 10 амінокислотних залишків у довжину (FC-L10OSK1). Гібридна конструкція стабільно експресувалась в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО). Фігура 54В зображує період дії блокування FcL10-OSK1 при різних концентраціях. Було встановлено, що ІС50 для FC-L10-OSK1 становить 198 ± 35 пМ (n = 6 клітин), приблизно у 5-разів менше, ніж для синтетичного пептидного токсину OSK1. Фігура 55 зображує одинарну заміну амінокислотного залишка OSK1-пептитіла, яка зберігає інгібіторну активність щодо каналу людини Kv1.3. Фігура 55А зображує залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, відміченого на НЕK293 клітинах, що стійко експресували канал людини Κν1.3, OSK1-пептитілом з єдиною амінокислотною заміною (лізину на серин у 7-му положенні від N-термінального кінця, [K7S]) і зв'язаного з Fc-фрагментом антитіла людини lgG1 за допомогою лінкерного ланцюга завдовжки 10 амінокислотних залишків (Fc-L10-OSK1[K7S]). Гібридна конструкція стабільно експресувалась в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО). Фігура 55В зображує період дії блокування калієвого потоку Fc-L10-OSK1[K7S] при різних концентраціях. Було встановлено, що ІС50 становило 372 ±71 пМ (n = 4 клітини), приблизно у 10 разів менш потужно, ніж для синтетичного пептидного токсину OSK1. Фігура 56 свідчить, що дві амінокислотні заміни OSK1-пептитіла зберігають інгібіторну активність щодо каналу людини Kv1.3. Фігура 56А зображує залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, відмічене на НЕK293 клітинах, що стабільно експресували Κν1.3 канал людини, OSK1-пептитілом з подвійним амінокислотним заміщенням (глутамінової кислоти на лізин і лізину на аспарагінову кислоту в 16-му і 20-му положеннях від N-термінального кінця відповідно, [E16KK20D]) і зв'язаним з Fc-фрагментом імуноглобуліну людини lgG1 за допомогою лінкерного ланцюга, що складається з 10 амінокислотних залишків (Fc-L10-OSK1[E16KK20D]). Гібридна конструкція стабільно експресувалась в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО). Фігура 56В зображує період дії блокування калієвого потоку Fc-L10-OSK1[E16KK20D] при різних концентраціях. Було з'ясовано, що значення ІС50 становило 248 ± 63 пМ (n = 3 клітини), приблизно у 6 разів менш потужне, ніж для синтетичного пептидного токсину OSK1. Фігура 57 свідчить, що потрійне амінокислотне заміщення OSK1-пептитіла зберігає інгібуючу активність щодо каналу людини Kv1.3, однак активність інгібування була істотно нижчою у порівнянні з синтетичним пептидним токсином OSK1. 94226 30 Фігура 57А зображує залежне від концентрації блокування вихідного калієвого потоку, відмічене на НЕK293 клітинах, що стабільно експресували Κν1.3 канал людини, OSK1-пептитілом з потрійними амінокислотними заміщеннями (лізину на серин, глутамінової кислоти на лізин і лізину на аспарагінову кислоту у 7-му, 16-му і 20-му положеннях від N-термінального кінця, відповідно, [K7SE16KK20D]) і зв'язаний з Fc-фрагментом імуноглобуліну людини lgG1 лінкерним ланцюгом, що складається з 10 амінокислотних залишків у довжину (Fc-L10-OSK1[K7SE16KK20D]). Гібридна конструкція стабільно експресувалась в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО). Фігура 57В зображує період блокуючої дії калієвого потоку Fc-L10-OSK1[K7SE16KK20D] при різних концентраціях. Було встановлено, що значення константи ІС50 становило 812 ± 84 рМ (n = 3 клітини), приблизно у 21 разів менше, ніж для синтетичного пептидного токсину OSK1. Фігура 58 зображує калібрувальні криві для ShK (Фігура 58А) і 20К PEG-ShK[1-35] (Фігура 58В), які включають рівняння лінійної регресії для кожної кривої при заданій концентрації сироватки. Фігура 59 зображує фармакокінетичний профіль у щурів сполуки 20K PEG ShK[1-35] після внутрішньовенної ін'єкції. Фігура 60 зображує активність інгібітора Kv1.3 у зразках сироватки (5%) щурів, що отримували однаразову еквімолярну внутрішньовенну ін'єкцію Κν1.3 інгібітора ShK у порівнянні з 20К PEG-ShK[135]. Фігура 61 представляє схему модельного експерименту Adoptive Transfer ЕАЕ (n = 5 щурів на варіант досліду). Величина дозування в мікрограмах на кілограм (мг/кг) ґрунтується на вмісті пептиду. Фігура 62 зображує, що застосування ΠΕΓ-ShK полегшувало хворобу у щурів в модельному експерименті Adoptive Transfer ЕАЕ. Клінічні показники: 0 = жодних проявів, 0.5 = в'ялість дистальної частини хвоста, 1.0 = в'ялість хвоста, 2.0 = легкий парапарез, атаксія, 3.0 = помірний парапарез, 3.5 = параліч однієї задньої ноги, 4.0 = повний параліч задніх ніг, 5.0 = повний параліч задньої ноги і нетримання, 5.5 = тетраплегія, 6.0 = агонія або смерть. Щурі, які набирали від 5.5 до 6 балів, помирали або були евтаназовані. Представлені величини середнє ± середня арифметична похибка (n = 5 щурів на варіант досліду). Фігура 63 представляє, що застосування ΠΕΓShK попереджує втрату ваги тіла в модельному експерименті Adoptive Transfer ЕАЕ. Щурів зважували на 1, 4, 6, і 8 день (для щурів, що вижили). Представлені величини середнє ± середня арифметична похибка. Фігура 64 зображує, що індуковане тапсигаргіном утворення IL-2 в цільній крові людини, пригнічувалось ігнібіторами Kv1.3 каналу ShK[1-35] і FcL10-ShK[2-35]. Інгібітор кальциневрину циклоспорин А також блокує відповідь. Інгібітор іберіотоксин (ІbТх) каналу ВKСа не виявив істотної активності. Відповідь крові двох окремих донорів представлена на Фігурі 64А і Фігурі 64В. 31 Фігура 65 зображує, що індуковане тапсигаргіном утворення IFN-g в цільній крові людини, пригнічувалось інгібіторами Kv1.3 каналу ShK[1-35] і Fc-L10-ShK[2-35]. Інгібітор кальциневрину циклоспорин А також блокував відповідь. Інгібітор ВKСа каналу іберіотоксин (ІbТх) не виявив істотної активності. Відповідь крові двох окремих донорів представлена на Фігурі 65А і Фігурі 65В. Фігура 66 зображує, що індукована тапсигаргіном надрегуляція CD40L на Т-клітинах в цільній крові людини пригнічувалась інгібіторами Kv1.3 каналу ShK[1-35] і Fc-L10-ShK[1-35] (Fc-ShK). Інгібітор кальциневрину циклоспорин A (CsA) також блокував відповідь. Фігура 66А зображує результати дослідження відповіді загалом CD4+ Τ клітин. Фігура 66В зображує результати досліджень загалом CD4+ Т-клітин, а також CD4+CD45+ і CD4+CD45- Τ клітини. На Фігурі 66В інгібітор каналу ВKСа іберіотоксин (ІbТх) і інгібітор каналу Κν1.1 дендротоксин-K (DTX-K) не виявляли істотної активності. Фігура 67 зображує, що індукована тапсигаргіном надрегуляція IL-2R на Т-клітинах в цільній крові людини пригнічувалась інгібіторами Κν1.3 каналу ShK[1-35] і Fc-L10-ShK[1-35] (Fc-ShK). Інгібітор кальциневрину циклоспорин A (CsA) також блокував відповідь. Фігура 67А зображує результати