16е-(4′-метоксибензиліден)-1,3,5(10)-триєн-3,17b-діол, що виявляє антиоксидантну активність та гальмує розвиток постменопаузального метаболічного синдрому

16Е-(4'-метоксибензиліден)-1,3,5(10)-триєн3,17 b -діол, що виявляє антиоксидантну активність та гальмує розвиток постменопаузального метаболічного синдрому. (19) (21) u200904147 (22) 27.04.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) ГОРБЕНКО НАТАЛІЯ ІВАНІВНА, ТАРАН КАТЕРИНА ВІКТОРІВНА, КОНДРАТЮК ЖАННА ОЛЕКСАНДРІВНА, БОРИКОВ ОЛЕКСІЙ ЮРІЙОВИЧ, ОКСЕНЕНКО СВІТЛАНА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, ІВАНОВА ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА, СТЕПАНОВА АЛЛА ВАСИЛІВНА, ЗВЯГІНА ТЕТЯНА СЕРГІЇВНА, 3 44634 Сполука ПЕ0607 одержується відновленням анізиліденпохідного естрону (похідне 1) відомими методами [2], зокрема, за допомогою натрію борогідриду. В свою чергу похідне 1 одержується при Me O 4 альдольно-кратоновій конденсації естрону з анісовим альдегідом у лужному середовищі. Спосіб одержання подано на схемі: Me HB OH HB NaBH4 HO HO OMe I OMe ПЕ-0607 Визначення антиоксидантної активності речовини ПЕ0607 in vitro проводили на моделі окислення ліпопротеїнів яєчного жовтка [3]. Речовину ПЕ0607 додавали до розчину ліпідів у концентраціях 4, 10, 20, 30 та 40мкМ та проводили інкубацію при 37°С. Рівень малонового діальдегіду (МДА) визначали методом спектрофотометрії, загальну антиоксиданту активність розраховували в відсотках зниження вмісту МДА порівняно з контрольною пробою. Як препарат порівняння використовували 3,17 b -естрадіол. Встановлено, що антиоксидантна активність речовини ПЕ0607 підвищувалася дозо-залежно в діапазоні концентрацій від 4 до 40мкМ. При цьому 50% пригнічення продукції МДА (СІ50) спостерігалося при застосуванні речовини ПЕ0607 у концентрації 4,1мкМ, тоді як для 3,17 b -естрадіолу цей показник був майже в 4 рази вищим (табл.1). Отримані дані можуть свідчити про наявність у сполуки ПЕ0607 антиоксидантної активності, яка за виразністю ефекту суттєво перевищує дію препарату порівняння 3,17 b -естрадіолу. Таблиця 1 Коефіцієнт кореляції (r), коефіцієнти регресії (а, b) та розрахункова СІ50 для ПЕ0607 та 3,17 b -естрадіолу (I%=aC±b), (X±SX, n=4). Сполука 3,17 b -естрадіол ПЕ0607 1) к 0,85 0,96 а 0,98±0,13 1,15±0,13 В 33,10±3,60 45,79±3,561) СІ50, мкМ 17,2 4,1 Статистично значущі відмінності показників від таких для 3,17 b -естрадіолу, р £ 0,05. В результаті оцінки гострої токсичності [4] сполуки ПЕ0607 встановлено, що при пероральному введенні у мишей ЛД50 перевищує 5000мг/кг маси тіла, що за класифікацією Сидорова К.К. [5] дозволяє віднести її до практично нешкідливих речовин. Дослідження впливу речовини ПЕ0607 на розвиток постменопаузального МС проводили у оваріектомованих щурів [6], які утримувалися протягом 16 тижнів на високожировій дієті (ВЖД), де білки, вуглеводи, жири складали 4,9%; 26,4% та 68,8%, відповідно, від загальних калорій. Контрольні тварини знаходилися на стандартній дієті, яка складалась із білків, вуглеводів, жирів (15,0%, 81,1% та 3,9%, відповідно, від загальних калорій) [7]. Через 8 тижнів від початку експерименту розпочинали пероральне введення ПЕ0607 або 3,17 b -естрадіолу в дозі 