Штам культивованих клітин женьшеню panax ginseng c.a.mey.-продуцент біологічно активних речовин

Штам культивованих клітин женьшеню Рапах ginseng С А Меу - продуцент біологічно активних речовин, який зареєстровано в Колекції клітинних культур Інституту молекулярної біологи і генетики НАН України під номером 11 генетики НАН України під номером 11 Число пасажів на момент паспортизації - 234 Стандартні умови вирощування Культивування штаму проводиться у вигляді калюсу (на агаризованому живильному середовищі) при температурі 24 - 26°С, ВІДНОСНІЙ ВОЛОГОСТІ повітря 70 - 80% та відсутності освітлення Суспензійну культуру вирощують при постійному перемішуванні на качалці при 60 - 80об/хв, для вирощування калюсної культури качалка не в и ко р исто вується Культивування калюсної культури штаму Рапах БІО-2 МК здійснюється одностадійним способом на середовищі наступного складу, мг/л NH4NO3 1400-1800 2000 - 2020 KNO3 CaCI2 2H2O 300 - 500 KH2PO4 180-220 MgSO4 7H2O 300 - 400 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 CuSO4 5H2O 0,02 - 0,03 CoCI2 6H2O 0,02 - 0,03 MnSO4 5H2O 23-25 5-8 H3BO3 ZnSO4 4H2O 10-12 FeSO4 7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,2-0,4 мезошозит 20-100 1-нафтилоцтова кислота 1,5-2,5 кінетин 0,5-1,2 гідролізат казеїну 400 - 600 сахароза 25000 - 35000 агар 0,6 - 0,8% рН до автоклавування 5,8-6,2 сч (О сч ю О) 52162 Вирощування суспензійної культури здійснюється одностадійним способом в середовищі наступного складу, мг/л NH 4 NO 3 600 - 900 KNO 3 800-1000 СаСІ 2 2Н 2 О 200-300 КН 2 РО 4 50-120 MgSO 4 7Н 2 О 150-190 KJ 0,8 - 0,9 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,2-0,3 CuSO 4 5H 2 O 0,02-0,03 СоСІ 2 6Н 2 О 0,02-0,03 MnSO 4 5H 2 O 23-25 НзВОз 5-8 ZnSO 4 4H 2 O 10-12 FeSO 4 7H 2 O 27-28 Na 2 ЕДТА 37 - 38 тіамін 0,2-0,4 мезошозит 100 - 200 1-нафтилоцтова кислота 1,5 - 2,5 кінетин 0,05-0,15 гибберелова кислота 3 -6 гідролізат казеїну 400 - 600 сахароза 20000 - 30000 рН до автоклавування 5,8 - 6,2 Культуральні властивості Біомаса культивованих клітин штаму Рапах БІО-2 МК складається з клітин і пухких клітинних агрегатів невисокої ЩІЛЬНОСТІ Максимальний розмір клітинних агрегатів суспензійної культури складає біля 0,5см, середній розмір - 0,2 - 0,3см При вирощуванні на твердому (агаризованому) живильному середовищі калюсна культура гомогенна Колір культури - від світлосірого до світложовтого з кремовим ВІДТІНКОМ Тривалість пасажу та режим пересіву суспензійної культури - 14 - 16 днів, калюсної культури, що вирощується на агаризованому середовищі 21 - 2 8 днів Маса інокуляту становить 80 - 100г живої біомаси в перерахунку на 1л живильного середовища Життєздатність культури та стабільність її основних ознак і характеристик перевірялись протягом 11 років (1990 - 2001 рр) Ростові ознаки Тип росту неорганізований, ростовий індекс 3 4 для суспензійної культури і 5 - 7 - для калюсної Крива росту має типовий S-подібний характер з виходом на плато на 9 - 11 день росту для суспензії і на 15 - 18 день росту для калюсу Вихід сухої біомаси з 1л середовища складає для суспензії на 14 день росту 9 - 11 г, а для калюсу на 21 день росту - 1 2 - 1 6 г Життєздатність клітин становить 75 - 85% в стандартних умовах культивування Крива мітотичної активності має, як правило, один підйом з максимумом на 3 - 5 день росту в суспензії і на 9 - 12 день росту на агаризованому середовищі КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН, ЩО знаходяться в різних стадіях мітозу (мітотичний індекс) в максимумі мітотичної активності сягає 2,5 - 3,6% До 10% клітин може ділитись шляхом фрагментації, при цьому ядро клітин ділиться прямим поділом (шляхом амітозу) Карюлопчні ознаки Культура є МІКСОПЛОІДНОЮ популяцією Середнє число хромосом на клітину - 49 ± 5 з межами варіювання від 22 до 180 хромосом Модальний клас формують клітини, що містять 42 - 50 хромосом, вони складають понад 50% популяції Частота аберацій хромосом в анафазах мітозу складає в середньому 23,0 ± 1,3%, коливаючись протягом пасажу в межах 4,5 - 35,3% Анафази зі свіжими розривами хромосом (анафази з фрагментами) складають біля 1 % Цитоморфолопчні ознаки Як суспензійну, так і калюсну культуру формують клітини паренхіматичного та меристематичноготипу, переважно округлої форми Розміри клітин коливаються в межах від 25мкм до 170мкм Середній розмір клітин - 82,6 ± 9,5мкм Основну масу складають дрібні та середні клітини (45 - 120мкм), значно менше (до 15%) крупних клітин (121 170мкм) Співвідношення крупних та дрібніших клітин змінюється протягом пасажу Клітини паренхіматичного типу часто містять включення (крохмальні зерна) і, як правило, крупніші за розміром від меристематичних клітин Ядра клітин мають округлу форму, їх розміри коливаються в межах від 5,5мкм до 29мкм Середній розмір ядер - 15,29 ± 3,12мкм В старіючій культурі (в стаціонарній фазі росту) значна частина ядер зазнає фрагментації, частина ядер стають пікнотичними БІОХІМІЧНІ ознаки Висушена при 54 - 56°С біомаса штаму Рапах БІО-2 МК містить 3 - 5% суми тритерпенових ГЛІКОЗИДІВ, спектр котрих представлений не менше ніж 21 глікозидом КІЛЬКІСТЬ ГЛІКОЗИДІВ В області Rf 0,26 - 0,43 - 6 - 8 Вміст пнзенозидів (тритерпенових ГЛІКОЗИДІВ даммаранового ряду) сягає 2,55мг/л сухої маси Маркерні ознаки Забарвлення культури від світлосірого до світложовтого, здатність до неорганізованого типу росту як на агаризованому, так і в рідкому живильному середовищі Штам накопичує в КІНЦІ циклу росту 3 - 5% тритерпенових ГЛІКОЗИДІВ в перерахунку на суху біомасу, їх спектр представлений 21 глікозидом КІЛЬКІСТЬ ГЛІКОЗИДІВ В області Rf 0,26 0,43 складає 6 - 8 Сума тритерпенових ГЛІКОЗИДІВ даммаранового ряду (пнзенозидів) сягає 2,55мг/г сухої біомаси В залежності від гормонального складу живильного середовища (типу, КІЛЬКОСТІ та співвідношення ауксинів і ЦИТОКІНІНІВ) в біомасі змінюється КІЛЬКІСТЬ, спектр та співвідношення ГЛІКОЗИДІВ, в тому числі пнзенозидів Спектр множинних молекулярних форм естераз складається з 1 0 - 1 2 ізоформ, що визначаються методом електрофорезу в поліакриламідному гелі за методом Брюбейкера та співавторів Розмах МІНЛИВОСТІ за числом хромосом від 22 до 200 з середнім числом хромосом на клітину 48 ± 5 Модальний клас формують клітини з числом хромосом від 42 до 50, вони складають понад 50% Рівень аберацій хромосом в анафазі - біля 23%, переважну КІЛЬКІСТЬ серед яких складають анафази з мостами без фрагментів Культура формується клітинами з розмірами від 25мкм до 170мкм з середнім 82,6 ± 9,5мкм Ядра клітин округлої форми з розміром від 3,5мкм 52162 до 29,5мкм з середнім 15,29 ± 3,12мкм Старіючій культурі властива фрагментація та пікноз ядер Настоянка з біомаси має антимутагенну дію Винахід ілюструється такими прикладами Приклад 1 Для калюсної культури в КОНІЧНІ колби Ерленмейера об'ємом 250мл розливають по 50мл живильного середовища наступного складу, мг/л NH4NO3 1400-1800 KNO3 2000 - 2020 СаСІ2 2Н2О 300-500 КН2РО4 180-220 MgSO4 7Н2О 300-400 KJ 0,8 - 0,9 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 СоСІ2 6Н2О 0,02-0,03 MnSO4 5H2O 23-25 НзВОз 5-8 ZnSO4 4H2O 10-12 FeSO4 7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37 - 38 тіамін 0,2-0,4 мезошозит 20-100 1-нафтилоцтова кислота 1,5 - 2,5 кінетин 0,5 -1,2 гідролізат казеїну 400 - 600 сахароза 25000 - 35000 