Спосіб визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської

Спосіб визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської, що включає підготовку досліджуваної 3 61524 струшують протягом 15 хвилин та фільтрують. Повторюють процедуру таким же чином та об'єднують фільтрати. Об'єднані фільтрати упарюють досуха під вакуумом. Сухий залишок розчиняють у 50 мл 0,05 М розчину сірчаної кислоти за допомогою ультразвукового диспергатора та фільтрують. Фільтрат доводять до позначки 100 мл за допомогою 0,05 М розчину сірчаної кислоти. Отриманий розчин доводять до pH 9-10 за допомогою концентрованого розчину аміаку та потім додають 50 мл етилацетату. Ретельно струшують та центрифугують. Збирають верхній органічний шар та повторюють процедуру таким же чином. Об'єднані органічні шари висушують над натрію сульфатом безводним, фільтрують та упарюють досуха під вакуумом. Сухий залишок розчиняють у 100 мл оцтової кислоти безводної та титрують 0,02 М розчином хлорної кислоти, визначаючи точку еквівалентності потенціометрично, 1 мл 0,02 М хлорної кислоти еквівалентний 7,068 мг протопіну. Вміст суми алкалоїдів рутки лікарської у перерахунку на протопін розраховують за формулою: X n  706,8 %, m (1) де: n - кількість 0,02 М хлорної кислоти, мл, m - наважка сировини, мг, Xmin  0,4 % . За прототип вибраний спосіб визначення алкалоїдів трави рутки лікарської за Німецькою фармакопеєю [3], згідно з яким ідентифікацію алкалоїдів рутки лікарської проводять методом тонкошарової хроматографії. Для приготування досліджуваної проби висушену сировину подрібнюють на порошок до розміру часток 0,5 мм. 1 г порошку кип'ятять 20 хвилин зі зворотним холодильником у 10 мл метанолу. Фільтрують. Фільтрат використовують як досліджуваний розчин (пробу). Для приготування референтного розчину 10 мг носкапіну гідрохлориду розчиняють у 5 мл метанолу. Хроматографують у системі розчинників: ацетон-толуол-аміак-етанол (40:52:2:6). Кількісне визначення алкалоїдів рутки лікарської за Німецькою фармакопеєю проводять методом алкаліметрії. Висушену лікарську рослинну сировину подрібнюють на порошок до розміру часток 0,5 мм. 10,0000 г порошку (точна наважка) зволожують 35 мл суміші, яка складається з 10 частин розчину аміаку, 10 частин етанолу 96 % та 30 частин вільного від перекисних сполук ефіру у фарфоровій ступці та ретельно перемішують. Суміш переносять у перколятор. Ступку та товкачик промивають 10 мл суміші розчинів аміаку-етанолуефіру та переносять рідину для промивання у перколятор. Мацерують протягом 4 годин та переколюють вільним від перекисних сполук ефіром доти, доки повністю не пройде екстракція алкалоїдів (відсутність підтверджують за допомогою реактиву Майєра). Перколят упарюють вдвічі та переносять у ділильну лійку. Розчин струшують 5 разів кожний раз з 25 мл 0,25 М сірчаної кислоти. Об'єднані кислі фракції доводять до лужної реакції за допомогою концентрованого розчину аміаку та екстрагу 4 ють 5 разів кожний раз з 20 мл вільного від перекисних сполук ефіру. Об'єднані ефірні екстракти промивають 10 мл води, воду видаляють. Ефірний екстракт випарюють на водяній бані досуха, сухий залишок прогрівають протягом 10 хвилин та розчиняють у 10 мл вільного від перекисних сполук ефіру. Розчин змішують з 20 мл 0,01 М сірчаної кислоти та випарюють ефір на водяній бані. Після додавання 30 крапель змішаного метилового червоного індикатора титрують розчином 0,02 М натрію гідроксиду. Вміст суми алкалоїдів рутки лікарської у перерахунку на протопін розраховують за формулою: X 70,67  (20  n) %, m  (100  d) (2) де: n - показник кількості титранту натрію гідроксиду (0,02 моль/л), мл, m - наважка сировини, г, d - втрати при висушуванні, %, Xmin  0,4 % . Наведені способи ідентифікації та кількісного визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської мають ряд недоліків: необхідність використання реактивів та обладнання з високою вартістю, що в умовах виробництва може виявитись нерентабельним. Суттєвим недоліком можна вважати використання токсичних розчинників у ході аналізу (толуол, ацетон, діетиловий ефір, оцтова кислота), які можуть викликати розлади з боку нервової, серцево-судинної та дихальної систем, важкі порушення зору, а також захворювання на рак [4]. Крім того, розчинники, які використовуються для