0,2мг/кг маси тіла один раз на добу протягом 8 тижнів. Стан глюкозного гомеостазу оцінювали за показниками базальної глікемії та під час внутрішньочеревного тесту толерантності до глюкози (ВЧТТГ) (3г на кг маси тіла). Площі під глікемічни ми кривими (ППК) при проведенні ВЧТТГ розраховували за допомогою комп'ютерної програми "Mathlab". Коефіцієнт чутливості до інсуліну визначали у кінці експерименту за допомогою короткого інсулінового тесту (0,5Од/кг маси тіла) [8]. В якості інтегральних показників визначали масу тіла, матки та вісцерального жиру. Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) в сироватці крові виявляли динітрофенілгідразиновим методом [9]. Вираженість оксидантного стресу оцінювали за рівнем дієнових кон'югатів (ДК) у гомогенатах серця [10]. Біохімічні показники в органах подано у перерахунку на кількість білка, яку оцінювали методом Лоурі [11]. Інтенсивність нітрозивного стресу в сироватці та сечі оцінювали за рівнем стабільних метаболітів окису нітрогену - нітритів та нітратів (NOx) [12]. Стан системи згортання крові визначали за ступенем та швидкістю АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів [13]. Статистичну обробку отриманих результатів проводили методами варіаційної статистики. Для 5 44634 визначення характеру розподілу отриманих результатів дослідження використовували критерій Шапіро-Уілка. У разі нормального розподілу проводили дисперсійний аналіз ANOVA, для множин 6 ного порівняння використовували критерій Н'юмана-Кайлса [14]. Отримані результати представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Дані щодо впливу сполуки ПЕ0607 на показники глюкозного гомеостазу, масу матки, приріст маси тіла, ступінь та швидкість АДФ індукованої агрегації тромбоцитів, рівень ДК у серці й метаболітів окису нітрогену у сечі та сироватці крові експериментальних щурів, (X±SX, n=6). Показник ППК, ммоль/л × хв Коефіцієнт чутливості до інсуліну, % Приріст маси тіла, % Маса матки, г Відносна маса загального вісцерального жиру, % Вміст ДК, нмоль/мг білка NO в сечі, нмоль/мл NO в сироватці, нмоль/мл Ступінь агрегації, % Швидкість агрегації, у.о. Інтактний конт- ВЖД + оваріектомія + ВЖД + оваріектомія + ВЖД + оваріектомія + роль плацебо ПЕ0607 3,17 b -естрадіол 975,4±41,4 1837,9±145,61) 1093,3±65,72) 1375,2±101,52) 33,1±2,9 17,3±4,81) 31,2±5,72) 32,7±3,32) 12,1±1,6 41,8±2,41) 25,3±4,51)2) 27,0±3,71)2) 0,52±0,04 0,11±0,021) 0,35±0,031)2) 0,22±0,031)2)3) 2,49±0,44 8,00±0,601) 5,45±0,391)2) 6,03±0,761)2) 0,26±0,06 0,54±0,071) 0,29±0,092) 0,28±0,022) 61,64±12,58 35,62±3,801) 67,81±6,652) 65,07±6,622) 33,56±4,58 21,23±3,991) 31,51±2,122) 30,48±2,292) 18,1±2,7 43,2±6,11) 25,4±2,22) 19,5±3,182) 101±10 289±351) 158±222) 105±142) 1) Статистично значущі відмінності у порівнянні з даними для групи "інтактний контроль", р £ 0,05; Статистично значущі відмінності у порівнянні з даними для групи "ВЖД + оваріектомія + плацебо", р £ 0,05; 3) Статистично значущі відмінності у порівнянні з даними для групи "ВЖД + оваріектомія + 3,17 b естрадіол", р £ 0,05. 