агар 0,6 - 0,8% рН до автоклавування 5,8 - 6,2 Середовище стерилізують в автоклаві гарячою парою при 1атм 15 - 20хв Після охолодження в кожну колбу в стерильних умовах саджають калюсну тканину живою масою біля 5г На 25-й день росту при температурі 24 - 26° С в темряві тканину виймають із колб, висушують при 54 - 56°С Визначають вихід сухої маси і сумарну глікозидну фракцію Отримані результати наведені в табл 1 Вони свідчать, що вихід сухої біомаси коливається в межах 12,2 - 14,0г/л середовища, а вміст ГЛІКОЗИДІВ в сухій біомасі коливається в межах 3,9 - 5,0% Приклад 2 Для суспензійної культури в КОНІЧНІ колби Ерленмейера об'ємом 250мл розливають 50мл живильного середовища наступного складу, мг/л NH4NO3 600 - 900 KNO3 800-1000 СаСІ2 2Н2О 200-300 КН2РО4 90-110 MgSO4 7H2O 150-190 KJ 0,8 - 0,9 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 СоСІ2 6Н2О 0,02-0,03 MnSO4 5H2O 23-25 НзВОз 5-8 ZnSO4 4H2O 10-12 FeSO4 7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37 - 38 тіамін 0,2-0,4 мезошозит 100 - 200 1-нафтилоцтова кислота 1,5 - 2,5 кінетин 0,05-0,15 гибберелова кислота 3-6 гідролізат казеїну 400 - 600 сахароза 20000 - 30000 рН до автоклавування 5,8 - 6,2 Середовище стерилізують в автоклаві гарячою парою при 1атм 15 - 20хв Після охолодження в кожну колбу в стерильних умовах вносять біля 5г живої маси суспензійних клітин На 14 день росту при постійному перемішуванні на качалці в темряві при температурі 24 - 26°С суспензію виймають з колб, відфільтровують, висушують при 54 - 56°С Визначають вихід сухої маси і сумарну глікозидну фракцію Отримані результати наведені в табл 2 Вони свідчать, що вихід сухої маси коливається в межах 9,0 - 11,0г/л середовища, а вміст ГЛІКОЗИДІВ В сухій масі коливається в межах 3,0 - 4,2% Приклад 3 Готують три варіанти твердого живильного середовища наступного складу, мг/г NH4NO3 1400-1800 KNO3 2000 - 2020 СаСІ2 2Н2О 300-500 КН2РО4 180-220 MgSO4 7H2O 300-400 KJ 0,8 - 0,9 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 СоСІ2 6Н2О 0,02-0,03 MnSO4 5H2O 23-25 НзВОз 5-8 ZnSO4 4H2O 10-12 FeSO4 7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37 - 38 тіамін 0,2-0,4 мезошозит 20-100 гідролізат казеїну 400 - 600 сахароза 25000 - 35000 агар 0,6 - 0,8% рН до автоклавування 5,8 - 6,2 У варіант середовища №1 додатково вносять 1-нафтилоцтову кислоту (НОК) - 2мг/л та кінетин 1мг/л, у варіант середовища №2 вносять 1нафтилоцтову кислоту (НОК) - 2мг/л та кшетинрибозид - 2мг/л, у варіант середовища №3 вносять шдолилоцтову кислоту (ІОК) - 8мг/л та кшетинрибозид - 2мг/л На цих середовищах вирощують калюсну тканину, як описано в прикладі 1, протягом 6 пасажів На 28 день росту шостого пасажу калюсну тканину виймають, висушують при 54 56°С і визначають в ній вміст суми ГЛІКОЗИДІВ, ГІНзенозиди Rg-групи, Rb-групи, їх співвідношення та суму пнзенозидів Отримані результати наведені в табл 3 Вони свідчать, що на різних варіантах середовища калюснатканина накопичує різну КІЛЬКІСТЬ ЯК суми ГЛІКОЗИДІВ, так і пнзенозидів При цьому на варіанті середовища №2 співвідношення пнзенозидів Rbгрупи до пнзенозидів Rg-групи складає 1,01 Таке їх співвідношення характерне для коренів природного женьшеня На варіанті середовища №1 співвідношення Rb/Rg дорівнює 0,73, а на варіанті середовища №3 - 0,16 Такі співвідношення пнзенозидів різних груп характерні для наземних органів рослини (листків та стебел) Приклад 4 Отримують суху біомасу, як описано в прикладах 1 та 2 Із цієї біомаси готують спиртову настоянку методом перколяцм у ваговому співвідношенні 1 частина біомаси 10 частин 40 52162 спирту Одержану спиртову настоянку вивчають на антимутагенну дію Результати такого вивчення наведено в табл 4 Вони свідчать, що спиртовий екстракт із клітинної біомаси як калюсної, так і суспензійної культури штаму Рапах БІО-2 МК пригнічує рівень індукованих мутацій в тесті Еймса на 21 - 35% Таблиця І.