дослідження відповіді загалом CD4+ Τ клітин. Фігура 67В зображує результати досліджень загалом CD4+ Т-клітин, а також CD4+CD45+ і CD4+CD45+ Τ клітини. На Фігурі 67В, інгібітор ВKСа каналу іберіотоксин (ІbТх) і інгібітор Κν1.1 каналу дендротоксин-K (DTX-K) не виявляли істотної активності. Фігура 68 зображує іоно-обмінні хроматограми очистки ПЕГ-пептиду на колонках SP Sepharose HP для очистки ΠΕΓ-Shk (Фігура 68А) і очистки ΠΕΓ-OSK-1 (Фігура 68В). Фігура 69 зображує хроматограми, отримані за допомогою RP-HPLC, на пулі ПЕГ-пептиду, для того щоб продемонструвати чистоту пептидного пулу, що свідчить про чистоту ΠΕΓ-Shk >99% (Фігура 69А) і чистоту ΠΕΓ-Osk1 >97% (Фігура 69В). Фігура 70 зображує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO: 976) типового FcLoop-L2-OsK1L2, що має три зв'язані домени: N-термінальний домен Fc (амінокислотні залишки 1-139); OsK1 (підкреслені амінокислотні залишки 142-179); і Стермінальний домен Fc (амінокислотні залишки 182-270). Фігура 71 зображує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO: 977) типового FcLoop-L2-ShKL2, що має три зв'язані домени: N-термінальний домен Fc (амінокислотні залишки 1-139); ShK (підкреслені амінокислотні залишки 142-176); і Стермінальний домен Fc (амінокислотні залишки 179-267). Фігура 72 зображує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO: 978) типового FcLoop-L2-ShKL4, що має три зв'язані домени: N-термінальний домен Fc (амінокислотні залишки 1-139); ShK (підкреслені амінокислотні залишки 142-176); і С 94226 32 термінальний домен Fc (амінокислотні залишки 181-269). Фігура 73 зображує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO: 979) типового FcLoop-L4-OsK1L2, що має три зв'язані домени: N-термінальний домен Fc (амінокислотні залишки 1-139); OsK1 (підкреслені амінокислотні залишки 144-181); і Стермінальний домен Fc (амінокислотні залишки 184-272). Фігура 74 зображує, що 20К ПЕГільований ShK[1-35] забезпечував потужне блокування каналу людини Kv1.3, як було визначено за допомогою електрофізіологічного методу фіксації потенціалу (петч-кламп метод) на HEK293/Kv1.3 клітинах. Дані свідчать про блокування максимального струму. Фігура 75 схематично представляє структури деяких інших типових втілень композиції сполук винаходу. "X2" і "X3" представляють пептидні токсини або комбінації лінкер-пептидний токсин (тобто, -(L)f-P-(L)g-), як тут визначається. Як тут описано, але не представлено на Фігурі 75, додатковий домен X1 і одна або більше додаткових ПЕГ частин молекули також охоплені іншими втіленнями. Конкретні втілення наведено далі: Фігура 75С, Фігура 75D, Фігура 75G і Фігура 75Н: представляють молекулу, що складається з одинарного ланцюга, і може також представляти ДНК-конструкцію для молекули. Фігура 75А, Фігура 75В, Фігура 75Е і Фігура 75F: представляють Fc димери, зв'язані подвійним дисульфідним зв'язком (в положенні F2); Фігура 75А і Фігура 75В представляють димер, що має частину пептидного токсину на обох ланцюгах в положенні X3; Фігура 75Е і Фігура 75F представляє димер, що має частину пептидного токсину на обох ланцюгах в положенні X2. Фігура 76А зображує спектральну сканограму 50 мкл ShK[2-35]-Fc продукту, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 76В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті ShK[2-35]-Fc. Доріжки 1-12 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. На Фігурі 76С наведено результати гельпроникаючої хроматографії на 70 мкг кінцевого продукту ShK[2-35]-Fc, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, pH 6.9 при 1 мл/хв. Поглинання спостерігали при довжині хвилі 280 нм. Фігура 76D зображує результати РХ-МС аналізу кінцевого зразка ShK[2-35]-Fc з використанням проточної високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) зі зворотною фазою (хроматограф Agilent 1100), з вивідною колонкою, що безпосередньо з'єднана з джерелом іонів типу електроспрей мас-спектрометра Thermo Finnigan LCQ з детекто 33 ром типу «іонної ловушки». Релевантні спектри були просумовані і піддані деконволюційному аналізу стосовно мас даних за допомогою пакету програмного забезпечення Bioworks. Фігура 77А зображує результати гельпроникаючої хроматографії на 20 мкг продукту met-ShK[1-35]-Fc, розведеного в 700 мкл PBS (контрольний буфер), отриману за допомогою спектрофотометра Hewlett Packard 8453 і кварцової кювети з довжиною пробігу 1 см. Фігура 77В зображує забарвлений Кумассі брильянтовим синім трис-гліцин 4-20% SDS-PAGE на кінцевому продукті met-ShK[1-35]-Fc. Доріжки 112 були завантажені таким чином: стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг невідновленого продукту, контроль, 2.0 мкг невідновленого продукту, контроль, 10 мкг відновленого продукту, стандарти білків широкого діапазону Novex Mark12, 0.5 мкг відновленого продукту, контроль, 2.0 мкг відновленого продукту, контроль, і 10 мкг відновленого продукту. Фігура 77С наводить результати гельпроникаючої хроматографії на 93 мкг кінцевого продукту met-ShK[1-35]-Fc, введеного в колонку Phenomenex BioSep SEC 3000 (7.8  300мм) в 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ NaCI, pH 6.9 при 1 мл/хв., спостереження проводили при поглинанні 280 нм. Фігура 77D представляє графік лазерної десорбційно-іонізаційної мас-спектроскопії з участю матриці (MALDI) кінцевого зразка met-ShK[1-35]Fc, проаналізованого за допомогою "времяпролетного" мас-спектрометра Voyager DE-RP, устаткованого азотним лазером (337нм, імпульс 3 нс). Використовувався позитивний йонний/лінійний режим з прискорюючою напругою 25 кВ. Кожен спектр був отриманий внаслідок накопичення даних з ~ 200 лазерних імпульсів. Калібрування зовнішніх мас було проведено за допомогою очищених білків з відомою молекулярною масою. Докладний опис та втілення винаходу Визначення термінів Терміни, що використовуються в цій специфікації, визначаються наступним чином, якщо за інших умов не було обумовлено щось інше у конкретних випадках. Як використовується у специфікації і у формулі винаходу, що додається, форма однини включає терміни у множині, якщо за контекстом чітко не передбачено щось інше. Термін "частина молекули, що підвищує період напіввидення" (тобто, F1 або F2 у Формулі І) стосується фармацевтично прийнятної частини молекули, домену, або "носія", ковалентно зв'язаного або кон'югованого з пептидним токсином, який попереджує або уповільнює in vivo протеолітичне розщеплення або іншу хімічну модифікацію, яка зменшує активність пептидного токсину, підвищує період напіввиведення або інші фармакокінетичні властивості, такі як, але не обмежуючись ними, підвищення швидкості адсорбції, зменшення токсичності, покращення розчинності, підвищення біологічної активності і/або селективність пептидного токсину щодо йонного каналу, який становить інтерес, підвищення технологічності, і/або зниження імуногенності пептидного токсину, у порівнянні з некон'югованою формою пептидного токсину. 