2) У результаті проведеного дослідження було встановлено, що терапевтичне пероральне застосування сполуки ПЕ0607 значною мірою ослаблює розвиток інсулінорезистентності та інтолерантності до вуглеводів у оваріектомованих щурів, яких утримували на ВЖД, підтвердженням чому було суттєве підвищення коефіцієнта чутливості до інсуліну та зменшення площі під глікемічними кривими в порівнянні з показниками для групи, що отримувала плацебо. Оцінка приросту маси тіла експериментальних тварин показала, що введення сполуки ПЕ0607 протягом 8 тижнів гальмувало зростання маси тіла оваріектомованих тварин. В той же час встановлено, що речовина ПЕ0607 не призводила до зростання маси матки оваріектомованих щурів, що може свідчити про відсутність у неї стимулюючого ефекту на проліферативні процеси у даному органі. Застосування препарату порівняння 3,17 b естрадіолу супроводжувалось збільшенням маси матки майже на 50% порівняно з групою, яка отримувала плацебо. В останні роки епідеміологічні дослідження встановили щільний кореляційний зв'язок між ожирінням за центральним типом та основними компонентами метаболічного синдрому. Встановлено, що застосування сполуки ПЕ0607 призводить до вірогідного зниження відносної маси вісцерального жиру, що може бути результатом безпосереднього впливу 3,17 b естрадіолу та його похідного на ядерні фактори PPAR g та LXR, які відіграють значну роль у регуляції метаболізму ліпідів у жировій тканині [15]. Оскільки відомо, що функціональний стан серця суттєво погіршується за умов метаболічного синдрому, було доцільним визначення показників перекисного окислення ліпідів та антиоксидантного захисту в гомогенатах даного органу. Встановлено, що рівень ДК у гомогенатах серця у тварин, що отримували ПЕ0607, практично не відрізнявся від показників контрольних тварин. Відомо, що одним із механізмів реалізації вазопротекторного ефекту естрадіолу є його стимулюючий вплив на продукцію NO ендотеліальними клітинами судин. В результаті проведених досліджень було виявлено, що при використанні сполуки ПЕ0607 відмічали нормалізацію концентрації стабільних метаболітів NО в сироватці та їх екскреції з сечею, що може свідчити на користь її можливого вазопротекторного ефекту. 7 До біохімічних маркерів печінкової інсулінорезистентності також відносять активність АлАТ, яка є одночасно індикатором гепатотоксичності фармакологічних препаратів. В результаті проведених досліджень було показано, що за умов даної експериментальної моделі активність АлАТ в усіх групах суттєво не відрізнялася від показників в групі інтактного контролю (р>0,05). Проте, відсутність змін в активності даного ферменту при введенні сполуки ПЕ0607 підтверджує відсутність гепатотоксичних властивостей у досліджуваної речовини. Одним із незалежних факторів ризику серцево-судинних ускладнень за умов інсулінорезистентності є протромбічний стан, який обумовлено порушенням балансу між про- та антикоагулянтами, та високою реактивністю тромбоцитів. В результаті проведених досліджень встановлено, що при введені сполуки ПЕ0607 спостерігалось зниження як ступеня так і швидкості АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів. Корисна модель демонструється наступним прикладом: Приклад Одержання 16Е-(4'-метоксибензиліден)1,3,5(10)-триєн-3,17 b -діолу відновленням 16Е-(4'метоксибензиліден)естрону. А) Розчин естрону 2,0г (7,4ммоль) та свіжоперегнаного анісового альдегіду 1,16г (8,5ммоль) у 30мл спирті до якого додано 0,6г КОН, кип'ятять в продовж 1,5 годин. Після завершення реакції контроль ТШХ на пластинах Силуфол (елюент хлороформ-ацетон, 3:1) при проявленні розчином 2,4динітрофенілгідразину. Після охолодження осад продукту відфільтровують, промивають спиртом до нейтрального середовища та сушать. Одержують 16Е-(4'-метоксибензиліден)естрон (1) з т.