Вихїд біомаси і накопичення суми гшшзндш кашосною 8 Таблица 4. Визначення бїояопчної активності субстрату, отриманого з біомаси кяітан штаму Рапах БІО - 1 МК за критерієм зменшеній індукованих мутацій в тесті Еймса з використанням штщ> Salmonella fyphimumim ТА 98 Кількість КОЛОНІЙ «а Вплив субстрату в біомаси ' рєвергантш І ___^^ _ _ _ _, М±ні Субстрат із калюсної культури Без оброки Еряенмейера об'ємом 250 ы і, що містили 50 мя середовища ~~ ГЛІКОЗИДІВ В зі л з колби сухій біомасі, % _ _ _ _ С0редо*шца -jjg— ї 0 64 12 8 12 2 50 0 53 126 13 2 41 0 60 120 50 0 70 140 39 0 69 13S 40 0 68 136 130 Без обробки ДДЦГДП(500 мьг/чашку) Д£ЩТДП{50& мкг/чатку) Бензапірен (50 мкг/чашку) 43 0 65 2. В ш а д біомаси і накопичення суми ГЯІКОЗЙДЇВ БІО - 2 М К е а І4-Й день росту Е колбах Ерленмейера об'ємом 250 мл, що містини 50 ып середовища Вміст Вихід сухої біомаси, г Номер колби ГЛІКОЗИДІВ В сухій біомасі, з1л з колби середовища 1 0 49 98 Зі 2 0 50 100 37 3 0 49 98 42 4 0 54 108 32 5 0 48 96 35 6 0 55 110 7 0 53 10 6 зо 35 39 8 0 45 90 9 0 52 104 3 І 10 0 45 90 41 Таблиця 3- Накопичення глікозидів каяюсяою тканиною штаму Рапах БІО - 2 МК ігри вирощуванні на живильних середовищах з різним вмістим екзогенних фітогормонт варіанту Вміст фітогормоьів в середовищі, мг/л Сума Вміст гіизенозидаа, мг/л сухої гяікозидт маси є сухій Rg бюмасц % група „™ RbJRg НОК- 2 кшегий" 3 рибозад - 2 ЮК- 8, кінетик рнбозвд 2 Сума "Тга" 1 2 775 1±57 8 Обробка субстратом (0 1 мя на чашку) 503 2+107 Без обробки 7243+27 3 Обробка субстратом (0 1 мл на чашку) Субстрат із суспензійної культури 5713±І15 23 3+0 9 Обробка субсдратом (0 І мд на чашку) 775 1±57 8 «а субстратом (0 1 мл на чашку Без обробки 548 2±13 1 724 3±27 З 47 суспензійною культурою штаму Рапах Номер 20?±2 7 Бет обробки 43 0 66 Таблипя , ДЩЦДП(500 мкг/чатку) Бензапірен (50 мкг/чапжу) Бевзашрен (50 шг/чажку) 49 0 61 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 3+09 ДВДТДП(500 Вмзст Вихзд сухої біомаси г Номер колби Без обробки Обробка субстратом (01 ші на чаш* тканиною штам> Рапах БІО-2 МК на 254г день росту в коябах 4В 1 17 1 18 101 2 35 49 2.20 0 35 016 2 55 Список літератури 1 Маханьков В В , Малиновская Г В , Константинова Н А , Уварова Н И Химическое исследование биомассы культуры клеток женьшеня IY Количественный анализ гинзенозидов Химия природных соединений -1990 - 3 - е 361-363 2 Asaka I , її І , Hirotam M , Asada Y , Fumya T Gmsenoside contents of plantlets regenerated from Panax ginseng embryoides // Phytochemistry 1994 -v 36 -N1 - p 61 -63 3 Патент Российской Федерации №2052925 С 1 МПК 6С 12 №5/04 Штамм клеток растительной ткани женьшеня - продуцент гинзенозидов // Константинова Н А , Маханьков В В , Уварова Н И , Баранова В А , Михайлова О М , Малиновская Г В -1996, Бюл №3 4 Маханьков В В Сравнительное исследование качественного состава и количественного содержания тритерпеновых гликозидов, продуцируемых дикорастущим и плантационным женьшенем Рапах ginseng С A Meyer и клеточной культурой на его основе Автореф дисс канд хим наук, Владивосток, 2001 5 Патент Российской Федерации №2038378 С 1 МПК 6С 12 №5/04 Штамм культивируемых клеток растений Рапах ginseng С А Меу - продуцент гинзенозидов // Журавлев Ю Н , Булгаков В П , Козыренко М М , Ожигова И Т , Еляков Г Б , Артюков А А , Уварова Н И , Маханьков В В - 27 06 1995, Бюл №18 52162 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 10