94226 34 "ПЕГільований пептид" означає пептид або білок, що має складову поліетиленгліколь (ПЕГ), ковалентно зв'язану з амінокислотним залишком власне пептиду, або з пептидильним чи непептидильним лінкерами (включаючи, але не обмежуючись ароматичними лінкерами), які ковалентно зв'язуються з залишком пептиду. "Поліетиленгліколь" або "ПЕГ" означає сполуку поліетиленгліколю або його похідні, з або без зв'язуючих засобів або дериватизацію зі зв'язуючими чи активуючими частинами молекули (напр., альдегідом, гідроксисукцинімідом, гідразидом, тіолом, трифлатом, тресилатом, азирдином, оксираном, ортопіридилу дисульфідом, вінілсульфоном, йодоацетамідом або малеімідом). Відповідно до даного винаходу, корисний ПЕГ включає, головним чином, лінійні, з прямими ланцюгами ПЕГ, розгалужені ПЕГ, або дендритні ПЕГ. (Див., напр., Merrill, US Patent No. 5,171,264; Harris et al., Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces, US Patent No. 5,932,462; Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, US Patent No. 6,602,498). Термін "пептитіло" стосується сполук за Формулою І, в якій F1 і/або F2 являє собою Fc домен імуноглобуліну або його частину, так що СН2 домен Fc, або в який пептидний токсин вставляється в петлю Fc домену імуноглобуліну людини lgG1, так що F1 і F2 кожен є частиною Fc домену з пептидним токсином, вставленим між ними (див., напр., Фігури 70-73 і Приклад 49 тут). Пептитіла цього винаходу можуть також бути ПЕГільовані, як описано тут далі, або в Fc домені або його частині, або в частині пептидного токсину (нів) сполуки винаходу, або в обох. Термін "нативний Fc" стосується молекули або послідовності, яка включає послідовність фрагмента, що не зв'язується з антигеном, отриману внаслідок розщеплення цілого антитіла, в мономерній чи мультимерній формі. Джерелом нативного Fc є, як правило, імуноглобулін людини. Ним може бути будь-який з імуноглобулінів, хоча lgG1 або lgG2 є кращими. Нативний Fc утворений мономерними поліпептидами, які можуть бути зв'язані в димерні або мультимерні форми за допомогою ковалентної (тобто, дисульфідними зв'язками) і нековалентної асоціації. Число міжмолекулярних дисульфідних зв'язків між мономерними субодиницями нативних молекул Fc варіює від 1 до 4, залежно від класу (напр., IgG, IgA, IgE) чи підкласу (напр., lgG1, lgG2, lgG3, lgA1, lgGA2). Одним з прикладів нативного Fc є зв'язаний за допомогою дисульфідного зв'язку димер, отриманий внаслідок розщеплення папаїном IgG (див. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Термін "нативний Fc", як тут використовується, є характерним для мономерних, химерних і мультимерних форм. Термін "Fc варіант" стосується сполуки або послідовності, яка модифікується з нативного Fc, однак ще включає сайт зв'язування для salvage рецептора, FcRn. Кілька опублікованих патентів описують типові Fc варіанти, а також взаємодію з salvage рецептором. Див. міжнародні заявки на патент WO 97/34 631 (опублікована 25 вересня 1997; WO 96/32 478, що відповідає Патенту США 35 № 6,096,891, видана 1 серпня 2000, включені тут у повному обсязі у вигляді посилань; і WO 04/110 472. Таким чином, термін "Fc варіант" включає молекулу або послідовність, яка гуманізується з нативного Fc, що не належить людині. Крім того, нативний Fc включає сайти, що можуть бути видалені, тому що вони забезпечують структурні особливості або біологічну активність, яка не є необхідною для гібридних молекул даного винаходу. Таким чином, термін "Fc варіант" включає молекулу або послідовність, які втратили один або більше сайтів нативного Fc або залишки, що впливають або включені в (1) утворення дисульфідного зв'язку, (2) несумісність з обраною клітиноюхазяїном (3) N-термінальну гетерогенність після експресії в обраній клітині-хазяїні, (4) глікозилюванні, (5) взаємодіє з комплементом, (6) зв'язуванні з рецептором Fc або іншим salvage рецептором, або (7) антитілозалежній клітинній цитотоксичності (ADCC). Fc варіанти описуються тут далі. Термін "Fc домен" охоплює молекули нативного Fc і Fc варіанту і послідовності, як визначено вище. Як стосовно Fc варіантів, так і нативного Fc домену, термін "Fc домен" включає молекули в мономерній і мультимерній формі, або отримані внаслідок розщеплення цілого антитіла, або за допомогою інших засобів. Термін "мультимер" стосовно Fc доменів або молекул, що включають Fc домени, стосується молекул, що мають два або більше поліпептидних ланцюги, зв'язані ковалентно, нековалентно, або як ковалентною, так і нековалентною взаємодією. Молекули IgG, як правило, утворюють димери; IgМ - пентамери; IgD - димери; і IgА, мономери, димери, тримери або тетрамери. Будь-хто з досвідом роботи у цій галузі може отримати мультимери за допомогою послідовності і наявної активності природного Ig джерела Fc або за допомогою дериватизації (як визначено нижче) такого нативного Fc. Термін "димер", як він застосовується щодо Fc доменів або молекул, що включають Fc домени, стосується молекул, що мають два поліпептидні ланцюги, зв'язані ковалентно або нековалентно. Таким чином, типові димери в межах винаходу є такі димери, що представлені на Фігурі 2. Терміни "дериватизація", "похідний" або "дериват" включають процеси і, відповідно, отримані внаслідок них сполуки, в яких (1) сполука має циклічну частину; наприклад, перехресне зв'язування між залишком цистеїну - цистеїнілом зі сполукою; (2) сполука перехресно зв'язується або має сайт перехресного зв'язування; наприклад, сполука має цистеїніл, і, таким чином, утворює перехресно зв'язані димери в культурі або in vivo; (3) один або більше пептидильних зв'язки заміщуються на непептидильні зв'язки; (4) N-термінус заміщується на -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, NHC(O)NHR, сукцинімідну групу, або заміщений чи незаміщений бензилоксикарбоніл-NH-, де R і R1 і являють собою кільцеві замісники, як визначено далі; (5) С-кінець заміщується на -C(O)R2 або NR3R4, де R2, R3 і R4 будуть визначені далі; і (6) сполуки, в яких окремі амінокислотні частини молекули модифікуються шляхом застосування засобів, що здатні реагувати з обраними бічними 94226 36 ланцюгами або термінальними залишками. Похідні сполуки описано далі. Термін "пептид" стосується молекул, які включають від 2 до, приблизно, 80 амінокислотних залишків, краще, від, приблизно, 10 до, приблизно, 60 амінокислотних залишків, і, найкраще, від, приблизно, 