пл. 266-268°С, вихід 84%. ІЧ спектр у таблетках KBr, n , см-1: 3320, 3384 (ОН), 1620, 1604 (С=С, Аr), 1700 (С=О). Дані ЯМР спектру у ДМСОd6 (хімічний зсув у м.ч., кількість протонів та їх віднесення): 0,90 (3Н, 18-Ме); 3,81 (3Н, ОМе); 7,28 (1H, b =СН); 8,59 (1Н, ОН). Б) До розчину 1,5г (3,8ммоль) похідного естрону 1 у 300мл спирту додають порціями надлишок натрія борогідриду (3,0г, 78ммоль) протягом кількох годин при постійному розмішуванні. Контроль за перебігом реакції здійснюють за допомогою ТШХ на пластинах Силуфол (елюент хлороформ-ацетон, 3:1) при проявленні розчином 2,4динітрофенілгідразину. Ознакою завершення реакції є зникнення плями вихідного кетону (Rf 0,54). Одержаний продукт у цій системі проявляється плямою бордового кольору з Rf 0,43. Реакційну суміш виливають у воду, відфільтровують білий осад, який кристалізують зі спирту. Одержують ПЕ0607 з т.пл. 135-137°С, виходи становлять 72-85%. Для (ПЕ0607) брутто-формула С26Н30O3, Мr=390,53; знайдено, % С: 79,99 розраховано, % С: 79,96. знайдено, % Н: 7,72, розраховано, % Н: 7,74. Мас-спектр (І>20%): 390 (16%) [М]; 213 (29%); 146 (27%); 133 (21%); 122 (22%); 121 (100%); 91 (34%); 84 (21%); 70 (23%); 69 (21%). ІЧ спектр у таблетках KBr, n , cм-1: 3468, 3404 (ОН), 1608 44634 8 (С =С, Аr). Дані ЯМР спектрів (1Н, 13С в ДМСО-d6) наведено у табл.3. Відносну орієнтацію замісників при подвійному зв'язку у 16-С визначено методом ядерного ефекту Оверхаузера (NOESY). Наявність крос-піку в спектрі NOESY між сигналами протонів при 3,96м.ч. (17-СН) та 6,354м.ч. ( b -СН) свідчіть про їх близьке розміщення, а отже про Е-орієнтацію анізильного радикалу. Таблиця 3 Дані ЯМР спектрів 16Е-(4'-метоксибензиліден)1,3,5(10)-триєн 3,17 b -діолу /хімічний зсув відносно ТМС, в м.ч. (константа спін-спінової взаємодії, в Гц)/, кількість протонів Молекулярний фрагмент 1-СН 1 Н 3-С(ОН) 4-СН 5-С 6-СН2 7-СН2 8-СН 9-СН 10-С 11-СН2 12-СН2 7,04 д. (8,4) 1Н 6,50 д.д. (8,4; 0.9) 1Н 8,86 с. 1Н 6,45 с. 1Н 2,73 м. 2Н 1,3-1,9 м. 11Н 1,3-1,9 м. 11Н 2,58-2,64 м. 1Н 1,3-1,9 м. 11Н 1,3-1,9 м. 11Н 13-СМе 0,596 с. 3Н 14-СН 15-СН2 16-С 17-СН 17-ОН b -СН 1'-СН 2',6'-СН 3',5'-СН 4'-С 4'-ОМе 1,3-1,9 м. 11Н 2,13-2,28 м. 2Н 3,96 д. (5.3) 1Н 4,93 д. (5.3)1Н 6,354 с. 1Н 7,30 д. (9,0) 2Н 6,90 д. (9,0) 2Н 3,741с. 3Н 2-СН 13 С 125,5 112,42 154,61 114,65 136,77 28,9 25,84 37,3 43,4 136,76 26,85 29,9 46,8; 11,4 (Me) 47,81 28,7 143,45 83,15 120,99 127,44 122,70 113,51 158,13 54,7 Таким чином, проведені дослідження біологічної активності 16Е-(4'-метоксибензиліден)1,3,5(10)-триєн-3,17 b -діолу свідчать, що пероральне терапевтичне застосування вказаної сполуки у тварин із метаболічним синдромом на тлі гіпоестрогенії призводить до зниження інсулінорезистентності та приросту