Діетиламіноетиламіда 1-пропіл-2-оксо-4-гідроксіхінолін-3-карбонової кислоти гідрохлорид, що проявляє анестезуючу, протиаритмічну, антиоксидантну, антимікробну та фунгіцидну активність

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается биологически-активных веществ, конкретно, диэтиламиноэтиламида 1-пропил-2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты гидрохлорида формулы проявляющего анестезирующее, противо-аритмическое, антиоксидантное, антимикробное и фунгицидное действие. Указанные свойства позволяют предположить возможность его применения в медицине, в частности, в хирургии в качестве лекарственного препарата комплексного действия. Аналогом по структуре и действию является диэтиламиноэтиламида 1-этил-2-оксо-4-гидроксихинолин-3карбоновой кислоты гидрохлорид формулы: проявляющий местноанестезирующую, антимикробную и противогрибковую активность [1]. Аналогом по действию является широко применяемый в медицинской практике препарат - лидокаин [2]. Задачей настоящего изобретения является изыскание в ряду производных 2-оксо-4-гидроксихинолин-3карбоновых кислот нового соединения с более высокой анестезирующей, противоаритмической, антиоксидантной, антимикробной и фунгицидной активностью. Решение поставленной задачи обеспечивает диэтиламиноэтиламида-1-пропил-2-оксо-4гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты гидрохлорид. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Диэтиламиноэтиламида 1-пропил-2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты гидрохлорид формулы 1. К раствору 2,75 г (0,01 моль) 1-пропил-2-оксо-3-карбэтокcи-4-гидроксихинолина в 10 мл метанола прибавляют 1,3 г (0,012 моль) диэтиламиноэтиламина и кипятят с обратным холодильником 5 ч. Охлаждают, прибавляют 30 мл ледяной воды. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат. Затем растворяют в 15 мл метанола, содержащего 0,011 моль НСІ. Прибавляют 5 мл гексана и охлаждают. выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают, суша т. Вы ход 3,20 г (84%). Т.пл. 160-2°С. Найдено, %: С 59,62; Η 7,50; N 11,10; СІ 9,17; С19Н27N3 О3 × НСІ. Вычислено,%: С 59,76; Η 7,39; N 11,00; Cl 9,28. Спектр ПМР: 16,92 (1H,c,OH); 10,69 (1Η,c,ΝΗ); 10,48(1Η,τ,ΝΗ); 8,11(1Η,дд,Η-5); 7,81 (1Н, тд, Н-7); 7,66 (1Н, д, Н-8); 7,37 (1Н, тд, Н-6); 4,21 (2Н, к, NCH2-C2H5); 3,77(2H, к, NHCH2); 3,23 (6Н, М, Ν, (СН2)3; 1.65 (2Н,М,NСН2,СН2СН3); 1,26 (6H,т,NCH2CH3 x 2); 0,97 (3Н, т, СН2СН2СH3)· Пример 2. 1-Пропил-2-оксо-3-карбэтокси-4-гидроксихинолин. К раствору 2,0,7 г (0,01 моль) этилового эфира N-пропилантраниловой кислоты в 15 мл ацетона прибавляют 1,4 мл (0,01 моль) триэтиламина и 1,51 г (0,01 моль) этоксималонилхлорида. Оставляют на ночь. Ацетон удаляют, к остатку прибавляют радтвор 2,0 г КОН в 20 мл воды. Перемешивают в течение 1 ч при 50°С. Охлаждают, подкисляют HCI до рН 4. Осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат. Вы ход 2,09 г (76%). Т.пл. 76-8° С (водный этанол). Найдено, %: С 65,51; Η 6,16; N 5,14. C15H17NO 4. Вычислено,%: С 65,44; Η 6,22; N 5,09. Спектр ПМР: 13,07 (1Н, с, ОН); 8,05 (1Н, дд. Н-5); 7,76 (1Н, тд, Н-7); 7.56 (1Н.д.Н-8); 7,29 (1 Н,тд, Н-6); 4,35 (2Н,к, ОСН2); 4,14 (2Н, т, NCH2); 1,60 (2Н, м, NСН2СН2)/ 1,31 (3Н, т, ОСН2СН3); 0,95 (3Н, т, NСН2СН2СН3). Спектры ПМР синтезированных соединений записаны на приборе "Bruker WP-100 SY" (ФРГ), рабочая частота 100 МГц, растворитель ДМСО-D6 , химические сдвиги приведены в шкале δ по отношению к ТМС. Пример 3. Острую токсичность соединения I и препаратов сравнения определяли на белых мышах обоего пола массой 20-25 г по 5 животных в серии с каждой дозой. Исследуемые вещества растворяли в 0,9%-ном растворе NaCI и вводили внутрибрюшинно в объеме, не превышающем 0,55 мл, в диапазоне доз от 40 до 150 мг/кг. Наблюдения за животными велись в течение 14 дней. ЛД50 (табл.1) рассчитывали по методу Кербера. Пример 4. Анестезирующую активность каждого соединения в условиях инфильтрационной анестезии изучали на 6 морских свинках рыже-черно-белой масти, стандартизованных по массе и полу, по методу Бальбринга. Исследуемые соединения в виде 0,5%-ного раствора, приготовленного на 0,9%-ном растворе NaCI, вводили внутрикожно в объеме 0,25 мл. Анестезирующую активность оценивали через каждые 10 мин, проводя серию уколов в место инъекции исследуемого соединения (5-6 уколов иглой). Адекватной считалась анестезия, если животные не проявляли признаков беспокойства, отсутствовала вокализация и реакция сердечно-сосудистой системы (учащение числа сердечных сокращений): Пример 5. Изучение