проведення контролю якості (ефір, толуол, ацетон), відносять до наркотичних речовин та прекурсорів, що викликає певні труднощі при їх закупівлі та роботі з ними [5]. До того ж, такі розчинники є вибухонебезпечними речовинами, віднесеними до класу займистості 3. Пари толуолу надзвичайно вогненебезпечні навіть при кімнатній температурі, вони накопичуються у повітрі та утворюють з ним вибухонебезпечну суміш. Пари діетилового ефіру у суміші з киснем повітря також є вибухонебезпечними. Спільним недоліком наведених способів кількісного визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської як за Європейською, так і за Німецькою фармакопеєю можна вважати тривалий час проведення аналізу. Так, проведення кількісного аналізу за Європейською фармакопеєю (пробопідготовка, калібрування приладу, проведення контрольного визначення та титрування) займає близько 4-5 годин для одного зразка, за Німецькою фармакопеєю - понад 8 годин на один зразок. Така тривалість проведення аналізу є незручною для контролю якості лікарської рослинної сировини в умовах виробництва. Задача корисної моделі полягає у розробці способу визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської, який завдяки використанню спектрофотометричного методу при ідентифікації та кількісному визначенні алкалоїдів у заданих умовах дозволяє забезпечити необхідну точність та відтворюваність одночасно з високою швидкістю проведення ана 5 61524 лізу, не потребує використання небезпечних розчинників та великих матеріальних витрат. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської, що включає підготовку досліджуваної проби шляхом одержання водно-спиртової витяжки з подрібненої сировини при кип'ятінні з наступним охолодженням і фільтрацією, на відміну від прототипу передбачає, що пробу у розведенні 1:250 аналізують спектрофотометричним методом в ультрафіолетовому світлі шляхом визначення оптичної густини за довжини хвилі 291 та 320 нм, причому для одержання проби та як компенсаційний розчин використовують спирт етиловий 60 %. Всі параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом. Авторами було передбачено у заявленому способі новий процес одержання досліджуваної проби у розведенні 1:250 (розчинник 60 % спирт етиловий), який забезпечує: 1) максимальне вилучення алкалоїдів з сировини, 2) одержання УФ-спектра з двома вираженими максимумами поглинання за довжини хвилі 291 та 320 нм (креслення). Вміст суми алкалоїдів у перерахунку на протопін розраховують за емпіричною формулою: X D1  mo  V1  V3  100 % , Do  Vo  m1  V2  (100  d) (3) де: D1 - питомий показник поглинання досліджуваної проби за довжини хвилі 320 нм, Do - питомий показник поглинання стандартного розчину за довжини хвилі 320 нм, mo - маса наважки стандартної речовини для приготування стандартного розчину, г, m1 - маса наважки трави рутки лікарської для приготування екстракту, г, Vo - об'єм розчинника (60 % спирту етилового) для приготування стандартного розчину, мл, V1 - об'єм розчинника (60 % спирту етилового) для приготування екстракту з трави рутки лікарської, мл, V2 - об'єм аліквоти екстракту з трави рутки лікарської для приготування досліджуваної проби, мл V3 - об'єм розчинника (60 % спирту етилового) для приготування досліджуваної проби, мл, d - показник вологості лікарської рослинної сировини трави рутки лікарської, %. Для досліджуваної проби Do  0,3480 , mo  0,008 г, Vo  100 мл (у перерахунку на протопін згідно зі стандартними умовами приготування розчинів). Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. З подрібненої сировини готують досліджувану пробу у розведенні 1:250 шляхом екстракції 60 % спиртом етиловим при кип'ятінні з наступним охолодженням і фільтрацією. Одержану пробу аналі 6 зують спектрофотометричним методом в УФ світлі, визначаючи оптичні густини за довжини хвилі 291 та 320 нм. Заявлений спосіб є простим у виконанні, він дозволяє швидко визначити вміст алкалоїдів у лікарській рослинній сировині, є точним, відтворюваним та відрізняється невеликою собівартістю, що особливо важливо в умовах виробництва. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. У відповідності з заявленим способом висушену надземну частину рутки лікарської подрібнили на порошок до розміру часток 0,35 мм. 5,0000 г порошку (точна наважка) вмістили у колбу, додали 50 мл 60 % спирту етилового та кип'ятили на водяній бані протягом 30 хвилин. Отриманий екстракт охолодили та відфільтрували. Аліквоту 1 мл фільтрату перенесли у мірну колбу місткістю 250 мл, довели 60 % спиртом етиловим до позначки та перемішали. як компенсаційний розчин використовували 60 % спирт етиловий. Вимірювання оптичної густини проводили за довжини хвилі 291 та 320 нм. Вміст алкалоїдів трави рутки лікарської у одержаній пробі розраховували за емпіричною формулою (3): 0,3689  0,008  100  250  100 X ,% 0,3480  100  5,003  1 (100  13) X  0,4272% . Отримані результати знаходяться у рамках мінімально допустимого значення вмісту алкалоїдів у траві рутки лікарської (відповідно з аналітичною нормативною документацією, не менше 0,4 %), що свідчить про те, що даний спосіб дозволяє отримувати коректні результати. Для того, щоб оцінити точність даного способу в умовах лабораторії, було проведено визначення алкалоїдів у лікарській рослинній сировині за існуючими методиками. Приклад 2. Для визначення достовірності заявленого способу алкалоїди трави рутки лікарської аналізували для порівняння за вимогами Європейської фармакопеї. Для цього висушену лікарську рослинну сировину подрібнили до розміру часток 0,35 мм. До 2 грамів порошку додали 15 мл 0,05 М розчину сірчаної кислоти та струшували протягом 15 хвилин. Відфільтрували. Довели фільтрат до позначки 20 мл за допомогою 0,05 м розчину сірчаної кислоти. Потім додали 1 мл концентрованого розчину аміаку та 10 мл етилацетату, струшували та центрифугували. Зібрали верхній органічний шар та повторили екстракцію таким же чином. Об'єднані органічні шари висушили над натрію сульфатом безводним та випарили досуха під вакуумом. Сухий залишок розчинили у 0,5 мл метанолу. Референтний розчин приготували наступним чином: 5 мг протопіну гідрохлориду та 5мг хініну розчинили у 10 мл метанолу. Хроматографували у системі розчинників: ацетон-толуоламіак-етанол (40:52:2:6). На пластинку нанесли у вигляді смуг по 30 л досліджуваного та референтного розчинів та хроматографували висхідним способом доти, доки розчинники не пройдуть відстань 15 см від лінії старту. Після цього пластинку висушили на повітрі та обробили реактивом Дра 7 61524 гендорфа. Спостерігали появу оранжевих плям у верхній та середній частині пластинки у зоні референтного розчину та у зоні досліджуваного розчину. Одержані результати достовірно свідчать про наявність алкалоїдів у траві рутки лікарської. Для визначення кількісного вмісту алкалоїдів у траві рутки лікарської висушену лікарську рослинну сировину подрібнили на порошок до розміру часток 0,35 мм. Потім до 5,0000 г (точна наважка) порошку додали 5 мл розведеного розчину аміаку та 50 мл етилацетату. Ретельно струшували протягом 15 хвилин та відфільтрували. Повторили процедуру таким же чином та об'єднали фільтрати. Об'єднані фільтрати упарили досуха під вакуумом. Сухий залишок розчинили у 50 мл 0,05 М розчину сірчаної кислоти за допомогою ультразвукового диспергатора та відфільтрували. Отрима 8 ний розчин довели до pH 9-10 за допомогою концентрованого розчину аміаку та потім додали 50мл етилацетату. Ретельно струшували та центрифугували. Зібрали верхній органічний шар та повторили процедуру таким же чином. Об'єднані органічні шари висушили над натрію сульфатом безводним, відфільтрували та упарили досуха під вакуумом. Сухий залишок розчинили у 100 мл оцтової кислоти безводної та титрували 0,02 М розчином хлорної кислоти, визначаючи точку еквівалентності потенціометрично, 1 мл хлорної кислоти еквівалентний 7,068 мг протопіну. Вміст суми алкалоїдів у траві рутки у перерахунку на протопін розраховували за формулою (1). Результати кількісного визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської за трьома титруваннями наведені у таблиці 1: Таблиця 1 Кількісне визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської (за Європейською фармакопеєю) № титрування 1 2 3 Наважка, г 5,0000 5,0003 5,0007 Vтитр, мл 3,1 3,3 3,2 Середній вміст алкалоїдів у траві рутки лікарської, визначений за Європейською фармакопеєю, склав: Vср  0,45 % . Приклад 3. Для порівняння заявленого способу аналізу алкалоїдів трави рутки лікарської зі способом за Німецькою фармакопеєю висушену сировину подрібнили на порошок до розміру часток 