30 до, приблизно, 50 амінокислотних залишків. Типові пептиди можуть довільно бути отримані за допомогою будь-якого з відомих методів, запозичені з комбінаторної бібліотеки пептидів (напр., комбінаторної фагової бібліотеки), або отримані внаслідок розщеплення білків. В будьякій пептидній частині композицій винаходу, наприклад, пептидному токсині або пептидній лінкерній частині, описаній тут, додаткові амінокислоти можуть бути включені в один з термінусів або в кожен N- або С- термінус даної послідовності. Звичайно, ці додаткові амінокислотні залишки не повинні істотно впливати на функціональну активність композиції. "Пептидні токсини" включають пептиди, які мають ту ж саму амінокислотну послідовність природного фармакологічно активного пептиду, що може бути виділений з отрути, а також включають модифіковані аналоги пептидів, що зустрічаються у природі. Приклади пептидних токсинів, що застосовуються у практиці даного винаходу, наведено в Таблицях 1-32. Пептидний токсин ("Р", або аналогічно названий "Р1" на Фігурі 2) включає, щонайменше, два міжпептидні дисульфідні зв'язки, як показано, наприклад, на Фігурі 9. Відповідно, цей винахід стосується сполук, які включають: a) С1-С3 і С2-С4 дисульфідні зв'язки, в яких С1, 2 С , С3, і С4 представляють порядок, в якому цистеїнові залишки з'являються в первинній послідовності пептидного токсину, відлік традиційно ведеться з N-термінального кінця пептиду зліва, перший і третій цистеїни в амінокислотній послідовності утворюють дисульфідний зв'язок, другий і четвертий цистеїни утворюють дисульфідний зв'я1 зок. Приклади пептидних токсинів, з таким як С 3 2 4 С , С -С типом дисульфідних зв'язків, включають, але не обмежені ними, апамінові пептиди, конопептиди, РnІА пептиди, РnІВ пептиди, і Мll пептиди, і аналоги будь-якого з вищезгаданих пептидів. b) С1-С6, С2-С4 і С3-С5 дисульфідний зв'язок, в якому, як описано вище, С1, С2, С3, С4, С5 і С6 представляють порядок, в якому цистеїнові залишки з'являються в первинній послідовності пептидного токсину, відлік традиційно ведеться з Nтермінального кінця пептиду (ів) зліва; перший і шостий цистеїни у амінокислотній послідовності утворюють дисульфідний зв'язок, другий і четвертий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, і третій та п'ятий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок. Приклади пептидних токсинів, з таким як С1-С6, С2-С4, С3-С5 типом дисульфідних зв'язків, включають, але не обмежені ними, ShK, BgK, HmK, AeKS, AsK, і DTX1, а також аналоги будьякого із вищевказаних пептидів. c) С1-С4, С2-С5 і С3-С6 дисульфідний зв'язок, в якому, як описано вище, С1, С2, С3, С4, С5 і С6 представляють порядок, в якому цистеїнові залишки з'являються в первинній послідовності пеп 37 тидного токсину, відлік традиційно ведеться з Nтермінального кінця пептиду (ів) зліва; перший і четвертий цистеїни в амінокислотній послідовності утворюють дисульфідний зв'язок, другий і п'ятий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, третій і шостий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок. Приклади пептидних токсинів, з таким як С1-С4, С2С5, С3-С6 типом дисульфідних зв'язків, включають, але не обмежені ними, ChTx, MgTx, OSK1, KTX1, AgTx2, Рi2, Рi3, NTX, HgTx1, BeKM1, BmKTX, P01, ВmKK6, Тс32, Tc1, BmTx1, ВmТХ3, IbTx, P05, ScyTx, TsK, НаТх1, ProTX1, PaTX2, Ptu1, ωGVIA, ωΜVllΑ, і Smllla, а також аналоги будь-якого із вищевказаних пептидів. d) С1-С5, С2-С6, С3-С7, і С4-С8 дисульфідний зв'язок, в яких С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 і С8 представляють порядок, в якому цистеїнові залишки з'являються в первинній послідовності пептидного токсину, відлік традиційно ведеться з Nтермінального кінця пептиду (ів) зліва; перший і п'ятий цистеїни в амінокислотній послідовності утворюють дисульфідний зв'язок, другий і шостий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, третій і сьомий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, четвертий і восьмий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок. Приклади пептидних токсинів, з таким як С1-С5, С2-С6, С3-С7, С4-С8 типом дисульфідних зв'язків, включають, але не обмежені ними, Anuoroctoxin (АnТх), Рi1, HsTx1, МТХ (Р12А, Р20А), і Рi4 пептиди, а також аналоги будь-якого із вищевказаних пептидів. 1 4 2 6 3 7 5 8 e) С -С , С -С , С -С , і С -С дисульфідний зв'язок, в якому С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 і С8 представляють порядок, в якому цистеїнові залишки з'являються в первинній послідовності пептидного токсину, відлік традиційно ведеться з Nтермінального кінця пептиду (ів) зліва, перший і четвертий цистеїни в амінокислотній послідовності утворюють дисульфідний зв'язок, другий і шостий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, третій і сьомий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, і п'ятий та восьмий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок. Приклади пептидних токсинів, з таким як С1-С4, С2-С6, С3-С7, С5-С8 типом дисульфідних зв'язків, включають, але не обмежені ними, хлоротоксин, Вm-12b та їх аналоги. f) С1-С5, С2-С6, С3-С4, і С7-С8 дисульфідний зв'язок, в якому С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 і С8 представляють порядок, в якому цистеїнові залишки з'являються в первинній послідовності пептидного токсину, відлік традиційно ведеться з Nтермінального кінця пептиду (ів) зліва, перший і п'ятий цистеїни в амінокислотній послідовності утворюють дисульфідний зв'язок, другий і шостий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, третій і четветий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок, сьомий і восьмий цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок. Приклади пептидних токсинів, з таким як С1-С5, С2-С6, С3-С4, С7-С8 типом дисульфідних зв'язків, включають, але не обмежені ними, Maurotoxin пептиди та їх аналоги. Термін "ріомізований" при використанні для позначення пептидних послідовностей, стосується повністю ріомних послідовностей (напр., обраних за допомогою методів фагового дисплею) і послі 94226 38 довностей, в яких один або більше залишків молекул, що зустрічаються в природі, заміщуються амінокислотними залишками, які не зустрічаються в цьому положенні у природних молекул. Типові методи для ідентифікації послідовностей пептида включають методи комбінаторних фагових бібліотек, дисплею Е. соlі, рибосомного дисплею, скринінгу. основаному на дріжджах, скринінгу РНКпептиду, хімічного скринінгу, раціональної моделі, структурного аналізу білка тощо. Термін "фармакологічно активний" означає, що речовина, якої стосується таке визначення, має активність, що впливає на медичні