маси тіла, поліпшення толерантності до вуглеводів, зниження відносної маси вісцерального жиру та оксидативного стресу, підвищення ендогенної продукції NO та поліпшення гемореологічних властивостей крові. Перевагою сполуки ПЕ0607 є відсутність виразного впливу на проліферативні процеси у матці, що суттєво може знизити ризик побічних ефектів при використанні даної речовини. Джерела інформації: 9 44634 1. Jayachandran, M. Mechanisms of estrogenic vascular protection [Text] / M. Jayachandran, V.M. Miller // Amer. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2006. Vol. 290. - P.H507-H508. 2. Титце, Л. Препаративная органическая химия [Текст] / Л. Титце, Т. Айхер. - М.: Мир, 1999. 704с. 3. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеинов [Текст] / И.В. Бабенкова, Ю.О. Теседкин, Г.И. Клебанов [и др.] // Лаб. дело. - 1985. - № 2. - С.5962. 4. Доклинические исследования лекарственных средств: Метод, рекомендации / Под ред. А.В. Стефанова. - К.: Авиценна, 2002. - С.116-117. 5. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения // Токсикология новых промышленных химических веществ / Под ред. А.А. Летавета и B.C. Саноцкого. - М.: Медицина, 1973. - Вып.13. - 158с. 6. Западнюк, И.П. Лабораторные животные, их разведение, содержание и использование в эксперименте [Текст] / И.П. Западнюк, В.Ю. Западнюк, Е.А. Захария - К.: Гос. мед. изд-во УССР, 1962. - 253с. 7. Mechanism of fat-induced hepatic gluconeogenesis: effect of metformin [Text] / S. Song [et al.] // Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol. 2001. - Vol. 281, №2. - P.E275-282. 8. The short insulin tolerance test for determination of insulin sensitivity: a comparison with the euglycaemic clamp [Text] / A. Akinmokun [et al.] // Diabet. Med. - 1992. - Vol.9, № 4. - P.432-437. Комп’ютерна верстка А. Рябко 10 9. Reitmann, S. Calcimetric method for the determination of serum and glutamanie pyruvis transaminases [Text] / S. Reitmann, S.A. Frankel // Amer. J. Clin. Pathol. - 1957. - Vol.28, №1. - P.56-59. 10. Сопоставление различных подходов к определению перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови [Текст] / И.А. Волчегорский, А.Г. Налимов, Б.Г. Яровинский [и др.] // Вопросы мед. химии. - 1989. - №1. - С.127131. 11. Bradford, М.М. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing protein-dye binding [Text] / M.M. Bredford // Anal. Biochem. - 1976. - Vol.72. - P.248252. 12. Орлова, Е.А. Анализ нитритов и нитратов в ткани при экспериментальной острой почечной недостаточности [Текст] / Е.А. Орлова. // Укр. журн. эксперим. медицины. - 2002. - Т.3, №1. С.79-82. 13. Пособие по изучению адгезивноагрегационной активності тромбоцитов [Текст] / А.Л. Берковский, С.А. Васильєв, Л.В. Жердева [и др.] - М.: [б.и.], 2002. - 28с. 14. Гланс, С. Медико-биологическая статистика [Текст] / С. Гланс; пер. с англ. Ю.А. Данилова. М.: Практика, 1998. - 459с. 15. Gene expression profiling identifies liver X receptor alpha as an estrogen-regulated gene in mouse adipose tissue [Text] / L. Lundholm, S. Moverare, K. R. Steffensen [et al.] // J. Molec. Endocrinol. - 2004. - Vol.32. - P.879-892. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601