0,5 мм. 1 г порошку кип'ятили 20 хвилин зі зворотним холодильником у 10 мл метанолу. Відфільтрували. Фільтрат використовували як досліджувану пробу. Для приготування референтного розчину 10 мг носкапіну гідрохлориду розчинили у 5 мл метанолу. Хроматографували у системі розчинників ацетон-толуол-аміак-етанол (40:52:2:6). На пластинку нанесли у вигляді смуг 30 л досліджуваної проби та 10 л референтного розчину та хроматографували висхідним способом доти, доки розчинники не пройдуть відстань 15 см від лінії старту. Після цього пластинку висушили на повітрі та обробили проявником - свіжоприготовленим реактивом Драгендорфа. Спостерігали появу оранжевої плями у зоні референтного розчину та появу оранжевих плям в зоні досліджуваного розчину на рівні референтної речовини та нижче зазначеної області, що свідчить про наявність алкалоїдів трави рутки лікарської у досліджуваній пробі. Для визначення кількісного вмісту алкалоїдів у траві рутки лікарської висушену сировину подрібнили на порошок до розміру часток 0,5 мм. 10,0000 г порошку (точна наважка) зволожили 35мл суміші, яка складається з 10 частин розчину К 1,00 1,00 1,00 % вміст 0,4382 0,4664 0,4523 аміаку, 10 частин етанолу 96 % та 30 частин вільного від перекисних сполук ефіру у фарфоровій ступці та ретельно перемішали. Суміш перенесли у перколятор. Ступку та товкачик промили 10 мл суміші розчинів аміаку-етанолу-ефіру та перенесли рідину для промивання у перколятор. Мацерували протягом 4 годин та переколювали вільним від перекисних сполук ефіром доти, доки повністю не пройде екстракція алкалоїдів (відсутність підтвердили за допомогою реактиву Майєра). Перколят упарили вдвічі та перенесли у ділильну лійку. Розчин струшували 5 разів кожний раз з 25 мл 0,25мл сірчаної кислоти. Об'єднані кислі фракції довели до лужної реакції за допомогою концентрованого розчину аміаку та екстрагували 5 разів кожний раз з 20 мл вільного від перекисних сполук ефіру. Об'єднані ефірні екстракти промили 10 мл води, воду видалили. Ефірний екстракт випарили на водяній бані досуха, сухий залишок прогріли протягом 15 хвилин та розчинили у 10 мл вільного від перекисних сполук ефіру. Розчин змішали з 20мл 0,01 М сірчаної кислоти та випарили ефір на водяній бані. Після додавання 30 крапель змішаного метилового червоного індикатора титрували 0,02 М розчином натрію гідроксиду. Кількісний вміст алкалоїдів у траві рутки лікарської розраховували за емпіричною формулою (2). Результати кількісного визначення алкалоїдів трави рутки лікарської за трьома титруваннями наведені у таблиці 2: 9 61524 10 Таблиця 2 Кількісне визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської (за Німецькою фармакопеєю) № титрування 1 2 3 Наважка, г 10,0002 10,0004 10,0002 Vтитр, мл 14,5 14,2 14,8 Середній вміст алкалоїдів у траві рутки лікарської, визначений за Німецькою фармакопеєю, склав X  0,44% . Результати експериментів довели, що заявлений спосіб спектрофотометричного визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської дозволяє отримувати достовірні та відтворювані результати, які узгоджуються з вимогами Європейської та Німецької фармакопеї. Таким чином заявлено простий, не трудомісткий, точний та відтворюваний спосіб визначення алкалоїдів у траві рутки лікарської, який є економічно більш доцільним та може бути використаний в умовах лабораторій з контролю якості лікарських засобів, аптек та виробництва на етапі контролю якості лікарської рослинної сировини. Джерела інформації: Комп’ютерна верстка А. Крижанівський К 1,00 1,00 1,00 % вміст 0,4467 0,4711 0,4224 1. Гродзинський A.M. Лікарські рослини. Енциклопедичний довідник. - Київ, головна редакція Української радянської енциклопедії ім. М.П.Бажана.-1991. - с. 390 і 2. European Pharmacopoeia 6 ed. - Strasbourg: European department for the Quality of Medicines.2009. - p.4234-4235 3. Schollkraut// Deutsches Arzneibuch 2000. Stuttgart: Govi-Verlag GmbH Frankfurt, 1993.-p.3351 4. Голиков С.Н. Неотложная помощь при острых отравлениях: Справочник по токсикологии. М.: Медицина, 1977. - с. 261 5. Бабаян Э.А., Гаевский А.В., Бардин Е.В. Правовые аспекты оборота наркотических, психотропных, сильнодействующих, ядовитых веществ и прекурсоров. - М.: МЦФЭР, 2000. - с. 148 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601