показники (напр., кров'яний тиск, формулу крові, рівень холестерину) або стан захворювання (напр., рак, аутоімунні розлади). Таким чином, фармакологічно активні пептиди включають агоністи або міметики і пептиди-антагоністи, як описано нижче. Терміни "пептид-міметик" і "пептид-агоніст" стосуються пептидів, які мають біологічну активність, яку можна порівнювати з біологічною активністю молекули природного токсину, напр., пептидного токсину ShK, який зустрічається в природі. Крім того, ці терміни включають пептиди, які опосередковано імітують активність молекули природного пептидного токсину, потенціюючи дію природної молекули. Термін "пептид-антагоніст" або "пептидінгібітор" стосується пептиду, який блокує або у інший спосіб впливає на біологічну активність рецептора, що становить інтерес, або виявляє біологічну активність, яку можна порівняти з біологічною активністю відомого антагоніста чи інгібітора, який становить інтерес (такими як, але не обмежені ними, йонні канали). Термін "кислотний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що включають амінокислотні групи. Типові приклади амінокислотних залишків включають D і Е. Термін "амідний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що включають амідні похідні амінокислотних груп. Типові залишки включають N і Q. Термін "ароматичний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що включають ароматичні групи. Типові ароматичні залишки включають F, Y, і W. Термін "основний залишок" стосується амінокислотних залишків в D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що включають основні групи. Типові приклади основних залишків включають Н, K, R, Nметил-аргінін, ω-аміноаргінін, ω-метил-аргінін, 1метил-гістидин, 3-метил-гістидин, і гомоаргінін (hR). Термін "гідрофільний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що включають полярні групи. Типові гідрофільні залишки включають С, S, Т, N, Q, D, Е, K, і цитрулін (Cit). Термін "нефункціональний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що втратили амінокислотну, основну або ароматичну групу. Типові нефункціо 39 нальні амінокислотні залишки включають М, G, А, V, І, L і норлейцин (Nle). Термін "нейтральний полярний залишок" стосується амінокислотних залишків у D-або L-формі, які мають бічні ланцюги, що втратили основні, амінокислотні або полярні групи. Типові нейтральні полярні амінокислотні залишки включають А, V, L, І, Р, W, М, і F. Термін "полярний гідрофільний залишок" стосується амінокислотних залишків у D-або L-формі, які мають бічні ланцюги, що включають полярні групи. Типові полярні гідрофобні амінокислотні залишки включають Т, G, S, Y, С, Q, і N. Термін "гідрофобний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або L-формі, які мають бічні ланцюги, що втратили основні чи амінокислотні групи. Приклади гідрофобних амінокислотних залишків включають А, V, L, І, Р, W, М, F, Т, G, S, Y, С, Q, і N. В деяких кращих втіленнях композиції винаходу амінокислотна послідовність пептидного токсину модифікується у один чи більше способів у порівнянні з послідовністю природного пептидного токсину, що становить інтерес, таких як, але не обмежених ними, послідовністю нативного ShK або OSK1, аналогами пептидного токсину, або інших пептидних токсинів, які мають амінокислотні послідовності, що наведені у будь-якій з Таблиць 1-32. Одна чи більше кращих модифікацій можуть включати амінокислотні вставки чи інсерції, амінокислотні делеції, усічення пептидного токсину, амінокислотні заміщення, і/або хімічні перетворення амінокислотних залишків, виконані за допомогою відомих хімічних методик. Такі модифікації можуть бути здійснені, наприклад, з метою посилення біологічної активності, селективності і/або протеолітичної стійкості тощо. Кожен фахівець з досвідом роботи у цій галузі знайомий з методиками конструювання аналогів пептидного токсину, що мають такі оптимізовані властивості, такими як сканування за допомогою аланіну, раціональне моделювання, виходячи з «вирівнювання» амінокислотних послідовностей, отриманого внаслідок мутагенезу, з використанням відомих послідовностей пептидного токсину і/або молекулярного моделювання. Наприклад, аналоги ShK можуть бути створені для того, щоб видалити сайти протеазного розщеплення (напр., сайти трипсинового розщеплення у K або R залишках і/або сайти хімотрипсинового розщеплення в F, Y, або W залишках) в ShK пептидному токсині- або композиції винаходу, що містить аналог ShK, грунтуючись частково на вирівнюванні, опосередкованому мутагенезом за допомогою HmK (див., напр., Фігуру 6) і молекулярне моделювання. (Див., напр., Kalman et al., ShKDap22, а potent Kv1.3-specific immunosuppressive polipeptide toxin, J. Biol. Chem. 273(49):32697-707 (1998); Kem et al., US Patent No. 6,077,680; Mouhat et al., OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2)). Термін "протеаза" є синонімом терміну "пептидаза". Протеази включаютьдві групи ензимів: ендопротеази, які розщеплюють зв'язки в пептидному токсині в точках в межах білка, і екзопептидази, які видаляють одну або більше амінокислот або з N- чи С-термінальних кінців, відповідно Термін 94226 40 "протеїназа" також використовується як синонім ендопептидази Виділяють чотири механістичних класи протеїназ: серинові протеїнази, цистеїнові протеїнази, аспартатні протеїнази, і металопротеїнази Крім цих чотирьох механістичних класів, існує секція номенклатури ферментів, призначена для протеаз, які мають каталітичний механізм невизначеної природи. Це свідчить про те, що механізм каталізу ще не було з'ясовано. Як правило використовується номенклатура «підсайтів» розщеплення за схемою, розробленою Schechter і Berger (Schechter І & Berger А., On the size of the active site in proteases I. Papain, Biochemical і Biophysical Research Communication, 27 157 (1967), Schechter I. & Berger A., On the active site of proteases 3 Mapping the active site of papain; specific inhibitor peptide toxins of papain, Biochemical і Biophysical Research Communication, 32 898 (1968)). Відповідно до цієї моделі, амінокислотні залишки у субстраті, який піддається розщепленню, позначають Р1, Р2, Р3, Р4 тощо у Nтермінальному напрямку від зв'язку, що розщеплюється. Аналогічно, залишки у С-термінальному напрямку позначаються Р1', Р2', Р3', Р4' тощо. Досвідчений фахівець цілковито усвідомлює, скільки засобів існує для ідентифікації сайтів зв'язування протеази чи протеазного розщеплення, що становить інтерес. Наприклад, програмне забезпечення PeptideCutter доступне через ExPASy (Expert Protein Analysis System) сервер протеоміки Швейцарського Інституту Біоінформатики (SIB, www