анестезирующей активности соединения I и лидокаина на модели эпидуральной анестезии проводили на кроликах породы Шиншилла массой 2,0-2,5 кг. Для этого депилировали участок кожи в проекции 3-5 поясничных позвонков и обрабатывали этанолом. Анестезию кожи и подкожной клетчатки проводили 0,25%-ным раствором новокаина. В области 3-4 поясничных позвонков иглой TUOHY-PERIDUR фирмы VYGON проводилась пункция эпидурального пространства. Соединение I и лидокаин в виде 2%-ного раствора вводили в эпидуральное пространство вобъеме, рассчитанном по формуле Результаты учитывали по отсутствию глубокой болевой чувствительности и двигательной активности в соответствующи х группах мышц в области действия эпидуральной анестезии. Пример 6. Изучение противоаритмической активности соединения I и лидокаина проводилось на модели хлоркальциевой аритмии на белых беспородных крысах массой 120-160 г. Животные наркотизировались этаминал-натрием в дозе 60 мг/кг. Исследуемые вещества медленно вводили в виде 1 %-ного раствора внутривенно. Через 2 мин внутривенно вводили 10%-ный раствор кальция хлорида из расчета 2 мл/кг. Регистрацию электрокардиограмм проводили с помощью кардиоэнцефалоскопа КЭС 01 и прибора быстродействующего самопишущего Н3021. Результаты противоаритмического действия соединения I и лидокаина оценивали в процентах выживших животных и по времени до наступления фибрилляции желудочков (табл.3). Пример 7. Изучение местнораздражающего действия соединения I проводили на кроликах породы Шиншилла. Однократно на конъюктиву глаза наносили 1%-ный раствор соединения I. Наблюдение проводили в течение 6 ч, через каждые 30 мин. Инъекции сосудов конъюнктивы и склеры не наблюдалось, т.е. соединение I местнораздражающего действия не оказывает. Пример 8. Изучение влияния соединения I и лидокаина на интенсивность перекисного окисления липидов мембран (ПОЛ) и митохондриальную энергетику проводили на крысах-самках линии Вистар массой 200-250 г. Мито хондрии выделяли одновременно с микросомами методом дифференцированного центрифугирования по Комату в модификации В.В.Лемешко. Исследование интенсивности ПОЛ проводили в микросомальной фракции гомогената печени крыс. Интенсивность НАДФ-зависимого ПОЛ мембран микросом определяли в среде следующего состава: 100мМ трис-НСІ-буфер(рН 7,4), 1мМ НАДФ, 4мМ АДФ, 12 мкМ соль Мора. При аскорбатзависимом ПОЛ среда содержала 100мМ трис-НСІ-буфер(рН 7,4), 0,5мМ аскорбата, 12 мкМ соль Мора. В некоторых опытах в среду инкубации дополнительно вносили 4мМ АДФ. Концентрация белка микросом в инкубационной смеси составляла 0,5-0,6 мг на 1 мл. В инкубационную смесь постоянно продували прогретый до 37°С воздух, обеспечивая насыщение среды кислородом воздуха и перемешивание. Концентрацию соединения І и лидокаина определяли с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой, после осаждения белка трихлоруксусной кислотой. Белок определяли по Лоури и соавт. в модификации Миллера. Результаты исследования влияния соединения I и лидокаина на интенсивность ферментативного и неферментативного ПОЛ мембран микросом печени крыс представлены в табл.4. Отмечалось, что введение соединения I в среду инкубации приводит к значительному ингибированию ферментативного и неферментативного ПОЛ. При этом эффективность соединения I при неферментативном ПОЛ была выше, чем при ферментативном ПОЛ. 50%-ное ингибирование (рассчитана графическим методом) неферментативного и ферментативного ПОЛ наблюдалось при концентрации соединения I, 0,015 мг/мл (15 мг/л) и 0,195 мг/мл (195 мг/л) соответственно. Лидокаин при неферментативном ПОЛ даже в концентрации 2 мг/мл (2 г/л) достоверно не снижал интенсивность свободно-радикального окисления липидов. При ферментативном ПОЛ лидокаин снижал накопление малонового диальдегида (МДА) на 50% при концентрации 1 мг/мл (1 г/л), что вероятно, обусловлено ингибирующим действием препарата НАДФ-зависимой редокс-цепи микросом. Полученные данные свидетельствуют, что соединение І, в отличие от лидокаина, проявляет выраженное антиоксидантное действие. Дыхание митохондрий измеряли полярографически с помощью закрытого кислородного электрода, регистрируя кривые убыли кислорода на ленте самописца КСП-4. Состав реакционной среды: 100мМ сахароза, 75мМ KCI, 10 мМ КН2РО4, 2мМ MgCI2, 10мМ трис-НСІ-буфер (рН 7,4). Субстрат окисления глутамат-малат (5+5 мМ). АДФ добавляли в концентрации 200 мкМ, ЭДТА - 0,5мМ. По кривым потребления кислорода рассчитывали скорость дыхания в метаболических состояниях 2 по Ларди и Вэлману (4 по Чансу, V2), 3 по Чансу (V3), й в разобщенном состоянии (V3p) при использовании 2,4динитрофенола (ДНФ) в концентрации 10-4 М. Белок в пробах определяли по Лоури в модификации Миллера. Полученные данные (табл.5) свидетельствуют о том, что внесение в ячейку соединения І в количестве 0,125-0,25 мг/мл) приводит к выраженному ускорению потребления кислорода в состоянии 4 по Чансу. Дальнейшее же увеличение содержания этого вещества в ячейке приводило к резкому ингибированию дыхания митохондрий. Обращает на себя внимание также весьма существенное ингибирование дыхания в состоянии 3 (т.