Спосіб культивування продуцента позаклітинного полісахариду bacillus mucilaginosus

Реферат: UA 82464 U UA 82464 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способів отримання біологічно активних речовин мікробного походження. Полісахариди бактерій знайшли широке використання на практиці, вони мають здатність підвищувати стійкість організму людини до бактеріальних і вірусних інфекцій, мають протипухлинну активність, сприяють загоюванню ран, їх використовують для лікування наслідків травм і порушень нервової системи, попередження утворення післяопікових і посттравматичних рубців. Завдяки своїм загущуючим і біоакумуляційним властивостям вони знайшли широке використання у харчовій, хімічній, фармацевтичній, косметичній та інших галузях промисловості [1]. Відомий спосіб отримання полісахариду Bacillus mucilaginosus на рідкому поживному середовищі, яке містить пептон 0,8-1,2 г, мелясу 6-8 г, Na2HPО4 0,4-0,5 г, MgSO4 0,01-0,03 г, K2SO4 0,01-0,03 г, воду водопровідну – 100 мл [2]. Недоліком цього способу є висока вартість пептону, який має харчове значення і коштує 122$ за 1 кг. Відомий спосіб підвищення продуктивності синтезу полісахариду В. mucilaginosus шляхом ультрафіолетового опромінювання культуральної рідини при вирощуванні продуцента на сінному відварі за 37 °C [3]. Недоліком способу є невисокий рівень продуктивності синтезу цільового продукту (полісахариду). Найближчим до запропонованого є винахід, який описано у [4], згідно з яким продуцент попередньо вирощують у середовищі, яке містить 100-200 мл м'ясо-пептонного бульону (МПБ) і 100-200 мл сінного відвару протягом 1-2 діб, а потім - на агаризованому середовищі, яке містить м'ясо-пептонний агар (МПА), натрій хлористий 0,5-1,0 г, цукор (глюкозу, сахарозу, мальтозу або левульозу) 1,5-3,0 г протягом 18-24 год. за температури 37 °C. Даний спосіб дозволяє підвищити продуктивність синтезу полісахариду до 100-150 мл/л, тобто вихід полісахариду 2 в'язкістю 8,18 м /с становить 10-15 об. %. Проте, недоліком прототипу є необхідність вирощування продуцента на агаризованому середовищі, що є нетехнологічним, оскільки потребує додаткового етапу - змивання культури із поверхні середовища та використання у складі поживного середовища дорогих компонентів - м'яса, агару і т.ін; недостатньо висока продуктивність синтезу та використання штаму, який потребує високої температури культивування. В основу корисної моделі поставлена задача здешевлення виробництва і підвищення продуктивності синтезу полісахариду шляхом використання як посівного матеріалу спорової суспензії штаму В. mucilaginosus IMB-54 і культивуванні продуценту на здешевленому рідкому середовищі, що забезпечує підвищення продуктивності синтезу полісахариду в 2,4 разу. Поставлена задача вирішується шляхом вирощування В. mucilaginosus на рідкому поживному середовищі, яке містить (г/л): MgSO4·7H2O-0,7, Na2HPO4·2H2O-2,0, КNO3-1,0-2,5, FeCl3·6H2O-0,05; субстрат (глюкоза, сахароза, фруктоза лактоза, сорбіт, маніт і т.ін) - 15,0. Культивування проводять протягом 22-320 годин за температури 28 °C. Для засіву використовують спорову суспензію штаму В. mucilaginosus IMB-548, що забезпечує підвищення продуктивності синтезу полісахариду порівняно із використанням посівного матеріалу на основі вегетативних клітин в 2,43 разу. Використовуються нативні спори продуцента, які не оброблені ніякими хімічними речовинами і не опромінені ультрафіолетом, що забезпечує збереження генетичного матеріалу продуцента в незмінному вигляді. Особливістю фізіології мікроорганізму В. mucilaginosus є зниження продуктивності синтезу позаклітинного полісахариду (ППС) протягом перебування клітин у вегетативному стані, тому для поновлення їхньої полісахаридсинтезувальної здатності необхідно проходження продуцентом процесу споруляції. Відмінності метаболічних властивостей клітин продуценту, які виросли із спор і вегетативних клітин, проявляються у ефективності використання джерела азоту і в їхній здатності до синтезу позаклітинного полісахариду. Із збільшенням кількості пересівів вегетативних клітин у рідкому середовищі здатність до синтезу екзополісахариду (ЕПС) суттєво зменшується (Фіг. 1), 1 – посівний матеріал – спори; 2 - посівний матеріал – вегетативні клітини другого пересіву; 3 - посівний матеріал – вегетативні клітини четвертого пересіву; 4 - посівний матеріал – вегетативні клітини шостого пересіву. Час культивування – 22 години. Так, для спорового посівного матеріалу оптимальною концентрацією для синтезу полісахариду KNO3 є 2,5 г/л, за якої синтезується 3,62 г/л полісахариду. При засіванні середовища культурою, яка пересівалася у рідкому середовищі двічі, оптимальна концентрація нітрату калію залишається на тому ж рівні, однак, полісахариду синтезується на 20 % менше. За використання культури четвертого пересіву оптимальна концентрація нітрату калію зменшується до 2,25 г/л, при цьому синтезується 2,41 г/л полісахариду. При проведенні шести пересівів культури у вегетативному стані ще менш ефективно використовується джерело азоту і синтезується лише 1,65 г/л полісахариду. За концентрації 1 UA 82464 U 5 10 15 20 25 30 35 40 KNO3 5,5 г/л настає інгібування синтетичних процесів. Наші дослідження показали також, що після 8-9 пересівів культура взагалі втрачає здатність синтезувати полісахарид, особливо на середовищі із співвідношенням N/C 1:3 і поновлює цю здатність лише після проходження процесу споруляції або значного збільшення співвідношення N/C. Особливістю синтезу полісахариду В. mucilaginosus є також його двофазність (Фіг. 2), 1 – в'язкість культуральної рідини; 2 – концентрація ЕПС; 3 – концентрація глюкози. Первинне накопичення полісахариду в культуральній рідині спостерігається протягом перших двох діб культивування. Продуктивність синтезу в цей час визначається співвідношенням N/C в середовищі. На 3-5 добу відбувається зниження концентрації ЕПС в середовищі до 0,025 г/л. На восьму добу починається період повторного синтезу екзополісахариду. Особливістю повторного синтезу ЕПС є відсутність залежності продуктивності від співвідношення азоту до вуглецю в середовищі. 1 Продуктивність синтезу ЕПС однакова у всіх варіантах досліду і складає 0,01 год.- . Результатом повторного періоду синтезу є накопичення у 1,7-2,5 разу більшої кількості полісахариду, ніж протягом першого періоду. Даний винахід представляє спосіб культивування продуценту позаклітинного полісахариду Bacillus mucilaginosus, який може бути використаний у медицині (імуностимулююча, імуномодулююча, противірусна, протипухлинна активність) і ветеринарії (кормова добавка в раціон сільськогосподарських тварин, консервування кормів), у нафтодобувній і гірничій промисловості, у виробництві кераміки і мастильних матеріалів, замінників відомих технічних масел, антифрикційної присадки у гальмівних та охолоджуючих розчинах [5, 6, 7]. Список використаної літератури: 1. Промышленная микробиология: учебн. пособие для вузов по спец. "Микробиология" и "Биотехнология". / З.А. Аркадьева, A.M. Безбородов, И.Н. Блохина и др. Под ред. Н.С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989.-688 с. 2. Патент 2140454 РФ, МКИ С 12 Р 19/04. Способ получения полисахарида Bacillus mucilaginosus / Г.Г. Няникова, О.В. Пестова, Е.Я. Виноградов, М.В. Рутто. 3. Авторське свідоцтво 948142 СССР, МКИ С 12 15/00. Штамм слизистых бацилл Bacillus mucilaginosus / Е.Я. Виноградов, А.И. Берденников // Открытия. Изобретения. 1984. 4. Авторське свідоцтво № 908797 СССР, МКИ С 12 Р 1/04. Способ получения слизи из Bacillus mucilaginosus / Е.Я. Виноградов, B.C. Злобин, В.П. Шишечкина и др. // Открытия. Изобретения. 1982, БИ № 48. 5. Няникова Г.Г. Биосинтез полисахарида Bacillus mucilaginosus и изучение его иммуностимулирующей активности: Дис. канд.биол.наук. - Л., 1990.-158 с. 6. Малиновська І.М., Косенко Л.В. із співав. Роль полисахарида Bacillus mucilaginosus в процессе деструкции силикатных минералов / Микробиология.-1990. - Т.59,вып.1. - С. 70-78. 7. Авторське свідоцтво 1210452 СССР, МКИ С 12N 1/00 Штамм бактерии Bacillus mucilaginosus продуцента биостимулятора неспецифического иммунитета телят/ Виноградов Е.Я., Шишкина В.П. - № 3474518/15 Опубл.27.09.96, Бюл. № 12. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб культивування продуцента позаклітинного полісахариду В. mucilaginosus в рідкому поживному середовищі, який відрізняється тим, що використовують як посівний матеріал нативні спори продуцента, поживне середовище зі складом (г/л): MgSO4·7H2O - 0,7, Na2HPO4·2H2O - 2,0, KNO3 - 1,0-2,5, FeCl3·6H2O - 0,05; субстрат (глюкоза, сахароза, фруктоза лактоза, сорбіт, маніт і т. ін.) - 15,0. 2 UA 82464 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3