expasy. org/tools/peptidecutter). PeptideCutter здійснює пошук послідовності білка в базах даних SWISS-PROT і/або TrEMBL або послідовності білка, яка вводиться користувачем для сайтів протеазного розщеплення. Можуть бути використані окремі протеази або хімічні речовини, обрані з повного переліку протеаз або хімічних речовин. Наявні різні форми вихідної інформації таблиці сайтів розщеплення або згруповані за абеткою відповідно до назв ферментів, або послідовно відповідно до номера амінокислоти. Третій варіант вихідної інформації - це карта сайтів розщеплення. Послідовність і сайти розщеплення, картовані на ній, групуються в блоки, розмір яких може обиратись користувачем. Відомі також інші засоби для визначення сайтів протеазного розщеплення (Е.g., Turk, В. et al., Determination of protease cleavage site motifs using mixture-based oriented peptide libraries, Nature Biotechnology, 19 661-667 (2001); Barrett A. et al., Handbook of proteolytic enzymes, Academic Press (1998)). Серинові протеїнази включають родину хімотрипсину, що включає протезні ферменти ссавців, такі як хімотрипсин, трипсин або еластаза чи калікреїн. Серинові протеїнази виявляють різну специфічність щодо субстрату, що пов'язана з амінокислотними заміщеннями в різних субсайтах ферменту, що взаємодіють із залишками субстрату. Деякі ферменти мають широкий центр взаємодії з субстратом, тоді як інші мають обмежену специфічність до Р1 залишку субстрату. Трипсин переважно розщеплює в R або K положенні Р1. Статистичне дослідження, виконане Keil (1992), описує негативний вплив залишків, що 41 оточують Arg- і Lys- зв'язки (тобто, положення Р2 і Р1', відповідно) протягом процесу розщеплення трипсином. (Keil, В., Specificity of proteolysis, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-NewYork, 335 (1992)). Залишок проліну в положенні Р1' виявляє сильний негативний вплив на розщеплення трипсином. Аналогічно, позиціонування R і K в положенні Р1' призводить до інгібування, а також негативно заряджує залишки в положеннях Р2 і Р1'. Хімотрипсин переважно розщеплює в W, Υ або F в положенні Р1 (висока специфічність) і меншою мірою в L, Μ або Η залишках в положенні Р1. (Keil, 1992). З цього правила існують такі винятки: якщо W виявляється в положенні Р1, розщеплення блокується, якщо Μ або Ρ виявляються у положенні Р1' в один і той же час. Крім того, залишок проліну в положенні Р1' майже повністю блокує розщеплення, незалежно від амінокислот, що перебувають у положенні Р1. Якщо Μ залишок знаходиться в положенні Р1, розщеплення блокується присутністю Υ залишка в положенні Р1'. Остаточно, якщо Η знаходиться в положенні Р1, присутність D, Μ або W залишка також блокує розщеплення. Мембранна метало-ендопептидаза (ΝΕΡ; нейтральна ендопептидаза, нейтральна протеїназа війчастої кайми нирки, енкефаліназа, ЕС 3.4.24.11) розщеплює пептидні токсини з боку амінів гідрофобних амінокислотних залишків. (Connelly, JC et al., Neutral Endopeptidase 24.11 in Human Neutrophils: Cleavage of Chemotactic Peptide, PNAS, 82(24):8737-8741 (1985)). Тромбін переважно розщеплює в R залишку в положенні Р1. (Keil, 1992). Природний субстрат тромбіну - фібриноген. Оптимальні центри розщеплення, це коли R залишок знаходиться в положенні Р1, а Gly - в положенні Р2 і положенні Р1'. Аналогічно, якщо гідрофобні амінокислотні залишки виявляються в положенні Р4 і положенні Р3, залишок проліну - в положенні Р2, R залишок - в положенні Р1, і некислі амінокислотні залишки в положенні Р1' і положенні Р2'. Дуже важливий залишок для його природного субстрату фібриногену є D залишок в положенні Ρ10. Каспаси - це родина цистеїнових протеаз, що несуть активний центр з консервативною амінокислотною послідовністю, і які розщеплюють пептидні токсини саме після D залишків. (Earnshaw WC et al., Mammalian caspases: Structure, activation, substrates, and functions during apoptosis, Annual Review of Biochemistry, 68:383-424 (1999)). Arg-C протеїназа переважно розщеплює R залишок в положенні Р1. На розщеплення, очевид 94226 42 но, лише частково впливають залишки в положенні Р1'. (Keil, 1992). Asp-N ендопептидаза розщеплює конкретно зв'язок із D залишком в положенні Р1'. (Keil, 1992). Вищенаведені приклади лише типові і жодним чином не обмежують широкого застосування знань, які є доступними для досвідченого фахівця, стосовно протезного зв'язування і/або сайтів розщеплення, які можуть становити інтерес в процесі практичного використання винаходу. В інших прикладах, амінокислотна послідовність пептидного токсину, модифікована з амінокислотної послідовності природного пептидного токсину, включає, щонайменше, один амінокислотний залишок, який вставлений або заміщений у цій послідовності, порівняно з амінокислотною послідовністю нативного пептидного токсину, що становить інтерес, в якому вставлений або заміщений амінокислотний залишок має бічний ланцюг, що несе нуклеофільну або електрофільну реакційну функціональну групу, за допомогою якої пептид зв'язується з лінкером або частиною молекули, що підвищує час напіввиведення. Відповідно до винаходу, корисні приклади таких нуклеофільних або електрофільних реакційних функціональних груп включають, але не обмежені ними, тіол, первинний амін, селено, гідразид, альдегід, карбоксильну групу, кетон, аміноокси, замасковану (захищену) альдегідну, або замасковану (захищену) кето функціональну групу. Прикладами амінокислотних залишків, які мають бічні ланцюги з нуклеофільними реакційними функціональними групами включають, але не обмежені ними, лізин, залишок ,диамінопропіонової кислоти, залишок ,диаміномасляної кислоти, орнітин, цистеїн, гомоцистеїн, глютамінову кислоту, аспарагінову кислоту, або селеноцистеїновий залишок. Далі у цьому описі пептидних токсинів, часто застосовується система однобуквених скорочень, для того щоб позначити характерні особливості двадцяти "канонічних" амінокислотних залишків, що, як правило, входять до складу природних пептидів і білків (Таблиця 1А). Такі однобуквені скорочення є цілковито рівнозначними трибуквеним скороченням, або повним назвам амінокислот. В межах системи однобуквеного, що тут застосовується, велика буква означає L-амінокислоту, а маленька буква означає D-амінокислоту, якщо не обумовлено щось інше. Наприклад, скорочення "R" означає L-аргінін, а скорочення "r" означає Dаргінін. 