е. в присутствии АДΦ и Ф н), что, в принципе, может свидетельствовать о замедлении скорости синтеза АТФ благодаря снижению активности АТФ-синтетазы либо переносчика аденозиннуклеотидов. Но поскольку добавление разобщителя в ячейку (состояние Зр) не приводит к увеличению интенсивности потребления кислорода митохондриями, наблюдаемое явление, вероятно, не связано с ингибированием митохондриальной АТФ-синтетазы, а обусловлено ингибированием дыхательной цепи. При внесении в ячейку 0,5 мг/мл соединения I это ингибирование было максимальным. Сравнение действия на митохондриальную энергетику клетки соединения 1 и лидокаина свидетельствует о том, что лидокаин в исследованных концентрациях (до 2 мг/мл) не оказывает существенного разобщающего действия, но ингибировал активность дыхательной цепи, причем, максимальный эффект наблюдался при внесении в ячейку 2 мг/мл указанного агента. Следовательно, представленные данные свидетельствуют о том, что соединение I оказывает на митохондриальную энергетику клетки значительно более выраженное действие, чем лидокаин, чем объясняется его более выраженное антимикробное и фунгицидное действие. Пример 9. Антимикробную активность соединения I и препаратов сравнения изучали используя метод диффузии в питательный агар и метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Для бактериальных культур использовали мясо-пептонный бульон, для дрожжеподобного гриба - авизированную и жидкую среду Сабуро. Суспензию микробных культур готовили в физиологическом растворе. Концентрацию клеток в 1 мл определяли пользуясь оптическим стандартом мутности, полученным в ГНИИСИКМЕП им. Л А.Тарасевича. В стерильные чашки Петри разлили по 10 мл питательного агара. На застывшие пластинки агара ставили цилиндры из нержавеющей стали диаметром 8 мм. Затем 20 мл расплавленного и охлажденного до 40°С питательного агара контаминиовали суспензией клеток, исследуемой тест-культуры до концентрации 10 кл/мл. Распределив равномерно суспензию культуры по всему объему агара, его быстро выливали на застывший 1-й слой. После застывания контаминированного агара (2-го слоя) из него извлекали цилиндры. В образовавшиеся лунки вносили по 0,1 мл растворов исследуемых соединений, используя концентрацию 100 мг/мл. Чашки оставляли на 2 ч при комнатной температуре, затем инкубировали 48 ч при 37°С. Антимикробную активность оценивали по величине зоны угнетения роста тест-культуры. При использовании метода серийных разведений для каждой исследуемой тест-культуры в штати в ставят 6 стерильных пробирок. Затем готовят рабочий раствор каждого соединения в мясо-пептонном бульоне концентрация 1 мг/мл. В первую пробирку вносят 4 мл рабочего раствора, в остальные - по 2 мл мясопептонного бульона. Из первой пробирки стерильной пипеткой переносят 2 мл раствора во вторую и хорошо перемешивают. Затем методом перекатки переносят 2 мл в следующую пробирку и т.д., каждый раз используя новую пипетку. Из пятой пробирки 2 мл раствора выливали. Шестая пробирка служила контролем. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл суспензии клеток, используя концентрацию 107 кл/мл. Таким образом, концентрация микробных клеток в используемых растворах составила 106 кл/мл. Все пробирки инкубировали в термостате при 37°С в течение 48 ч. Антимикробную активность оценивали по наличию и интенсивности роста тест-культуры, сравнивая с контрольными пробирками. Проведенные исследования позволили установить высокую антимикробную активность соединения I по отношению к стафилококку золотистому, кишечной палочке, спорообразующей сапрофитной палочке, протею и дрожжеподобному патогенному грибу (табл.6). Таким образом, соединение формулы I по анестезирующей, противоаритмической, антиоксидантной, антимикробной и фунгицидной активности значительно превосходит препараты сравнения практически не уступая им по токсичности, что позволяет предположить возможность его применения в практической медицине, в частности, в хир ургии.