43 94226 Таблиця 1А Однобуквені скорочення для позначення канонічних амінокислот. В круглих дужках наведені скорочення, які складаються з трьох букв Аланін (Ala) Глутамін (Gln) Лейцин (Leu) Серин (Ser) Аргінін (Arg) Глютамінова кислота (Glu) Лізин (Lys) Треонін (Thr) Аспарагін (Asn) Гліцин (Gly) Метионін (Met) Триптофан (Тrp) Аспарагінова кислота (Asp) Гістидин (His) Фенілаланін (Phe) Тирозин (Туr) Цистеїн (Cys) Ізолейцин (lle) Пролін (Pro) Валін (Val) А Q L S R Ε K Τ Ν G Μ W D Η F Υ С I Ρ V Амінокислотні заміщення в амінокислотній послідовності, як правило, позначаються тут скороченням, яке складається з однієї букви, амінокислотного залишка у конкретному положенні, після чого йде числове положення амінокислоти, відповідно до нативної послідовності природного токсину, що становить інтерес, після чого далі йде скорочення, що складається з однієї букви, амінокислотного залишку, на який відбувається заміна. Наприклад, "T30D" символізує заміщення треоніну на залишок аспарагінової кислоти в положенні 30, відповідно до послідовності гіпотетичного природного пептидного токсину. Як ще один приклад можна навести, "R18hR" або "R18Cit" означає, що відбулось заміщення аргініну на гомоаргінін або цитрулін, відповідно, в положенні амінокислоти 18, відповідно до послідовності гіпотетичного природного пептидного токсину. Положення амінокислоти в межах амінокислотної послідовності будь-якого конкретного пептидного токсину (або аналога пептиду), що тут описується, може відрізнятись від її положення у природній послідовності, тобто, як визначено у вирівнюванні N-термінального кінця або С-термінального кінця амінокислотної послідовності пептиду з Nтермінальним або С-термінальним кінцями, послідовності природного пептидного токсину. Наприклад, положення 1 амінокислоти послідовності SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC (ShK(2-35); SEQ ID NO:92), N-термінальне усічення нативної ShK послідовності, таким чином вирівняна з С-термінальним кінцем нативного ShK(1-35) (SEQ ID NO:5), відповідає положенню амінокислоти 2 відповідно до нативної послідовності, а положення амінокислоти 34 послідовності SEQ ID 44 NO:92 відповідає положенню амінокислоти 35 відповідно до природної послідовності (SEQ ID NO:5). В деяких втіленнях даного винаходу, амінокислотні заміщення охоплюють неканонічні амінокислотні залишки, які можуть включати природні рідкісні (в петидах або білках) амінокислотні залишки або неприродні амінокислотні залишки. Неканонічні амінокислотні залишки можуть бути включені в пептиди за допомогою методу хімічного синтезу пептидів, а не синтезу в біологічних системах, таких як рекомбінантно екпресовані, або, альтернативно, досвідчений фахівець може використовувати відомі методики конструювання білків, які передбачають використанням рекомбінантно експресованих клітин (див., напр., Link et al., Noncanonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)). Термін "неканонічний амінокислотний залишок" стосується амінокислотних залишків у D- або Lформі, яких немає серед 20 канонічних амінокислотних залишків, що, як правило, входять до складу природних білків, наприклад, -амінокислоти, гомоамінокислоти, циклічні амінокислоти і амінокислоти з похідними бічними ланцюгами. Приклади включають (у L-формі або D-формі): цитрулін (Cit), гомоцитрулін (hCit), N-метилцитрулін (NMeCit), N-метилгомоцитрулін (NMeHoCit), орнітин (Оrn або О), N-метилорнітин (NMeOrn), саркозин (Sar), гомолізин (hK або Hlys), гомоаргінін (hR або hArg), гомоглутамін (hQ), N-метиларгінін (NMeR), N-метиллейцин (NMeL), Nметилгомолізин (NMeHoK), N-метилглутамін (NMeQ), норлейцин (Nle), норвалін (Nva), 1,2,3,4тетрагідроізохінолін (Tic), нітрофенілаланін (nitrophe), амінофенілаланін (aminophe), бензилфенілаланін (benzylphe), -карбоксиглутамінову кислоту (-carboxyglu), гідроксипролін (hydroxypro), ркарбоксил-фенілаланін (Сра), -аміноадипінову кислоту (Aad), ацетиларгінін (acetylarg), ,диамінопропіоноєву кислоту (Dpr), ,диаміномасляну кислоту (Dab), диамінопропіонову кислоту (Dap), -(1-нафтил)-аланін (1Na1), -(2нафтил)-аланін (2Na1), циклогексилаланін (Cha), 4-метил-фенілаланін (MePhe), , -дифеніл-аланін (BiPhA), аміномасляну кислоту (Abu), 4-фенілфенілаланін (4Вір), -аміно-ізомасляну кислоту (Aib), і похідні форми будь-якох з тих, що тут описані. Номенклатура і система позначень для амінокислот і пептидів за об'єднаною комісією UPACIUB з біохімічної номенклатури (JCBN) була опублікована в наступних документах: Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 937; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p 84; J. Biol. Chem., 1985, 260,14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature і Related Documents, 2nd edition, Portli Press, 1992, pages 39-69]. Як тут стверджується, відповідно до цього винаходу, пептидні частини композиції винаходу, такі як пептидний токсин або пептидний лінкер, можуть також бути хімічно дериватизовані в одному або більше амінокислотних залишках. Пептидні токсини, які включають похідні амінокислотні залишки, 45 можуть бути синтезовані за допомогою відомих методик органічної хімії. "Хімічна похідна сполука" або "хімічно дериватизована" в контексті пептидного токсину стосується пептидного токсину, який має один або більше залишків, що отримані хімічним шляхом внаслідок реакції функціональної бічної групи. Такі похідні молекули включають, наприклад, такі молекули, в яких вільні амінокислотні групи були отримані для того, щоб отримати аміногідрохлориди, р-толуосульфонільні групи, карбобензоксигрупи, t-бутилоксикарбонільні групи, хлорацетильні групи або формільні групи. Вільні карбоксильні групи можуть бути отримані, для того щоб утворити солі, метилові і етилові естери або інші типи естерів чи гідразидів. Вільні гідроксильні групи можуть бути дериватизовані, для того щоб утворились О-ацильні чи О-алкільні похідні сполуки. Імідазольний азот гістидину може бути дериватизований, щоб отримати N-im-бензилгістидин. Як хімічні похідні сполуки також включені ті пептиди, що містять одну або більше похідну амінокислот, що зустрічаються в природі, двадцяти канонічних амінокислот, як в L-, так і в D- формі. Наприклад, 4-гідроксипролін може бути заміщений на пролін; 5-гідроксилізин може бути заміщений на лізин; 3метилгістидин може бути заміщений на гістидин; гомосерин може бути заміщений на серин; і орнітин може бути заміщений на лізин. В деяких втіленнях цього винаходу, основні залишки (напр., лізин) пептидного токсину, що становить інтерес, можуть бути заміщені на інші залишки (кращими є нефункціональні залишки). Такі молекули будуть менше основними, ніж молекули, від яких вони походять, однак зберігатимуть активність молекул, від яких вони походять, що може призвести до переваг у стійкості і імуногенності; однак даний винахід не повинен бути обмежений цією теорією. Крім того, фізіологічно прийнятні солі композиції винаходу також охоплені, включаючи випадки, коли композиції винаходу називаються тут як "молекули" чи "сполуки". "Фізіологічно прийнятні солі" означає будь-яку сіль, що є або може бути надалі фармацевтично прийнятною. Деякими прикладами є такі солі: ацетати; трифторацетати; гідрогаліди, такі як гідрохлориди і гідроброміди; сульфати; цитрати; малеати; тартрати; гліколати; глюконати; сукцинати; мезилати; безилати і оксалати. Структура сполук: Загальна інформація. Рекомбінантні білки були розроблені як терапевтичні засоби, за допомогою, разом з іншими засобами, ковалентного приєднання до частин молекули, що подовжують період напіввиведення. Такі частини включають "Fc" домен антитіла, як тут використовується Enbrel® (etanercept), а також біологічно сумісні полімери (напр., поліетиленгліколь, або "ПЕГ"), як вони використовуються у Neulasta® (pegfilgrastim). Feige et al. описали застосування таких речовин, що подовжують період напіврозпаду, з пептидами у Патенті США № 6,660,843, виданому 9 грудня, 2003 (включений тут у повному обсязі як посилання). 94226 46 Попередні винахідники визначили, що молекули цього винаходу - пептиди, які складаються приблизно з 80 амінокислот або менше з, щонайменше, двома міжпептидними дисульфідними зв'язками мають терапевтичні переваги, якщо вони ковалентно з'єднуються з частинами, що подовжують період напіввиведення. Молекули цього винаходу, крім того, можуть включати додатковий фармакологічно активний, ковалентно зв'язаний пептид, який може бути зв'язаний з частиною молекули, що подовжує період напіврозпаду (F1 і/або F2) або з частиною такого пептиду (Р). Втілення композицій винаходу, які містять більше, ніж одну складову, що подовжує час напіврозпаду (F1 і F2), включають ті, в яких F1 і F2 являють собою одну й ту ж або різні складові частини молекули, що подовжують період напіввиведення. Приклади (з або без лінкерів між кожним доменом) включають структури, проілюстровані у Фігурі 75, а також у наступних втіленнях (й інші, описані тут, і в робочих Прикладах): 20KПЕГ - пептидний токсин - Fc домен, узгоджується з формулою [(F1)1-(Х2)1-(F2)1]; 20ΚΠΕΓ - пептидний токсин - Fc CH2 домен, узгоджується з формулою [(F1)1-(Х2)1-(F2)1]; 20KПЕГ - пептидний токсин - HSA, узгоджується з формулою [(F1)1-(Х2)1-(F2)1]; 20KПЕГ - Fc домен - пептидний токсин, узгоджується з формулою [(F1)1-(F2)1-(X3)1]; 20KПЕГ - Fc CH2 домен - пептидний токсин, узгоджується з формулою [(F1)1-(F2)1-(X3)1]; і 20KПЕГ - HSA - пептидний токсин, що узгоджується з формулою [(F1)1-(F2)1-(X3)1]. Пептидні токсини. Відповідно до даного винаходу, будь-яка кількість пептидних токсинів (тобто, "Р", або еквівалентно позначене як "Р1" на Фігурі 2) може бути використане для кон'югації. Особливий інтерес представляють пептидні токсини ShK, HmK, MgTx, AgTx2, OsK1 (також називаються як "OSK1"), Agatoxins, і HsTx1, а також модифіковані їх аналоги, та інші пептиди, які імітують активність таких пептидних токсинів. Як тут стверджувалось вище, якщо більше ніж один пептидний токсин "Р" представлений у композиції винаходу, "Р" може незалежно бути тим же або іншим, ніж інший пептидний токсин (ни), що також присутні у композиції винаходу. Наприклад, в композиції, що має формулу P-(L)g-F1-(L)f-P, обидва пептидні токсини, "Р", можуть бути одним і тим же пептидним аналогом ShK, різними пептидними аналогами ShK, або один може бути пептидним аналогом ShK, а інший - пептидним аналогом OSK1. У деяких втіленнях винаходу, інші пептиди, що представляють інтерес, є особливо цінними у сполуках, що мають додаткові особливості у порівнянні зі сполуками за структурною Формулою І. У деяких сполуках, сполука за Формулою І, крім того, включає додатковий фармакологічно активний, ковалентно зв'язаний пептид, який є пептидомагоністом, пептидом-антагоністом або «прицільним» пептидом. Цей пептид може бути кон'югований з F1 або F2, або P. Такі пептиди-агоністи мають активність, яка є агоністичною до пептидного токсину, однак механізм цієї дії не обов'язково має бути таким же, що й у пептидного токсину. Пепти 47 94226 ди-антагоністи також використовуються у втіленнях винаходу, перевага надається тим пептидам, активність яких є комплементарною до активності пептидного токсину. «Прицільні» пептиди також становлять інтерес, оскільки ці пептиди спрямовують молекулу на конкретний тип клітин, органів тощо. Ці класи пептидів можуть бути розкриті за допомогою методів, описаних у посиланнях, цитованих у цій специфікації, а також у інших літературних джерелах. Комбінаторна бібліотека фагового дисплею, зокрема, використовується при виготовленні пептидних токсинів для використання у даному винаході. Добір афінності з бібліотек випадкових пептидів може бути використаний для ідентифікації пептидних лігандів для будь-якого сайту будь-якого імунного продукту. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. Фаговий дисплей є особливо добре прийнятним для ідентифіка 48 ції пептидів, що зв'язуються з такими білками, що представляють інтерес як рецептори клітинної поверхні чи будь-які інші білки, що мають лінійні епітопи. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Такі білки детально висвітлені у Herz et al. (1997), J. Receptor and Signal Transduction Res. 17(5): 671776, що включені тут шляхом посилання у повному обсязі. Такі білки, що становлять інтерес, є кращими для використання у цьому винаході. Перелік пептидів, яким особливо слід надати перевагу, наведений далі у таблицях. Ці пептиди можуть бути отримані з використанням методів, які є загально відомими або розкриваються далі. Використовуються однобуквені скорочення амінокислот. Якщо не обумовлено щось інше, кожна X є незалежно нефункціональним залишком. Таблиця 1 - послідовності пептидів - інгібіторів Kv1.3 49 94226 50 Таблиця 2 - Послідовності пептиду ShK і аналога пептиду ShK 51 94226 52 53 94226 54 55 94226 56 57 Багато пептидів, як описано в Таблиці 2, можуть бути отримані, як описано в Патенті США № 6,077,680, виданому 20 червня, 2000 Kem et al., який включений тут шляхом посилання у повному обсязі. Інші пептиди Таблиці 2 можна отримати за допомогою методик, відомих з рівня техніки. Наприклад, ShK(L5) (SEQ ID NO: 950) можна отримати, як описано у Beeton et al., Targeting effector 94226 58 memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4): 1369- 81 (2005), який включений тут шляхом посилання у повному обсязі. В Таблиці 2 і всюди у специфікації, Xs15, Xs21, Xs22, Xs23 і Xs27 кожен незалежно стосується нефункціональних амінокислотних залишків. Таблиця 3 - Послідовності HmK, BgK, АеK і AsKS пептидів і аналогів пептидів 59 94226 60 В Таблиці 3 і всюди у специфікації, Xh6, Xh22, Xh26 кожен незалежно означає нефункціональні залишки.